Étudier la motilité induite par flagelle chez Escherichia coli en appliquant trois techniques établies dans une série
Summary
De nombreuses bactéries utilisent la motilité entraînée par les flagelles pour naviguer dans leur environnement et coloniser un environnement favorable à la fois individuellement et collectivement. Démontré ici est l’utilisation de trois méthodes établies qui exploitent la motilité comme un outil de sélection pour identifier les composants / voies contribuant à la natation et la motilité de l’essaimage.
Abstract
La motilité est cruciale pour la survie et le succès de nombreuses espèces bactériennes. De nombreuses méthodologies existent pour exploiter la motilité afin de comprendre les voies de signalisation, d’élucider la fonction et l’assemblage des pièces flagelleuses, et d’examiner et de comprendre les modèles de mouvement. Nous démontrons ici une combinaison de trois de ces méthodologies. La motilité dans la gélose molle est la plus ancienne, offrant une sélection forte pour isoler des mutations de suppresseur de gain-de-fonction dans les contraintes motilité-altérées, où la motilité est reconstituée par une deuxième mutation. La technique d’attache cellulaire, d’abord employée pour démontrer la nature rotative du moteur flagellaire, peut être employée pour évaluer l’impact des effecteurs de signalisation sur la vitesse du moteur et sa capacité à commuter la direction de rotation. L’analyse du « passage de la frontière » est plus récente, où les bactéries nageurs peuvent être amorcées pour passer à se déplacer collectivement comme un essaim. En combinaison, ces protocoles représentent une approche systématique et puissante pour identifier les composants de la machinerie de motilité, et pour caractériser leur rôle dans différentes facettes de la natation et de l’essaimage. Ils peuvent être facilement adaptés pour étudier la motilité chez d’autres espèces bactériennes.
Introduction
Les bactéries emploient de nombreux appendices pour le mouvement et la dispersion dans leurs niches écologiques1. La motilité induite par flagelles est la plus rapide d’entre elles, favorisant la colonisation de lieux favorables en réponse aux signaux environnementaux, et contribuant de manière significative à la capacité pathogène de certaines espèces2,3. Les bactéries flagellées peuvent nager individuellement dans un liquide en vrac, ou essaimer en tant que collectif sur une surface semi-solide4. Les flagelles extracellulaires se fixent et sont entraînés par des moteurs rotatifs intégrés dans la membrane, qui exploitent la puissance des gradients d’ions pour générer un couple qui provoque une rotation1,2,4,5,6,7,8. Chez E. coli, dont les moteurs fonctionnent à un couple constantde 9, la sortie du moteur peut être classée en termes de vitesse de rotation et de commutation du rotor entre les directions dans le sens inverse des aiguilles d’une montre (CCW) et dans le sens des aiguilles d’une montre (CW). La rotation CCW favorise la formation d’un faisceau flagellaire cohérent qui propulse la cellule vers l’avant (run), tandis qu’un commutateur transitoire dans le sens de rotation (CW) provoque le démontage partiel ou complet du faisceau10,et la cellule réoriente sa direction de nage (chute). E. coli court généralement une seconde et chute pendant un dixième de seconde. La fréquence de commutation du rotor ou « biais de culbute » est contrôlée par le système de signalisation de la chimiotaxie, dans lequel les chimiorécepteurs transmembranaires détectent les signaux chimiques externes et les transmettent via phosphorelay au moteur flagellaire pour prolonger les courses en réponse aux attractifs, ou les supprimer en réponse à des produits chimiques toxiques11,12. La motilité de la natation est analysée dans une gélose molle à 0,3 %.
Pendant l’essaimage, les bactéries naviguent sur une surface semi-solide comme un collectif dense, où des paquets de bactéries coulent dans un mouvement tourbillonnant continu2,13,14,15. Les essaims d’E. coli présentent une physiologie chimiosensorieuse altérée (biais de chute plus faible), des vitesses plus élevées et une tolérance plus élevée aux antimicrobiens sur les cellules nageant dans un liquide en vrac16,17. Les nains varient dans leur déploiement d’une pléthore de stratégies qui facilitent le mouvement, y compris la production de surfactants, l’hyperflagellation et l’allongement cellulaire2. L’essaimage offre aux bactéries un avantage concurrentiel dans les milieux écologiques et cliniques18,19,20. Il existe deux catégories de bactéries essaimantes: les nains tempérés, qui ne peuvent essaimer que sur des milieux solidifiés avec une gélose à 0,5-0,8%, et les nains robustes, qui peuvent naviguer à travers des concentrations de gélose plus élevées21.
Il existe une variété de tests pour interroger la motilité de la natation et sa régulation. Lorsqu’elle est altérée par des mutations ou des conditions environnementales, la motilité elle-même offre une sélection forte pour identifier les mutations suppresseurs de gain de fonction. Ces suppresseurs peuvent être de véritables réducteurs de la mutation d’origine, ou des pseudo-réducteurs, où une deuxième mutation restaure la fonctionnalité. Ces mutants peuvent être identifiés par séquençage du génome entier (WGS). Une solution de rechange à la sélection impartiale des suppresseurs est une stratégie de mutagenèse ciblée biaisée (p. ex. mutagenèse par PCR). Ces méthodologies mettent souvent en lumière la fonction ou la régulation environnementale de l’appareil de motilité. Si l’objectif est d’étudier la fonction motrice, alors la restauration de la motilité de type sauvage telle que mesurée dans la gélose molle n’indique pas nécessairement la restauration de la puissance motrice de type sauvage. L’essai de cellule-attache, dans lequel les cellules sont attachées à une surface de verre par un flagelle simple et la rotation du corps cellulaire est par la suite surveillée, peut être l’essai initial de choix pour évaluer le comportement moteur. Bien que des méthodologies plus sophistiquées soient maintenant disponibles pour surveiller les propriétés du moteur, la configuration de caméras à grande vitesse requise et l’application de progiciels pour l’analyse de mouvement limitent leur utilisation généralisée22,23,24,25. L’essai d’attache cellulaire exige seulement que les flagelles soient ciselés, permettant la fixation des filaments courts à une lame de verre, suivie de l’enregistrement vidéo de la rotation du corps cellulaire. Bien que les vitesses motrices enregistrées soient faibles dans ce test en raison de la charge élevée que le corps cellulaire exerce sur le flagelle, ce test a néanmoins contribué à des informations précieuses sur les réponses chimiotactiques26,27,28,29,et reste un outil d’investigation valide comme discuté ci-dessous.
La motilité de l’essaimage pose un ensemble différent de défis aux chercheurs. La sélection des suppresseurs de gain de fonction ne fonctionne que chez les nains qui produisent des tensioactifs copieux et essaiment facilement13. Les non-producteurs de tensioactifs tels que E. coli sont méqueux en ce qui concerne le choix de la gélose, la composition des milieux et l’humidité de l’environnement2,13,14,21. Une fois les conditions d’essaimage établies, l’essai17 au passage de la frontière est une méthodologie utile pour interroger la capacité d’un essaim à naviguer dans des conditions nouvelles ou difficiles. Bien que les protocoles présentés ci-dessous se rapportent à E. coli,ils peuvent être facilement adaptés pour être épayus chez d’autres espèces.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’isolement et la caractérisation des mutations suppresseurs ont contribué avec succès à identifier les composants clés du système de chimiotaxie35,36,37,ainsi que la machinerie motrice elle-même38,39,40. Lors de l’utilisation du protocole 1, il est important d’inclure plusieurs répétitions indépendantes pour assurer l?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention GM118085 des National Institutes of Health et en partie par la Fondation Robert Welch (subvention F-1811 à R.M.H.).
Materials
| Reagents | |||
| Bacto Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | |
| EDTA Disodium Salt, Dihydrate | Fisher Scientific | 02-002-786 | |
| Eiken agar | Eiken Chemical Co. Japan | E-MJ00 | Essential for E. coli swarming |
| Glucose D (+) | Fisher Scientific | 410955000 | |
| LB (Lennox) Broth | Fisher Scientific | BP1427-500 | |
| Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | 18-605-496 | |
| Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Materials and Equipment | |||
| CellSense microscope imaging software (V. 1.6) | Olympus | Or equivalent software for microscope used | |
| Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape | Fisher | 50-285-28 | |
| Frosted microscope slides 3x1x1mm | Fisher | 12-550-343 | |
| Olympus BX53 microscope | Olympus | BX53 | Any upright or inverted phase microscope can be used |
| Petri dishes (100 mm diameter) | Fisher Scientific | FB0875712 | For soft-agar assays |
| Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m) | Perkin Elmer | 9908265 | |
| Round Petri Dish with 2 Compartments | VWR | 89200-944 | For border-crossing assays |
| Safety Hypodermic Needles (23G) | Fisher Scientific | 14-826A | |
| Sterile Syringe – 1 mL | Fisher scientific | 14-955-450 | |
| Task/Tissue wipes | Fisher scientific | 06-666 | Or equivalent single use tissue wipes |
| VWR micro cover-glass 18x18mm | VWR | 48366205 | |
| XM10 camera | Olympus | XM10 | Or equivalent microscope camera |
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