JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biology

Undersøker Flagella-drevet motilitet i Escherichia coli ved å bruke tre etablerte teknikker i en serie

Published: May 10, 2020
doi:
10.3791/61364
,
1Department of Molecular Biosciences,The University of Texas at Austin

Summary

Mange bakterier bruker flagelladrevet motilitet for å navigere i miljøet og kolonisere gunstige omgivelser både individuelt og som kollektiv. Demonstrert her er bruk av tre etablerte metoder som utnytter motilitet som et utvalgsverktøy for å identifisere komponenter / veier som bidrar til svømming og swarming motility.

Abstract

Motilitet er avgjørende for overlevelse og suksess for mange bakterielle arter. Mange metoder eksisterer for å utnytte motilitet for å forstå signalveier, for å belyse funksjonen og monteringen av flagellardeler, og for å undersøke og forstå bevegelsesmønstre. Her demonstrerer vi en kombinasjon av tre av disse metodene. Motilitet i myk agar er den eldste, og tilbyr et sterkt utvalg for å isolere gain-of-function suppressor mutasjoner i motility-svekkede stammer, hvor motilitet gjenopprettes gjennom en annen mutasjon. Celle-tethering teknikken, først brukt til å demonstrere den roterende naturen til flagellarmotoren, kan brukes til å vurdere virkningen av signaleffektorer på motorhastigheten og dens evne til å bytte rotasjonsretning. Den “grenseoverskridende” analysen er nyere, hvor svømmebakterier kan primes til å gå over til å bevege seg kollektivt som en sværm. I kombinasjon representerer disse protokollene en systematisk og kraftig tilnærming til å identifisere komponenter i motilitetsmaskineriet, og å karakterisere deres rolle i forskjellige fasetter av svømming og swarming. De kan lett tilpasses for å studere motilitet i andre bakteriearter.

Introduction

Bakterier bruker mange vedlegg for bevegelse og spredning i sine økologiske nisjer1. Flagella-drevet motilitet er den raskeste av disse, fremmer koloniseringen av gunstige lokaliteter som svar på miljøsignaler, og bidrar betydelig til den patogene evnen til noen arter2,3. Flagelerte bakterier kan svømme individuelt i bulkvæske, eller sverme som et kollektiv over en halvfast overflate4. Ekstracellulær flagella festes til og drives av roterende motorer innebygd i membranen, som utnytter kraften til iongradienter for å generere dreiemoment som forårsaker rotasjon1,2,4,5,6,7,8. I E. coli, hvis motorer kjører med konstant dreiemoment9, kan motorutgangen kategoriseres når det gjelder rotasjonshastighet og veksling av rotoren mellom retninger mot klokken (CCW) og med klokken (CW). CCW-rotasjon fremmer dannelsen av en sammenhengende flagellarbunt som driver cellen fremover (kjør), mens en forbigående bryter i rotasjonsretning (CW) får bunten til å demontere enten delvis eller helt10, og cellen til å reorientere svømmeretningen (tumble). E. coli løper vanligvis et sekund og snubler i en tiendedel av et sekund. Koblingsfrekvensen til rotoren eller “tumble bias” styres av chemotaxis-signalsystemet, hvor transmembrane chemoreceptorer oppdager eksterne kjemiske signaler og overfører dem via fosforelegg til flagellarmotoren for å forlenge løp som svar på tiltrekningsmidler, eller undertrykke dem som svar på giftige kjemikalier11,12. Svømmemotilitet er analysert i 0,3% myk agar.

Under swarming navigerer bakterier på en halvfast overflate som et tett kollektiv, hvor pakker med bakterier strømmer i en kontinuerlig virvlende bevegelse2,13,14,15. E. coli svermer viser endret kjemosensorisk fysiologi (lavere tumble bias), høyere hastigheter, og høyere toleranse for antimikrobielle over celler som svømmer i bulkvæske16,17. Svermere varierer i utplasseringen av en mengde strategier som hjelper bevegelse, inkludert overflateaktiv produksjon, hyperflagellasjon og celleforlengelse2. Swarming tilbyr bakterier et konkurransefortrinn i både økologiske og kliniske omgivelser18,19,20. Det er to kategorier av swarming bakterier: tempererte svermere, som bare kan svømme på media størknet med 0,5-0,8% agar og robuste svermere, som kan navigere over høyere agarkonsentrasjoner21.

Det finnes en rekke analyser for å forhøre svømmemotiliteten og reguleringen. Når det er svekket av mutasjoner eller miljøforhold, tilbyr motilitet i seg selv et sterkt utvalg for å identifisere gain-of-function suppressor mutasjoner. Disse undertrykkerne kan være ekte revertanter av den opprinnelige mutasjonen, eller pseudo-revertanter, der en annen mutasjon gjenoppretter funksjonaliteten. Slike mutanter kan identifiseres ved hele genomsekvensering (WGS). Et alternativ til objektivt valg av undertrykker er en partisk målrettet mutagenesestrategi (f.eks. PCR-mutagenese). Disse metodene kaster ofte lys over funksjonen eller miljøreguleringen av motilitetsapparatet. Hvis målet er å studere motorisk funksjon, kan restaurering av villtype motilitet målt i myk agar ikke nødvendigvis indikere restaurering av villmotorutgang. Celle-tethering analysen, der celler er festet til en glassoverflate med et enkelt flagellum og rotasjon av cellekroppen overvåkes senere, kan være den første analysen du velger for å vurdere motorisk oppførsel. Selv om mer avanserte metoder nå er tilgjengelige for å overvåke motoregenskaper, begrenser det nødvendige høyhastighetskameraoppsettet og anvendelsen av programvarepakker for bevegelsesanalyse deres utbredte bruk22,23,24,25. Den celle-tethering analysen krever bare at flagellaen skal skjæres, slik at vedlegg av de korte filamentene til et glasssklie, etterfulgt av videoopptak av rotasjonen av cellekroppen. Selv om de registrerte motorhastighetene er lave i denne analysen på grunn av den høye belastningen cellekroppen utøver på flagellumet, har denne analysen likevel bidratt til verdifull innsikt i kjemoaktiske responser26,27,28,29, og forblir et gyldig undersøkende verktøy som diskutert nedenfor.

Swarming motility utgjør et annet sett med utfordringer for forskere. Utvalg av gain-of-function suppressors fungerer bare i svermere som produserer store overflateaktive stoffer og sverm lett13. Overflateaktive ikke-produsenter som E. coli er begeistret med hensyn til valg av agar, mediesammensetning og fuktighet i miljøet2,13,14,21. Når svermende forhold er etablert, er grenseovergangsanalysen17 en nyttig metodikk for å forhøre en sværms evne til å navigere nye / tøffe forhold. Selv om protokollene som presenteres nedenfor er relatert til E. coli, kan de lett tilpasses for bruk i andre arter.

Protocol

1. Isolering av undertrykkermutanter i motilitetsmangel MERK: Bruk denne metoden som en bred “catch-all” for å identifisere den generelle karakteren av motilitetsfeilen. Myk agarplate forberedelseMERK: Soft-agar, også referert til som motility- eller swim-agar, er en lav prosentandel agar (~ 0,2-0,35% m / v), lenge brukt til å analyse chemotaxis31,32. Tilsett 3 g bacto-agar (0,3% m/v) og 20 g L…

Representative Results

Isolering av pseudo-revertanter i en E. coli-stamme hvis motilitet er svekket av høye nivåer av signalmolekylet c-di-GMP, ble detaljert i nyere arbeid fra laboratoriet vårt34. Denne stammen (JP1442) inneholdt to mutasjoner: ΔyhjH og ΔycgR. YhjH er den mest aktive fosfodiesterase som forringer c-di-GMP i E. coli. Fravær av YhjH fører til forhøyede c-di-GMP nivåer og hemming av motilitet. YcgR er en c-di-GMP-effektor. I kompleks med c-di-GMP binder YcgR s…

Discussion

Isolasjon og karakterisering av undertrykkermutasjoner har med hell bidratt til å identifisere nøkkelkomponenter i chemotaxis-systemet35,36,37, samt selve motormaskineriet38,39,40. Når du bruker protokoll 1, er det viktig å inkludere flere uavhengige repliker for å sikre isolering av et stort spekter av mulige mutasjoner som kan ko…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health grant GM118085 og delvis av Robert Welch Foundation (grant F-1811 til R.M.H.).

Materials

Reagents
Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140-15-4
EDTA Disodium Salt, Dihydrate Fisher Scientific 02-002-786
Eiken agar Eiken Chemical Co. Japan E-MJ00 Essential for E. coli swarming
Glucose D (+) Fisher Scientific 410955000
LB (Lennox) Broth Fisher Scientific BP1427-500
Poly-L-lysine Solution (0.1%) Sigma-Aldrich P8920
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific 18-605-496
Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP362-500
Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-500
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-500
Materials and Equipment
CellSense microscope imaging software (V. 1.6) Olympus Or equivalent software for microscope used
Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape Fisher 50-285-28
Frosted microscope slides 3x1x1mm Fisher 12-550-343
Olympus BX53 microscope Olympus BX53 Any upright or inverted phase microscope can be used
Petri dishes (100 mm diameter) Fisher Scientific FB0875712 For soft-agar assays
Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m) Perkin Elmer 9908265
Round Petri Dish with 2 Compartments VWR 89200-944 For border-crossing assays
Safety Hypodermic Needles (23G) Fisher Scientific 14-826A
Sterile Syringe – 1 mL Fisher scientific 14-955-450
Task/Tissue wipes Fisher scientific 06-666 Or equivalent single use tissue wipes
VWR micro cover-glass 18x18mm VWR 48366205
XM10 camera Olympus XM10 Or equivalent microscope camera
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jarrell, K. F., McBride, M. J. The surprisingly diverse ways that prokaryotes move. Nature Reviews in Microbiology. 6 (6), 466-476 (2008).
  2. Harshey, R. M. Bacterial motility on a surface: many ways to a common goal. Annual Reviews Microbiology. 57, 249-273 (2003).
  3. Duan, Q., Zhou, M., Zhu, L., Zhu, G. Flagella and bacterial pathogenicity. Journal of Basic Microbiology. 53 (1), 1-8 (2013).
  4. Nakamura, S., Minamino, T. Flagella-Driven Motility of Bacteria. Biomolecules. 9 (7), (2019).
  5. Haiko, J., Westerlund-Wikstrom, B. The role of the bacterial flagellum in adhesion and virulence. Biology (Basel). 2 (4), 1242-1267 (2013).
  6. Berg, H. C. . E. coli in Motion. 1 edn. , (2004).
  7. Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annual Review of Biochemistry. 72, 19-54 (2003).
  8. Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
  9. Chen, X., Berg, H. C. Torque-speed relationship of the flagellar rotary motor of Escherichia coli. Biophysics Journal. 78 (2), 1036-1041 (2000).
  10. Turner, L., Ryu, W. S., Berg, H. C. Real-time imaging of fluorescent flagellar filaments. Journal of Bacteriology. 182 (10), 2793-2801 (2000).
  11. Brown, M. T., Delalez, N. J., Armitage, J. P. Protein dynamics and mechanisms controlling the rotational behaviour of the bacterial flagellar motor. Current Opinion in Microbiology. 14 (6), 734-740 (2011).
  12. Parkinson, J. S., Hazelbauer, G. L., Falke, J. J. Signaling and sensory adaptation in Escherichia coli chemoreceptors: 2015 update. Trends in Microbiology. 23 (5), 257-266 (2015).
  13. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
  14. Harshey, R. M., Partridge, J. D. Shelter in a Swarm. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3683-3694 (2015).
  15. Ariel, G., et al. Swarming bacteria migrate by Levy Walk. Nature Communications. 6, 8396 (2015).
  16. Partridge, J. D., Nhu, N. T. Q., Dufour, Y. S., Harshey, R. M. Escherichia coli Remodels the Chemotaxis Pathway for Swarming. mBio. 10 (2), (2019).
  17. Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107 (8), 3776-3781 (2010).
  18. Mobley, H. L., Belas, R. Swarming and pathogenicity of Proteus mirabilis in the urinary tract. Trends in Microbiology. 3 (7), 280-284 (1995).
  19. Burall, L. S., et al. Proteus mirabilis genes that contribute to pathogenesis of urinary tract infection: identification of 25 signature-tagged mutants attenuated at least 100-fold. Infections and Immunity. 72 (5), 2922-2938 (2004).
  20. Mazzantini, D., et al. FlhF Is Required for Swarming Motility and Full Pathogenicity of Bacillus cereus. Frontiers in Microbiology. 7, 1644 (2016).
  21. Partridge, J. D., Harshey, R. M. Swarming: flexible roaming plans. Journal of Bacteriology. 195 (5), 909-918 (2013).
  22. Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
  23. Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. Journal of Molecular Biology. 390 (3), 394-400 (2009).
  24. Terasawa, S., et al. Coordinated reversal of flagellar motors on a single Escherichia coli cell. Biophysics Journal. 100 (9), 2193-2200 (2011).
  25. Nord, A. L., Sowa, Y., Steel, B. C., Lo, C. J., Berry, R. M. Speed of the bacterial flagellar motor near zero load depends on the number of stator units. Proceedings of the National Academy of Science. 114 (44), 11603-11608 (2017).
  26. Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation kinetics in bacterial chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
  27. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 83 (23), 8987-8991 (1986).
  28. Wolfe, A. J., Conley, M. P., Kramer, T. J., Berg, H. C. Reconstitution of signaling in bacterial chemotaxis. Journal of Bacteriology. 169 (5), 1878-1885 (1987).
  29. Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
  30. Parkinson, J. S. A “bucket of light” for viewing bacterial colonies in soft agar. Methods Enzymol. 423, 432-435 (2007).
  31. Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153 (3737), 708-716 (1966).
  32. Wolfe, A. J., Berg, H. C. Migration of bacteria in semisolid agar. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 86 (18), 6973-6977 (1989).
  33. Kojadinovic, M., Sirinelli, A., Wadhams, G. H., Armitage, J. P. New motion analysis system for characterization of the chemosensory response kinetics of Rhodobacter sphaeroides under different growth conditions. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4082-4088 (2011).
  34. Nieto, V., et al. Under Elevated c-di-GMP in Escherichia coli, YcgR Alters Flagellar Motor Bias and Speed Sequentially, with Additional Negative Control of the Flagellar Regulon via the Adaptor Protein RssB. Journal of Bacteriology. 202 (1), (2019).
  35. Parkinson, J. S., Parker, S. R., Talbert, P. B., Houts, S. E. Interactions between chemotaxis genes and flagellar genes in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 155 (1), 265-274 (1983).
  36. Roman, S. J., Meyers, M., Volz, K., Matsumura, P. A chemotactic signaling surface on CheY defined by suppressors of flagellar switch mutations. Journal of Bacteriology. 174 (19), 6247-6255 (1992).
  37. Sanna, M. G., Simon, M. I. Isolation and in vitro characterization of CheZ suppressors for the Escherichia coli chemotactic response regulator mutant CheYN23D. Journal of Biological Chemistry. 271 (13), 7357-7361 (1996).
  38. Sockett, H., Yamaguchi, S., Kihara, M., Irikura, V. M., Macnab, R. M. Molecular analysis of the flagellar switch protein FliM of Salmonella typhimurium. Journal of Bacteriology. 174 (3), 793-806 (1992).
  39. Irikura, V. M., Kihara, M., Yamaguchi, S., Sockett, H., Macnab, R. M. Salmonella typhimurium fliG and fliN mutations causing defects in assembly, rotation, and switching of the flagellar motor. Journal of Bacteriology. 175 (3), 802-810 (1993).
  40. Ishida, T., et al. Sodium-powered stators of the bacterial flagellar motor can generate torque in the presence of phenamil with mutations near the peptidoglycan-binding region. Molecular Microbiology. 111 (6), 1689-1699 (2019).
  41. Barker, C. S., Meshcheryakova, I. V., Kostyukova, A. S., Samatey, F. A. FliO regulation of FliP in the formation of the Salmonella enterica flagellum. PLoS Genetics. 6 (9), 1001143 (2010).
  42. Paul, K., Nieto, V., Carlquist, W. C., Blair, D. F., Harshey, R. M. The c-di-GMP binding protein YcgR controls flagellar motor direction and speed to affect chemotaxis by a “backstop brake” mechanism. Molecular Cell. 38 (1), 128-139 (2010).
  43. Qian, C., Wong, C. C., Swarup, S., Chiam, K. H. Bacterial tethering analysis reveals a “run-reverse-turn” mechanism for Pseudomonas species motility. Applied and Environmental Microbiology. 79 (15), 4734-4743 (2013).
  44. Manson, M. D., Tedesco, P. M., Berg, H. C. Energetics of flagellar rotation in bacteria. Journal of Molecular Biology. 138 (3), 541-561 (1980).
  45. Kuwajima, G. Construction of a minimum-size functional flagellin of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 170 (7), 3305-3309 (1988).
  46. Kuhn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369 (2018).
  47. Hranitzky, K. W., Mulholland, A., Larson, A. D., Eubanks, E. R., Hart, L. T. Characterization of a flagellar sheath protein of Vibrio cholerae. Infections and Immun. 27 (2), 597-603 (1980).
  48. Wang, Q., Frye, J. G., McClelland, M., Harshey, R. M. Gene expression patterns during swarming in Salmonella typhimurium: genes specific to surface growth and putative new motility and pathogenicity genes. Molecular Microbiology. 52 (1), 169-187 (2004).
  49. Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Molecular Microbiology. 79 (1), 240-263 (2011).
  50. McCarter, L., Silverman, M. Surface-induced swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. Molecular Microbiology. 4 (7), 1057-1062 (1990).
  51. Pearson, M. M., Rasko, D. A., Smith, S. N., Mobley, H. L. Transcriptome of swarming Proteus mirabilis. Infections and Immunity. 78 (6), 2834-2845 (2010).
  52. Swiecicki, J. M., Sliusarenko, O., Weibel, D. B. From swimming to swarming: Escherichia coli cell motility in two-dimensions. Integrative Biology (Cambridge). 5 (12), 1490-1494 (2013).
  53. Colin, R., Drescher, K., Sourjik, V. Chemotactic behaviour of Escherichia coli at high cell density. Nature Communication. 10 (1), 5329 (2019).
  54. Partridge, J. D., Harshey, R. M. More than motility: Salmonella flagella contribute to overriding friction and facilitating colony hydration during swarming. Journal Bacteriology. 195 (5), 919-929 (2013).
  55. Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal Visualized Experiment. (98), e52338 (2015).
  56. Chawla, R., Ford, K. M., Lele, P. P. Torque, but not FliL, regulates mechanosensitive flagellar motor-function. Science Reports. 7 (1), 5565 (2017).

Tags

Escherichia ColiFlagellaMotilitySwarm PlatesSoft AgarHard AgarSuppressor MutantsMotility BufferCentrifugationMicroscopy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Partridge, J. D., Harshey, R. M. Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series. J. Vis. Exp. (159), e61364, doi:10.3791/61364 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image