Исследование подвижности жгутиков у кишечной палочки путем применения трех установленных методов в серии
Summary
Многие бактерии используют подвижность, управляемую жгутиками, чтобы ориентироваться в окружающей среде и колонизировать благоприятное окружение как индивидуально, так и коллективно. Здесь показано использование трех установленных методов, которые используют подвижность в качестве инструмента выбора для выявления компонентов / путей, способствующих плаванию и роевой подвижности.
Abstract
Подвижность имеет решающее значение для выживания и успеха многих видов бактерий. Существует множество методологий для использования подвижности для понимания сигнальных путей, выяснения функции и сборки жгутиков, а также для изучения и понимания моделей движения. Здесь мы демонстрируем сочетание трех из этих методологий. Подвижность в мягком агарове является самой старой, предлагая сильный отбор для выделения мутаций супрессора усиления функции у штаммов с нарушениями подвижности, где подвижность восстанавливается с помощью второй мутации. Метод клеточного троса, впервые использованный для демонстрации вращательной природы жгутикового двигателя, может быть использован для оценки влияния сигнальных эффекторов на скорость двигателя и его способность переключать направление вращения. Анализ «пересечения границы» является более недавним, где плавающие бактерии могут быть подготовлены к переходу в коллективное движение в качестве роя. В сочетании эти протоколы представляют собой систематический и мощный подход к выявлению компонентов механизмов подвижности и характеристике их роли в различных аспектах плавания и роения. Они могут быть легко адаптированы для изучения подвижности у других видов бактерий.
Introduction
Бактерии используют множество придатков для перемещения и рассеивания в своих экологических нишах1. Подвижность, управляемая жгутителями, является самой быстрой из них, способствуя колонизации благоприятных мест в ответ на сигналы окружающей среды и внося значительный вклад в патогенную способность некоторых видов2,3. Жгутиковые бактерии могут плавать индивидуально в объемной жидкости или роиться как коллектив над полутвердой поверхностью4. Внеклеточные жгутики прикрепляются и приводятся в движение роторными двигателями, встроенными в мембрану, которые используют мощность ионных градиентов для создания крутящегомомента,который вызывает вращение1,2,4,5,6,7,8. В E. coli,чьи двигатели работают с постоянным крутящим моментом9,мощность двигателя может быть классифицирована с точки зрения скорости вращения и переключения ротора между направлениями против часовой стрелки (CCW) и по часовой стрелке (CW). Вращение КНО способствует образованию когерентного жгутикового пучка, который продвигает ячейку вперед (бег), в то время как переходный переключатель в направлении вращения (CW) заставляет пучок разбираться частично или полностьюна 10,а клетка переориентировать свое направление плавания (кувыркаться). Кишечно-кишечное кишечное правило бегает в течение секунды и кувыркается в течение десятой доли секунды. Частота переключения ротора или «кувыркающееся смещение» контролируется сигнальной системой хемотаксиса, в которой трансмембранные хеморецепторы обнаруживают внешние химические сигналы и передают их через фосфорелай жгутиковый двигатель для продления пробегов в ответ на аттрактанты или подавления их в ответ на токсичные химические вещества11,12. Подвижность плавания анализируется в 0,3% мягкого агара.
Во время роения бактерии перемещаются по полутвердой поверхности в виде плотного коллектива, где стаи бактерий текут в непрерывном вихревом движении2,13,14,15. Рои E. coli демонстрируют измененную хемосенсорную физиологию (более низкое смещение падения), более высокие скорости и более высокую толерантность к противомикробным препаратам над клетками, плавающими в объемной жидкости16,17. Рои различаются в своем развертывании множества стратегий, которые помогают движению, включая производство поверхностно-активных добавок, гиперфлагелляцию и удлинение клеток2. Роение дает бактериям конкурентное преимущество как в экологических, так и в клинических условиях18,19,20. Существует две категории роящихся бактерий: умеренные рои, которые могут роиться только на средах, затвердевшие с 0,5-0,8% агара, и надежные рои, которые могут перемещаться по более высоким концентрациям агара21.
Существует множество анализов, чтобы исследовать подвижность плавания и ее регулирование. При нарушении мутаций или условий окружающей среды подвижность сама по себе предлагает сильный выбор для выявления мутаций-супрессоров усиления функции. Эти супрессоры могут быть подлинными ревертантами исходной мутации или псевдо-ревертантами, где вторая мутация восстанавливает функциональность. Такие мутанты могут быть идентифицированы путем секвенирования всего генома (WGS). Альтернативой непредвзятому выбору супрессора является предвзятая стратегия целенаправленного мутагенеза (например, мутагенез ПЦР). Эти методологии часто проливает свет на функцию или экологическую регуляцию аппарата моторики. Если цель состоит в том, чтобы изучить двигательную функцию, то восстановление подвижности дикого типа, измеренное в мягком агари, не обязательно может указывать на восстановление двигательной мощности дикого типа. Анализ клеточного привязки, в котором клетки прикрепляются к стеклянной поверхности одним жгутиком и впоследствии контролируется вращение тела клетки, может быть начальным анализом выбора для оценки двигательного поведения. Хотя в настоящее время доступны более сложные методологии для мониторинга свойств двигателя, требуемая высокоскоростная настройка камер и применение пакетов программного обеспечения для анализа движения ограничивают их широкое использование22,23,24,25. Анализ клеточного привязки требует только, чтобы жгутики были сстрижены, что позволяет прикрепить короткие нити к стеклянному слайду с последующей видеозаписью вращения тела клетки. Хотя зарегистрированные скорости двигателя низки в этом анализе из-за высокой нагрузки, которую тело клетки оказывает на жгутик, этот анализ, тем не менее, способствовал ценному пониманию хемотаксических реакций26,27,28,29и остается действительным инструментом исследования, как обсуждается ниже.
Роевая подвижность ставит перед исследователями другой набор проблем. Выбор супрессоров усиления функции работает только в роях, которые производят обильные поверхностно-активные вещества и роя легко13. Поверхностно-активные непроизводители, такие как E. coli, привередливы в отношении выбора агара, состава среды и влажности окружающей среды2,13,14,21. После того, как условия роения установлены, анализ пересечения границы17 является полезной методологией для опроса о способности роя ориентироваться в новых/суровых условиях. Хотя протоколы, представленные ниже, относятся к E. coli,они могут быть легко адаптированы для применения у других видов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Выделение и характеристика мутаций супрессоров успешно способствовали выявлению ключевых компонентов системы хемотаксиса35,36,37,а также самого моторного механизма38,39,40. При использов?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения GM118085 и частично Фондом Роберта Уэлча (грант F-1811 R.M.H.).
Materials
| Reagents | |||
| Bacto Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | |
| EDTA Disodium Salt, Dihydrate | Fisher Scientific | 02-002-786 | |
| Eiken agar | Eiken Chemical Co. Japan | E-MJ00 | Essential for E. coli swarming |
| Glucose D (+) | Fisher Scientific | 410955000 | |
| LB (Lennox) Broth | Fisher Scientific | BP1427-500 | |
| Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | 18-605-496 | |
| Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Materials and Equipment | |||
| CellSense microscope imaging software (V. 1.6) | Olympus | Or equivalent software for microscope used | |
| Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape | Fisher | 50-285-28 | |
| Frosted microscope slides 3x1x1mm | Fisher | 12-550-343 | |
| Olympus BX53 microscope | Olympus | BX53 | Any upright or inverted phase microscope can be used |
| Petri dishes (100 mm diameter) | Fisher Scientific | FB0875712 | For soft-agar assays |
| Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m) | Perkin Elmer | 9908265 | |
| Round Petri Dish with 2 Compartments | VWR | 89200-944 | For border-crossing assays |
| Safety Hypodermic Needles (23G) | Fisher Scientific | 14-826A | |
| Sterile Syringe – 1 mL | Fisher scientific | 14-955-450 | |
| Task/Tissue wipes | Fisher scientific | 06-666 | Or equivalent single use tissue wipes |
| VWR micro cover-glass 18x18mm | VWR | 48366205 | |
| XM10 camera | Olympus | XM10 | Or equivalent microscope camera |
References
- Jarrell, K. F., McBride, M. J. The surprisingly diverse ways that prokaryotes move. Nature Reviews in Microbiology. 6 (6), 466-476 (2008).
- Harshey, R. M. Bacterial motility on a surface: many ways to a common goal. Annual Reviews Microbiology. 57, 249-273 (2003).
- Duan, Q., Zhou, M., Zhu, L., Zhu, G. Flagella and bacterial pathogenicity. Journal of Basic Microbiology. 53 (1), 1-8 (2013).
- Nakamura, S., Minamino, T. Flagella-Driven Motility of Bacteria. Biomolecules. 9 (7), (2019).
- Haiko, J., Westerlund-Wikstrom, B. The role of the bacterial flagellum in adhesion and virulence. Biology (Basel). 2 (4), 1242-1267 (2013).
- Berg, H. C. . E. coli in Motion. 1 edn. , (2004).
- Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annual Review of Biochemistry. 72, 19-54 (2003).
- Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
- Chen, X., Berg, H. C. Torque-speed relationship of the flagellar rotary motor of Escherichia coli. Biophysics Journal. 78 (2), 1036-1041 (2000).
- Turner, L., Ryu, W. S., Berg, H. C. Real-time imaging of fluorescent flagellar filaments. Journal of Bacteriology. 182 (10), 2793-2801 (2000).
- Brown, M. T., Delalez, N. J., Armitage, J. P. Protein dynamics and mechanisms controlling the rotational behaviour of the bacterial flagellar motor. Current Opinion in Microbiology. 14 (6), 734-740 (2011).
- Parkinson, J. S., Hazelbauer, G. L., Falke, J. J. Signaling and sensory adaptation in Escherichia coli chemoreceptors: 2015 update. Trends in Microbiology. 23 (5), 257-266 (2015).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Harshey, R. M., Partridge, J. D. Shelter in a Swarm. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3683-3694 (2015).
- Ariel, G., et al. Swarming bacteria migrate by Levy Walk. Nature Communications. 6, 8396 (2015).
- Partridge, J. D., Nhu, N. T. Q., Dufour, Y. S., Harshey, R. M. Escherichia coli Remodels the Chemotaxis Pathway for Swarming. mBio. 10 (2), (2019).
- Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107 (8), 3776-3781 (2010).
- Mobley, H. L., Belas, R. Swarming and pathogenicity of Proteus mirabilis in the urinary tract. Trends in Microbiology. 3 (7), 280-284 (1995).
- Burall, L. S., et al. Proteus mirabilis genes that contribute to pathogenesis of urinary tract infection: identification of 25 signature-tagged mutants attenuated at least 100-fold. Infections and Immunity. 72 (5), 2922-2938 (2004).
- Mazzantini, D., et al. FlhF Is Required for Swarming Motility and Full Pathogenicity of Bacillus cereus. Frontiers in Microbiology. 7, 1644 (2016).
- Partridge, J. D., Harshey, R. M. Swarming: flexible roaming plans. Journal of Bacteriology. 195 (5), 909-918 (2013).
- Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
- Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. Journal of Molecular Biology. 390 (3), 394-400 (2009).
- Terasawa, S., et al. Coordinated reversal of flagellar motors on a single Escherichia coli cell. Biophysics Journal. 100 (9), 2193-2200 (2011).
- Nord, A. L., Sowa, Y., Steel, B. C., Lo, C. J., Berry, R. M. Speed of the bacterial flagellar motor near zero load depends on the number of stator units. Proceedings of the National Academy of Science. 114 (44), 11603-11608 (2017).
- Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation kinetics in bacterial chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 83 (23), 8987-8991 (1986).
- Wolfe, A. J., Conley, M. P., Kramer, T. J., Berg, H. C. Reconstitution of signaling in bacterial chemotaxis. Journal of Bacteriology. 169 (5), 1878-1885 (1987).
- Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
- Parkinson, J. S. A “bucket of light” for viewing bacterial colonies in soft agar. Methods Enzymol. 423, 432-435 (2007).
- Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153 (3737), 708-716 (1966).
- Wolfe, A. J., Berg, H. C. Migration of bacteria in semisolid agar. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 86 (18), 6973-6977 (1989).
- Kojadinovic, M., Sirinelli, A., Wadhams, G. H., Armitage, J. P. New motion analysis system for characterization of the chemosensory response kinetics of Rhodobacter sphaeroides under different growth conditions. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4082-4088 (2011).
- Nieto, V., et al. Under Elevated c-di-GMP in Escherichia coli, YcgR Alters Flagellar Motor Bias and Speed Sequentially, with Additional Negative Control of the Flagellar Regulon via the Adaptor Protein RssB. Journal of Bacteriology. 202 (1), (2019).
- Parkinson, J. S., Parker, S. R., Talbert, P. B., Houts, S. E. Interactions between chemotaxis genes and flagellar genes in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 155 (1), 265-274 (1983).
- Roman, S. J., Meyers, M., Volz, K., Matsumura, P. A chemotactic signaling surface on CheY defined by suppressors of flagellar switch mutations. Journal of Bacteriology. 174 (19), 6247-6255 (1992).
- Sanna, M. G., Simon, M. I. Isolation and in vitro characterization of CheZ suppressors for the Escherichia coli chemotactic response regulator mutant CheYN23D. Journal of Biological Chemistry. 271 (13), 7357-7361 (1996).
- Sockett, H., Yamaguchi, S., Kihara, M., Irikura, V. M., Macnab, R. M. Molecular analysis of the flagellar switch protein FliM of Salmonella typhimurium. Journal of Bacteriology. 174 (3), 793-806 (1992).
- Irikura, V. M., Kihara, M., Yamaguchi, S., Sockett, H., Macnab, R. M. Salmonella typhimurium fliG and fliN mutations causing defects in assembly, rotation, and switching of the flagellar motor. Journal of Bacteriology. 175 (3), 802-810 (1993).
- Ishida, T., et al. Sodium-powered stators of the bacterial flagellar motor can generate torque in the presence of phenamil with mutations near the peptidoglycan-binding region. Molecular Microbiology. 111 (6), 1689-1699 (2019).
- Barker, C. S., Meshcheryakova, I. V., Kostyukova, A. S., Samatey, F. A. FliO regulation of FliP in the formation of the Salmonella enterica flagellum. PLoS Genetics. 6 (9), 1001143 (2010).
- Paul, K., Nieto, V., Carlquist, W. C., Blair, D. F., Harshey, R. M. The c-di-GMP binding protein YcgR controls flagellar motor direction and speed to affect chemotaxis by a “backstop brake” mechanism. Molecular Cell. 38 (1), 128-139 (2010).
- Qian, C., Wong, C. C., Swarup, S., Chiam, K. H. Bacterial tethering analysis reveals a “run-reverse-turn” mechanism for Pseudomonas species motility. Applied and Environmental Microbiology. 79 (15), 4734-4743 (2013).
- Manson, M. D., Tedesco, P. M., Berg, H. C. Energetics of flagellar rotation in bacteria. Journal of Molecular Biology. 138 (3), 541-561 (1980).
- Kuwajima, G. Construction of a minimum-size functional flagellin of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 170 (7), 3305-3309 (1988).
- Kuhn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369 (2018).
- Hranitzky, K. W., Mulholland, A., Larson, A. D., Eubanks, E. R., Hart, L. T. Characterization of a flagellar sheath protein of Vibrio cholerae. Infections and Immun. 27 (2), 597-603 (1980).
- Wang, Q., Frye, J. G., McClelland, M., Harshey, R. M. Gene expression patterns during swarming in Salmonella typhimurium: genes specific to surface growth and putative new motility and pathogenicity genes. Molecular Microbiology. 52 (1), 169-187 (2004).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Molecular Microbiology. 79 (1), 240-263 (2011).
- McCarter, L., Silverman, M. Surface-induced swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. Molecular Microbiology. 4 (7), 1057-1062 (1990).
- Pearson, M. M., Rasko, D. A., Smith, S. N., Mobley, H. L. Transcriptome of swarming Proteus mirabilis. Infections and Immunity. 78 (6), 2834-2845 (2010).
- Swiecicki, J. M., Sliusarenko, O., Weibel, D. B. From swimming to swarming: Escherichia coli cell motility in two-dimensions. Integrative Biology (Cambridge). 5 (12), 1490-1494 (2013).
- Colin, R., Drescher, K., Sourjik, V. Chemotactic behaviour of Escherichia coli at high cell density. Nature Communication. 10 (1), 5329 (2019).
- Partridge, J. D., Harshey, R. M. More than motility: Salmonella flagella contribute to overriding friction and facilitating colony hydration during swarming. Journal Bacteriology. 195 (5), 919-929 (2013).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal Visualized Experiment. (98), e52338 (2015).
- Chawla, R., Ford, K. M., Lele, P. P. Torque, but not FliL, regulates mechanosensitive flagellar motor-function. Science Reports. 7 (1), 5565 (2017).
