JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

نموذج ثقافة الخلية لإنتاج ارتفاع الأسهم فيروس التهاب الكبد Titer E

Published: June 26, 2020
doi:
10.3791/61373
, , ,
1Molecular and Medical Virology,Ruhr University Bochum

Summary

وصف هنا هو وسيلة فعالة على كيفية إنتاج ارتفاع الأسهم تتر الفيروسية من فيروس التهاب الكبد E (HEV) لتصيب خلايا الورم الكبدي بكفاءة. مع طريقة عرض، سواء غير مغلفة، وكذلك الجسيمات الفيروسية المغلفة يمكن حصادها واستخدامها في تلقيح خطوط الخلايا المختلفة.

Abstract

فيروس التهاب الكبد E هو السبب الرئيسي لتليف الكبد وفشل الكبد مع زيادة انتشاره في جميع أنحاء العالم. وينتقل فيروس الحمض النووي الريبي الوحيد في الغالب عن طريق نقل الدم، والظروف الصحية غير الملائمة، والمنتجات الغذائية الملوثة. حتى الآن من خارج التسمية دواء ريبافيرين (RBV) هو العلاج المفضل لكثير من المرضى. ومع ذلك، لا يزال هناك علاج محدد لمعالجات الـ HEV التي لا يزال يتعين تحديدها. حتى الآن، وقد أعاقت بشدة المعرفة حول دورة حياة HEV و pathogenesis بسبب عدم وجود نظام فعال لثقافة الخلايا HEV. نظام قوي لثقافة الخلية ضروري لدراسة دورة الحياة الفيروسية التي تشمل أيضا الإمراض الفيروسية. مع الأسلوب الموصوف هنا يمكن للمرء أن ينتج ال titers الفيروسية تصل إلى 3 × 106 وحدة التركيز تشكيل / مل (FFU / مل) من غير مغلفة HEV وما يصل إلى 5 × 104 FFU / مل من HEV مغلفة. باستخدام هذه الجسيمات، فمن الممكن أن تصيب مجموعة متنوعة من الخلايا من أصول متنوعة بما في ذلك الخلايا الأولية والإنسان، فضلا عن خطوط الخلايا الحيوانية. إنتاج الجسيمات HEV المعدية من البلازميدات يشكل مصدرا لا نهائي، مما يجعل هذا البروتوكول فعالة للغاية.

Introduction

التهاب الكبد E هو مرض أقل من الواقع إلى حد ما مع تزايد انتشاره في جميع أنحاء العالم. حوالي 20 مليون إصابة تؤدي إلى أكثر من 70،000 حالة وفاة سنويا1. تم إعادة تعيين العامل الكامن، فيروس التهاب الكبد E (HEV)، مؤخرًا، وهو الآن مصنف داخل Hepeviridae العائلية بما في ذلك فيروس جينيرا أورثوبي وفيروس بيستشيهيبي. يتم تصنيف HEV من أصول مختلفة ضمن الأنواع Orthohepevirus A-D بما في ذلك عزل عن البشر والخنازير والأرانب والجرذان والطيور والثدييات الأخرى2. في الوقت الحاضر، تم تحديد ثمانية أنواع جينية مختلفة (GT) من فيروس الحمض النووي الريبي الإيجابي الموجه، الذي تقطعت به السبل واحد2. وعلى الرغم من اختلافها في هوية تسلسلها وطرق نقلها وتوزيعها الجغرافي، إلا أن هيكلها الجيني يحافظ عليه بدرجة عالية. أكثر تحديدا، 7.2 كيلو بايت 10000 1000 1000 1000 1000 1000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 بينما ORF1 ترميز جميع الإنزيمات اللازمة للنسخ المتماثل الناجح داخل الخلية المضيفة، ORF2 ترميز البروتين capsid، والبروتين ORF3 تعمل كقناة أيون وظيفية مطلوبة للتجميع وإطلاق الجزيئات المعدية3. مرة واحدة أطلقت في التجويف القاعدية أو apical HEV موجود في كل من, شبه مظلومة والأنواع غير مغلفة / عارية اعتمادا على ما إذا كان الفيروس ينشأ من الدم أو البراز, على التوالي4,5.

في حين أن GT1 و GT2 توجدان بشكل رئيسي في البلدان النامية تصيب البشرفقط 6 عبر الطريق الفموي البرازي ، فإن GT3 و GT4 و GT7 تحدث بشكل رئيسي في البلدان المتقدمة1،7 مع مجموعة متنوعة من الأنواع التي تخدم كمكامن ، على سبيل المثال، الخنازير8، الجرذ9، الدجاج10،11، الغزلان12، النمس 13 ، الخفافيش14، الأرانب15،16، الخنزير البري17 والعديد من أكثر7،18،19، تقديم أدلة على zoonosis7،1320،21،22. بالإضافة إلى الظروف الصحية غير كافية23 والمنتجات الغذائية الملوثة12,24,25,26, انتقال عن طريق نقل الدم وزرع الأعضاء هو أيضا ممكن27,28. HEV هو سبب شائع لتليف الكبد وفشل الكبد29 خاصة في المرضى الذين يعانون من أمراض الكبد الموجودة من قبل ، والأفراد المناعيين (النمط الجيني 3 و 4 و 7) والنساء الحوامل (النمط الجيني 1). ملاحظة، وهناك أيضا مظاهر خارج الكبد مثل مرض الدم30،31،32، الاضطرابات العصبية33 والإصابات الكلوية34.

حتى الآن, خارج التسمية المخدرات ريبافيرين (RBV) هو العلاج المفضل بالنسبة للعديد من المرضى المصابين35,36. ومع ذلك، فقد تم الإبلاغ عن حالات فشل في العلاج وضعف النتائج السريرية على المدى الطويل. وقد تم ربط فشل العلاج إلى الطفرات الفيروسية وزيادة التجانس الفيروسي في المرضى المصابين بشكل مزمن37,38,39. على العكس من ذلك، لم تكن دراسة متعددة المراكز الأوروبية بأثر رجعي الأخيرة قادرة على ربط طفرات البوليميراز بفشل العلاج RBV40. في الملاحظات السريرية والتجارب في المختبر, إنترفيرون41,,42,,43, sofosbuvir44,45, أملاح الزنك46 و silvestrol47,,48 كما أظهرت آثار مضادة للفيروسات. ومع ذلك، لا يزال هناك علاج محدد لـ HEV لا يزال يتعين العثور عليه، ويعيقه نقص المعرفة حول دورة حياة HEV والعوامل المسببة للمرض. ولذلك، هناك حاجة ماسة إلى نظام قوي لثقافة الخلايا للدراسات الفيروسية وتطوير أدوية جديدة مضادة للفيروسات49.

لسوء الحظ، مثل فيروسات التهاب الكبد الأخرى، من الصعب نشر HEV في خطوط الخلايا التقليدية وعادة ما يتقدم ببطء شديد مما يؤدي إلى انخفاض الأحمال الفيروسية. ومع ذلك، كانت بعض المجموعات قادرة على زيادة الأحمال الفيروسية من خلال توليد من خلية خط subclones50 أو تعديل وسائل الاعلام ملاحق51. في الآونة الأخيرة جيل استنساخ cDNA52 والتكيف مع عزل المريض الابتدائي عن طريق passaging53،54 مزيد من تحسين انتشار HEV في خلية ثقافة55. في هذا البروتوكول، استخدمنا جينوم ثقافة الخلية تكييف Kernow-C1 سلالة (يشار إليها باسم p6_WT)54 وسلالة متحولة إيواء طفرة تعزيز النسخ المتماثل (يشار إليها باسم p6_G1634R)37. Kernow-C1 هو السلالة الأكثر استخداما في ثقافة الخلية HEV وقادرة على إنتاج الأحمال الفيروسية العالية. من خلال تقييم أعداد نسخ الحمض النووي الريبي الفيروسي ، يمكن رصد النسخ المتماثل HEV في المختبر. ومع ذلك، فإن هذه التقنيات لا تسمح بتقييم عدد الجسيمات المعدية التي يجري إنتاجها. لذلك، أنشأنا تلطيخ مناعيا لتحديد وحدات تشكيل التركيز (FFU / مل).

يمكن استخدام الطريقة56 الموصوفة هنا لإنتاج جزيئات فيروسية معدية كاملة الطول قادرة على إصابة مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا من أصول متنوعة بما في ذلك الخلايا الأولية وخطوط خلايا الثدييات. هذا هو شرط أساسي لفك الجوانب الهامة من العدوى HEV وtropism. ليست هناك حاجة لللقح مع عزل المريض عادة محدودة. إنتاج الجسيمات HEV المعدية من البلازميدات يشكل مصدرا لا حصر له، مما يجعل هذا البروتوكول فعالة بالمقارنة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا النظام لعلم الوراثة العكسية تمكين دراسة في تحوي تغير الجينوم المحدد وتأثيرها على تكرار HEV واللياقة البدنية. هذه التقنية تتغلب على العديد من القيود ، ويمكن أن المسار الطريق لتطوير المخدرات ، والدراسات المطفرة وتقييم التفاعلات استقبال الفيروس مثل العوامل المقيدة أو الدخول.

Protocol

ملاحظة: يتم تنفيذ كافة التجارب تحت شرط BSL-2. يجب أن تشطف جميع المواد التي تحصل على اتصال مع فيروس التهاب الكبد E RNA أو الفيروس المعدي بشكل صحيح مع 4٪ كوهرسولين FF من حاوية النفايات داخل غطاء محرك السيارة قبل التخلص منها. 1- إعداد بلاسميد تلقيح 200 مل LB المتوسطة التي تحتوي على 100…

Representative Results

في هذا البروتوكول ، ونحن وصف إنتاج عالية تيتر المعدية HEVcc. الخطوة الأولى هي عزل الحمض النووي plasmid (pBluescript_SK_HEVp654 و pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37، الشكل 8a) ، والتي هي بعد ذلك خطية عن طريق الهضم تقييد وتنقيت للنسخ في المختبر (الشكل 1). ويمكن التحقق من ا…

Discussion

بدءا من إعداد البلازميد، ينبغي أن تتجاوز غلة الحمض النووي 150 نانوغرام/ميكرولتر لتكون قادرة على إجراء خطية متعددة من نفس المخزون البلازميد، مما يقلل من خطر الطفرات الناجمة عن البكتيريا من تسلسلات الجينوم الحاسمة. وعلاوة على ذلك، من المهم للتحقق من خلاصة تقييد لplsmid الخطية كاملة بواسطة جل ele…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نحن ممتنون لسوزان ايمرسون لالتهاب الكبد E فيروس P6 استنساخ. تم توفير مصل الأرانب فرط المناعة الخاصة بHV بلطف من قبل راينر أولريش، معهد فريدريش لوفلر، ألمانيا. وعلاوة على ذلك، نشكر جميع أعضاء قسم علم الفيروسات الجزيئي والطبي في جامعة الرور بوخوم على دعمهم ومناقشتهم. تم إنشاء الأرقام 1-7 مع BioRender.com.

Materials

0.45 µm mesh Sarstedt 83.1826 Harvest extracellular Virus
4 % Histofix CarlRoth P087.4 Immunofluorescence
Acetic acid CarlRoth 6755.1 Collagen working solution
Amicon Ultra-15 Merck Millipore UFC910024 Virus harvesting
Ampicillin Sigma-Aldrich A1593 Selection of transformed bacteria
ATP Roche 11140965001 in vitro transcription and electroporation
BioRender BioRender Figure Generation
CaCl2 Roth 5239.2 Cytomix
Collagen R solution 0.4 % sterile Serva 47256.01 Collagen working solution
CTP Roche 11140922001 in vitro transcription
Cuvette Biorad 165-2088 Electroporation
DAPI Invitrogen D21490 Immunofluorescence
DMEM gibco 41965-039 Cell culture
DNAse Promega M6101 in vitro transcription
DTT Promega included in P2077 in vitro transcription
EGTA Roth 3054.3 Cytomix
Escherichia coli JM109 Promega L2005 Transformation
Fetal bovine serum gibco 10270106 Cell culture
Fluoromount SouthernBiotech 0100-01 Immunofluorescence
GenePulser Xcell Electroporation System BioRad 1652660 Electroporation
Gentamycin gibco 15710049 Cell culture
GTP Roche 11140957001 in vitro transcription
H2O Braun 184238001 Immunofluorescence
Hepes Invitrogen 15630-03 Cytomix
Horse serum gibco 16050122 Immunofluorescence
K2HPO4 Roth P749.1 Cytomix
KCL Roth 6781.3 Cytomix
KH2PO4 Roth 3904.2 Cytomix
L-Glutamin gibco 25030081 Cell culture
L-Glutathione reduced Sigma-Aldrich G4251-5G Cytomix
MEM gibco 31095-029 Cell culture
MEM NEAA (100×) gibco 11140-035 Cell culture
MgCl2 Roth 2189.2 Cytomix
Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One Thermo Fisher ND-ONE-W DNA/RNA concentration
MluI enzyme NEB R0198L Linearization
NEB buffer NEB included in R0198L Linearization
NucleoSpin Plasmid kit Macherey & Nagel 740588.250 Plasmid preparation
NucleoSpin RNA Clean-up Kit Macherey & Nagel 740948.250 RNA purification
PBS gibco 70011051 Cell culture
Pen/Strep Thermo Fisher 15140122 Cell culture
Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R) Todt et.al Virus production
Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT) Shukla et al. GenBank accession no. JQ679013 Virus production
Primary antibody 1E6 LS-Bio C67675 Immunofluorescence
Primary antibody 8282 Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 DNA extraction
Ribo m7G Cap Analog Promega P1711 in vitro transcription
RNase away CarlRoth A998.3 RNA purification
RNasin (RNase inhibitor) Promega N2515 in vitro transcription
Secondary antibody donkey anti-mouse 488 Thermo Fisher A-21202 Immunofluorescence
Secondary antibody goat anti-rabbit 488 Thermo Fisher A-11008 Immunofluorescence
Sodium Pyruvat gibco 11360070 Cell culture
T7 RNA polymerase Promega P2077 in vitro transcription
Transcription Buffer Promega included in P2077 in vitro transcription
Triton X-100 CarlRoth 3051.3 Immunofluorescence
Trypsin-EDTA (0.5 %) gibco 15400054 Cell culture
ultra-low IgG gibco 1921005PJ Cell culture
UTP Roche 11140949001 in vitro transcription
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wedemeyer, H., Pischke, S., Manns, M. P. Pathogenesis and treatment of hepatitis e virus infection. Gastroenterology. 142 (6), 1388-1397 (2012).
  2. Smith, D. B., et al. Proposed reference sequences for hepatitis E virus subtypes. The Journal of General Virology. 97 (3), 537-542 (2016).
  3. Ding, Q., et al. Hepatitis E virus ORF3 is a functional ion channel required for release of infectious particles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (5), 1147-1152 (2017).
  4. Chapuy-Regaud, S., et al. Characterization of the lipid envelope of exosome encapsulated HEV particles protected from the immune response. Biochimie. 141, 70-79 (2017).
  5. Yin, X., Ambardekar, C., Lu, Y., Feng, Z. Distinct Entry Mechanisms for Nonenveloped and Quasi-Enveloped Hepatitis E Viruses. Journal of Virology. 90 (8), 4232-4242 (2016).
  6. Khuroo, M. S., Khuroo, M. S., Khuroo, N. S. Hepatitis E: Discovery, global impact, control and cure. World Journal of Gastroenterology. 22 (31), 7030-7045 (2016).
  7. Rasche, A., et al. Hepatitis E Virus Infection in Dromedaries, North and East Africa, United Arab Emirates, and Pakistan, 1983-2015. Emerging Infectious Diseases. 22 (7), 1249-1252 (2016).
  8. Hsieh, S. Y., et al. Identity of a novel swine hepatitis E virus in Taiwan forming a monophyletic group with Taiwan isolates of human hepatitis E virus. Journal of Clinical Microbiology. 37 (12), 3828-3834 (1999).
  9. Johne, R., et al. Detection of a novel hepatitis E-like virus in faeces of wild rats using a nested broad-spectrum RT-PCR. The Journal of General Virology. 91, 750-758 (2010).
  10. Payne, C. J., Ellis, T. M., Plant, S. L., Gregory, A. R., Wilcox, G. E. Sequence data suggests big liver and spleen disease virus (BLSV) is genetically related to hepatitis E virus. Veterinary Microbiology. 68 (1-2), 119-125 (1999).
  11. Haqshenas, G., Shivaprasad, H. L., Woolcock, P. R., Read, D. H., Meng, X. -. J. Genetic identification and characterization of a novel virus related to human hepatitis E virus from chickens with hepatitis–splenomegaly syndrome in the United States. Journal of General Virology. 82, 2449-2462 (2001).
  12. Tei, S., Kitajima, N., Takahashi, K., Mishiro, S. Zoonotic transmission of hepatitis E virus from deer to human beings. The Lancet. 362 (9381), 371-373 (2003).
  13. Nakamura, M., et al. Hepatitis E virus infection in wild mongooses of Okinawa, Japan: Demonstration of anti-HEV antibodies and a full-genome nucleotide sequence. Hepatology Research: the Official Journal of the Japan Society of Hepatology. 34 (3), 137-140 (2006).
  14. Drexler, J. F., et al. Bats worldwide carry hepatitis E virus-related viruses that form a putative novel genus within the family Hepeviridae. Journal of Virology. 86 (17), 9134-9147 (2012).
  15. Zhao, C., et al. A novel genotype of hepatitis E virus prevalent among farmed rabbits in China. Journal of Medical Virology. 81 (8), 1371-1379 (2009).
  16. Lhomme, S., et al. Risk of zoonotic transmission of HEV from rabbits. Journal of Clinical Virology: the Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 58 (2), 357-362 (2013).
  17. Kaci, S., Nöckler, K., Johne, R. Detection of hepatitis E virus in archived German wild boar serum samples. Veterinary Microbiology. 128 (3-4), 380-385 (2008).
  18. Liu, B., et al. Avian hepatitis E virus infection of duck, goose, and rabbit in northwest China. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 76 (2018).
  19. Raj, V. S., et al. Novel hepatitis E virus in ferrets, the Netherlands. Emerging Infectious Diseases. 18 (8), 1369-1370 (2012).
  20. Dong, C., et al. Restricted enzooticity of hepatitis E virus genotypes 1 to 4 in the United States. Journal of Clinical Microbiology. 49 (12), 4164-4172 (2011).
  21. Goens, S. D., Perdue, M. L. Hepatitis E viruses in humans and animals. Animal Health Research Reviews. 5 (2), 145-156 (2004).
  22. Geng, Y., Wang, Y. Transmission of Hepatitis E Virus. Advances in Experimental Medicine and Biology. 948, 89-112 (2016).
  23. Naik, S. R., Aggarwal, R., Salunke, P. N., Mehrotra, N. N. A large waterborne viral hepatitis E epidemic in Kanpur, India. Bulletin of the World Health Organization. 70 (5), 597-604 (1992).
  24. Feagins, A. R., Opriessnig, T., Guenette, D. K., Halbur, P. G., Meng, X. -. J. Detection and characterization of infectious Hepatitis E virus from commercial pig livers sold in local grocery stores in the USA. The Journal of General Virology. 88, 912-917 (2007).
  25. Colson, P., et al. Pig liver sausage as a source of hepatitis E virus transmission to humans. The Journal of Infectious Diseases. 202 (6), 825-834 (2010).
  26. Wenzel, J. J., et al. Detection of hepatitis E virus (HEV) from porcine livers in Southeastern Germany and high sequence homology to human HEV isolates. Journal of Clinical Virology: the Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 52 (1), 50-54 (2011).
  27. Colson, P., et al. Transfusion-associated Hepatitis E, France. Emerging Infectious Diseases. 13 (4), 648-649 (2007).
  28. Kamp, C., et al. Impact of hepatitis E virus testing on the safety of blood components in Germany – results of a simulation study. Vox Sanguinis. , (2018).
  29. Kamar, N., Dalton, H. R., Abravanel, F., Izopet, J. Hepatitis E virus infection. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 116-138 (2014).
  30. Pischke, S., Behrendt, P., Manns, M. P., Wedemeyer, H. HEV-associated cryoglobulinaemia and extrahepatic manifestations of hepatitis E. The Lancet Infectious Diseases. 14 (8), 678-679 (2014).
  31. Colson, P., et al. Severe thrombocytopenia associated with acute hepatitis E virus infection. Journal of Clinical Microbiology. 46 (7), 2450-2452 (2008).
  32. Mishra, P., Mahapatra, M., Kumar, R., Pati, H. P. Autoimmune hemolytic anemia and erythroid hypoplasia associated with hepatitis E. Indian Journal of Gastroenterology: Official Journal of the Indian Society of Gastroenterology. 26 (4), 195-196 (2007).
  33. Sood, A., Midha, V., Sood, N. Guillain-Barré syndrome with acute hepatitis E. The American Journal of Gastroenterology. 95 (12), 3667-3668 (2000).
  34. Fousekis, F. S., Mitselos, I. V., Christodoulou, D. K. Extrahepatic manifestations of hepatitis E virus: An overview. Clinical and Molecular Hepatology. 26 (1), 16-23 (2020).
  35. Pischke, S., et al. Ribavirin treatment of acute and chronic hepatitis E: A single-centre experience. Liver International: Official Journal of the International Association for the Study of the Liver. 33 (5), 722 (2013).
  36. Kamar, N., et al. Ribavirin for Chronic Hepatitis E Virus Infection in Transplant Recipients. The New England Journal of Medicine. 370, 1111-1120 (2014).
  37. Todt, D., et al. In vivo evidence for ribavirin-induced mutagenesis of the hepatitis E virus genome. Gut. 65, 1733-1743 (2016).
  38. Todt, D., Walter, S., Brown, R. J. P., Steinmann, E. Mutagenic Effects of Ribavirin on Hepatitis E Virus-Viral Extinction versus Selection of Fitness-Enhancing Mutations. Viruses. 8 (10), 8100283 (2016).
  39. Todt, D., Meister, T. L., Steinmann, E. Hepatitis E virus treatment and ribavirin therapy: Viral mechanisms of nonresponse. Current Opinion in Virology. 32, 80-87 (2018).
  40. Kamar, N., et al. Ribavirin for Hepatitis E Virus Infection After Organ Transplantation: A Large European Retrospective Multicenter Study. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. , (2019).
  41. Kamar, N., et al. Influence of immunosuppressive therapy on the natural history of genotype 3 hepatitis-E virus infection after organ transplantation. Transplantation. 89 (3), 353-360 (2010).
  42. Kamar, N., et al. Pegylated interferon-alpha for treating chronic hepatitis E virus infection after liver transplantation. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 50 (5), 30-33 (2010).
  43. Todt, D., et al. Antiviral Activities of Different Interferon Types and Subtypes against Hepatitis E Virus Replication. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (4), 2132-2139 (2016).
  44. Dao Thi, V. L., et al. Sofosbuvir Inhibits Hepatitis E Virus Replication In Vitro and Results in an Additive Effect When Combined with Ribavirin. Gastroenterology. 150 (1), 82-85 (2016).
  45. van der Valk, M., Zaaijer, H. L., Kater, A. P., Schinkel, J. Sofosbuvir shows antiviral activity in a patient with chronic hepatitis E virus infection. Journal of Hepatology. 66 (1), 242-243 (2017).
  46. Kaushik, N., et al. Zinc Salts Block Hepatitis E Virus Replication by Inhibiting the Activity of Viral RNA-Dependent RNA Polymerase. Journal of Virology. 91 (21), (2017).
  47. Todt, D., et al. The natural compound silvestrol inhibits hepatitis E virus (HEV) replication in vitro and in vivo. Antiviral Research. 157, 151-158 (2018).
  48. Glitscher, M., et al. Inhibition of Hepatitis E Virus Spread by the Natural Compound Silvestrol. Viruses. 10 (6), 301 (2018).
  49. Kinast, V., Burkard, T. L., Todt, D., Steinmann, E. Hepatitis E Virus Drug Development. Viruses. 11 (6), 485 (2019).
  50. Schemmerer, M., et al. Enhanced Replication of Hepatitis E Virus Strain 47832c in an A549-Derived Subclonal Cell Line. Viruses. 8 (10), 267 (2016).
  51. Huang, R., et al. Cell Culture of Sporadic Hepatitis E Virus in China. Clinical and Vaccine Immunology. 6 (5), 729-733 (1999).
  52. Emerson, S. U., et al. Recombinant hepatitis E virus genomes infectious for primates: Importance of capping and discovery of a cis-reactive element. PNAS. 98 (26), 15270-15275 (2001).
  53. Shukla, P., et al. Cross-species infections of cultured cells by hepatitis E virus and discovery of an infectious virus-host recombinant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2438-2443 (2011).
  54. Shukla, P., et al. Adaptation of a genotype 3 hepatitis E virus to efficient growth in cell culture depends on an inserted human gene segment acquired by recombination. Journal of Virology. 86 (10), 5697-5707 (2012).
  55. Meister, T. L., Bruening, J., Todt, D., Steinmann, E. Cell culture systems for the study of hepatitis E virus. Antiviral Research. 163, 34-49 (2019).
  56. Todt, D., et al. Robust hepatitis E virus infection and transcriptional response in human hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2020).
  57. Ankavay, M., et al. New insights into the ORF2 capsid protein, a key player of the hepatitis E virus lifecycle. Scientific Reports. 9 (1), 6243 (2019).
  58. Schemmerer, M., Johne, R., Erl, M., Jilg, W., Wenzel, J. J. Isolation of Subtype 3c, 3e and 3f-Like Hepatitis E Virus Strains Stably Replicating to High Viral Loads in an Optimized Cell Culture System. Viruses. 11 (6), 483 (2019).

Tags

Cell CultureHepatitis E VirusHigh Titer VirusVirus ProductionIn Vitro TranscriptionDNA LinearizationRNA IntegrityLiver Cancer CellsCell Culture TechniquesBSL-2 Facility

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Meister, T. L., Klöhn, M., Steinmann, E., Todt, D. A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks. J. Vis. Exp. (160), e61373, doi:10.3791/61373 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image