Модель клеточной культуры для производства высокой тетер гепатита E Вирус Запасы

Summary

Описанный здесь является эффективным методом о том, как производить высокие вирусные титр запасов вируса гепатита Е (HEV), чтобы эффективно заразить клетки гепатомы. С представленным методом, как неохотные, так и окутанные вирусные частицы могут быть собраны и использованы для прививки различных клеточных линий.

Abstract

Вирус гепатита Е является основной причиной цирроза печени и печеночной недостаточности с ростом распространенности во всем мире. Одноцепочечный РНК-вирус в основном передается при переливании крови, неадекватных санитарных условиях и загрязненных пищевых продуктах. На сегодняшний день не по этикетке препарат рибавирин (RBV) является лечение выбора для многих пациентов. Тем не менее, конкретные лечения HEV еще предстоит определить. До сих пор знания о жизненном цикле HEV и патогенеза были серьезно затруднены из-за отсутствия эффективной системы культуры Клеток HEV. Надежная система клеточной культуры имеет важное значение для изучения вирусного жизненного цикла, который также включает вирусный патогенез. С методом описанным здесь одно может произвести вирусные titers up to 3 x 10⁶ блока фокусим формирования/mL (FFU/mL) non-enveloped HEV и up to 5 x 10⁴ FFU/mL окутанного HEV. Используя эти частицы, можно заразить различные клетки различного происхождения, включая первичные клетки и человека, а также линии клеток животных. Производство инфекционных частиц HEV из плазмидов представляет собой бесконечный источник, что делает этот протокол чрезвычайно эффективным.

Introduction

Гепатит Е является довольно недооцененным заболеванием с ростом распространенности во всем мире. Около 20 миллионов случаев инфицирования приводят к более чем 70 000 случаев смерти в год^1. Основной агент, вирус гепатита Е (HEV), был недавно переназначен и в настоящее время классифицируется в семье Hepeviridae в том числе рода ортохерепвирус и Piscihepevirus. HEV различного происхождения классифицируются в пределах видов Orthohepevirus A-D в том числе изоляты от людей, свиней, кроликов, крыс, птиц и других млекопитающих². В настоящее время выявлено восемь различных генотипов (GT) положительно-ориентированного одноцепоченого РНК-вируса². Хотя они отличаются по последовательности идентичности, маршрутов передачи и географического распределения, их геномная структура очень сохраняется. Более конкретный, геном 7.2 kbp HEV делится на 3 основных открытых считывания кадров (ORF1-3). В то время как ORF1 кодирует все ферменты, необходимые для успешной репликации в клетке-хозяине, ORF2 кодирует капсидный белок, а белок ORF3 работает как функциональный ионный канал, необходимый для сборки и высвобождения инфекционных частиц^3. После выпуска в базальных или апических просвета HEV существует в обоих, quasienveloped и не-окутанных / голых видов в зависимости от того, вирус происходит от крови или кала, соответственно^4,5.

В то время как GT1 и GT2 в основном встречаются в развивающихся странах, заражая людей⁶ только по фекально-устному маршруту, GT3, GT4 и GT7 преимущественно встречаются в развитых странах^1,7 с различными видами, служащими в качестве резервуаров, например, свиньи⁸, крыса⁹, курица^10,11, олени¹², мангуста¹³, летучая мышь¹⁴, кролик^15,16, дикий кабан¹⁷ и многое другое^7,18,19, предоставляя доказательства зооноза^7,20,21,22. Помимо неадекватных санитарных условий²³ и загрязненных пищевых продуктов^{12,,24,25,,26}, передача через переливание крови и трансплантации органов также возможно^27,28.^, HEV является распространенной причиной цирроза печени и печеночной недостаточности²⁹ особенно у пациентов с уже существующими заболеваниями печени, иммунокомпромиссных лиц (генотип 3, 4 и 7) и беременных женщин (генотип 1). Следует отметить, Есть также экстра-епатические проявления, такие как гематопоэтическое заболевание^30,31,32, неврологические расстройства³³ и почечной травмы³⁴.

На сегодняшний день, вне этикетки препарат рибавирин (RBV) является лечение выбора для многих инфицированных пациентов^35,36. Тем не менее, случаи отказа лечения и плохих клинических долгосрочных исходов были зарегистрированы. Неудача лечения была связана с вирусным мутагенезом и повышенной вирусной неоднородностью у хронически инфицированных пациентов^37,,38,,39. Напротив, недавнее европейское ретроспективное многоцентровое исследование не смогло соотнести мутации полимеразы с неудачей лечения^{РБВ 40.} В клинических наблюдениях и экспериментах в пробирке интерферон^41,,42,,43,софосбувир^44,,45,соли цинка⁴⁶ и силвестрол^47,48 также показали противовирусные эффекты. Тем не менее, конкретные лечения HEV еще предстоит найти, препятствует отсутствие знаний о жизненном цикле HEV и его патогенеза. Таким образом, надежная система клеточной культуры для вирусологических исследований и разработки новых противовирусных препаратов срочно необходимо⁴⁹.

К сожалению, как и другие вирусы гепатита, HEV трудно размножаться в обычных клеточных линий и обычно прогрессирует очень медленно, что приводит к низкой вирусной нагрузки. Тем не менее, некоторые группы смогли повысить вирусные нагрузки путем генерации подклонов клеточной линии⁵⁰ или корректировки медиа-добавок^51. Недавно генерация клонов кДНА⁵² и адаптация первичных изолятов пациента путем прохождения^53,54 дальнейшего улучшения распространения HEV в клеточной культуре⁵⁵. В этом протоколе мы использовали геном клеточной культуры, адаптированной штаммом Kernow-C1 (именуемым p6_WT)^54, и штаммом мутанта, укрывающим мутацию, повышающую репликацию (называемую p6_G1634R)^37. Kernow-C1 является наиболее часто используемым штаммом в культуре HEV клеток и способен производить высокие вирусные нагрузки. Оценивая вирусные номера копий РНК, репликация HEV может контролироваться in vitro. Тем не менее эти методы не позволяют оценить количество производимых инфекционных частиц. Таким образом, мы установили иммунофлуоресценции окрашивания для определения фокус формирования единиц (FFU/mL).

Описанный здесь метод⁵⁶ может быть использован для производства полнометражных инфекционных вирусных частиц, способных инфицировать различные типы клеток различного происхождения, включая первичные клетки и клеточные линии млекопитающих. Это является фундаментальным условием для расшифровки важных аспектов инфекции HEV и тропизма. Нет необходимости в прививке с обычно ограниченными изолятами пациента. Производство инфекционных частиц HEV из плазмидов представляет собой бесконечный источник, что делает этот протокол сравнительно эффективным. Кроме того, эта система может быть использована для обратной генетики, позволяющей изучать изменение генома in vivo и их влияние на репликацию и пригодность HEV. Этот метод преодолевает многие ограничения и, может путь путь для разработки лекарств, mutagenesis исследований и оценки вирус-хозяин взаимодействий, таких как ограничения или факторы входа.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты выполняются в состоянии BSL-2. Все материалы, которые соприкасаются с вирусом гепатита Е РНК или инфекционным вирусом, должны быть промыты должным образом с 4% Kohrsolin FF из контейнера для отходов внутри капота до удаления. 1. Плазмидная подготовка …

Representative Results

В этом протоколе мы описываем производство высокотер инфекционных HEVcc. Первый шаг заключается в том, чтобы изолировать плазмид ДНК (pBluescript_SK_HEVp654 и pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Рисунок 8a), который затем линейный ограничения пищеварения и очищены для in vitro тра…

Discussion

Начиная с плазмидной подготовки, урожайность ДНК должна превышать 150 нг/МЛ, чтобы иметь возможность выполнять несколько линейных данных из одного и того же плазмидного запаса, что сводит к минимуму риск индуцированного бактериями мутагенеза важнейших последовательностей генома. Кром?…

Materials

0.45 µm mesh	Sarstedt	83.1826	Harvest extracellular Virus
4 % Histofix	CarlRoth	P087.4	Immunofluorescence
Acetic acid	CarlRoth	6755.1	Collagen working solution
Amicon Ultra-15	Merck Millipore	UFC910024	Virus harvesting
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A1593	Selection of transformed bacteria
ATP	Roche	11140965001	in vitro transcription and electroporation
BioRender	BioRender		Figure Generation
CaCl2	Roth	5239.2	Cytomix
Collagen R solution 0.4 % sterile	Serva	47256.01	Collagen working solution
CTP	Roche	11140922001	in vitro transcription
Cuvette	Biorad	165-2088	Electroporation
DAPI	Invitrogen	D21490	Immunofluorescence
DMEM	gibco	41965-039	Cell culture
DNAse	Promega	M6101	in vitro transcription
DTT	Promega	included in P2077	in vitro transcription
EGTA	Roth	3054.3	Cytomix
Escherichia coli JM109	Promega	L2005	Transformation
Fetal bovine serum	gibco	10270106	Cell culture
Fluoromount	SouthernBiotech	0100-01	Immunofluorescence
GenePulser Xcell Electroporation System	BioRad	1652660	Electroporation
Gentamycin	gibco	15710049	Cell culture
GTP	Roche	11140957001	in vitro transcription
H2O	Braun	184238001	Immunofluorescence
Hepes	Invitrogen	15630-03	Cytomix
Horse serum	gibco	16050122	Immunofluorescence
K2HPO4	Roth	P749.1	Cytomix
KCL	Roth	6781.3	Cytomix
KH2PO4	Roth	3904.2	Cytomix
L-Glutamin	gibco	25030081	Cell culture
L-Glutathione reduced	Sigma-Aldrich	G4251-5G	Cytomix
MEM	gibco	31095-029	Cell culture
MEM NEAA (100×)	gibco	11140-035	Cell culture
MgCl2	Roth	2189.2	Cytomix
Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One	Thermo Fisher	ND-ONE-W	DNA/RNA concentration
MluI enzyme	NEB	R0198L	Linearization
NEB buffer	NEB	included in R0198L	Linearization
NucleoSpin Plasmid kit	Macherey & Nagel	740588.250	Plasmid preparation
NucleoSpin RNA Clean-up Kit	Macherey & Nagel	740948.250	RNA purification
PBS	gibco	70011051	Cell culture
Pen/Strep	Thermo Fisher	15140122	Cell culture
Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R)	Todt et.al		Virus production
Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT)	Shukla et al.	GenBank accession no. JQ679013	Virus production
Primary antibody 1E6	LS-Bio	C67675	Immunofluorescence
Primary antibody 8282			Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106	DNA extraction
Ribo m7G Cap Analog	Promega	P1711	in vitro transcription
RNase away	CarlRoth	A998.3	RNA purification
RNasin (RNase inhibitor)	Promega	N2515	in vitro transcription
Secondary antibody donkey anti-mouse 488	Thermo Fisher	A-21202	Immunofluorescence
Secondary antibody goat anti-rabbit 488	Thermo Fisher	A-11008	Immunofluorescence
Sodium Pyruvat	gibco	11360070	Cell culture
T7 RNA polymerase	Promega	P2077	in vitro transcription
Transcription Buffer	Promega	included in P2077	in vitro transcription
Triton X-100	CarlRoth	3051.3	Immunofluorescence
Trypsin-EDTA (0.5 %)	gibco	15400054	Cell culture
ultra-low IgG	gibco	1921005PJ	Cell culture
UTP	Roche	11140949001	in vitro transcription