Un modelo de cultivo celular para producir acciones de virus de la hepatitis E de alto título

Summary

Aquí se describe un método eficaz sobre cómo producir altas existencias de título virales del virus de la hepatitis E (HEV) para infectar eficientemente las células del hepatoma. Con el método presentado, tanto las partículas virales no envueltas, como las envueltas, pueden ser cosechadas y utilizadas para inocular varias líneas celulares.

Abstract

El virus de la hepatitis E es la principal causa de cirrosis hepática e insuficiencia hepática con una prevalencia creciente en todo el mundo. El virus del ARN de una sola cadena se transmite predominantemente por transfusiones de sangre, condiciones sanitarias inadecuadas y productos alimenticios contaminados. Hasta la fecha, el medicamento fuera de etiqueta ribavirina (RBV) es el tratamiento de elección para muchos pacientes. No obstante, queda por identificar un tratamiento específico para el HEV. Hasta ahora, el conocimiento sobre el ciclo de vida del HEV y la patogénesis se ha visto gravemente obstaculizado debido a la falta de un sistema eficiente de cultivo celular HEV. Un sistema de cultivo celular robusto es esencial para el estudio del ciclo de vida viral que también incluye la patogénesis viral. Con el método descrito aquí se pueden producir títulos virales de hasta 3 x 10⁶ unidad de formación de enfoque/ ml (FFU/ml) de HEV no envolvente y hasta 5 x 10⁴ FFU/ml de HEV envuelto. Usando estas partículas, es posible infectar una variedad de células de diversos orígenes incluyendo células primarias y humanas, así como líneas celulares animales. La producción de partículas HEV infecciosas a partir de plásmidos plantea una fuente infinita, lo que hace que este protocolo sea extremadamente eficiente.

Introduction

La hepatitis E es una enfermedad bastante subestimada con una prevalencia cada vez mayor en todo el mundo. Alrededor de 20 millones de infecciones provocan más de 70.000 muertes al año¹. El agente subyacente, el virus de la hepatitis E (HEV), fue reasignado recientemente y ahora se clasifica dentro de la familia Hepeviridae incluyendo los géneros Orthohepevirus y Piscihepevirus. HEV de diversos orígenes se clasifican dentro de la especie Orthohepevirus A-D incluyendo aislados de humanos, cerdos, conejos, ratas, aves y otros mamíferos². En la actualidad, se han identificado ocho genotipos diferentes (GT) del virus de ARN de una sola cadena de orientación positiva². Aunque difieren en su identidad de secuencia, rutas de transmisión y distribución geográfica, su estructura genómica es altamente conservada. Más específico, el genoma HEV de 7,2 kbp se divide en 3 marcos de lectura abiertos principales (ORF1-3). Mientras ORF1 codifica todas las enzimas necesarias para una replicación exitosa dentro de la célula huésped, ORF2 codifica la proteína capsid, y la proteína ORF3 funciona como un canal iónico funcional necesario para el montaje y liberación de partículas infecciosas^3. Una vez liberado en el lumen basal o apical HEV existe en ambas especies, casi biseladas y no envueltas/desnudas dependiendo de si el virus se origina en sangre o heces, respectivamente^4,5.

Mientras que GT1 y GT2 se encuentran principalmente en los países en desarrollo que infectan únicamente a los seres humanos⁶ a través de la vía fecal-oral, GT3, GT4 y GT7 se producen predominantemente en los países desarrollados^1,,7 con una variedad de especies que sirven como reservorios, por ejemplo, cerdo⁸, rata⁹, pollo^10,11, ciervo¹², mangosta¹³, murciélago¹⁴, conejo^15,16, jabalí¹⁷ y muchos más^7,18,19, proporcionando evidencia de zoonosis^7,20,21,22. Además de las condiciones sanitarias inadecuadas²³ y los productos alimenticios contaminados^12,24,25,26, la transmisión a través de transfusión de sangre y trasplantes de órganos también es posible^27,28. El HEV es una causa frecuente de cirrosis hepática e insuficiencia hepática^29, especialmente en pacientes con enfermedad hepática preexistente, individuos inmunocomprometidos (genotipo 3, 4 y 7) y mujeres embarazadas (genotipo 1). Cabe destacar que también hay manifestaciones extrahepáticas como la enfermedad hematopoyética^30,31,32, trastornos neurológicos³³ y lesión renal³⁴.

Hasta la fecha, el medicamento fuera de etiqueta ribavirina (RBV) es el tratamiento de elección para muchos pacientes infectados^35,36. Sin embargo, se han notificado casos de insuficiencia del tratamiento y malos resultados clínicos a largo plazo. La insuficiencia del tratamiento se ha relacionado con la mutagénesis viral y el aumento de la heterogeneidad viral en pacientes infectados crónicamente^37,38,39. Por el contrario, un reciente estudio multicéntrico retrospectivo europeo no fue capaz de correlacionar las mutaciones de la polimerasa con la falla del tratamiento con RBV⁴⁰. En observaciones clínicas y experimentos in vitro, el interferón^41,42,43, sofosbuvir^44,45, sales de zinc⁴⁶ y silvestrol^47,48 también han mostrado efectos antivirales. No obstante, queda por encontrar un tratamiento específico para el HEV, obstaculizado por la falta de conocimiento sobre el ciclo de vida del HEV y su patogénesis. Por lo tanto, se necesita urgentemente un sistema de cultivo celular robusto para estudios virológicos y el desarrollo de nuevos medicamentos antivirales⁴⁹.

Desafortunadamente, al igual que otros virus de la hepatitis, el HEV es difícil de propagar en las líneas celulares convencionales y por lo general progresa muy lentamente, lo que conduce a bajas cargas virales. Sin embargo, algunos grupos fueron capaces de aumentar las cargas virales mediante la generación de subclones de línea celular⁵⁰ o el ajuste de los suplementos de medios⁵¹. Recientemente la generación de clones de ADNc⁵² y la adaptación de aislados primarios de pacientes mediante la transmisión^{de 53,,54} mejoraron aún más la propagación del HEV en el cultivo celular⁵⁵. En este protocolo, utilizamos el genoma de un cultivo celular adaptado a la cepa Kernow-C1 (denominada p6_WT)⁵⁴ y una cepa mutante que alberga una mutación que mejora la replicación (denominada p6_G1634R)³⁷. Kernow-C1 es la cepa más utilizada en el cultivo celular HEV y es capaz de producir altas cargas virales. Mediante la evaluación de los números de copia de ARN viral, la replicación de HEV se puede monitorear in vitro. Sin embargo, estas técnicas no permiten evaluar el número de partículas infecciosas que se producen. Por lo tanto, hemos establecido una tinción de inmunofluorescencia para determinar las unidades formadoras de enfoque (FFU/ml).

El método⁵⁶ descrito aquí se puede utilizar para producir partículas virales infecciosas de longitud completa que son capaces de infectar una variedad de tipos de células de diversos orígenes, incluyendo células primarias y líneas celulares de mamíferos. Este es un requisito previo fundamental para descifrar aspectos importantes de la infección por HEV y el tropismo. No hay necesidad de inoculación con aislados de pacientes generalmente limitados. La producción de partículas HEV infecciosas a partir de plásmidos plantea una fuente infinita, lo que hace que este protocolo sea comparativamente eficiente. Además, este sistema se puede utilizar para la genética inversa que permite el estudio de la alteración del genoma identificado in vivo y su impacto en la replicación y la aptitud del HEV. Esta técnica supera muchas limitaciones y, puede buscar el camino para el desarrollo de fármacos, estudios de mutagénesis y la evaluación de interacciones virus-huésped como restricciones o factores de entrada.

Protocol

NOTA: Todos los experimentos se realizan bajo la condición BSL-2. Todos los materiales que entren en contacto con el ARN del virus de la Hepatitis E o el virus infeccioso deben enjuagarse correctamente con un 4% de Kohrsolin FF desde un contenedor de residuos dentro de la campana antes de su eliminación. 1. Preparación de Plásmido Inocular 200 ml de medio LB que contiene 100 g/ml de ampicilina con Escherichia coli JM109 transformada incorporando una codificación de plá…

Representative Results

En este protocolo, describimos la producción de HEVcc infeccioso de alto título. El primer paso es aislar el ADN plásmido (pBluescript_SK_HEVp654 y pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Figura 8a), que luego se linealiza mediante la digestión de restricción y se purifica para la transcripción in vitro (Figura 1). Una linealización exitosa se puede verificar comparando el plásmido-ADN no digerido con el plásmido-A…

Discussion

A partir de la preparación del plásmido, los rendimientos del ADN deben superar los 150 ng/L para poder realizar una linealización múltiple desde el mismo stock de plásmido, lo que minimiza el riesgo de mutagénesis inducida por bacterias de secuencias genomas cruciales. Además, es importante comprobar el resumen de restricción para la linealización completa del plásmido por electroforesis de gel(Figura 8b). La falta de ADN plásmido linealizado induciría la amplificación del cír…

Materials

0.45 µm mesh	Sarstedt	83.1826	Harvest extracellular Virus
4 % Histofix	CarlRoth	P087.4	Immunofluorescence
Acetic acid	CarlRoth	6755.1	Collagen working solution
Amicon Ultra-15	Merck Millipore	UFC910024	Virus harvesting
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A1593	Selection of transformed bacteria
ATP	Roche	11140965001	in vitro transcription and electroporation
BioRender	BioRender		Figure Generation
CaCl2	Roth	5239.2	Cytomix
Collagen R solution 0.4 % sterile	Serva	47256.01	Collagen working solution
CTP	Roche	11140922001	in vitro transcription
Cuvette	Biorad	165-2088	Electroporation
DAPI	Invitrogen	D21490	Immunofluorescence
DMEM	gibco	41965-039	Cell culture
DNAse	Promega	M6101	in vitro transcription
DTT	Promega	included in P2077	in vitro transcription
EGTA	Roth	3054.3	Cytomix
Escherichia coli JM109	Promega	L2005	Transformation
Fetal bovine serum	gibco	10270106	Cell culture
Fluoromount	SouthernBiotech	0100-01	Immunofluorescence
GenePulser Xcell Electroporation System	BioRad	1652660	Electroporation
Gentamycin	gibco	15710049	Cell culture
GTP	Roche	11140957001	in vitro transcription
H2O	Braun	184238001	Immunofluorescence
Hepes	Invitrogen	15630-03	Cytomix
Horse serum	gibco	16050122	Immunofluorescence
K2HPO4	Roth	P749.1	Cytomix
KCL	Roth	6781.3	Cytomix
KH2PO4	Roth	3904.2	Cytomix
L-Glutamin	gibco	25030081	Cell culture
L-Glutathione reduced	Sigma-Aldrich	G4251-5G	Cytomix
MEM	gibco	31095-029	Cell culture
MEM NEAA (100×)	gibco	11140-035	Cell culture
MgCl2	Roth	2189.2	Cytomix
Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One	Thermo Fisher	ND-ONE-W	DNA/RNA concentration
MluI enzyme	NEB	R0198L	Linearization
NEB buffer	NEB	included in R0198L	Linearization
NucleoSpin Plasmid kit	Macherey & Nagel	740588.250	Plasmid preparation
NucleoSpin RNA Clean-up Kit	Macherey & Nagel	740948.250	RNA purification
PBS	gibco	70011051	Cell culture
Pen/Strep	Thermo Fisher	15140122	Cell culture
Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R)	Todt et.al		Virus production
Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT)	Shukla et al.	GenBank accession no. JQ679013	Virus production
Primary antibody 1E6	LS-Bio	C67675	Immunofluorescence
Primary antibody 8282			Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106	DNA extraction
Ribo m7G Cap Analog	Promega	P1711	in vitro transcription
RNase away	CarlRoth	A998.3	RNA purification
RNasin (RNase inhibitor)	Promega	N2515	in vitro transcription
Secondary antibody donkey anti-mouse 488	Thermo Fisher	A-21202	Immunofluorescence
Secondary antibody goat anti-rabbit 488	Thermo Fisher	A-11008	Immunofluorescence
Sodium Pyruvat	gibco	11360070	Cell culture
T7 RNA polymerase	Promega	P2077	in vitro transcription
Transcription Buffer	Promega	included in P2077	in vitro transcription
Triton X-100	CarlRoth	3051.3	Immunofluorescence
Trypsin-EDTA (0.5 %)	gibco	15400054	Cell culture
ultra-low IgG	gibco	1921005PJ	Cell culture
UTP	Roche	11140949001	in vitro transcription