Ein Zellkulturmodell zum Studium der Rolle von Neuron-Glia-Interaktionen in Ischämie

Summary

Hier präsentieren wir einen einfachen Ansatz mit spezifischen Kulturmedien, die die Etablierung von neuron- und astrozytenangereicherten Kulturen oder neuronglia-Kulturen aus dem embryonalen Kortex mit hoher Ausbeute und Reproduzierbarkeit ermöglichen.

Abstract

Der ischämische Schlaganfall ist ein klinischer Zustand, der durch eine Hypoperfusion des Hirngewebes gekennzeichnet ist, was zu Sauerstoff- und Glukoseentzug und dem daraus resultierenden neuronalen Verlust führt. Zahlreiche Hinweise deuten darauf hin, dass die Interaktion zwischen gliaalen und neuronalen Zellen nach einem ischämischen Ereignis positive Effekte ausübt. Daher ist es wichtig, Modelle zu entwickeln, die es ermöglichen, neuron-glia Wechselwirkungen in einer ischämischen Umgebung zu untersuchen, um mögliche Schutzmechanismen zu erforschen. Hierin stellen wir einen einfachen Ansatz vor, um Astrozyten und Neuronen aus dem embryonalen Kortex der Ratte zu isolieren, und das ermöglicht durch die Verwendung spezifischer Kulturmedien die Etablierung neuron- oder astrozytierter Kulturen oder neuronglia-Kulturen mit hoher Ausbeute und Reproduzierbarkeit.

Um den Crosstalk zwischen Astrozyten und Neuronen zu untersuchen, schlagen wir einen Ansatz vor, der auf einem Kokultursystem basiert, in dem Neuronen, die in Coverlips kultiviert sind, in Kontakt mit einer Monoschicht von Astrozyten gehalten werden, die in Mehrwellplatten platt sind. Die beiden Kulturen werden durch kleine Paraffinkugeln getrennt gehalten. Dieser Ansatz ermöglicht die unabhängige Manipulation und Anwendung spezifischer Behandlungen auf jeden Zelltyp, was in vielen Studien einen Vorteil darstellt.

Um zu simulieren, was während eines ischämischen Schlaganfalls geschieht, werden die Kulturen einem Sauerstoff- und Glukoseentzugsprotokoll unterzogen. Dieses Protokoll stellt ein nützliches Werkzeug dar, um die Rolle von neuron-glia Wechselwirkungen bei ischämischen Schlaganfällen zu untersuchen.

Introduction

Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation sterben jedes Jahr etwa 5,5 Millionen Menschen an ischämischen Schlaganfällen¹. Dieser Zustand ist durch die Unterbrechung des Blutflusses in eine bestimmte Hirnregion gekennzeichnet, was zu einem reversiblen oder irreversiblen Verlust in der Versorgung des Gewebes mit Sauerstoff und Nährstoffen führt, was die Gewebefunktion verändert und zu mitochondrialer Dysfunktion, Kalziumdysregulation, Glutamatexzitotoxizität, Entzündung und Zellverlust^{führt 2,3}.

Neben Gefäßzellen sind neuronale und gliale Zellen an der Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfalls^{beteiligt 4}. Insbesondere Sind Astrozyten für die Aufrechterhaltung von Neuronen von wesentlicher Bedeutung und haben in jüngster Zeit gezeigt, dass sie eine entscheidende Rolle bei der Reaktion auf die ischämische Läsion⁵spielen. Diese Art von Gliazelle erfüllt Funktionen der strukturellen Unterstützung, Abwehr gegen oxidativen Stress, Synthese von Neurotransmittern, Stabilisierung der Zell-Zell-Kommunikation, unter anderem⁶. Zusammen mit Neuronen spielen Astrozyten eine direkte Rolle bei der synaptischen Übertragung und regulieren die Freisetzung von Molekülen wie Adenosintriphosphat, Gamma-Aminobuttersäure und Glutamat⁷. Ein Teil der durch Ischämie induzierten Verletzung wird durch die übermäßige Freisetzung von Glutamat und seine Akkumulation am synaptischen Spalt verursacht, was zur Überaktivierung von N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren führt, die nachgeschaltete Signalkaskaden aktivieren, was letztlich zu Exzitotoxizität⁸führt. Da Astrozyten in der Lage sind, Glutamat aus dem synaptischen Spalten zu entfernen und in Glutamin umzuwandeln, sind sie entscheidend für die Abwehr von Exzitotoxizität und üben damit eine neuroprotektive Wirkung auf Ischämie aus. Diese Zellen spielen auch eine Rolle bei Derischämie-induzierten Neuroinflammation. Nach der ischämischen Beleidigung ereignen sich aktivierte Astrozyten morphologischen Veränderungen (Hypertrophie), vermehren sich und zeigen eine Zunahme der glialen fibrillären sauren Proteinexpression (GFAP). Sie können reaktiv werden (Astrogliose), pro-inflammatorische Zytokine wie Tumornekrosefaktor-α, Interleukin-1 und Interleukin-1″ freisetzen und freie Radikale, einschließlich Stickstoffmonoxid und Superoxid, produzieren, die wiederum den neuronalen^Tod9^,10induzieren können. Im Gegensatz dazu können reaktive Astrozyten auch eine neuroprotektive Wirkung spielen, da sie entzündungshemmende Zytokine freisetzen, wie z. B. die Transformation von Wachstumsfaktor-β, das nach Schlaganfall¹¹hochreguliert ist. Darüber hinaus können sie eine gliaale Narbe erzeugen, die die Geweberegeneration durch Hemmung des axonalen Keimens einschränken kann; diese Glianarbe kann jedoch die Verletzungsstelle von lebensfähigem Gewebe isolieren und so eine kaskadierende Welle unkontrollierter Gewebeschäden verhindern^12,13.

Daher ist es unerlässlich, Modelle zu etablieren, die die Untersuchung von neuron-glia Wechselwirkungen unter einer ischämischen Verletzung ermöglichen, um therapeutische Strategien zu finden, die die Auswirkungen ischämischer Verletzungen begrenzen oder umkehren. Im Vergleich zu anderen Modellen zur Erforschung ischämischer Verletzungen, nämlich in vivo-Modellen ^14,15,16, organotypische Kulturen^17,18,19 und akute Hirnscheiben^20,21,22, sind primäre Zellkulturen weniger komplex, was die Untersuchung einzelner Beiträge jedes Zelltyps in der Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfalls ermöglicht und wie jeder Zelltyp auf mögliche therapeutische Ziele reagiert. Typischerweise werden zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen neuronangereicherten Kulturen und astrozytenangereicherten Kulturen, Neuronen und Gliazellen postnatalen Ursprungs^23,,24oder postnatale Gliazellen und embryonale Neuronen^25,26verwendet. Hierin wird ein einfacher Ansatz vorgeschlagen, um neuron- oder astrozytenangereicherte Kulturen und Neuron-Glia-Kulturen aus demselben Gewebe zu etablieren. Diese Primärzellen werden aus dem embryonalen Kortex der Ratte gewonnen, einer Region, die häufig von Schlaganfall^27,28betroffen ist. Darüber hinaus wird die Dissoziation des Gewebes nur durch ein mechanisches Verfahren durchgeführt. Daher ermöglicht dieses Protokoll die Isolierung von Zellen im gleichen Entwicklungsstadium, auf eine schnelle und kostengünstige Weise und mit hoher Leistung und Reproduzierbarkeit.

Das Crosstalk zwischen Astrozyten und Neuronen kann mit einem Kokultursystem erforscht werden, in dem neuronenkultivierte In-Coverlips kultivierte Neuronen in Kontakt mit einer Monoschicht von Astrozyten gehalten werden, die in Multiwell-Platten gesät sind. Kleine Paraffinkugeln können verwendet werden, um die Trennung der beiden Zellkulturen zu gewährleisten. Dieser Ansatz ermöglicht eine unabhängige Manipulation jedes Zelltyps, bevor sie in Kontakt gebracht werden. Zum Beispiel ist es möglich, ein bestimmtes Gen in Astrozyten zum Schweigen zu bringen und zu sehen, wie es die neuronale Verletzlichkeit oder den Schutz vor ischämisch induzierten Schäden beeinflussen kann. Eine etablierte Methode zur Induzieren ischämisch-ähnlicher Bedingungen in vitro ist Sauerstoff- und Glukoseentzug (OGD)³, die darin besteht, die normale Atmosphäre (95% Luft und 5%_CO2) durch eine anoxische Atmosphäre (95% N₂ und 5%_CO2) zu ersetzen, die mit dem Auslassung von Glukose verbunden ist.

Die beschriebene Methode eignet sich zur einfachen, schnellen, reproduzierbaren und kostengünstigen Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Neuronen und Astrozyten im Kontext eines ischämischen Schlaganfalls.

Protocol

Alle verwendeten Tiere wurden im CICS-UBI Health Science Research Centre gemäß den nationalen ethischen Anforderungen für die Tierforschung und mit der Europäischen Konvention zum Schutz von Wirbeltieren für experimentelle und andere wissenschaftliche Zwecke (Richtlinie 2010/63/EU) gezüchtet. 1. Ratte Embryo Cortex primäre Zellkultur Kulturmedium Vorbereitung Bereiten Sie das Neurobasal Medium (NBM) vor, indem Sie die folgenden Ergänzungen hinzufügen: 2% B27, 0,5 mM …

Representative Results

Um die Kulturen zu charakterisieren, wurde die Immunzytochemie zur Beurteilung der Anzahl der Zellen, die GFAP oder MAP2, weit verbreitete Marker von Astrozyten und Neuronen (Abbildung 2), in jeder Art von kortikaler Kultur exprimiert. Diese Analyse ergab, dass astrozytenangereicherte Kulturen 97% der Zellen zeigten, die GFAP exdrückten (Abbildung 2A). In Bezug auf die neuronangereicherte Kultur 78% der Zellen exprimiert MAP2, 4% der Zellen ausgedrückt GFAP, u…

Discussion

Die hier beschriebene Methode besteht aus der Astrozyten- und Neuronenisolation aus dem embryonalen kortikalen Gewebe der Ratte, die die Etablierung neuron- oder astrozytierter Kulturen oder neuronglia-Kulturen ermöglicht. Es wurde aus einer früheren Studie unserer Gruppe⁵adaptiert, in der die kortikale Neuron-Glia und neuron-angereicherte embryonale Kulturen Isoliertheit beschrieben und die beiden Kulturen charakterisiert wurden. Mit diesen Kulturen, Roque et al. fand heraus, dass Astrozyten sp…

Materials

24 -well culture plates	Thermo Fischer Scientific	142475
95% N2/5% CO2 gas cylinder	ArLíquido
Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001	1/1000 dilution; incubation period – 1 h at room temperature
Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11010	1/1000 dilution; incubation period – 1 h at room temperature
B27 supplement (50x)	Gibco	17504-044
Dako Fluorescence Mounting Medium	Dako	S3023
D-glucose anhydrous	Fisher Scientific	G/0450/60	3.4 g/L
Epifluorescence microscope	Zeiss	AxioObserver Z1x	63x objective
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biochrom	S0615	10%
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1272	120 µg/mL
Glutamate	Sigma-Aldrich	G8415	25µM
Glutamine	Sigma-Aldrich	G3126	0.5 mM
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	2 µM; incubation period – 10 min at room temperature
Hypoxia incubation chamber	Stemcell Technologies	27310	Chamber used for OGD induction
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I5500	5 mg/L
Ketamine	Sigma-Aldrich	K-002	87.5 mg/Kg
Minimum Essential Medium Eagle medium	Sigma-Aldrich	M0268	warm up to 37 °C before use
Mouse Anti-MAP2	Santa Cruz Biotechnology	Sc-74421	1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C
Neurobasal medium	Gibco	21103-049	warm up to 37 °C before use
Paraffin pastilles for histology	Sigma-Aldrich	1.07164	Solidification point 56-58°C
Paraformaldehyde	Sigma -Aldrich	P6148	4% in PBS
Penicilin/Streptomycin	Biochrom	A 2213	penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL)
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P1024
Rabbit Anti-GFAP	DAKO	Z0334	1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C
Sodium hydrogen carbonate	Fisher Scientific	S/4240/60	2.2g/L
Xylazine	Sigma-Aldrich	X1126	12 mg/Kg