Denne protokollen beskriver en metode for å dyrke primære hippocampale nevroner fra embryonal musehjerne. Uttrykket av stor histokompatibilitet kompleks klasse I på den ekstracellulære overflaten av dyrkede nevroner blir deretter vurdert ved strømningscytometrisk analyse.
Økende bevis støtter hypotesen om at nevro-immuninteraksjoner påvirker nervesystemets funksjon i både homeostatiske og patologiske forhold. En godt studert funksjon av større histokompatibilitetskompleks klasse I (MHCI) er presentasjonen av celleavledede peptider til det adaptive immunsystemet, spesielt som respons på infeksjon. Mer nylig har det vist seg at uttrykket av MHCI-molekyler på nevroner kan modulere aktivitetsavhengige endringer i synaptisk tilkobling under normal utvikling og nevrologiske lidelser. Betydningen av disse funksjonene for hjernehelsen støtter behovet for en sensitiv analyse som lett oppdager MHCI-uttrykk på nevroner. Her beskriver vi en metode for primærkultur av murine hippocampal nevroner og deretter vurdering av MHCI-uttrykk ved strømningscytometrisk analyse. Murine hippocampus er mikrodissektert fra prenatal musevalper på den embryonale dagen 18. Vev dissosieres til en enkeltcellet suspensjon ved hjelp av enzymatiske og mekaniske teknikker, deretter dyrket i et serumfritt medium som begrenser veksten av ikke-nevronale celler. Etter 7 dager in vitro stimuleres MHCI-uttrykket ved å behandle dyrkede celler farmakologisk med betainterferon. MHCI-molekyler er merket in situ med et fluorescerende merket antistoff, da blir celler ikke-enzymatisk dissosiert til en enkelt celle suspensjon. For å bekrefte nevronidentiteten er cellene festet med paraformaldehyd, permeabilisert og merket med et fluorescerende merket antistoff som gjenkjenner nevronalt nukleært antigen NeuN. MHCI-uttrykk kvantifiseres deretter på nevroner ved strømningscytometrisk analyse. Nevronkulturer kan lett manipuleres av enten genetiske modifikasjoner eller farmakologiske intervensjoner for å teste spesifikke hypoteser. Med små modifikasjoner kan disse metodene brukes til å dyrke andre nevronpopulasjoner eller for å vurdere uttrykk for andre proteiner av interesse.
Sentralnervesystemet (CNS) ble en gang antatt å være blottet for immunovervåking, referert til som “immunprivilegert1.” Det er nå klart at dette privilegiet ikke tilsvarer det absolutte fraværet av immunkomponenter, men snarere en spesialisert regulering som fungerer for å begrense skaden forbundet med immunopathology1. Faktisk er kommunikasjon mellom CNS og immunsystemet en pågående samtale som er nødvendig for sunn hjerneutvikling og respons på infeksjoner2,3.
Store histokompatibilitetskompleksklasse I (MHCI) molekyler er polygene og polymorfiske transmembrane proteiner som er mest kjent for sin funksjon i å presentere antigene peptider til CD8+ T-celler under infeksjon4. Klassiske MHCI-komplekser består av en transmembran α-kjede og en ekstracellulær lyskjede, kalt β2-mikroglobulin. Den α-kjeden inneholder et polymorfisk spor som binder et antigent peptid for presentasjon5. Riktig uttrykk for MHCI på den ekstracellulære membranen krever koordinert virkning av molekylære anstander ved endoplasmic retikulum for å sikre riktig folding av α-kjeden og β2-mikroglobulin sammen med lasting av en høy affinitet peptid ligand5. Først når MHCI-komplekser er montert, eksporteres de fra endoplasmic retikulum til plasmamembranen6. Ved engasjement av cognate T celle reseptor med peptid-lastet MHCI kompleks, CD8+ T celler mediate celle drap ved å frigjøre lytiske granulater som inneholder perforin og granzymer eller ved å indusere apoptose gjennom bindende Fas reseptor på målcellemembranen7. I tillegg produserer CD8+ T-celler cytokiner, som gammainterferon (IFNγ) og tumornekrosefaktor alfa (TNFα), som kan aktivere antivirale mekanismer i infiserte celler uten cytopatiske effekter8,9. For mange nevrotrope virus er CD8+ T-celler nødvendige for å fjerne infeksjonen fra CNS10,11,12.
Det ble tidligere antatt at nevroner uttrykker MHCI bare under forhold med skade, virusinfeksjon eller med in vitro cytokinstimulering. Nylig har forskning identifisert en rolle for nevronal uttrykk for MHCI i synaptisk ombygging og plastisitet13,14. Selv om de presise mekanismene som ligger til grunn for synapsereguleringen ikke er godt forstått, indikerer data at MHCI-uttrykksnivå er regulert av synaptisk aktivitet15,16. En hypotese hevder at nevroner uttrykker parret immunoglobulin-lignende reseptor B (PirB) presynaptisk, som binder MHCI transynaptisk13,17. Denne interaksjonen starter en signalkaskade av PirB som motsetter seg veier som er involvert i synaptisk ombygging, og dermed forsterker og stabiliserer den synaptiske forbindelsen17,18,19. I fravær av nevronaktivitet reduseres MHCI-uttrykket14, og tapet av MHCI resulterer i defekt synapse eliminering og feilorganiserte synaptiske kretser20,21.
Analysen beskrevet her, som ble tilpasset fra Chevalier et al.9, bruker strømningscytometrisk analyse for å kvantitativt vurdere ekstracellulært proteinuttrykk av MHCI på primære kulturer av murine hippocampal nevroner. Denne protokollen illustrerer de første teknikkene for mikrodissecting hippocampal vev fra embryonale musevalper. Den beskriver deretter prosesser for enzymatisk og mekanisk dissosiasjon av vev i en enkelt celle suspensjon og metoder for å opprettholde kulturene in vitro. Fordi de ikke deler seg, når de først er i kultur, må nevroner være belagt i en tallerken og tetthet som passer for deres eksperimentelle endepunkt. Deretter skisserer den trinn for å indusere MHCI-uttrykk med betainterferon (IFNβ), immunolabeling for MHCI og nevronal nukleimarkør NeuN, og analysere celler ved strømningscytometri. Til slutt beskriver den prosedyrer for å vurdere strømningscytometridataene for å identifisere MHCI-positive nevroner og kvantifisere nivået på MHCI-uttrykket. Også nevnt i denne protokollen er små justeringer som kan gjøres for å kultur kortikale nevroner i tillegg til eller i stedet for hippocampal nevroner. Denne protokollen kan enkelt modifiseres for å teste spesifikke hypoteser ved hjelp av genetiske variasjoner eller farmakologiske behandlinger.
Denne protokollen beskriver disseksjonen og kulturen til primære hippocampale nevroner fra prenatale musevalper på embryonal dag 18. Bruken av primære nevroner dyrket fra gnagere er en av de mest grunnleggende metodene utviklet i moderne nevrobiologi22. Selv om udødelige cellelinjer kan modellere visse aspekter av nevroner, øker deres natur som tumoravledede celler, unnlatelse av å utvikle definerte axoner og fortsatt celledeling tvil om de trofast recapitulate egenskaper til post-mitotic nevroner in vivo23. Et annet alternativ til primære nevroner er bruk av menneskeskapte pluripotente stamceller (HiPSC). Teknologien for bruk av HiPSCer, spesielt de som er pasientavledede, har utviklet seg raskt de siste årene24. Det er imidlertid fortsatt begrensninger for å arbeide med HiPSCer, inkludert variasjon mellom cellelinjer, mangel på funksjonell modenhet og forskjeller i epigenetiske profiler25. Selv om det også er begrensninger for å jobbe med reduksjonsmodellen av primære gnagernevroner, beholder dyrkede nevroner den post-mitotiske naturen til nevroner in vivo. Også de ekspansive molekylærbiologiske verktøyene og genetiske modifikasjonene som er tilgjengelige for mus, favoriserer bruken av primære nevroner over HiPSCs for mange applikasjoner, og musestudier kan enkelt oversettes til den mer komplekse in vivo-organismen uten å miste det eksperimentelle genetiske systemet. Av disse grunnene bruker mange forskere primære gnagernevroner for å verifisere viktige aspekter, om ikke hoveddelen, av forskningen deres.
For visse analyser kan nevroner analyseres direkte etter isolasjon fra hjerne ex vivo. Dette er spesielt ønskelig for eksperimenter som involverer voksne mus som kan bli utsatt for spesifikke eksperimentelle forhold eller som kan avhenge av interaksjoner mellom flere celletyper; Det er imidlertid flere problemstillinger som begrenser hvilken type analyser som kan gjøres. Det er teknisk utfordrende å forberede en enkelt celle suspensjon av nevroner fra hjernen til voksne mus fordi nevroner er unikt sammenkoblet og omsluttet av myelin26. Ikke-enzymatiske metoder for vevstrianturasjon er ineffektive for å dissosiere vevet og forårsake celledød, mens enzymatiske preparater ofte cleave celleoverflateantigener27. Videre, mens myelin i stor grad er fraværende fra embryonale mus, består den av ca 20% av den voksne hjernen, og kan svekke levedyktig celleisolasjon og hindre strømningscytometrianalyse28. Mange av teknikkene som er utviklet, stripper til slutt nevroner av cytosolen og forlater små, avrundede cellelegemer som hovedsakelig består av kjerner29. Selv om dette er akseptabelt for noen analyser, er dette ikke hensiktsmessig for kvantifisering av cytoplasmatisk eller ekstracellulært proteinuttrykk. Videre tillater det reduksjonistiske cellekultursystemet å teste spesifikke mekanistiske spørsmål på kortere tidsskala enn det som ofte er mulig med et in vivo-system.
Også beskrevet i denne protokollen er metoder for å stimulere MHCI-uttrykk farmakologisk med IFNβ, og kvantifisering av ekstracellulært MHCI-uttrykk ved strømningscytometri. Stimulering ved IFNβ er en nyttig positiv kontroll for testing av andre eksperimentelle forhold, men det kan bemerkes at IFNγ og kainsyre også kan stimulere MHCI-uttrykk hos nevroner9,30, mens tetrodotoxin reduserer MHCI-uttrykk14. Tidligere metoder for å oppdage MHCI-uttrykk baserte seg på in situ hybridisering og immunhiistokjemisk analyse14,15,20,31. Mens mRNA-baserte analyser, som in situ hybridisering og qRT-PCR, kan bestemme den romlige lokaliseringen, celletypespesifikkiteten og nivåene av gentranskripsjon, kan ikke disse analysene vurdere proteinoversettelse eller transport til plasmamembranen. Immunhiistokjemisk og vestlig blotanalyse kan bestemme forskjeller i proteinuttrykk og potensielt cellulær lokalisering, men kan være vanskelig å kvantifisere nøyaktig. Videre gjenkjenner mange MHCI-antistoffer kompleksets tertiære struktur, og er svært følsomme for konformasjonsendringer. Dermed permeabilisering eller denaturering forhold resulterer i tap av MHCI immunoreaktivitet32. Metoden som presenteres her bruker in situ immunostaining for MHCI, noe som gjør det mulig å gjenkjenne proteinet ved antistoffet i sin opprinnelige konformasjon, etterfulgt av fikserings- og permeabiliseringsmetoder.
Med små modifikasjoner kan metodene beskrevet her brukes til å dyrke andre nevronpopulasjoner eller for å vurdere uttrykk for andre ekstracellulære proteiner av interesse. Notert i denne protokollen er enkle modifikasjoner som kan gjøres for å kultur kortikale nevroner, men metodene beskrevet her kan også brukes til å dyrke andre nevronale populasjoner, for eksempel striatal nevroner33. Videre, selv om denne protokollen spesifiserer immunisering av MHCI og NeuN, kan andre cellulære markører identifiseres på en lignende måte. Generelt kan ekstracellulære markører behandles som MHCI, og intracellulære markører kan behandles som NeuN. Det skal imidlertid bemerkes at under det cellulære dissosiasjonstrinnet blir axonale projeksjoner kuttet fra soma. Fordi gating strategien definert her skjermer ut cellulære rusk og fokuserer på nevronale nuklei markør NeuN, proteiner som uttrykkes utelukkende i axonal projeksjoner kan ikke oppdages.
Inntil nylig ble nevroner antatt å uttrykke MHCI bare som svar på skade, infeksjon eller in vitro cytokinstimulering for å engasjere cytotoksisk CD8+ T-celler9. Ny forskning har belyst en annen funksjon av MHCI i regulering av synaptiske forbindelser under utvikling13. Protokollen beskrevet her bruker IFNβ for å stimulere MHCI-uttrykk i wildtype dyrkede nevroner, men lignende metoder kan brukes med en rekke cellulære stimuli eller genetiske modifikasjoner for å teste spesifikke hypoteser. Denne metoden vil gjøre det mulig for forskere å undersøke de molekylære mekanismene som regulerer MHCI-uttrykket, noe som vil forbedre forståelsen av MHCI’s dikotome rolle på disse to forskjellige cellulære funksjonene.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIA R00 AG053412 (KEF).
1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Laboratory Supplies |
100 mm sterile culture dish | Fisher | FB012924 | Tissue Culture Supplies |
15 ml Centrifuge Tubes | Genesee | 21-103 | Laboratory Supplies |
50 ml centrifuge tube | Genesee | 21-108 | Laboratory Supplies |
500 mM EDTA | Invitrogen | AM9260G | FACS Buffer Reagent |
70% Ethanol | Fisher | BP82031Gal | Tissue Culture Supplies |
96 well U-bottom plate | Genesee | 25-221 | Flow Cytometry Supplies |
B27 | Gibco | 17504044 | Neuron Culture Reagent |
Borate Buffer | Thermo Scientific | 28341 | Tissue Culture Supplies |
Borosilicate Glass Pasteur Pipette | Fisher | 13 678 20C | Laboratory Supplies |
Cell Dissociation Buffer | Gibco | 13 151 014 | Flow Cytometry Supplies |
DNase I | Thermo | 90083 | Dissociation Solution Reagent |
dPBS | Gibco | 14190-235 | Tissue Culture Supplies |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Dissection Tool |
Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | Dissection Tool |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Tissue Culture Supplies |
Fine Forceps | Fine Science Tools | 91113-10 | Dissection Tool |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | Dissection Tool |
Fix and Perm Cell Permeabilization Kit | Invitrogen | GAS003 | Flow Cytometry Supplies |
Glutamax | Gibco | 35050061 | Neuron Culture Reagent |
Hibernate-E Medium | Gibco | A1247601 | Neuron Culture Reagent |
Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher | 181254 | Tissue Culture Supplies |
Interferon Beta | PBL Assay Science | 12405-1 | Flow Cytometry Supplies |
Milli-Mark Anti-NeuN-PE Antibody, clone A60 | MilliporeSigma | FCMAB317PE | Flow Cytometry Antibody |
Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | Neuron Culture Reagent |
Pacific Blue anti-mouse H-2Kb Antibody | BioLegend | 116513 | Flow Cytometry Antibody |
Papain Solution | Worthington | LS003126 | Dissociation Solution Reagent |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Fixative |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Neuron Culture Reagent |
Poly-D-Lysine | Sigma | P7280 | Neuron Culture Reagent |
Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 91100-12 | Dissection Tool |
Stereo dissection microscope | Swift | M29TZ-SM99CL-BTW1 | Dissection Tool |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91401-10 | Dissection Tool |
Transfer Pipets | Corning | 357575 | Laboratory Supplies |
TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | BioLegend | 101319 | Flow Cytometry Antibody |
Trypan Blue | Sigma | T8154-100ML | Tissue Culture Supplies |