Summary
Denne protokol beskriver en metode til dyrkning af primære hippocampale neuroner fra embryonale musehjerne. Udtrykket af større histokompatibilitet kompleks klasse I på den ekstracellulære overflade af kulturperlede neuroner vurderes derefter ved flow cytometrisk analyse.
Abstract
Stigende beviser understøtter hypotesen om, at neuro-immun interaktioner påvirker nervesystemets funktion i både homeostatiske og patologiske forhold. En velunderskrænkt funktion af større histokompatibilitet kompleks klasse I (MHCI) er præsentationen af celle-afledte peptider til adaptive immunsystemet, især som reaktion på infektion. For nylig har det vist sig, at udtrykket af MHCI molekyler på neuroner kan modulere aktivitetsafhængige ændringer i synaptisk forbindelse under normal udvikling og neurologiske lidelser. Betydningen af disse funktioner til hjernen sundhed understøtter behovet for en følsom analyse, der let registrerer MHCI udtryk på neuroner. Her beskriver vi en metode til primær kultur af murine hippocampal neuroner og derefter vurdering af MHCI udtryk ved flow cytometrisk analyse. Murine hippocampus er mikrodissected fra prænatal mus hvalpe på den embryonale dag 18. Væv er dissociated i en enkelt celle suspension ved hjælp af enzymatiske og mekaniske teknikker, derefter dyrkes i et serum-fri medier, der begrænser væksten af ikke-neuronale celler. Efter 7 dages in vitro stimuleres MHCI-ekspressionen ved at behandle dyrkede celler farmakologisk med betainterferon. MHCI molekyler er mærket in situ med en fluorescerende mærkede antistof, så cellerne er ikke-enzymatisk dissociated i en enkelt celle suspension. For at bekræfte den neuronale identitet, celler er fastgjort med paraformaldehyd, gennemtrængelig, og mærket med en fluorescerende mærket antistof, der genkender neuronale nukleare antigen NeuN. MHCI-ekspression kvantificeres derefter på neuroner ved flowcytometrisk analyse. Neuronale kulturer kan nemt manipuleres af enten genetiske modifikationer eller farmakologiske indgreb for at teste specifikke hypoteser. Med små modifikationer kan disse metoder bruges til at dyrke andre neuronale populationer eller til at vurdere ekspression af andre proteiner af interesse.
Introduction
Centralnervesystemet (CNS) blev engang anset for at være blottet for immunovervågning, benævnt "immun privilegeret1." Det er nu klart, at dette privilegium ikke svarer til det absolutte fravær af immunkomponenter, men snarere en specialiseret forordning, der fungerer for at begrænse skaden forbundet med immunpatologi1. Faktisk er kommunikation mellem CNS og immunsystemet en løbende samtale, der er nødvendig for sund hjerneudvikling og reaktion på infektioner2,3.
Større histokompatibilitet komplekse klasse I (MHCI) molekyler er polygene og polymorfe transmembrane proteiner bedst kendt for deres funktion i at præsentere antigene peptider til CD8+ T celler under infektion4. Klassiske MHCI-komplekser består af en transmembrane α-kæde og en ekstracellulær lyskæde, kaldet β2-microglobulin. Den α-kæde indeholder en polymorf rille, der binder en antigen peptid til præsentation5. Korrekt ekspression af MHCI på den ekstracellulære membran kræver koordineret virkning af molekylære chaperoner ved endoplasmisk reticulum for at sikre korrekt foldning af α-kæden og β2-mikroglobulin sammen med belastningen af en høj affinitets peptid ligand5. Først når MHCI-komplekserne er samlet, eksporteres de fra det endoplasmiske reticulum til plasmamembranen6. Efter indgreb af cognate T-cellereceptoren med det peptidbelastede MHCI-kompleks formidler CD8+ T-celler celledræbt ved at frigive lytiske granulater, der indeholder perforin og granzymer eller ved at fremkalde apoptose gennem bindende Fas-receptor på målcellemembranen7. Derudover producerer CD8+ T-celler cytokiner, såsom gamma interferon (IFNγ) og tumornekrosefaktor alpha (TNFα), som kan aktivere antivirale mekanismer i inficerede celler uden cytopatiske virkninger8,9. For mange neurotropiske vira er CD8+ T-celler nødvendige for at rydde infektionen fra CNS10,11,12.
Det blev tidligere antaget, at neuroner kun udtrykker MHCI under forhold med skade, virusinfektion eller med in vitro cytokinstimulering. For nylig har forskning identificeret en rolle for neuronal udtryk for MHCI i synaptisk remodeling og plasticitet13,14. Selv om de præcise mekanismer , der ligger til grund for synapsereguleringen , ikke er velforståede , tyder data på , at MHCI-udtryksniveauet reguleres af synaptisk aktivitet15,16. En hypotese hævder, at neuroner udtrykke parret immunoglobulin-lignende receptor B (PirB) presynaptically, som binder MHCI transynaptically13,17. Denne interaktion indleder en signalkaskade fra PirB, der modsætter sig veje, der er involveret i synaptisk remodellering, hvilket styrker og stabiliserer den synaptiske forbindelse17,18,19. I mangel af neuronal aktivitet reduceres MHCI-ekspressionen14, og tabet af MHCI resulterer i defekt synapse eliminering og misorganiserede synaptiske kredsløb20,21.
Analysen beskrevet her, som blev tilpasset fra Chevalier et al.9, bruger flow cytometrisk analyse til kvantitativt at vurdere ekstracellulært proteinudtryk af MHCI på primære kulturer af murine hippocampal neuroner. Denne protokol illustrerer de første teknikker til mikrodissecting hippocampal væv fra embryonale mus hvalpe. Derefter detaljer processer for enzymatisk og mekanisk dissociation af væv i en enkelt celle suspension og metoder til at opretholde kulturer in vitro. Fordi de ikke deler sig, når de først er i kultur, skal neuroner besudles i en skål og tæthed, der passer til deres eksperimentelle slutpunkt. Dernæst skitserer den trin til at fremkalde MHCI-udtryk med betainterferon (IFNβ), immunolabeling for MHCI og neuronal nukleimarkør NeuN og analysere celler ved flowcytometry. Endelig beskriver den procedurer for vurdering af flowcytometridata for at identificere MHCI-positive neuroner og kvantificere niveauet af MHCI-udtrykket. Også bemærket i denne protokol er små justeringer, der kan foretages for at kultur kortikale neuroner ud over eller i stedet for hippocampal neuroner. Denne protokol kan let ændres for at teste specifikke hypoteser ved hjælp af genetiske variationer eller farmakologiske behandlinger.
Protocol
Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for pleje og brug af forsøgsdyr fra de nationale sundhedsinstitutter og i overensstemmelse med de internationale vejledende principper for biomedicinsk forskning, der involverer dyr. Protokollen blev godkendt af University of North Carolina på Charlotte Institutional Animal Care and Use Committee (Protokol #19-020).
1. Forberedelse til kultur
BEMÆRK: Disse procedurer skal udføres under sterile forhold i et biosikkerhedsskab, der er udpeget af vævskulturen. Se tabel 1 for medier og løsninger.
- Steriliser alle dissektionsværktøjer ved autoklavering i selvforseglingssteriliseringsposer.
- Forbered arbejdslagre af poly-D-lysin til behandling af 12-brønds kulturretter.
- Poly-D-lysin opløses i 1x boratbuffer til en koncentration på 100 μg/mL (10x koncentreret). Der opbevares ca. 1 mL aliquots ved -20 °C, indtil det er nødvendigt.
- 10x koncentreret poly-D-lysin fortyndes i dPBS til 10 μg/mL (1x) og filtreres steriliseres.
- Behandl 12-brønds kulturplader med 0,5 mL pr. brønd på 1x poly-D-lysin ved stuetemperatur i mindst 1 time eller natten over til brug næste dag. Sørg for, at mængden af poly-D-lysin er nok til fuldt ud at dække bunden af kulturområdet.
- Lige før brugen skal du fjerne poly-D-lysin fra dyrkningspladen, skylle 3x i sterilt vand og opbevare sterilt vand, indtil det er klar til at pladeceller. Fjern alle spor af væske ved en grundig aspiration forud for plating celler.
- Forbered Neuron Vækst Media og FACS buffer. Filteret steriliseres og opbevares ved 4 °C, indtil det bruges. Neuron Vækst Media kan opbevares i ca 2 uger; FACS buffer kan opbevares i ca. 4 uger.
2. Dissekere embryonale hippocampus
BEMÆRK: Denne procedure kan udføres på bordpladen, da det kræver brug af et stereomikroskop til fjernelse af meninges og mikrodissement af hippocampus. Hold dig til streng aseptisk teknik for at minimere potentiel forurening.
- Aflive en tidsindstillet-gravid C57BL/6J kvindelige mus på embryonale dag 18 i en CO2 kammer.
- Spray abdominal hud og pels med 70% EtOH, derefter klemme huden med væv pincet og gøre små snit med kirurgisk saks. Incise bughinden til at udsætte indvolde og livmoder.
- Tag fat i livmoderen med standard mønster pincet, løft ud af hulrummet, og skær forbindelsen til mesometrium med fin saks. Overfør livmoderen med embryoner til 100 mm steril plastkultur skål placeret på is.
- Brug fin saks og fine pincet, forsigtigt skære livmoderen og fjerne embryonale sække til at frigive embryoner. Overfør embryoner til en ny 100 mm steril plastkulturskål, der indeholder dPBS placeret på is.
- Halshugge embryonale hvalpe ved hjælp af fine saks, og overføre hoveder til nye 100 mm steril plast kultur parabol indeholder Hibernate-E medium placeret på is.
- For at fjerne hjernen skal du holde hovedet med et par fine pincet i den ene hånd. Brug buede Dumont #7 pincet i anden hånd, indsætte spidsen af pincet i bunden af kraniet og klemme knoglen og overliggende hud bevæger sig anteriorly langs midterlinjen uden piercing hjernen.
- Brug buede pincet trække fra hinanden huden og kraniet til at udsætte hjernen. Fej de buede pincet under hjernen fra den udsatte olfaktoriske pære til lillehjernen for at løfte hjernen ud af kraniet. Overfør hjernen til en ny 100 mm steril plastkulturskål, der indeholder Hibernate-E-medium placeret på is. Gentag for hver hjerne.
BEMÆRK: Alle hjerner kan opsamles i en enkelt kulturret, medmindre det er nødvendigt for at være adskilt til eksperimentspecifikke formål. - Under et stereodissektion mikroskop, der arbejder med en hjerne ad gangen og to par sterile Dumont #5 pincet, klemme off olfaktoriske pærer og trække væk meninges. Grundig fjernelse af meninges er nødvendig for at undgå kulturforurening af andre celler og for at tillade yderligere dissektion.
- Når meninges er korrekt fjernet, åbner cortexens overlegne side side sideværts, hvilket vil udsætte hippocampus. Brug Dumont #5 pincet, klem hippocampus væk fra den vedhæftede cortex, og overfør forsigtigt isoleret hippocampus til et sterilt 15 mL konisk rør, der indeholder 5 mL Hibernate-E-medium på is.
- Gentag dissektionen for begge hjernehalvdele for hver embryonal museunge, og kombiner alle hippocampi i et enkelt 15 mL konisk rør, medmindre det er nødvendigt separat til eksperimentspecifikke formål.
- Til kultur kortikale neuroner, cortex kan adskilles fra subcortex og behandles identisk med hippocampal neuroner.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan protokollen være sat på pause. Opbevar hjerner eller dissekeret hippocampi i Hibernate-E-medie suppleret med B27 (2%) ved 4 °C i op til 1 måned, men forlænget forsinkelse kan bringe antallet af levedygtige celler i fare.
- Til kultur kortikale neuroner, cortex kan adskilles fra subcortex og behandles identisk med hippocampal neuroner.
3. Dissociating og dyrkning hippocampal neuroner
BEMÆRK: Alle procedurer skal udføres under sterile forhold i et vævskultur, der er udpeget som biosikkerhedsskab.
- Der fremstilles 0,5 ml papainde dissociationsopløsning pr. embryon til hippocampal dissociation. Mængden af dissociationsopløsning, der er nødvendig, vil variere afhængigt af antallet af embryonale hjerner, der dissekeres.
BEMÆRK: For kortikal neuronkultur skal du forberede 1,0 ml papainopløsning pr. embryon.- 20 μL papainophæng pr. 1 mL hibernate E-medium opløses ved hvirvelstrøm i ca. 3 min.
- Efter opløsningen af papain tilsættes 1 μL DNase I pr. 1 ml af opløsningen. Må ikke vortex opløsningen efter DNase jeg er blevet tilføjet, da dette kan deaktivere enzymet.
- Centrifuge 15 mL konisk rør indeholdende hippocampalt væv (trin 2.10) ved 1.000 x g i 5 min. Fjern supernatanten og tilsæt papainopløsning. Genbrug vævet ved at vende flere gange. Inkuber ved 37 °C i 30 min.
- Hvis du dyrker kortikale neuroner, overføres alle cortices til en ny 100 mm steril kulturskål, aspirat forsigtigt medier fra plade og hakket væv med fin saks eller barberblad. Papainopløsningen til dyrkningsskålen tilsættes, og kortikale væv overføres med papainopløsning til 15 ml konisk rør ved hjælp af en steril overførselspipette. Inkuber væv og enzymopløsning ved 37 °C i 30 min. omrøres hvert 10.
- Under 30 minutters inkubation skal du forberede 3 brandpolerede glas Pasteur pipetter: 1 helt åben, 1 halv åben og 1 fjerdedel åben.
- Efter 30 minutters inkubation centrifuge det 15 mL koniske rør, der indeholder fordøjet hjernevæv ved 125 x g i 10 minutter. Enzymopløsningen fjernes, og der erstattes med et lige stort antal friske hibernater E-medium.
- Brug helt åben Pasteur pipette, triturat vævet 10x. Lad vævet afregne i 2 minutter, og overfør derefter supernatantcelleaffjedringen til et sterilt 50 mL konisk rør. Tilsæt et lige så stort volumen af Dvale E medium tilbage til vævet.
- Brug halv åben Pasteur pipette, triturat væv 10x. Lad vævet nøjes i 2 minutter, og overfør derefter supernatantcelleaffjedringen til det samme 50 mL koniske rør som i det foregående trin. Tilsæt et lige så stort volumen af Dvale E medium tilbage til vævet.
- Brug kvart åben Pasteur pipette, triturat væv 10x. Lad vævet nøjes i 2 minutter, og overfør derefter supernatantcelleaffjedringen igen til samme 50 mL koniske som i tidligere trin. Kassér eventuelt resterende væv, der ikke er dissociated.
- Centrifuge det 50 mL koniske rør, der indeholder supernatanten fra celleaffjedringen ved 125 x g i 5 min. Hvis det ikke allerede er gjort, vask poly-D-lysin-coatede plader med sterilt vand og fjern alle spor af væske ved grundig aspiration under centrifugering.
- Efter centrifugering kasseres supernatanten og genbruges cellepillen i 5 mL Neuron Growth Media. Tæl levende celler ved hjælp af trypan blå og hæmocytometer.
- Hvis dyrkning kortikale neuroner, tilføje mindst 10 mL af Neuron Vækst Media for mindre tætte celler og mere præcis optælling.
- Fortyndede celler med Neuron Growth Media for en endelig plating tæthed på 5 x 105 levedygtige celler pr ml og tilsæt 1 ml fortyndet celle suspension til hver brønd af en 12 godt plade. Neuroner skal opretholdes ved 37 °C med 5% CO2.
BEMÆRK: Hippocampi fra 1 embryonal musehjerne, dvs. Dette nummer er kun beregnet til forsøgsplanlægningsformål og bør ikke betragtes som en erstatning for optælling af celler for hver kultur. - Skift vækstmedierne dagen efter kulturen ved at fjerne halvdelen af mediemængden fra hver brønd, dvs. 0,5 mL, og tilføj en lige stor mængde friske medier til siden af brønden for at undgå at forstyrre de dyrkede celler. Komplet halv medier ændringer to gange om ugen for levetiden af kulturen.
4. Vurdering af MHCI-udtryk ved flowcytometri
- Forbered behandling ved fortynding af Interferon beta (IFNβ) eller et tilsvarende volumen af fortyndingsmiddel i Neuron Growth Media. Da medierne forandring vil være en halv-volumen forandring, forberede behandling medier med 2x koncentreret IFNβ. 3 brønde med en 12 brøndplade med 100 U/mL IFNβ, forbered 1,5 mL med 200 U/mL IFNβ eller et tilsvarende volumen IFNβ diluent til mediebehandlede kontroller.
- Fjern 0,5 mL fra hver brønd af neuroner og tilsæt 0,5 mL Neuron Growth Media med eller uden IFNβ til hver brønd. Inkuber under normale vækstbetingelser (37 °C, 5% CO2) i 6-72 timer, afhængigt af forsøgsbetingelser og signaloptimering.
- Efter behandlingstid skal du fjerne alle kulturmedier og forsigtigt vaske en gang i kolde Neurobasal-medier uden kosttilskud (B27, L-glutamin, Pen-Strep).
- Der tilsættes 0,5 mL ikke-supplerede kolde neurobasale medier, der indeholder 1 μg/mL Fc-blok og 1 μg/mL fluorescerende konjugeret anti-MHCI-antistof til hver brønd. Inkuber ved 4 °C beskyttet mod lys i 45 min.
- Fjern antistofholdige medier, og vask forsigtigt en gang i kolde dPBS. Tilsæt 0,5 mL stuetemperatur enzymfri celle dissociation buffer til hver brønd og omrøre at løsne celler. Hold øje med dissociation ved hjælp af omvendt vævskulturmikroskop.
- Når cellerne er løsrevet fra kultur parabol, tilføje 0,5 mL FACS buffer til hver brønd, triturat celler til at sprede klumper, og overføre det samlede volumen af hver brønd til de enkelte 1,7 mL mikrocentrifuge rør.
- Centrifuge ved 1.000 x g i 5 min. Supernatanten fjernes, cellepillen genbruges i 100 μL FACS-buffer, og det samlede volumen af hvert rør overføres til individuelle brønde i en 96 brønd U-bundplade.
- Der tilsættes 100 μL fiksativ reagens til hver brønd. Triturat flere gange for at undgå celler klumper og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur beskyttet mod lys.
- Centrifuge ved 500 x g i 5 min. Supernatanten fjernes og genbruges i 200 μl FACS-buffer.
- Centrifuge ved 500 x g i 5 min. Supernatanten fjernes, og det opsættes igen i 100 μL permeabilisationsreagens, der indeholder fluorescerende konjugeret anti-NeuN-antistof (1:100 fortynding) til hver brønd. Bland godt, og inkubat derefter ved stuetemperatur beskyttet mod lys med rokkende i 20 minutter.
- Efter inkubation centrifuge ved 500 x g i 5 min. Supernatanten fjernes og genbruges i 100 μL FACS-buffer. Gentag 2x.
- Efter den endelige vask opsuspendes cellerne i 100 μL af 2% paraformaldehyd fortyndet i FACS-buffer. Bland godt for at forhindre celler i at klumpe. Opbevares ved 4 °C beskyttet mod lys, indtil det er klar til aflæsning på et strømningscytometer. Læs prøver så hurtigt som muligt inden for 1 uge.
5. Kvantificering og evaluering af data
- Mål kompensationskontrollerne for hvert lysstofrør, og ret eventuelle spektraloverlapninger. Ideel kompensation kontrol omfatter kulturperler neuroner, der er unstained, plettet med anti-MHCI kun, og farves med anti-NeuN alene.
- Hvis det er muligt, skal du registrere 100.000 hændelser for hver prøve (mindst 10.000) og gemme dem som FCS-filer.
- Hvis du vil analysere data ved hjælp af passende analysesoftware, skal du oprette sekventielle porte som afbildet i figur 1A-C for at vælge neun-positive neuroner.
- Plot SSC-A (log) vs FSC-A (lineær). Tegn en port på den cellulære befolkning (P1) for at fjerne celleaffald fra analysen.
- Inden for P1 cellulære befolkning, plot FSC-H (lineær) vs FSC-A (lineær). Tegn en port på encellet population.
- Inden for enkeltcellepopulationen afbildes SSC-A (log) vs NeuN (log). Tegn en port på NeuN-positiv befolkning ved hjælp af ikke-indgroede eller MHCI-kun farvede celler som en guide.
- Plot et histogram af MHCI fluorescens med cellulære begivenheder normaliseret til mode på y-akse. Brug unstained eller NeuN-only farvede neuroner som en guide, tegne en vandret port til at kvantificere den procent neuroner positiv for MHCI.
- Eksporter procentcellerne positive for MHCI samt medianfluorescensintensiteten (MFI) for MHCI på den NeuN-positive population til statistisk evaluering og grafisk tegning.
Representative Results
Ved hjælp af den procedure, der præsenteres her, blev hippocampalt væv dissekeret fra prænatal musunger på den embryonale dag 18. Vævet blev dissociated i en enkelt celle suspension ved hjælp af enzymatiske og mekaniske metoder, derefter dyrket i 12 brønd plader, der blev forbehandlet med poly-D-lysin. Efter 7 dage in vitro blev celler kun behandlet med 100 U/mL IFNβ eller medier i 72 timer, hvilket stimulerede MHCI's ekspression. Neuroner blev farvet in situ for MHCI, før de ikke-enzymatisk dissociated i en enkelt celle suspension. Neuroner blev fastsat og gennemtrængelig, derefter farves intracellulært for neuronale kerner markør NeuN. Prøverne blev vurderet ved flowcytometri, og data blev analyseret ved hjælp af tilknyttet software. Neuroner blev identificeret ved sekventiel gating af de samlede begivenheder for at udelukke cellulære vragrester og doublets (Figur 1A, B). Neuroner blev endeligt identificeret ved NeuN-positivitet (Figur 1C). NeuN+ celler blev yderligere analyseret for MHCI-positivitet ved at plotte celler på et histogram med antallet af celler normaliseret til tilstanden på y-aksen og MHCI fluorescens på x-aksen. Der blev tegnet en MHCI+ gate på det punkt, hvor positive og negative toppe afveg (figur 1D). Herfra er procentdelen neuroner positive for MHCI-farvning (Figur 1E) og medianlyscensintensiteten (MFI; Figur 1F) blev beregnet. Resultaterne viser, at IFNβ behandling signifikant upreguleret procentdelen af neuroner positiv for ekstracellulær farvning af MHCI, samt niveauet af udtrykket, som angivet af MFI. Statistisk analyse og grafisk repræsentation blev udført ved hjælp af kommercielt tilgængelig statistisk software.
Figur 1: Repræsentativ gating-strategi og MHCI-kvantificering.
Primære hippocampale neuroner blev kun behandlet med 100 U/mL IFNβ eller medier. Efter 72 timer blev neuroner farvet ekstracellulært med Pacific Blue-konjugeret MHCI (1 μg/mL H2-Kb), derefter intracellulært mærket med PE-konjugeret NeuN (1:100 fortynding). Cellulær fluorescens blev vurderet ved flowcytometry, og data blev analyseret. (A) Totalhændelser blev afbildet som SSC-A (log) vs FSC-A (lineær), og celler (P1) blev gated at udelukke snavs. (B) Inden for P1-populationen blev celler afbildet som FSC-H (lineær) vs FSC-A (lineær) for at gate encellepopulationen. (C) Inden for enkeltcellepopulationen blev celler afbildet SSC-A (log) vs NeuN-PE (log). NeuN+ celler blev gated at identificere neuroner. (D) Inden for neuronpopulationen blev celler afbildet på et histogram med MHCI-PacBlu på x-aksen og cellenumre normaliseret til tilstand på y-aksen. En vandret port blev trukket for at kvantificere procentdelen af neuroner, der er positive for MHCI-farvning. (E) Kvantificering af procent MHCI+ af NeuN+ celler i medier alene og IFNβ-behandlede neuroner. (F) Kvantificering af medianfluorescensintensitet (MFI) af MHCI på NeuN+ celler i medier (sort) og IFNβ-behandlede (røde) neuroner. Den statistiske signifikans blev beregnet ved hjælp af en ikke-fortringstest. **, P < 0,01. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Neuron vækstmedier (50 ml) | |||
| Reagens | Endelig koncentration | Koncentration af bestanden | I 50 ml |
| B27 tillæg | 2% | 100% | 1,0 ml |
| L-glutamin | 2 mM | 200 mM | 0,5 ml |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/ml | 10.000 U/ml | 0,5 ml |
| Neurobasal medier | 48,0 ml | ||
| FACS-buffer (500 ml) | |||
| Reagens | Endelig koncentration | Koncentration af bestanden | For 500 ml |
| Føtalt kvægserum | 2% | 100% | 10 ml |
| Edta | 1 mM | 500 mM | 1 ml |
| dPBS | 489 ml | ||
| Papain dissociation løsning | |||
| Reagens | Endelig koncentration | Koncentration af bestanden | I 1 ml |
| Papain Suspension | 20 U/ml | 1000 U/ml | 0,020 ml |
| DNase I | 2,5 U/ml | 2500 U/ml | 0,001 ml |
| Dvale-E | 1,0 ml | ||
| Bemærk: Mængden af Papain Dissociation Solution behov vil variere afhængigt af antallet af embryonale hjerner, der dissekeres. Forbered 0,5 ml pr. hjerne til hippocampale neuroner eller 1,0 ml pr. hjerne til kortikale neuroner. | |||
| Bemærk: Forbered dissociation opløsning ved hvirvlende papain suspension i Dvale-E i ca 3 min. Efter papain er grundigt opløst, tilsæt DNase I. Må ikke hvirvle dNase I. | |||
Tabel 1: Medier og løsninger.
Discussion
Denne protokol beskriver dissektion og kultur af primære hippocampal neuroner fra prænatal mus hvalpe på embryonale dag 18. Brugen af primære neuroner dyrket fra gnavere er en af de mest grundlæggende metoder udviklet i moderne neurobiologi22. Selvom udødeliggjorte cellelinjer kan modellere visse aspekter af neuroner, rejser deres natur som tumor-afledte celler, manglende udvikling af definerede axoner og fortsat celledeling tvivl om, hvorvidt de trofast opsummerer egenskaber af post-mitotiske neuroner in vivo23. Et andet alternativ til primære neuroner er brugen af menneskeskabte pluripotente stamceller (HiPSCs). Teknologien til brug af HiPSCs, især dem, der er patient-afledte, har udviklet sig hurtigt i de seneste år24. Der er dog stadig begrænsninger i arbejdet med HiPSC'er, herunder variation mellem cellelinjer, manglende funktionel modenhed og forskelle i epigenetiske profiler25. Selv om der også er begrænsninger for at arbejde med den reduktionistiske model af primære gnaver neuroner, kulturperler neuroner bevare post-mitotiske karakter af neuroner in vivo. De ekspansive molekylærbiologiske værktøjer og genetiske modifikationer, der er tilgængelige for mus, favoriserer brugen af primære neuroner over HiPSCs til mange applikationer, og museundersøgelser kan let oversættes til den mere komplekse in vivo-organisme uden at miste det eksperimentelle genetiske system. Af disse grunde bruger mange forskere primære gnaverneuroner til at verificere nøgleaspekter, hvis ikke hovedparten, af deres forskning.
For visse assays kan neuroner analyseres direkte efter isolation fra hjernen ex vivo. Dette er især ønskeligt for forsøg med voksne mus, der kan underkastes særlige forsøgsbetingelser, eller som kan afhænge af interaktioner mellem flere celletyper; Der er dog flere spørgsmål, der begrænser den type analyser, der kan gøres. Det er teknisk udfordrende at forberede en enkelt celle suspension af neuroner fra hjernen hos voksne mus, fordi neuroner er unikt forbundet og indkapslet af myelin26. Ikke-enzymatiske metoder til vævstrituration er ineffektive til at adskille vævet og forårsage celledød, mens enzymatiske præparater ofte kløver celleoverfladeantigener27. Desuden, mens myelin er stort set fraværende fra embryonale mus, det omfatter omkring 20% af den voksne hjerne, og kan forringe levedygtig celle isolation og hindre flow cytometri analyse28. Mange af de teknikker, der er udviklet i sidste ende strimler neuroner af deres cytosol og efterlader små, afrundede cellelegemer, der primært består afkerner 29. Selv om dette er acceptabelt for nogle analyser, er dette ikke hensigtsmæssigt til kvantificering af cytoplasmisk eller ekstracellulært proteinudtryk. Desuden gør det reduktionistiske cellekultursystem det muligt at teste specifikke mekanistiske spørgsmål på en kortere tidshorisont, end det ofte er muligt med et in vivo-system.
I denne protokol beskrives også metoder til at stimulere MHCI-ekspression farmakologisk med IFNβ og kvantificering af ekstracellulær MHCI-ekspression ved strømningscytometri. Stimulering af IFNβ er en nyttig positiv kontrol til test af andre eksperimentelle tilstande, men det kan bemærkes, at IFNγ og kainsyre også kan stimulere MHCI-ekspression i neuroner9,30, mens tetrodotoxin reducerer MHCI-udtrykket14. Tidligere metoder til påvisning af MHCI-udtryk var baseret på in situ-hybridisering og immunohistokemisk analyse14,15,20,31. Mens mRNA-baserede assays, såsom in situ hybridisering og qRT-PCR, kan bestemme spatiotemporal lokalisering, celletype specificitet, og niveauer af gentransskription, disse assays kan ikke vurdere protein oversættelse eller transport til plasmamembranen. Immunhistokemisk og vestlig blot analyse kan bestemme forskelle i proteinudtryk og potentielt cellulær lokalisering, men kan være svært at kvantificere nøjagtigt. Desuden genkender mange MHCI-antistoffer kompleksets tertiære struktur og er meget følsomme over for kropsbygningsændringer. Således resulterer gennemtrængning eller denaturering af tilstande i tab af MHCI immunoreaktivitet32. Den metode, der præsenteres her, bruger in situ immunostaining til MHCI, som giver mulighed for anerkendelse af proteinet ved antistoffet i dets oprindelige kropsbygning efterfulgt af fikserings- og gennemtrængningsmetoder.
Med små modifikationer kan de metoder, der er beskrevet her, bruges til at dyrke andre neuronale populationer eller til at vurdere ekspressionen af andre ekstracellulære proteiner af interesse. Bemærket i denne protokol er nemme ændringer, der kan foretages for at kultur kortikale neuroner, men de metoder, der er beskrevet her, kan også bruges til at dyrke andre neuronale populationer, såsom striatal neuroner33. Selv om denne protokol specificerer immunosangering af MHCI og NeuN, kan andre cellulære markører desuden identificeres på samme måde. Generelt kan ekstracellulære markører behandles som MHCI, og intracellulære markører kan behandles som NeuN. Det skal dog bemærkes, at under det cellulære dissociationstrin afhugges axonale fremskrivninger fra soma. Fordi gating strategi defineret her skærme ud cellulære vragrester og fokuserer på neuronale kerner markør NeuN, proteiner, der er udtrykt udelukkende i axonal fremskrivninger kan ikke påvises.
Indtil for nylig blev neuroner kun anset for at udtrykke MHCI som reaktion på skade, infektion eller in vitro cytokinstimulering for at engagere cytotoksisk CD8+ T-celler9. Ny forskning har belyst en anden funktion af MHCI i reguleringen synaptiske forbindelser under udvikling13. Den her beskrevne protokol bruger IFNβ til at stimulere MHCI-ekspressionen i vildtypekulturerede neuroner, men lignende metoder kan anvendes med en række cellulære stimuli eller genetiske modifikationer til at teste specifikke hypoteser. Denne metode vil gøre det muligt for forskere at undersøge de molekylære mekanismer, der regulerer MHCI-ekspressionen, hvilket vil forbedre forståelsen af MHCI's dikotome rolle på disse to forskellige cellulære funktioner.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIA R00 AG053412 (KEF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Laboratory Supplies |
| 100 mm sterile culture dish | Fisher | FB012924 | Tissue Culture Supplies |
| 15 ml Centrifuge Tubes | Genesee | 21-103 | Laboratory Supplies |
| 50 ml centrifuge tube | Genesee | 21-108 | Laboratory Supplies |
| 500 mM EDTA | Invitrogen | AM9260G | FACS Buffer Reagent |
| 70% Ethanol | Fisher | BP82031Gal | Tissue Culture Supplies |
| 96 well U-bottom plate | Genesee | 25-221 | Flow Cytometry Supplies |
| B27 | Gibco | 17504044 | Neuron Culture Reagent |
| Borate Buffer | Thermo Scientific | 28341 | Tissue Culture Supplies |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipette | Fisher | 13 678 20C | Laboratory Supplies |
| Cell Dissociation Buffer | Gibco | 13 151 014 | Flow Cytometry Supplies |
| DNase I | Thermo | 90083 | Dissociation Solution Reagent |
| dPBS | Gibco | 14190-235 | Tissue Culture Supplies |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Dissection Tool |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | Dissection Tool |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Tissue Culture Supplies |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 91113-10 | Dissection Tool |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | Dissection Tool |
| Fix and Perm Cell Permeabilization Kit | Invitrogen | GAS003 | Flow Cytometry Supplies |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Neuron Culture Reagent |
| Hibernate-E Medium | Gibco | A1247601 | Neuron Culture Reagent |
| Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher | 181254 | Tissue Culture Supplies |
| Interferon Beta | PBL Assay Science | 12405-1 | Flow Cytometry Supplies |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE Antibody, clone A60 | MilliporeSigma | FCMAB317PE | Flow Cytometry Antibody |
| Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | Neuron Culture Reagent |
| Pacific Blue anti-mouse H-2Kb Antibody | BioLegend | 116513 | Flow Cytometry Antibody |
| Papain Solution | Worthington | LS003126 | Dissociation Solution Reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Fixative |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Neuron Culture Reagent |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7280 | Neuron Culture Reagent |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 91100-12 | Dissection Tool |
| Stereo dissection microscope | Swift | M29TZ-SM99CL-BTW1 | Dissection Tool |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91401-10 | Dissection Tool |
| Transfer Pipets | Corning | 357575 | Laboratory Supplies |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | BioLegend | 101319 | Flow Cytometry Antibody |
| Trypan Blue | Sigma | T8154-100ML | Tissue Culture Supplies |
References
- Galea, I., Bechmann, I., Perry, V. H. What is immune privilege (not). Trends in Immunology. 28 (1), 12-18 (2007).
- Morimoto, K., Nakajima, K. Role of the Immune System in the Development of the Central Nervous System. Frontiers in Neuroscience. 13, 916 (2019).
- Klein, R. S., et al. Neuroinflammation During RNA Viral Infections. Annual Review of Immunology. 37, 73-95 (2019).
- Janeway, C. A. The T cell receptor as a multicomponent signalling machine: CD4/CD8 coreceptors and CD45 in T cell activation. Annual Review of Immunology. 10, 645-674 (1992).
- Peaper, D. R., Cresswell, P. Regulation of MHC class I assembly and peptide binding. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 24, 343-368 (2008).
- Donaldson, J. G., Williams, D. B. Intracellular Assembly and Trafficking of MHC Class I Molecules. Traffic. 10 (12), Copenhagen, Denmark. 1745-1752 (2009).
- Charles, A., Janeway, J., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. T cell-mediated cytotoxicity. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition. , (2001).
- Guidotti, L. G., Chisari, F. V. Noncytolytic control of viral infections by the innate and adaptive immune response. Annual Review of Immunology. 19, 65-91 (2001).
- Chevalier, G., et al. Neurons are MHC class I-dependent targets for CD8 T cells upon neurotropic viral infection. PLoS Pathogens. 7 (11), 1002393 (2011).
- Shrestha, B., Diamond, M. S. Role of CD8+ T Cells in Control of West Nile Virus Infection. Journal of Virology. 78 (15), 8312-8321 (2004).
- Plaisted, W. C., Weinger, J. G., Walsh, C. M., Lane, T. E. T cell mediated suppression of neurotropic coronavirus replication in neural precursor cells. Virology. 449, 235-243 (2014).
- Marten, N. W., Stohlman, S. A., Zhou, J., Bergmann, C. C. Kinetics of virus-specific CD8+ -T-cell expansion and trafficking following central nervous system infection. Journal of Virology. 77 (4), 2775-2778 (2003).
- Shatz, C. J. MHC class I: an unexpected role in neuronal plasticity. Neuron. 64 (1), 40-45 (2009).
- Corriveau, R. A., Huh, G. S., Shatz, C. J. Regulation of class I MHC gene expression in the developing and mature CNS by neural activity. Neuron. 21 (3), 505-520 (1998).
- Goddard, C. A., Butts, D. A., Shatz, C. J. Regulation of CNS synapses by neuronal MHC class I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (16), 6828-6833 (2007).
- Needleman, L. A., Liu, X. B., El-Sabeawy, F., Jones, E. G., McAllister, A. K. MHC class I molecules are present both pre- and postsynaptically in the visual cortex during postnatal development and in adulthood. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (39), 16999-17004 (2010).
- Syken, J., Grandpre, T., Kanold, P. O., Shatz, C. J. PirB restricts ocular-dominance plasticity in visual cortex. Science. 313 (5794), New York, N.Y. 1795-1800 (2006).
- Atwal, J. K., et al. PirB is a functional receptor for myelin inhibitors of axonal regeneration. Science. 322 (5903), New York, N.Y. 967-970 (2008).
- Takai, T. Paired immunoglobulin-like receptors and their MHC class I recognition. Immunology. 115 (4), 433-440 (2005).
- Lee, H., et al. Synapse elimination and learning rules co-regulated by MHC class I H2-Db. Nature. 509 (7499), 195-200 (2014).
- Ribic, A., et al. Activity-dependent regulation of MHC class I expression in the developing primary visual cortex of the common marmoset monkey. Behavioral and Brain Functions. 7, 1 (2011).
- Sahu, M. P., Nikkilä, O., Lågas, S., Kolehmainen, S., Castrén, E. Culturing primary neurons from rat hippocampus and cortex. Neuronal Signaling. 3 (2), (2019).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 1-8 (2013).
- Zhang, X., Hu, D., Shang, Y., Qi, X. Using induced pluripotent stem cell neuronal models to study neurodegenerative diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1866 (4), 165431 (2020).
- Berry, B. J., Smith, A. S. T., Young, J. E., Mack, D. L. Advances and Current Challenges Associated with the Use of Human Induced Pluripotent Stem Cells in Modeling Neurodegenerative Disease. Cells, Tissues, Organs. 205 (5-6), 331-349 (2018).
- Ho, H., et al. A Guide to Single-Cell Transcriptomics in Adult Rodent Brain: The Medium Spiny Neuron Transcriptome Revisited. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 159 (2018).
- Panchision, D. M., et al. Optimized Flow Cytometric Analysis of Central Nervous System Tissue Reveals Novel Functional Relationships Among Cells Expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
- Snaidero, N., Simons, M. Myelination at a glance. Journal of Cell Science. 127 (14), 2999-3004 (2014).
- Martin, D., Xu, J., Porretta, C., Nichols, C. D. Neurocytometry: Flow Cytometric Sorting of Specific Neuronal Populations from Human and Rodent Brain. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 356-367 (2017).
- Lv, D., et al. Neuronal MHC Class I Expression Is Regulated by Activity Driven Calcium Signaling. PLoS One. 10 (8), 0135223 (2015).
- Barco, A., et al. Gene expression profiling of facilitated L-LTP in VP16-CREB mice reveals that BDNF is critical for the maintenance of LTP and its synaptic capture. Neuron. 48 (1), 123-137 (2005).
- Glynn, M. W., et al. MHCI negatively regulates synapse density during the establishment of cortical connections. Nature Neuroscience. 14 (4), 442-451 (2011).
- Facci, L., Skaper, S. D. Culture of Rodent Cortical, Hippocampal, and Striatal Neurons. Methods Molecular Biology. 1727, 39-47 (2018).
