Detta protokoll beskriver en metod för odling av primära hippocampal nervceller från embryonala mus hjärnan. Uttrycket av stora histocompatibility komplexa klass I på den extracellulära ytan av odlade nervceller utvärderas sedan genom flöde cytometrisk analys.
Ökande bevis stöder hypotesen att neuro-immun interaktioner påverkar nervsystemet funktion i både homeostatic och patologiskt villkor. En välstuderad funktion av stora histocompatibility komplexa klass I (MHCI) är presentationen av cell-härledda peptider till det adaptiva immunsystemet, särskilt som svar på infektion. På senare tid har det visat sig att uttrycket av MHCI-molekyler på nervceller kan modulera aktivitetsberoende förändringar i synaptisk anslutning under normal utveckling och neurologiska störningar. Betydelsen av dessa funktioner för hjärnans hälsa stöder behovet av en känslig analys som lätt upptäcker MHCI-uttryck på nervceller. Här beskriver vi en metod för primär kultur av murin hippocampal nervceller och sedan bedömning av MHCI uttryck genom flöde cytometrisk analys. Murine hippocampus är mikrodisksekerad från prenatala musvalpar på den embryonala dag 18. Vävnaden dissocieras till en enda cellupphängning med enzymatiska och mekaniska tekniker, sedan odlas i ett serumfritt medium som begränsar tillväxten av icke-neuronala celler. Efter 7 dagars in vitro stimuleras MHCI-uttrycket genom att odlade celler behandlas farmakologiskt med betainterferon. MHCI-molekyler är märkta på plats med en fluorescerande märkt antikropp, sedan avskildes celler icke-enzymatiskt till en enda cellupphängning. För att bekräfta neuronal identitet, celler är fixerade med paraformaldehyd, permeabilized och märkt med en fluorescerande taggad antikroppar som känner igen neuronal nukleära antigen NeuN. MHCI uttryck kvantifieras sedan på nervceller genom flöde cytometrisk analys. Neuronala kulturer kan lätt manipuleras genom antingen genetiska modifieringar eller farmakologiska ingrepp för att testa specifika hypoteser. Med små modifieringar kan dessa metoder användas för att odla andra neuronala populationer eller för att bedöma uttryck för andra proteiner av intresse.
Centrala nervsystemet (CNS) ansågs en gång sakna immunövervakning, kallad “immunprivilegierad1“. Det är nu uppenbart att detta privilegium inte motsvarar den absoluta frånvaron av immunkomponenter, utan snarare en specialiserad förordning som fungerar för att begränsa skadorna i samband med immunopatologi1. Faktum är att kommunikation mellan CNS och immunsystemet är ett pågående samtal som är nödvändigt för hälsosam hjärnutveckling och svar på infektioner2,3.
Stora histokompatibilitet komplexa klass I (MHCI) molekyler är polygena och polymorfa transmembran proteiner mest kända för sin funktion i att presentera antigena peptider till CD8+ T celler under infektion4. Klassiska MHCI-komplex består av en transmembran α-kedja och en extracellulär ljuskedja, kallad β2-mikroglobulin. Den α innehåller ett polymorfa spår som binder en antigen peptid för presentation5. Korrekt uttryck av MHCI på det extracellulära membranet kräver samordnad verkan av molekylära förkläde vid det endoplasmatiska retikulumet för att säkerställa korrekt vikning av α-kedjan och β2-mikroglobulin tillsammans med belastningen av en hög affinitetpeptid ligand5. Endast när MHCI-komplex har monterats exporteras de från det endoplasmatiska retikulumet till plasmamembranet6. Vid in engagement av cognate T-cellreceptorn med det peptidbelastade MHCI-komplexet förmedlar CD8+ T-celler celldödande genom att släppa ut lytiska granulat som innehåller perforin och granzymer eller genom att inducera apoptos genom bindning Fas-receptorn på målcellmembranet7. Dessutom producerar CD8+ T-celler cytokiner, såsom gammainterferon (IFNγ) och tumörnekrosfaktor alfa (TNFα), som kan aktivera antivirala mekanismer i infekterade celler utan cytopatiska effekter8,9. För många neurotropa virus är CD8+ T-celler nödvändiga för att rensa infektionen från CNS10,11,12.
Man trodde tidigare att nervceller uttrycker MHCI endast under förhållanden av skador, viral infektion, eller med in vitro cytokin stimulering. Nyligen har forskning identifierat en roll för neuronalt uttryck av MHCI i synaptisk ombyggnad och plasticitet13,14. Även om de exakta mekanismerna bakom synapsregleringen inte är väl förstådda, indikerar data att MHCI-uttrycksnivå regleras av synaptiskaktivitet 15,16. En hypotes hävdar att nervceller uttrycker parat immunglobulinliknande receptor B (PirB) presynaptiskt, vilket binder MHCI transynaptically13,17. Denna interaktion initierar en signalkaskad av PirB som motsätter sig vägar som är involverade i synaptisk ombyggnad, vilket förstärker och stabiliserar den synaptiskaanslutningen 17,18,19. I avsaknad av neuronal aktivitet minskar MHCI-uttrycket14, och förlusten av MHCI resulterar i defekt synapseliminering och felorganiserade synaptiskakretsar 20,21.
Analysen beskrivs här, som anpassades från Chevalier et al.9, använder flöde cytometrisk analys för att kvantitativt bedöma extracellulära protein uttryck av MHCI på primära kulturer av murin hippocampal nervceller. Detta protokoll illustrerar de första teknikerna för microdissekerande hippocampal vävnad från embryonala mus valpar. Den beskriver sedan processer för enzymatisk och mekanisk dissociation av vävnad till en enda cell suspension och metoder för att upprätthålla kulturerna in vitro. Eftersom de inte delar sig, när de är i kultur, måste nervceller pläteras i en maträtt och densitet som är lämplig för deras experimentella slutpunkt. Därefter beskriver den steg för att inducera MHCI-uttryck med betainterferon (IFNβ), immunolabeling för MHCI och neuronal nuklei markör NeuN, och analysera celler genom flöde cytometri. Slutligen beskriver den förfaranden för att bedöma flöde cytometri data för att identifiera MHCI-positiva nervceller och kvantifiera nivån på MHCI uttrycket. Också noterat i detta protokoll är små justeringar som kan göras för att odla när nervceller utöver eller istället för hippocampal nervceller. Detta protokoll kan enkelt ändras för att testa specifika hypoteser med hjälp av genetiska variationer eller farmakologiska behandlingar.
Detta protokoll beskriver dissekering och kultur av primära hippocampal nervceller från prenatala mus valpar på embryonala dag 18. Användningen av primära nervceller odlade från gnagare är en av de mest grundläggande metoderna som utvecklats i modern neurobiologi22. Även om odödliga cellinjer kan modellera vissa aspekter av nervceller, deras natur som tumör-härledda celler, underlåtenhet att utveckla definierade axoner och fortsatt celldelning väcker tvivel om de troget rekapitulerar egenskaper hos post-mitotiska nervceller in vivo23. Ett annat alternativ till primära nervceller är användningen av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (HiPSCs). Tekniken för att använda HiPSCs, särskilt de som är patientbaserade, har utvecklats snabbt under de senaste åren24. Det finns dock fortfarande begränsningar för att arbeta med HiPSCs inklusive variation mellan cellinjer, brist på funktionell mognad och skillnader i epigenetiska profiler25. Även om det också finns begränsningar för att arbeta med reduktionistiska modellen av primära gnagare nervceller, odlade nervceller behåller den post-mitotiska karaktären av nervceller in vivo. De expansiva molekylärbiologiska verktygen och genetiska modifieringar som finns tillgängliga för möss gynnar också användningen av primära nervceller över HiPSCs för många applikationer, och musstudier kan enkelt översättas till den mer komplexa in vivo-organismen utan att förlora det experimentella genetiska systemet. Av dessa skäl använder många forskare primära gnagare nervceller för att verifiera viktiga aspekter, om inte huvuddelen, av deras forskning.
För vissa analyser kan nervceller analyseras direkt efter isolering från hjärnan ex vivo. Detta är särskilt önskvärt för experiment som involverar vuxna möss som kan utsättas för specifika experimentella tillstånd eller som kan bero på interaktioner av flera celltyper. Det finns dock flera frågor som begränsar vilken typ av analyser som kan göras. Det är tekniskt utmanande att förbereda en enda cell suspension av nervceller från hjärnan hos vuxna möss eftersom nervceller är unikt sammankopplade och ensheathed av myelin26. Icke-enzymatiska metoder för vävnadstrituration är ineffektiva vid dissociering av vävnaden och orsakar celldöd, medan enzymatiska preparat ofta klyver cellytans antigener27. Dessutom, medan myelin till stor del är frånvarande från embryonala möss, består den av cirka 20% av den vuxna hjärnan och kan försämra livskraftig cellisolering och hindra flödescytometrianalys28. Många av de tekniker som har utvecklats i slutändan strippa nervceller av deras cytosol och lämna små, rundade cellkroppar som främst består avatomkärnor 29. Även om detta är acceptabelt för vissa analyser, är detta inte lämpligt för kvantifiering cytoplasmic eller extracellulära protein uttryck. Dessutom tillåter reduktionistcellkultursystemet testning av specifika mekanistiska frågor på kortare tidsskala än vad som ofta är möjligt med ett in vivo-system.
Beskrivs också i detta protokoll är metoder för att stimulera MHCI uttryck farmakologiskt med IFNβ, och kvantifiering av extracellulära MHCI uttryck genom flöde cytometri. Stimulering av IFNβ är en användbar positiv kontroll för att testa andra experimentella tillstånd, men det kan noteras att IFNγ och kainsyra också kan stimulera MHCI-uttryck i nervceller9,30, medan tetrodotoxin minskar MHCI-uttryck14. Tidigare metoder för att upptäcka MHCI-uttryck som förlitats på in situ hybridisering och immunohistochemical analys14,15,20,31. Medan mRNA-baserade analyser, såsom in situ hybridisering och qRT-PCR, kan bestämma spatiotemporal lokalisering, celltyp specificitet och nivåer av gen transkription, dessa analyser kan inte bedöma protein översättning eller transport till plasma membranet. Immunohistochemical och western blot analys kan bestämma skillnader i protein uttryck och potentiellt cellulära lokalisering men kan vara svårt att exakt kvantifiera. Dessutom känner många MHCI-antikroppar igen komplexens tertiära struktur och är mycket känsliga för konformationsförändringar. Således permeabilization eller denaturering villkorar resulterar i förlust av MHCI immunoreactivity32. Metoden som presenteras här använder in situ immunostaining för MHCI, vilket möjliggör erkännande av proteinet av antikroppen i sin inhemska konformation, följt av fixering och permeabiliseringsmetoder.
Med små modifieringar kan de metoder som beskrivs här användas för att odla andra neuronala populationer eller för att bedöma uttryck för andra extracellulära proteiner av intresse. Noterat i detta protokoll är enkla ändringar som kan göras för att odla när nervceller, men de metoder som beskrivs här kan också användas för att odla andra neuronala populationer, såsom striatala nervceller33. Även om detta protokoll specificerar immunostaining av MHCI och NeuN, kan andra cellulära markörer identifieras på ett liknande sätt. I allmänhet kan extracellulära markörer behandlas som MHCI och intracellulära markörer kan behandlas som NeuN. Det bör dock noteras att under cellulära dissociation steg, axonal projektioner avskurna från soma. Eftersom gating strategi definieras här skärmar ut cellulära skräp och fokuserar på neuronal atomkärnor markör NeuN, proteiner som uttrycks uteslutande i axonal projektioner får inte detekteras.
Fram till nyligen, neuroner troddes uttrycka MHCI endast som svar på skador, infektion, eller in vitro cytokin stimulering för att engagera cytotoxiska CD8+ T celler9. Ny forskning har belyst en annan funktion av MHCI för att reglera synaptiska anslutningar under utveckling13. Det protokoll som beskrivs här använder IFNβ för att stimulera MHCI-uttryck i vilda typer odlade nervceller, men liknande metoder kan användas med en mängd olika cellulära stimuli eller genetiska modifieringar för att testa specifika hypoteser. Denna metod kommer att göra det möjligt för forskare att undersöka de molekylära mekanismer som reglerar MHCI-uttryck, vilket kommer att förbättra förståelsen för MHCI: s dichotomösa roll på dessa två distinkta cellulära funktioner.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NIA R00 AG053412 (KEF).
1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Laboratory Supplies |
100 mm sterile culture dish | Fisher | FB012924 | Tissue Culture Supplies |
15 ml Centrifuge Tubes | Genesee | 21-103 | Laboratory Supplies |
50 ml centrifuge tube | Genesee | 21-108 | Laboratory Supplies |
500 mM EDTA | Invitrogen | AM9260G | FACS Buffer Reagent |
70% Ethanol | Fisher | BP82031Gal | Tissue Culture Supplies |
96 well U-bottom plate | Genesee | 25-221 | Flow Cytometry Supplies |
B27 | Gibco | 17504044 | Neuron Culture Reagent |
Borate Buffer | Thermo Scientific | 28341 | Tissue Culture Supplies |
Borosilicate Glass Pasteur Pipette | Fisher | 13 678 20C | Laboratory Supplies |
Cell Dissociation Buffer | Gibco | 13 151 014 | Flow Cytometry Supplies |
DNase I | Thermo | 90083 | Dissociation Solution Reagent |
dPBS | Gibco | 14190-235 | Tissue Culture Supplies |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Dissection Tool |
Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | Dissection Tool |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Tissue Culture Supplies |
Fine Forceps | Fine Science Tools | 91113-10 | Dissection Tool |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | Dissection Tool |
Fix and Perm Cell Permeabilization Kit | Invitrogen | GAS003 | Flow Cytometry Supplies |
Glutamax | Gibco | 35050061 | Neuron Culture Reagent |
Hibernate-E Medium | Gibco | A1247601 | Neuron Culture Reagent |
Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher | 181254 | Tissue Culture Supplies |
Interferon Beta | PBL Assay Science | 12405-1 | Flow Cytometry Supplies |
Milli-Mark Anti-NeuN-PE Antibody, clone A60 | MilliporeSigma | FCMAB317PE | Flow Cytometry Antibody |
Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | Neuron Culture Reagent |
Pacific Blue anti-mouse H-2Kb Antibody | BioLegend | 116513 | Flow Cytometry Antibody |
Papain Solution | Worthington | LS003126 | Dissociation Solution Reagent |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Fixative |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Neuron Culture Reagent |
Poly-D-Lysine | Sigma | P7280 | Neuron Culture Reagent |
Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 91100-12 | Dissection Tool |
Stereo dissection microscope | Swift | M29TZ-SM99CL-BTW1 | Dissection Tool |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91401-10 | Dissection Tool |
Transfer Pipets | Corning | 357575 | Laboratory Supplies |
TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | BioLegend | 101319 | Flow Cytometry Antibody |
Trypan Blue | Sigma | T8154-100ML | Tissue Culture Supplies |