Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تحسين UPLC-UV طريقة ل الكم من فيتامين (ج) في أصناف الخس(Lactuca sativa L.) والمحاصيل البرية الأقارب(Lactuca spp.)

Published: June 30, 2020 doi: 10.3791/61440
Automatic Translation
*1,4, *2,4, 3, 1,4
1Unidad de Hortofruticultura, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2Unidad de Producción y Sanidad Animal, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 3Dpto Química Analítica, Escuela Politécnica Superior (Universidad de Zaragoza), 4Instituto Agroalimentario de Aragón - IA2 (CITA-Universidad de Zaragoza)
* These authors contributed equally

Summary

نقدم طريقة سريعة وموثوق بها لتحديد فيتامين C في لاكوكا SPP. باستخدام UPLC-UV، التي يحتمل أن تكون قابلة للنقل إلى نباتات أخرى. الخطوات الرئيسية هي إعداد العينة واستخراج فيتامين (ج) في ظل ظروف مستقرة، والحد من حمض ديهيدرواسكوبيك إلى حمض الاسكوربيك وتحسين الإجراء الكروماتوغرافي.

Abstract

الفيتامينات، وخاصة فيتامين (ج)، هي المغذيات الدقيقة الهامة الموجودة في الفواكه والخضروات. فيتامين C هو أيضا مساهم رئيسي في قدرتها المضادة للأكسدة. الخس هو واحد من الخضروات الأكثر شعبية بين المستهلكين في جميع أنحاء العالم. بروتوكول دقيق لقياس محتوى فيتامين (ج) في الخس والأنواع الأخرى ذات الصلة أمر بالغ الأهمية. نحن نُصف هنا طريقة تستخدم تقنية التصوير اللوني -فوق البنفسجية-البنفسجية السائلة فائقة الأداء، حيث تم تحسين إعداد العينة، واستخراج الفيتامينات، وظروف التصوير اللوني.

تم جمع عينات لتمثيل المصنع بأكمله، والمجمدة في -80 درجة مئوية وlyophilized لمنع الأكسدة غير المرغوب فيها وجعل التلاعب بهم أسهل. تم استخراج فيتامين (ج) في وسائل الإعلام الحمضية، مما ساهم أيضا في استقراره. كما يمكن أن يكون فيتامين (ج) موجودة في شكلين مختلفين، حمض الاسكوربيك (AA) وحمض ديهيدرواسكوبيك (DHAA)، وينبغي قياس كل من المركبات لقياس دقيق. تم قياس DHAA بشكل غير مباشر بعد تخفيضه إلى AA لأن AA يظهر absorptivity أعلى من DHAA في نطاق الأشعة فوق البنفسجية من الطيف. من المقتطف نفسه, تم إجراء قياسين, واحد قبل وواحد بعد أن الحد من التفاعل. في الحالة الأولى، كنا تحديد كمية المحتوى AA، وفي الثانية، ونحن كمي مجموع AA وDA (TAA: مجموع حمض الأسكوربيك) في شكل AA. ثم تم الحصول على كمية DHAA بشكل غير مباشر عن طريق طرح AA قادمة من القياس الأول من TAA. تم تحديدها بواسطة UPLC-UV، وذلك باستخدام معيار AA التجاري لبناء منحنى المعايرة وتحسين الإجراء الكروماتوغرافي، للحصول على قمم AA التي تم حلها بالكامل في وقت قصير. ويمكن استقراء هذا البروتوكول بسهولة على أي مواد نباتية أخرى مع تغييرات طفيفة أو معدومة. وكشفت دقته عن اختلافات ذات دلالة إحصائية غير من تصور. وتناقش نقاط القوة والقيود الأخرى في عمق أكثر في المخطوطة.

Introduction

الخس المزروع(Lactuca sativa L.) هو واحد من أكثر الخضروات الورقية المنتجة والمستهلكة في جميع أنحاء العالم ، مع إنتاج إجمالي حوالي 27.3 مليون طن في عام 20181. وينظر المستهلكون إلى الخس على أنه صحي. وتعزى الخصائص الغذائية أساسا إلى مصدر المركبات المضادة للأكسدة في المحصول، مثل فيتامين C، من بين أمور أخرى مثل البوليفينول وفيتامين E2. فيتامين ج هو المغذيات الدقيقة الأساسية للبشر على عكس العديد من الفقاريات الأخرى، كما أننا غير قادرين على إنتاجه بسبب الطفرات الموجودة في الترميز الجيني للانزيم الخطوة الأخيرة في المسار البيولوجي3. وهو مطلوب لعملية التمثيل الغذائي للخلايا الطبيعية، كما أنه يلعب دورا هاما في الاستجابات المناعية أساسا بسبب نشاطها المضادة للأكسدة3,4.

يتكون مجموع فيتامين C من حمض الاسكوربيك (AA) وحمض ديهيدرواسكوبيك (DHAA). AA هو الشكل الأكثر نشاطا بيولوجيا من فيتامين، ولكن DHAA (منتج الأكسدة) يظهر أيضا النشاط البيولوجي ويمكن تحويلها بسهولة إلى AA في جسم الإنسان5. ولذلك، فإن تحديد كلا الشكلين مهم لتحديد إجمالي محتوى فيتامين C لأي محصول بستين، بما في ذلك الخس.

وقد استخدمت مجموعة واسعة من النهج على أساس تقنيات تحليلية مختلفة لقياس فيتامين (ج) في الخضروات، مثل الأنزيمية، الطيفية، وأساليب titrimetric6،7،8. على الرغم من أن هذه الطرق بسيطة، فهي ليست محددة كيميائيا لAA9. وبالتالي، يفضل أساليب الكروماتوغرافي، وخاصة تقنية التصوير اللوني عالي الأداء السائل -الأشعة فوق البنفسجية (HPLC-UV)، وذلك بسبب دقتها العالية10. وقد استخدمت HPLC-UV لتحديد فيتامين C في تنوع كبير من المحاصيل, مثل القرنبيط, السبانخ والخس11,12,13. ومع ذلك، فإن القياس الكمي المتزامن للـ AA و DHAA معقد بسبب انخفاض الاستيعاب في DHAA في نطاق الأشعة فوق البنفسجية للطيف. بدلا من ذلك، يمكن تحديد DHAA بشكل غير مباشر باستخدام عامل خفض أن يحول DHAA إلى AA، وقياس مجموع حمض الاسكوربيك (TAA)، ومن ثم حساب الفرق بين TAA وAA. نظرا لضرورة انخفاض التفاعل, في بعض الدراسات, فقط AA تم تحديد كميا14, والتي يمكن أن تمثل في الواقع التقليل من نشاط فيتامين (ج). وهناك حاجة أيضا إلى أن رد فعل التخفيض إضافية لتحديد DHAA بشكل غير مباشر حتى عندما يتم استخدام التقدم الأخير في تقنيات الكروماتوغرافيا السائلة، لونية سائلة فائقة الأداء (UPLC). وتستفيد هذه الخطوة أيضا من المزايا التي يعرضها UPLC عند مقارنتها بـ HPLC: زيادة الكفاءة والدقة، وزيادة الحساسية، وتحليل الوقت الأقصر، والاستهلاك الأقل للمذيبات15. ونتيجة لذلك، تم استخدام تقنية UPLC-UV لتحديد كمية فيتامين C في المحاصيل المختلفة16.

بالإضافة إلى ذلك ، AA هو جزيء لاتمل جدا . وهكذا، من المهم وضع بروتوكول يمنع تدهوره أثناء تخزين الخس وتحليل فيتامين C9. وفي هذا السياق، يقدم البروتوكول التالي تحديدًا كميًا سريعًا ومحسّنًا لمحتوى فيتامين C في الخس بواسطة UPLC-UV، بالإضافة إلى إجراء استخراج فعال. ولم تدرج أصناف النخبة في هذه الدراسة فحسب، بل أدرجت أيضا في الأراضي التقليدية وبعض الأقارب البرية بسبب اهتمامهم المحتمل بتربية المحاصيل، وتحديدا في تحسين القيمة الغذائية للخس.

Protocol

1- إعداد المواد النباتية

  1. عينة ما لا يقل عن اثنين من الأوراق لكل مصنع في أنابيب البولي بروبلين 50 مل، الخارجي (كبار السن) والداخلية (الأصغر) واحدة من أجل تمثيل أكثر دقة النبات كله. جمع ما لا يقل عن ثلاثة متماثلة بيولوجية لكل عينة.
  2. تجميدها على الفور باستخدام النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. تأكد من أن النيتروجين السائل لا يحصل في الأنابيب; وإلا فإنها يمكن أن تنفجر عند إزالتها بسبب توسع الغاز أثناء التبخير.
    تنبيه: يلزم وجود قفازات ودرع وجه بسبب المخاطر المحتملة المرتبطة باستخدام النيتروجين السائل.
  3. إزالة القبعات من الأنابيب ووضعها على الصواني داخل غرفة مجفف تجميد من lyophilizer (جدول المواد) المبرمجة على النحو التالي: -25 درجة مئوية لمدة 72 ساعة، -10 درجة مئوية لمدة 10 ساعة، 0 درجة مئوية لمدة 10 ساعة، و 20 درجة مئوية لمدة 4 ساعات على الأقل. الحفاظ على درجة حرارة المكثف والثابت فراغ خلال عملية تجميد التجفيف في -80.2 درجة مئوية و 112 mTorr، على التوالي.
  4. عندما تكون المادة جافة تماما (بين 4 و 7 أيام اعتمادا على النبات ودرجة الضغط في أنبوب)، والحفاظ على 4 درجة مئوية، -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية لفترة قصيرة (أيام إلى أسابيع)، متوسطة (أشهر) أو طويلة (سنوات) التخزين، على التوالي. ويوصى بإدراج أكياس تحتوي على حبات هلام السيليكا في الأنابيب المحتوية على العينة.
  5. ضع العينات المزيلة في أنابيب البولي بروبلين 20 مل مع كرات الفولاذ المقاوم للصدأ قطرها 10 مم وطحنها مع دوامة متعددة المستويات باستخدام الكثافة والوقت اللازمين للحصول على غبار ناعم.
    ملاحظة: خلال العملية بأكملها، حماية العينات من التعرض للضوء المباشر.

2. كاشف وإعداد الحل

  1. إعداد محلول استخلاص المذيبات: 8٪ حمض الخليك (v/v)، 1٪ MPA (حمض الفوسفوريك الفوقي) (ث / الخامس)، 1 mM EDTA (حمض الإيثيلين didiaminetetraacetic).
    1. حساب الحجم الإجمالي للمذيبات اللازمة لمعالجة مجموعة كاملة من العينات مع الأخذ في الاعتبار أن 5 مل سيتم إضافة إلى كل. لإعداد 1 لتر من الحل، إضافة إلى قارورة: 30 غرام من MPA، 0.372 غرام من الجفاف EDTA، 80 مل من حمض الخليك و 500 مل من المياه فائقة السخ (حجم كميات وكميات وفقا لذلك). ختم الفم قارورة مع فيلم من البلاستيك.
    2. مرة واحدة حل بمساعدة من مُحرك مغناطيسي، استخدم قارورة حجمية لقياس بدقة 1 L، مضيفا الماء اللازم فائقة السخاء.
  2. إعداد العازلة تفاعل الحد من (0.5 M تريس (2-أمينو-2-(هيدروكسي ميثيل)-1،3-بروبانديول) درجة الحموضة 9.0) والحد من الحل (40 M DTT (1،4-Dithiothreitol) مع 0.5 M تريس درجة الحموضة 9.0).
    1. حساب الحجم الإجمالي للحد من الحل اللازمة لمعالجة مجموعة كاملة من العينات مع الأخذ في الاعتبار أن 200 سوف تضاف μL إلى كل منها. لإعداد 100 مل من العازلة، إضافة إلى الكأس: 6.055 غرام من تريس و 90 مل من المياه فائقة الخطورة (حجم الحجم والكميات وفقا لذلك). ختم الفم منقار مع فيلم من البلاستيك.
    2. بمجرد حلها بمساعدة من مُحرك مغناطيسي، اضبط المحلول إلى درجة حِس 9.0 بإضافة 2 M HCl واستخدم قارورة حجمية لقياس 100 مل بدقة، إضافة إلى الماء اللازم فائق الخطورة.
    3. لإعداد 100 مل من محلول الخفض، أضف إلى الكأس: 0.629 غرام من DTT (نقاء: 98٪) و 90 مل من العازلة (0.5 M تريس الرقم PH 9.0) أعدت سابقا (2.2.1 إلى 2.2.2). حجم الأحجام والكميات وفقا لذلك. ختم الفم منقار مع فيلم من البلاستيك.
    4. مرة واحدة حل بمساعدة من مُحرك مغناطيسي، استخدم قارورة حجمية لقياس بدقة 100 مل، مضيفاً حجم اللازمة من العازلة 0.5 M تريس 9.0 pH.
      ملاحظة: حل تقليل غير مستقر جداً. هذا هو السبب في أن الحل الطازج يوصى به بشدة.
  3. حامض الكبريتيك (0.4 M H2SO4)
    1. حساب الحجم الإجمالي للحمض الكبريتيك 0.4 M اللازمة لمعالجة مجموعة كاملة من العينات مع الأخذ في الاعتبار أن 200 سوف تضاف إلى كل μl. لإعداد 100 مل من الحل، إضافة إلى الكأس: 80 مل من الماء فائقة النقاء ثم 2.22 مل من H2SO4 (نقاء: 96٪، الكثافة: 1.84 غرام مل-1). استخدام قارورة الحجمي لقياس بدقة 100 مل، مضيفا المياه الفائقة السخاء اللازمة.
      تنبيه: حمض الكبريتيك هو تآكل جدا، لذلك يجب التعامل معها باستخدام معدات واقية وتحت غطاء محرك السيارة. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي إضافة حمض للمياه فائقة الخطورة، وليس الماء إلى حمض، للحد من الأبخرة وتجنب الحوادث.
  4. حمض الهيدروكلوريك (2 M HCl).
    1. لإعداد 100 مل من 2 M حمض الهيدروكلوريك، إضافة إلى الكأس: 80 مل من الماء فائقة النقاء ثم 6.13 مل من حمض الهيدروكلوريك (نقاء: 37٪، كثافة: 1.19 غرام مل-1). ختم الفم منقار مع فيلم من البلاستيك. استخدام قارورة الحجمي لقياس بدقة 100 مل، مضيفا المياه الفائقة السخاء اللازمة. حجم وحدات التخزين وفقا لذلك.
      تنبيه: حمض الهيدروكلوريك متآكل للغاية، لذلك يجب التعامل معه باستخدام معدات الحماية وتحت غطاء محرك السيارة. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي إضافة حمض للمياه فائقة الخطورة، وليس الماء إلى حمض، للحد من الأبخرة وتجنب الحوادث.
  5. AA القياسية (المخزون والتخفيف)
    1. تزن بالضبط 10 ملغ من AA القياسية (النقاء: 99٪) باستخدام توازن الدقة وإضافة 90 مل من المرحلة المتنقلة (فائقة الخطورة درجة الحموضة المياه 2.0 مع حمض فورميك).
    2. مرة واحدة حل بمساعدة من مُنجل مغناطيسي، استخدم قارورة حجمية لقياس بدقة 100 مل، مضيفا الحجم اللازم من درجة الحموضة للماء فائقة السخاء 2.0 مع حمض الفورميك.
      ملاحظة: حماية هذا الحل الأسهم من التعرض للضوء.
    3. إعداد خمسة تخفيفات من المخزون من معيار AA للحصول على منحنى المعايرة باتباع التعليمات الواردة في الجدول 1 والمضي قدما في الخطوة 5.2.
القياسيه [ألف] (ميكروغرام مل-1) AA (100 ميكروغرام مل-1) حل (μL) المرحلة المتنقلة (μL)أ
1 0.5 5 995
2 2.5 25 975
3 5 50 950
4 10 100 900
5 25 250 750
(أ) فائقة البور درجة الحموضة المياه 2.0 حموضة بواسطة حمض فورميك.

الجدول 1: بروتوكول لإعداد خمسة معايير من AA (حمض الأسكوربيك). يشار إلى كميات من المذاب والمذيبات لإعداد كل من التركيزات المختلفة للمعايير.

3. استخراج AA وDA

ملاحظة: يوصى بالعمل في ظروف من شدة الإضاءة المنخفضة أثناء خطوات الاستخراج.

  1. إلى أنبوب الطرد المركزي البولي بروبلين 15 مل، إضافة 50 ملغ من عينة الأرض الlyophilized و 5 مل من المذيبات استخراج (الخطوة 2.1).
  2. يهز الخليط باستخدام دوامة لمدة 5 S ثم شاكر المداري لمدة 10 دقيقة في 2000 دورة في الدقيقة.
  3. إدخال أنبوب في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الموجات فوق الصوتية تنشيط.
  4. جهاز طرد مركزي عند 4000 x غم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  5. اتخاذ supernatant، وتمريره من خلال مرشح السليلوز 0.22 ميكرومتر مجددة وتخزينه في قارورة العنبر 5 مل. هذا هو استخراج 1، الذي يحتوي على AA وDA.
    ملاحظة: يمكن أن توقف البروتوكول هنا عن طريق تجميد مقتطفات في -80 درجة مئوية وحمايتها من التعرض للضوء كما AA وDA غير مستقرة جدا وتتحلل بسهولة في وجود الضوء، في درجات حرارة عالية أو تحت الأجواء المؤكدة(ملف إضافي 1).

4. تخفيض DHAA إلى AA لاستخراج TAA

  1. نقل 200 ميكرولتر من استخراج 1 إلى 2 مل قارورة العنبر ل اللوني السائل وإضافة 200 μL من حل الحد (الخطوة 2.2). أغلق القارورة بمكونات PTFE-silicone مع فتحة ما قبل الفتح واهتزها مع دوامة لمدة 5 s.
  2. السماح للحل أن يقف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وحماية من الضوء.
  3. أضف 200 ميكرولتر من 0.4 M H2SO4 لوقف التفاعل وتثبيت AA في الأسيحام. الحل الناتج هو استخراج 2، الذي يحتوي على AA فقط وهو في الواقع TAA.

5- التصميم

  1. UPLC-الأشعة فوق البنفسجية إعداد
    1. إعداد حلول العمل الموضحة في الجدول 2، تمت تصفيتها بشكل مناسب من خلال مرشحات 0.22 ميكرومتر ، سونيكاتيد لمدة 10 دقيقة على الأقل ووضعها في نظام UPLC.
    2. قم بتشغيل وحدات UPLC الثلاث وانتظر حتى تنتهي عملية المعايرة الداخلية.
    3. فتح البرنامج (على سبيل المثال، تمكين 3) وتحميل البرنامج مفيدة الموصوفة في الجدول 2: تمكين 3 | تشغيل عينات | طريقة فيتامين سي | UPLC_PDA | استخدم التشغيل السريع.
    4. مرة واحدة يتم تحميل البرنامج مع البرنامج الصحيح، والوصول إلى وحدة التحكم إدارة UPLC: مدير المذيبات الرباعية | انقر بزر الفأرة الأيمن | وحدة التحكم في التشغيل.
    5. المضي قدما في إعداد وتثبيت صك UPLC : النظام | التحكم | بدء التشغيل.
      1. تطهير جميع خطوط UPLC لمدة 5 دقائق على الأقل: مذيبات رئيس | QSM | فحص A، B، C، D وغسل الختم | مدة رئيس > 5 دقيقة.
      2. تطهير وتنظيف حاقن: المذيبات رئيس | SM | تحقق من المذيبات غسل (> 45 s) والتحقق من تطهير المذيبات (> 35 دورات).
      3. اكويبيل UPLC للشروط الأسلوب: اكويبيل إلى الأسلوب | QSM | تدفق (0.3 مل دقيقة-1) | المذيب A (2%) | المذيب B (0٪ ) | المذيب C (98٪) | D المذيب (0%)؛ توازن إلى الأسلوب | SM | عينة (5 درجة مئوية) | عمود (30 درجة مئوية) و اكوايب إلى الأسلوب | أخرى | فحص مصباح على | اضغط على ابدأ.
      4. انتظر ما لا يقل عن 1 ساعة (ينصح بمزيد من الوقت) للمعدات لتحقيق الاستقرار. يمكن التحقق من الاستقرار التحقق من الضغط في العمود في وحدة التشغيل: النظام | مدير المذيبات الرباعية | QSM ضغط النظام. تأكد من عدم وجود اتجاهات محددة في تغيرات الضغط (إما زيادة أو نقصان) وقيمة دلتا أقل من 10 psi.
    6. في شاشة التشغيل السريع، تعبئة المصفوفة بأسماء المعايير والعينات التي سيتم تحليلها.
  2. AA تحديد في المعايير
    1. نقل 1 مل من كل من المعايير الخمسة AA التي تم إعدادها سابقا (الخطوة 2.5.3) إلى 2 مل قنينات العنبر ل اللون الكروماتوغرافيا السائلة. أغلق القارورة بمكونات PTFE-سيليكون مع فتحة ما قبل الفتح وحقن 5 ميكرولتر في جهاز UPLC.
    2. تنفيذ الكروماتوغرافيا التالية للإجراء الموضح في الجدول 2 بدءا من معظم المخفف إلى الأكثر تركيزا.
  3. AA تحديد في العينات
    1. Pipette 200 ميكرولتر من استخراج 1 في 2 مل قارورة العنبر ل اللوني السائل وإضافة 800 ميكرولتر من الماء فائقة الpure. أغلق القارورة بمكونات PTFE-سيليكون مع فتحة ما قبل الفتح وحقن 5 ميكرولتر في جهاز UPLC.
    2. تنفيذ الكروماتوغرافيا بعد الإجراء الموصوف في الجدول 2.
  4. TAA تحديد في العينات
    1. إضافة 400 μL من المياه فائقة الpure لاستخراج 2. أغلق القارورة بمكونات PTFE-سيليكون مع فتحة ما قبل الفتح وحقن 5 ميكرولتر في جهاز UPLC.
    2. تنفيذ الكروماتوغرافيا بعد الإجراء الموصوف في الجدول 2.
المكونات والمعلمات وصف
الصك ابراء UPLC H-الفئة
كاشف PDA eλ كاشف λabs لAA = 245 نانومتر
البرمجيات تمكين 3
العمود ابراء UPLC HSS T3 (150 مم × 2.1 مم × 1.8 μm)
القناة أ CH3OH
قناة ب / غسل H2O:CH3OH (50:50 v:v)
قناة C فائقة البور درجة الحموضة المياه 2.0 حموضة بواسطة حمض فورميكأ
قناة D / غسل الختم المياه فائقة الpure:acetonitrile (90:10 v:v)
مرحلة المحمول 0.3 مل1 من 2% A + 98% C (وضع متساوي الراسك)
درجة حرارة العمود 30 درجة مئوية
درجة حرارة اampler 5 درجة مئوية
حجم الحقن 5 ميكرولتر
وقت الاحتفاظ بـ AA 1.874 دقيقة
تشغيل الوقت 3 دقائق
(أ) حجم غير محدد من حمض الفورميك المستخدمة حتى تعديل الأسي

الجدول 2: إجراء الكروماتوغرافي الأمثل لتحديد AA (حمض الاسكوربيك) في مقتطفات من الخس والأقارب البرية. وصف المكونات والشروط والحلول المستخدمة.

6. القياس الكمي للA وDA

  1. التحليل الإحصائي
    1. تحديد البارامترات التحليلية لأسلوب الكروماتوغرافي كما وصفها برتولين وآخرون18 (الجدول 3).
      ملاحظة: يجب تحديد قيم المعلمات الواردة في الجدول 3 في ظل ظروف تجريبية محددة.
المعلمات التحليلية للأسلوب القيم
نطاق خطي (μg مل-1) 0.5-25
المعادلة الخطية y = 53,143.03x
R2 0.99998
حد الكشف (ملغ AA ز-1 من المادة الجافة) 0.013
حد القياس الكمي (ملغ AA ز-1 من المادة الجافة) 0.045
التكرار (السيرة الذاتية،%) 1.75
الدقة المتوسطة (السيرة الذاتية،%) 4.22
الاستعادة (Rec,%) 95-6±2-4
(أ) السيرة الذاتية: معامل التغير
(ب) تم إجراء اختبار الاسترداد مع 10 aliquots تحتوي على 50 ملغ من نفس العينة، 5 ارتفعت مع 2 ملغ من AA ز-1 من المادة الجافة، و 5 غير ارتفعت. %Rec=([AA]spiked نموذج-[AA]sample)/([AA]spiked) x100.

الجدول 3: المعلمات التحليلية المثلى للكشف عن حمض الأسكوربيك (حمض الأسكوربيك) و TAA (مجموع حمض الأسكوربيك) وتحديد كمّية هذه البارامترات. تم الحصول على النطاق الخطي، والمعادلة ومعامل تحديد منحنى المعايرة (R2)،وكذلك حدود الكشف عن AA وتحديد كميتها (نفس بالنسبة لـ TAA)، وقابلية التكرار والدقة المتوسطة والاسترداد مع حجم حقن العينة 5 ميكرولتر.

  1. حساب تركيز AA و TAA.
    1. فتح معيار وعينة الكروماتوجرامات: التشغيل السريع | تصفح المشروع | قنوات | "اسم معيار أو عينة" | المساعد الشخصي الرقمي Ch1 245 nm@1.2 نانومتر.
    2. دمج الذروة المقابلة (AA أو TAA) في المعايير والعينات بالنقر على نقطة البداية (حوالي 1.790 دقيقة) وسحبها مع الماوس إلى نقطة النهاية (حوالي 1.910 دقيقة).
    3. بناء منحنى معايرة تمثل قيم الامتصاص المحددة الكروماتوغرافيا (الخطوة 5.2.) ضد تركيز المعايير الخمسة AA المعدة أعلاه(الجدول 1).
    4. 10 - استيفاء قيم الامتصاص للعينات المحددة في الخطوتين 5-3 و5-4 والحصول على تركيز AA و TAA، على التوالي، بالصيغة التالية:
      Equation 1
      حيث y هو منطقة الذروة المتكاملة، س هو AA أو TAA التركيز في جزء في المليون وm و n هي المنحدر وy-intercept خط الانحدار الذي تم الحصول عليه، على التوالي.
    5. لحساب تركيز DHAA، وتطبيق الصيغة التالية:
      Equation 2
      ملاحظة: للحصول على تركيزات إجمالية من DHAA، AA و TAA في ملغ ز-1 من الوزن الجاف، والقيم التي تم الحصول عليها مباشرة في منحنى المعايرة يجب أن تكون مضروبة في حجم استخراج الإجمالي وعامل التخفيف المطبق، ومن ثم تقسيمها على وزن العينة المستخدمة لتنفيذ الاستخراج.

Representative Results

يتطلب تحديد كمي فيتامين ج في مصفوفات Lactuca تطوير نهج الكروماتوغرافي يمكن أن يضمن نتائج موثوقة. ويبين الشكل 1A خروماً ناتجاً عن بروتوكول غير محسن(ملف إضافي 2)، الذي يقدم ذروة AA مع "الكتف" الثانوية غير معروفة الهوية. ومع ذلك، بعد تحسين ظروف الاستخراج والكروماتوغرافية، تم التوصل إلى حل AA الذروة دون تداخل مركبات غير معروفة(الشكل 1B). وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام معدات UPLC-UV بدلاً من HPLC-UV سمح لنا بتقليل وقت الاحتفاظ (RT) لـ AA: 1.874 دقيقة في الكروماتوغرامات المحسنة مقابل 2.980 دقيقة في غير المحسنة(الشكل 1) ، بالإضافة إلى أوقات التشغيل ، 3 و 7 دقائق للبروتوكولات المحسنة وغير المحسنة ، على التوالي.

Figure 1
الشكل 1: الكروماتوغرام من AA في نفس عينة الخس (أصناف تجارية 'Begoña'). (A) HPLC-UV الكروم الناتجة عن بروتوكول غير محسن (الشروط الموضحة في الملف التكميلي 2). (B) UPLC-UV الكروماتجرام التي تم الحصول عليها مع بروتوكول الأمثل (الشروط الموضحة في الجدول 2). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

التدخلات في AA القمم، مثل تلك التي لوحظت في الشكل 1A،أدى باستمرار إلى التقليل من فيتامين C (AA، DHAA و TAA) المحتوى(الشكل 2)بسبب عدم كفاية الفصل أثناء عملية الكروماتوغرافي كما تم دمج مناطق الذروة المتداخلة من قبل انخفاض عمودي عند أعمق نقطة بينهما. هذا التحيز ملحوظ بشكل خاص في حالة الأقارب البرية المحاصيل، وخاصة في DHAA ومحتوى TAA(الشكل 2).

Figure 2
الشكل 2: توزيع محتوى فيتامين C. تقسيم المؤامرات الكمان من DHAA، AA و TAA المحتوى (ملغ ز-1 من الوزن الجاف) في أصناف الخس التجارية والتقليدية وبعض الأقارب البرية باستخدام بروتوكولات غير الأمثل والمحسنة. تظهر الخطوط السوداء قيم الوسط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وعلاوة على ذلك، منعنا استخدام بروتوكول غير محسن من استخراج أي استنتاج مفيد من النتائج لأنها أظهرت جميع العينات، كلا النوعين من الخس والأقارب البرية، وجود محتوى مماثل من فيتامين C. وعلى النقيض من ذلك، فإن البروتوكول الأمثل سمح لنا بالكشف عن الاختلافات ذات الأهمية الإحصائية فيما بينها بالنسبة لمحتوى DHAA و TAA(الجدول 4)،وأغنىها هي الأنواع البرية (الشكل 2).

غير مُحسّن الامثل
F-نسبة p-قيمة F-نسبة p-قيمة
DHAA 0.460 0.637ns 5.613 0.009**
Aa 0.070 0.932ns 1.020 0.374ns
TAA 0.015 0.985ns 4.438 0.022*
nsو * و ** تشير إلى غير هامة وكبيرة في p<0.05 و 0.01 على التوالي.

الجدول 4: التباين في محتوى فيتامين (ج). نسب F (حاصل من اثنين من الفروق، الفرق بين المجموعة والتباين داخل المجموعة) وقيم الأهمية من ANOVA في اتجاه واحد النظر في نوع Lactuca (أصناف الخس التجارية، وأصناف الخس التقليدية، والأقارب البرية المحاصيل) ل DHAA، AA و TAA المحتوى في بروتوكولات غير الأمثل والمحسنة.

ملف تكميلي 1: AA و TAA الاستقرار في 5 درجة مئوية على 24 ساعة. (أ)AA و TAA مناطق الذروة في جميع أنحاء 24 ح . (ب) AA و TAA المحتوى (ملغ ز-1 من الوزن الجاف) في جميع أنحاء 24 ساعة. تمثل الأشرطة الانحرافات المعيارية لاثنين من النسخ المتماثلة التقنية (n = 2) التي يتم الاحتفاظ بها في الاختزال التلقائي عند 5 درجة مئوية وحمايتها من التعرض للضوء. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

ملف تكميلي 2: الاختلافات الرئيسية بين الأمثل والبروتوكول غير الأمثل ل تا، AA و DHAA استخراج و الكم. وكانت العينات المستخدمة هي نفسها في كلتا الحالتين. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

فيتامين ج هو عنصر غذائي مهم جدا، لكنه مركب لتيل جدا جدا، لذلك له UPLC-الأشعة فوق البنفسجية الكم يعتمد على عوامل متعددة، مثل تخزين العينة وإعداد، وطريقة الاستخراج والظروف الكروماتوغرافي. لذلك، كان هناك حاجة إلى إجراء سريع وبسيط لمنع AA (مع قوة مضادة للأكسدة) أكسدة إلى DHAA (بدون خصائص مضادة للأكسدة). وكان من الضروري أيضا تجنب ارتفاع درجة الحرارة ودرجة الحرارة الظروف، فضلا عن الضوء الشديد والغلاف الجوي المؤكد أثناء العلاج عينة لتعزيز استقرار المجمع.

للحد من أكسدة AA، اتخذت التدابير التالية. أولاً، تم حقن العينات كمواد بداية لكلا البروتوكولين لضمان التحديد الكمي الدقيق لمحتوى فيتامين C والتلاعب بسهولة بالعينات. وكان يفضل هذا الخيار على طحن غرامة، وجدت عادة في جميع أنحاء الأدب19، كما يذوب الغبار بسرعة كبيرة حتى يصبح الماء المتاحة مرة أخرى. أثناء إجراء الاستخراج، تم استخدام حجم أعلى من محلول أكثر حمضية (8٪ حمض الخليك و 1٪ من الـ MPA) كمستخرج في البروتوكول الأمثل(الملف التكميلي 2)، والذي يعمل أيضًا كمثبت عن طريق منع تدهور AA. هذا الحل الوارد أيضا EDTA كعامل شيلاتينغ لزيادة الاستقرار16، على عكس الاستخراج في البروتوكول غير الأمثل(ملف تكميلي 2). وعلاوة على ذلك، اختبرنا ما إذا كان من الممكن تعزيز إجراء الاستخراج باستخدام اثنين من الاستخراج المتتالية مع 2.5 مل من الاستخراج بدلا من واحد مع 5 مل وتحت الغلاف الجوي N2 بدلا من الظروف الجوية القياسية. تم التوصل إلى أفضل النتائج باستخدام استخراج واحد فقط في ظل جو غير معدل، مما أدى إلى تبسيط البروتوكول من خلال اتخاذ خطوات إضافية غير ضرورية (البيانات غير مبينة). كما أدخلت تغييرات طفيفة أخرى في البروتوكول من أجل تعزيز استخراج (أي صوتنة)، والحصول على استخراج أوضح (الترشيح أدق) وتقليل مدة البروتوكول(ملف إضافي 2). وفيما يتعلق بالظروف الكروماتوغرافية، تم التحقق من الطريقة كما ذكر قبل18،وضمان المعلمات التحليلية الجيدة(الجدول 3). الى جانب ذلك، واستخدام المياه فائقة الpure مع حمض فورميك (pH 2.0) والميثانول (98:2 v:v: v) مع تدفق 0.3 مل مين-1، بدلا من فوسفات مونوبوتاسيوم 30 مل م (pH 3.0) في 1 مل دقيقة-1 كما المرحلة المتنقلة(ملف تكميلي 2)،أدى إلى تحسين طريقة. وكان من المرجح أن يكون التقدم الأكثر أهمية باستخدام نظام UPLC بدلاً من HPLC ، مما سمح لنا بقدر أكبر من التحكم في الظروف المؤثرة (مثل درجة الحرارة) مما أدى إلى حل قمم AA دون تدخلات من قبل مركبات غير معروفة ، في وقت أقصر واستهلاك حجم أقل من استخراج (ملف إضافي 2).

ومع ذلك، هناك حدان رئيسيان لهذه الطريقة. الأول هو أنه لا يمكن قياس DHAA مباشرة باستخدام كاشف الأشعة فوق البنفسجية بسبب انخفاض الاستيعاب في نطاق الأشعة فوق البنفسجية من الطيف. من المهم تحديد محتوى DHAA لأنه يعرض بعض الأنشطة البيولوجية ويسهل تحويلها إلى AA في جسم الإنسان5. لذلك، هناك حاجة إلى رد فعل إضافي للحد من DHAA إلى AA، جنبا إلى جنب مع تشغيل الكروماتوغرافي الثاني من أجل قياس TAA ومن ثم تحديد DHAA بشكل غير مباشر عن طريق طرح AA المحتوى من TAA(الشكل 3). في هذا المعنى، وقد تم تحسين خطوة التخفيض باستخدام تركيز أعلى من وكيل خفض (DTT)، وزيادة وقت رد الفعل من 5 إلى 30 دقيقة، ووقف التفاعل مع حامض الكبريتيك(ملف تكميلية 2). ويشكل انخفاض استقرار AA القيد الثاني للأسلوب. كما AA يبدأ في التحلل 4 ح بعد استخراج (ملف تكميلية 1),فمن الضروري أن يحدد كميا في هذا الفاصل الزمني. لذلك، فإن عدد العينات لاستخراج مشروط من قبل إجراء الكروماتوغرافي. هذا هو السبب في أننا نقترح تجميدها في تلك الخطوة في هذا البروتوكول ، على الرغم من أنه في هذه الحالة ، لا يمكن وضعها جميعًا في أوتزل أوتوماتيبلر ليتم قياسها تلقائيًا. لحسن الحظ، RT مخفضة لAA سمح لنا للحصول على الكروماتوميجرامات 3 دقيقة، أقصر بكثير من الكروماتوجرامات 7 دقيقة التي تم الحصول عليها باستخدام HPLC (ملف تكميلية 2). وبالتالي، يمكن تحديد محتوى فيتامين C في عدد كبير من العينات في نافذة 4 ساعة.

Figure 3
الشكل 3: سير عمل القياس الكمي لفيتامين C في الخس وبعض الأقارب البرية.
مخطط تخطيطي للبروتوكول الأمثل الذي يظهر فرعين لتحديد AA فقط أو AA + DHAA (TAA). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

كما فيتامين (ج) هو المغذيات الأساسية للبشر ونظرا لفوائده الصحية الهامة, أصبح موضوع العديد من الدراسات. ولذلك، تم تحديد كميا في مجموعة كبيرة ومتنوعة من المحاصيل، بما في ذلك الخس، واحدة من أكثر الخضروات استهلاكا في جميع أنحاء العالم. وقد تم استبدال الطرق الكلاسيكية البسيطة تدريجيا من قبل تقنيات الكروماتوغرافيا السائل لأنها أكثر تحديدا ودقة10. ومع ذلك، نظرا للحاجة إلى رد فعل إضافي لقياس كل من، AA وDA عبر HPLC، في بعض الدراسات على الخس، فقط AA14 أو فقط TAA11 (دون تحديد كمية AA قبل الحد من DHAA إلى AA) تم قياسها. وعلاوة على ذلك، فإن عدد قليل فقط من المؤلفين قد كمية AA وDA، على الرغم من مساهمة كل من الجزيئات في نشاط فيتامين C المضادة للأكسدة2. ومع ذلك، أصبحت تقنية UPLC أكثر أهمية في الآونة الأخيرة بسبب أدائها العالي عند قياس فيتامين C في العديد من المحاصيل16. وبمقارنة النتائج التي تم الحصول عليها في هذه الدراسة مع المنهجيتين، UPLC و HPLC، تم تأكيد هذه المزايا: تم تحقيق مستويات عالية من الحساسية في AA، وفي أوقات قصيرة جداً، مما يعني أيضاً استهلاك موارد أقل. وعلى الرغم من كفاءة UPLC، فإن تشن وآخرون20 فقط هي التي طبقت هذه التقنية لقياس محتوى فيتامين C في الخس، مما أدى إلى التقليل من شأن ذلك حيث تم تحديد كمية نموذج AA فقط.

باختصار، يمثل هذا العمل أول محاولة ناجحة لتحديد إجمالي محتوى فيتامين C ليس فقط في أصناف مختلفة من الخس ولكن أيضًا في بعض أقاربهم البرية. كما أن تحديد كمي فيتامين ج ضروري لتحديد الخس الذي يحتوي على نشاط مضاد للأكسدة أعلى في برامج التربية. في هذا المعنى، وزيادة إجمالي فيتامين C المحتوى في الخس الأقارب البرية وجدت هنا وزيادة محتوى AA ذكرت في الدراسات السابقة14، فضلا عن غيرها من المركبات المضادة للأكسدة21، يوسع المرشحين المناسبين لتحسين القيمة الغذائية للخس.

في الختام, حتى مع بعض القيود الكامنة في طبيعة فيتامين (ج), مثل تدهوره التدريجي بعد ساعات قليلة من استخراجها أو الحاجة إلى رد فعل الحد بسبب انخفاض DHAA UV-absorptivity, فإنه يوفر أقل كثافة العمل وأقل وقتاً تستغرق طريقة لقياس محتوى فيتامين (ج). بالإضافة إلى ذلك، كما أنها قوية جدا ويظهر حساسية عالية وقوة القرار. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن نقلها بسهولة ليس فقط إلى المواد النباتية الأخرى مع تغييرات طفيفة أو معدومة، ولكن أيضا للمنتجات المصنعة التي توفر المداواة الغذائية من فيتامين (ج) إلى البشر، مما يؤدي إلى مجموعة واسعة من التطبيقات في المستقبل في مجال الناشئة من اختبار لجودة الغذاء موثوق بها.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

ونعترف بامتنان بنك جرثومبلاس النباتي في سرقسطة (BGHZ-CITA، إسبانيا) ومركز الموارد الوراثية (CNG، واغينغن، هولندا) لتوريد البذور اللازمة لهذا العمل. نشكر ج. أ. أرانجويلو، أ. كاستيانوس و"مختبر الفُرْقِة" من CITA على الدعم التقني، وD. L. Goodchild لاستعراض اللغة الإنجليزية. وقد تم تمويل هذا العمل من المشروعين RTA2017-00093-00-00 من المعهد الوطني للبحوث الزراعية والغذائية والتكنولوجيا (INIA) LMP164_18 من حكومة أراغون؛ والبرنامج التشغيلي فيدر أراغون 2014-2020 والصندوق الاجتماعي الأوروبي من الاتحاد الأوروبي [Grupos Consolidados A12-17R: "Grupo de investigación en fruticultura: caracterización, adaptación y mejora genéica" و A14-17R: "Sistemas agroganaderos alimentarios sostenibles" (SAGAS)]. وقد تم دعم I.M.L. بعقد ما قبل الدكتوراه لتدريب الأطباء من وزارة العلوم والابتكار والجامعات الإسبانية (MCIU) والوكالة الإسبانية للبحوث الحكومية (AEI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-Dithiothreitol (DTT) ≥98% (Ellman′s reagent) Roche 10197777001
10 mm Φ stainless steel ball Euro Aznar Supplies S.L. 20112100
15 mL polypropylene tube for centrifuge Deltalab 429946
2 mL HPLC amber vial Agilent 5190-9063
2 mL syringe with needle Deltalab JS2
20 mL polypropylene tubes Deltalab 202840
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIS) ≥99.9% (titration) Roche 10708976001
50 mL polypropylene tube Deltalab 429951
Acetic acid (CH3COOH) ≥99% purity glacial, ReagentPlus Sigma-Aldrich A6283
Acetonitrile, HPLC super gradient grade (99.9+% CH3CN-0.2 µm filtrated) Chem-lab CL00.0189
Acquity UPLC HSS T3 column (150 mm x 2.1 mm x 1.8 µm) Waters 186003540
Beaker 1 L, 200 mL Deltalab 191725, 191722
Dipotassium phosphate (KH2PO4) Panreac 766384 Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium salt (EDTA x 2H2O) 99-101% assay, ACS reagent Panreac 131669
Fisherbrand Analog MultiTube Vortexer Thermo Fisher Scientific 15549004
Formic acid 98-100% for HPLC LiChropur Supelco 5438040100
Freeze dryer VirTis genesis 25EL VirTis na
Heidolph Multi Reax mixer Heidolph na
Heidolph Reax top mixer Heidolph na
Hewlett Packard HPLC 1050 equipped with an eλ Detector Hewlett Packard na Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Hydrochloric acid (HCl) 37% purity, ACS reagent Sigma-Aldrich 320331
L-Ascorbic acid ≥99%, ACS reagent Sigma-Aldrich 255564
Meta-phosphoric acid (MPA) ACS reagent, chips, 33.5-36.5% Sigma-Aldrich 239275
Methanol ≥99.9% (HPLC supergradient grade) ChemLab CL00.0189.2500
Micropipettes 10-1000 μL Socorex na
Nucleosil 120 C18 Tracer column (250 mm x 4 mm x 5 µm) Merck (Sigma-Aldrich) 54919 Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
PTFE-silicone cap with preaperture Agilent 5190-9067
Refrigerated centrifuge Gyrozen 1248R Gyrozen na
Regenerated cellulose filters 0.22 µm (13 mm) Agilent 1015190-5108
Regenerated cellulose filters 0.45-µm (13 mm) Labbox SFCA-145-100 Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Spectrophotometer Heλios β Thermo Scientific Corporation na
Sulfuric acid (H2SO4) 95.0-98.0% purity, ACS reagent Sigma-Aldrich 258105
Ultrapure water WasserLab na
Ultrasons H-D Selecta na
Volumetric flasks 1 L, 100 mL DeltaLab 191489, 191486
Waters Acquity UPLC H-Class equipped with a PDA eλ Detector Waters na

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. FAOSTAT. Statistics of the Food and Agriculture Organization of the United Nations. FAOSTAT. , Available from: http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC (2018).
  2. Llorach, R., Martínez-Sánchez, A., Tomás-Barberán, F. A., Gil, M. I., Ferreres, F. Characterisation of polyphenols and antioxidant properties of five lettuce varieties and escarole. Food Chemistry. 108 (3), 1028-1038 (2008).
  3. Carr, A. C., Frei, B. Toward a new recommended dietary allowance for vitamin C based on antioxidant and health effects in humans. American Journal of Clinical Nutrition. 69 (6), 1086-1107 (1999).
  4. Carr, A. C., Vissers, M. C. M. Synthetic or food-derived vitamin C-Are they equally bioavailable. Nutrients. 5 (11), 4284-4304 (2013).
  5. Lee, S. K., Kader, A. A. Preharvest and postharvest factors influencing vitamin C content of horticultural crops. Postharvest Biology and Technology. 20 (3), 207-220 (2000).
  6. Shekhovtsova, T. N., Muginova, S. V., Luchinina, J. A., Galimova, A. Z. Enzymatic methods in food analysis: determination of ascorbic acid. Analytica Chimica Acta. 573-574, 125-132 (2006).
  7. Zhan, L., et al. Light exposure during storage preserving soluble sugar and L-ascorbic acid content of minimally processed romaine lettuce (Lactuca sativa L.var. longifolia). Food Chemistry. 136 (1), 273-278 (2013).
  8. Malejane, D. N., Tinyani, P., Soundy, P., Sultanbawa, Y., Sivakumar, D. Deficit irrigation improves phenolic content and antioxidant activity in leafy lettuce varieties. Food Science and Nutrition. 6 (2), 334-341 (2017).
  9. Tarrago-Trani, M. T., Phillips, K. M., Cotty, M. Matrix-specific method validation for quantitative analysis of vitamin C in diverse foods. Journal of Food Composition and Analysis. 26 (1-2), 12-25 (2012).
  10. Klimczak, I., Gliszczyńska-Świgło, A. Comparison of UPLC and HPLC methods for determination of vitamin C. Food Chemistry. 175, 100-105 (2015).
  11. Złotek, U., Świeca, M., Jakubczyk, A. Effect of abiotic elicitation on main health-promoting compounds, antioxidant activity and commercial quality of butter lettuce (Lactuca sativa L.). Food Chemistry. 148, 253-260 (2014).
  12. Koh, E., Charoenprasert, S., Mitchell, A. E. Effect of organic and conventional cropping systems on ascorbic acid, vitamin C, flavonoids, nitrate, and oxalate in 27 varieties of spinach (Spinacia oleracea L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (12), 3144-3150 (2012).
  13. Kałuzewicz, A., et al. The influence of short-term storage on the content of flavonoids and vitamin C in Broccoli. European Journal of Horticultural Science. 77 (3), 137-143 (2012).
  14. van Treuren, R., van Eekelen, H. D. L. M., Wehrens, R., de Vos, R. C. H. Metabolite variation in the lettuce gene pool: towards healthier crop varieties and food. Metabolomics. 14 (11), 1-14 (2018).
  15. Swartz, M. E. UPLC: An introduction and review. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 28 (7), 1253-1263 (2005).
  16. Spínola, V., Mendes, B., Câmara, J. S., Castilho, P. C. An improved and fast UHPLC-PDA methodology for determination of L-ascorbic and dehydroascorbic acids in fruits and vegetables. Evaluation of degradation rate during storage. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (4), 1049-1058 (2012).
  17. Ball, G. F. M. Water-soluble vitamin assays in human nutrition. , Springer. Boston, MA. (1994).
  18. Bertolín, J. R., et al. Simultaneous determination of carotenoids, tocopherols, retinol and cholesterol in ovine lyophilised samples of milk, meat, and liver and in unprocessed/raw samples of fat. Food Chemistry. 257, 182-188 (2018).
  19. Spínola, V., Llorent-Martínez, E. J., Castilho, P. C. Determination of vitamin C in foods: Current state of method validation. Journal of Chromatography A. 1369, 2-17 (2014).
  20. Chen, Y., et al. radiation is beneficial for yield and quality of indoor cultivated lettuce. Frontiers in Plant Science. 10, 1-10 (2019).
  21. Damerum, A., et al. Elucidating the genetic basis of antioxidant status in lettuce (Lactuca sativa). Horticulture Research. 2 (15055), 1-13 (2015).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 160، حمض الاسكوربيك، الأقارب البرية المحاصيل (CWR)، حمض ديهيدروسcorbic، الخس، Lactuca ساتيفا L.، الكروماتوغرافيا السائلة
تحسين UPLC-UV طريقة ل الكم من فيتامين (ج) في أصناف الخس<em>(Lactuca sativa</em> L.) والمحاصيل البرية الأقارب<em>(Lactuca</em> spp.)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Medina-Lozano, I., Bertolín, J. … More

Medina-Lozano, I., Bertolín, J. R., Zufiaurre, R., Díaz, A. Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (Lactuca sativa L.) and Crop Wild Relatives (Lactuca spp.). J. Vis. Exp. (160), e61440, doi:10.3791/61440 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter