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Biochemistry

सलाद पत्ता किस्मों(लैक्टुका सतीवा एल) और क्रॉप वाइल्ड रिश्तेदारों(लैक्टुका स्पीप) में विटामिन सी के परिमाणीकरण के लिए यूपीएलसी-यूवी विधि में सुधार हुआ।

Published: June 30, 2020 doi: 10.3791/61440
Automatic Translation
*1,4, *2,4, 3, 1,4
1Unidad de Hortofruticultura, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2Unidad de Producción y Sanidad Animal, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 3Dpto Química Analítica, Escuela Politécnica Superior (Universidad de Zaragoza), 4Instituto Agroalimentario de Aragón - IA2 (CITA-Universidad de Zaragoza)
* These authors contributed equally

Summary

हम लैक्टुका स्प्प में विटामिन सी की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक तेज और विश्वसनीय विधि प्रस्तुत करते हैं। UPLC-यूवी का उपयोग करके, संभावित रूप से अन्य पौधों के लिए हस्तांतरणीय। प्रमुख कदम स्थिर परिस्थितियों में नमूना तैयारी और विटामिन सी निष्कर्षण, एस्कॉर्बिक एसिड में डेयरोकॉर्बिक एसिड की कमी और क्रोमेग्राफिक प्रक्रिया का अनुकूलन हैं।

Abstract

विटामिन, विशेष रूप से विटामिन सी, फलों और सब्जियों में पाए जाने वाले महत्वपूर्ण सूक्ष्म पोषक तत्व हैं। उनकी एंटीऑक्सीडेंट क्षमता में विटामिन सी का भी बड़ा योगदान है। सलाद पत्ता दुनिया भर में उपभोक्ताओं के बीच सबसे लोकप्रिय सब्जियों में से एक है । सलाद पत्ता और अन्य संबंधित प्रजातियों में विटामिन सी की सामग्री को मापने के लिए एक सटीक प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है। हम यहां अल्ट्रा-हाई-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमेटोग्राफी-पराबैंगनी (यूपीएलसी-यूवी) तकनीक का उपयोग करके एक विधि का वर्णन करते हैं, जिसमें नमूना तैयारी, विटामिन निष्कर्षण और क्रोमेटोग्राफी स्थितियों को अनुकूलित किया गया था।

नमूने पूरे संयंत्र का प्रतिनिधित्व करने के लिए एकत्र किए गए थे, -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए और अवांछनीय ऑक्सीकरण को रोकने और उनके हेरफेर को आसान बनाने के लिए lyophilized। अम्लीय मीडिया में विटामिन सी का निष्कर्षण किया गया, जिसने इसकी स्थिरता में भी योगदान दिया। चूंकि विटामिन सी दो अलग-अलग अंतरसंभ्यीय रूपों, एस्कॉर्बिक एसिड (एए) और डेहिड्रोस्कोर्बिक एसिड (डीएचएए) में मौजूद हो सकता है, इसलिए दोनों यौगिकों को सटीक मात्राकरण के लिए मापा जाना चाहिए। एए में कमी के बाद डीएचए को अप्रत्यक्ष रूप से निर्धारित किया गया था क्योंकि एए स्पेक्ट्रम की यूवी रेंज में डीएचए की तुलना में अधिक अवशोषण दिखाता है । एक ही निकालने से, दो माप किए गए, एक से पहले और एक के बाद एक है कि कमी प्रतिक्रिया । पहले मामले में, हम ए. ए. सामग्री की मात्रा निर्धारित कर रहे थे, और दूसरे एक में, हम ए. ए. और DHAA (TAA: कुल ascorbic एसिड) ए. ए. के रूप में राशि मात्रा निर्धारित । फिर, DHAA मात्रा अप्रत्यक्ष रूप से टीएए से पहले माप से आ रहे ए. ए. घटाकर प्राप्त किया गया था । वे यूपीएलसी-यूवी द्वारा निर्धारित किए गए थे, एक अंशांकन वक्र बनाने और क्रोमेग्राफिक प्रक्रिया को अनुकूलित करने के लिए एक वाणिज्यिक ए. ए. मानक का उपयोग करके, ए. ए. चोटियों को प्राप्त करने के लिए जो कम समय में पूरी तरह से हल किए गए थे। इस प्रोटोकॉल को आसानी से किसी अन्य संयंत्र सामग्री में मामूली या कोई परिवर्तन नहीं किया जा सकता है। इसकी सटीकता सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेदों को अन्यथा बिना सहानुभूति के पता चला। पांडुलिपि में अन्य शक्तियों और सीमाओं पर गहराई से चर्चा की जाती है।

Introduction

खेती सलाद पत्ता(लैक्टुका सतीवा एल) दुनिया भर में सबसे अधिक उत्पादित और खपत पत्तेदार सब्जियों में से एक है, 20181में लगभग 27.3 मिलियन टन का कुल उत्पादन है। सलाद पत्ता उपभोक्ताओं द्वारा स्वस्थ के रूप में माना जाता है । पोषण गुणों को मुख्य रूप से फसल में एंटीऑक्सीडेंट यौगिकों के स्रोत, जैसे विटामिन सी, पॉलीफेनॉल और विटामिन ई 2 जैसे अन्य लोगों के लिए जिम्मेदार ठहरायाजाताहै। विटामिन सी कई अन्य कशेरुकी के विपरीत मनुष्यों के लिए एक आवश्यक सूक्ष्म पोषक तत्व है, क्योंकि हम बायोसिंथेटिक मार्ग3में अंतिम चरण एंजाइम के लिए जीन कोडिंग में मौजूद उत्परिवर्तनों के कारण इसका उत्पादन करने में असमर्थ हैं। यह एक सामान्य कोशिका चयापचय के लिए आवश्यक है और यह मुख्य रूप से अपनी एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि3,4के कारण प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है ।

कुल विटामिन सी एस्कॉर्बिक एसिड (एए) और डेहिड्रोस्कोर्बिक एसिड (डीएचएए) से बना है। ए. ए. विटामिन का सबसे जैविक रूप से सक्रिय रूप है, लेकिन DHAA (इसका ऑक्सीकरण उत्पाद) भी जैविक गतिविधि दिखाता है और इसे मानव शरीर5में आसानी से एए में परिवर्तित किया जा सकता है। इसलिए, किसी भी बागवानी फसल की कुल विटामिन सी सामग्री का निर्धारण करने के लिए दोनों रूपों की मात्रा निर्धारित करना महत्वपूर्ण है, सलाद पत्ता शामिल है।

सब्जियों में विटामिन सी को मापने के लिए विभिन्न विश्लेषणात्मक तकनीकों पर आधारित विभिन्न प्रकार के दृष्टिकोणों का उपयोग किया गया है, जैसे एंजाइमेटिक, स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक, और टिट्रीमेट्रिकविधियां 6,7,8। हालांकि ये तरीके सरल हैं, वे एए9के लिए रासायनिक रूप से विशिष्ट नहीं हैं। नतीजतन, क्रोमेटोग्राफिक विधियों को पसंद किया जाता है, विशेष रूप से उच्च प्रदर्शन वाले तरल क्रोमेटोग्राफी-पराबैंगनी (एचपीएलसी-यूवी) तकनीक, उनकी उच्च सटीकता10के कारण। एचपीएलसी-यूवी का उपयोग फसलों की एक महान विविधता में विटामिन सी का निर्धारण करने के लिए किया गया है, जैसे ब्रोकोली, पालक और सलाद पत्ता11,12,13। हालांकि, स्पेक्ट्रम की यूवी रेंज में डीएचए की कम अवशोषण के कारण एए और डीएचए का एक साथ मात्रा जटिल है । वैकल्पिक रूप से, डीएचए को एक कम करने वाले एजेंट का उपयोग करके अप्रत्यक्ष रूप से निर्धारित किया जा सकता है जो डीएचए को एए में परिवर्तित करता है, कुल एस्कॉर्बिक एसिड (टीएए) को मापता है, और फिर टीएए और एए के बीच अंतर की गणना करता है। एक कमी प्रतिक्रिया की आवश्यकता के कारण, कुछ अध्ययनों में, केवल ए. ए.14निर्धारित किया गया है, जो वास्तव में विटामिन सी गतिविधि के एक अनुमान का प्रतिनिधित्व कर सकता है । तरल क्रोमेटोग्राफी तकनीकों, अल्ट्रा-हाई परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमेटोग्राफी (यूपीएलसी) में अंतिम अग्रिम का उपयोग किए जाने पर भी अप्रत्यक्ष रूप से डीएचए को निर्धारित करने के लिए अतिरिक्त कमी प्रतिक्रिया की भी आवश्यकता होती है । यह कदम एचपीएलसी की तुलना में यूपीएलसी द्वारा प्रदर्शित किए जाने वाले लाभों से भी लाभ उठाता है: उच्च दक्षता और संकल्प, संवेदनशीलता में वृद्धि, कम समय विश्लेषण और कम विलायक खपत15। परिणामस्वरूप,16विभिन्न फसलों में विटामिन सी की मात्रा निर्धारित करने के लिए यूपीएलसी-यूवी तकनीक का उपयोग किया गया है।

इसके अलावा, ए. ए. एक बहुत ही प्रयोगशाला अणु है; इस प्रकार, यह एक प्रोटोकॉल है कि सलाद पत्ता भंडारण और विटामिन सी विश्लेषण 9 केदौरानइसके क्षरण को रोकता है विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है . इस संदर्भ में, निम्नलिखित प्रोटोकॉल यूपीएलसी-यूवी द्वारा सलाद पत्ता में विटामिन सी सामग्री की तेजी से और बेहतर मात्रा प्रदान करता है, साथ ही एक कुशल निष्कर्षण प्रक्रिया भी प्रदान करता है। न केवल वर्तमान अध्ययन में अभिजात वर्ग की खेती को शामिल किया गया है, बल्कि फसल प्रजनन में उनकी संभावित रुचि के कारण पारंपरिक लैंडरेस और कुछ जंगली रिश्तेदारों को भी विशेष रूप से सलाद के पोषण मूल्य में सुधार करने के लिए शामिल किया गया है ।

Protocol

1. पौधे सामग्री तैयार करने

  1. नमूना 50 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में प्रति पौधे कम से कम दो पत्तियों, एक बाहरी (पुराने) और एक आंतरिक (युवा) एक ताकि अधिक सही पूरे संयंत्र का प्रतिनिधित्व करने के लिए। प्रत्येक नमूने के लिए कम से कम तीन जैविक प्रतिकृति एकत्र करें।
  2. उन्हें तुरंत तरल नाइट्रोजन का उपयोग करके फ्रीज करें और उपयोग होने तक उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। सुनिश्चित करें कि तरल नाइट्रोजन ट्यूबों में नहीं मिलता है; अन्यथा वाष्पीकरण के दौरान गैस विस्तार के कारण हटाए जाने पर वे विस्फोट कर सकते थे।
    सावधानी: तरल नाइट्रोजन का उपयोग करने से जुड़े संभावित खतरों के कारण दस्ताने और एक चेहरा ढाल की आवश्यकता होती है।
  3. ट्यूबों से टोपियां निकालें और उन्हें लियोफिलाइजर(सामग्रीकी तालिका) के फ्रीज ड्रायर कक्ष के भीतर ट्रे पर रखें जो इस प्रकार प्रोग्राम किया गया है: -72 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस, 10 घंटे के लिए -10 डिग्री सेल्सियस, 10 घंटे के लिए 0 डिग्री सेल्सियस, और कम से कम 4 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस। कंपाउंडर तापमान और वैक्यूम को क्रमशः -80.2 डिग्री सेल्सियस और 112 मीटरटोर पर फ्रीज-सुखाने की प्रक्रिया के दौरान स्थिर बनाए रखें।
  4. जब सामग्री पूरी तरह से सूखी होती है (पौधे और ट्यूब में कॉम्पैक्टेशन की डिग्री के आधार पर 4 और 7 दिनों के बीच), क्रमशः 4 डिग्री सेल्सियस, -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर कम (दिन से सप्ताह), मध्यम (महीने) या लंबे (वर्ष) भंडारण पर संरक्षित करें। नमूना युक्त ट्यूबों में सिलिका जेल मोती युक्त बैग के शामिल होने की सिफारिश की जाती है।
  5. 10 मिमी व्यास स्टेनलेस स्टील की गेंदों के साथ 20 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में लियोफिलाइज्ड नमूनों को रखें और उन्हें एक अच्छी धूल प्राप्त करने के लिए आवश्यक तीव्रता और समय का उपयोग करके मल्टीट्यूब भंवर के साथ पीसें।
    नोट: पूरी प्रक्रिया के दौरान, नमूनों को सीधे प्रकाश के संपर्क से बचाते हैं।

2. रिएजेंट और समाधान की तैयारी

  1. सॉल्वेंट एक्सट्रैक्टिव सॉल्यूशन तैयार करें: 8% एसिटिक एसिड (v/v), 1% एमपीए (मेटा-फॉस्फोरिक एसिड) (w/v), 1 m EDTA (एथिलेंडियामाइमेटेट्राएक्टिक एसिड)।
    1. प्रत्येक में 5 एमएल जोड़े जाएंगे, यह ध्यान में रखते हुए नमूनों के पूरे सेट को संसाधित करने के लिए आवश्यक सॉल्वेंट की कुल मात्रा की गणना करें। समाधान के 1 एल तैयार करने के लिए, एक फ्लास्क में जोड़ें: एमपीए के 30 ग्राम, ईडीए डिहाइड्रेट के 0.372 ग्राम, एसिटिक एसिड के 80 एमएल और अल्ट्रापुरे पानी के 500 एमएल (स्केल वॉल्यूम और मात्रा तदनुसार)। प्लास्टिक फिल्म के साथ फ्लास्क मुंह सील।
    2. एक बार चुंबकीय उभारने वाले की मदद से भंग होने के बाद, आवश्यक अल्ट्रापुरे पानी को जोड़ते हुए 1 एल को सही ढंग से मापने के लिए वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क का उपयोग करें।
  2. 0.5 एम ट्रिस (2-अमीनो-2- (हाइड्रोक्सीमिथिल) - 1,3-प्रोपेनडिओल) पीएच 9.0) और समाधान को कम करने और समाधान (40 m M DTT (1,4-Dithiothreitol) 0.5 एम Tris pH 9.0 के साथ कम) तैयार करें।
    1. उनमें से प्रत्येक में 200 माइक्रोन जोड़े जाएंगे, यह ध्यान में रखते हुए नमूनों के पूरे सेट को संसाधित करने के लिए आवश्यक समाधान को कम करने की कुल मात्रा की गणना करें। बफर के 100 एमएल तैयार करने के लिए, एक बीकर में जोड़ें: 6.055 ग्राम ट्रिज़ और 90 एमएल अल्ट्रापुरे पानी (पैमाने की मात्रा और मात्रा तदनुसार)। प्लास्टिक फिल्म के साथ बीकर मुंह सील।
    2. एक बार चुंबकीय उभारने वाले की मदद से भंग होने के बाद, 2 एम एचसीएल जोड़कर पीएच 9.0 के समाधान को समायोजित करें और आवश्यक अल्ट्रापुरे पानी को जोड़ते हुए 100 मिलीएल को सही ढंग से मापने के लिए वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क का उपयोग करें।
    3. कम करने के समाधान के 100 एमएल तैयार करने के लिए, एक बीकर में जोड़ें: डीटीटी के 0.629 ग्राम (शुद्धता: 98%) और बफर के 90 एमएल (0.5 एम ट्रिस पीएच 9.0) पहले तैयार (2.2.1 से 2.2.2)। तदनुसार स्केल वॉल्यूम और मात्रा। प्लास्टिक फिल्म के साथ बीकर मुंह सील।
    4. एक बार चुंबकीय उभारने वाले की मदद से भंग होने के बाद, 100 मिलीएल को सही ढंग से मापने के लिए वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क का उपयोग करें, बफर 0.5 एम ट्राइस पीएच 9.0 की आवश्यक मात्रा जोड़ते हैं।
      नोट: कम करने का समाधान बहुत अस्थिर है। यही कारण है कि एक हौसले से बनाया समाधान दृढ़ता से सिफारिश की है ।
  3. सल्फ्यूरिक एसिड (0.4 एम एच2एसओ4)
    1. 0.4 एम सल्फ्यूरिक एसिड की कुल मात्रा की गणना करने के लिए ध्यान में रखते हुए नमूनों के पूरे सेट की प्रक्रिया की जरूरत है कि २०० μL प्रत्येक के लिए जोड़ा जाएगा । समाधान के 100 एमएल तैयार करने के लिए, एक बीकर में जोड़ें: अल्ट्रापुरे पानी का 80 एमएल और फिर एच 2 एसओ4 (शुद्धता: 96%, घनत्व: 1.84 ग्राम एमएल -1) का2.22एमएल। आवश्यक अल्ट्रापुरे पानी को जोड़ते हुए 100 एमएल को सही ढंग से मापने के लिए वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क का उपयोग करें।
      सावधानी: सल्फ्यूरिक एसिड बहुत संक्षारक है, इसलिए इसे सुरक्षात्मक उपकरणों का उपयोग करके और हुड के नीचे संभाला जाना चाहिए। इसके अलावा, एसिड को अल्ट्रापुरे पानी में जोड़ा जाना चाहिए, न कि एसिड को पानी, धुएं को कम करने और दुर्घटनाओं से बचने के लिए।
  4. हाइड्रोक्लोरिक एसिड (2 एम एचसीएल)।
    1. 2 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड के 100 एमएल तैयार करने के लिए, एक बीकर में जोड़ें: अल्ट्रापुरे पानी का 80 एमएल और फिर एचसीएल का 6.13 एमएल (शुद्धता: 37%, घनत्व: 1.19 ग्राम एमएल-1)। प्लास्टिक फिल्म के साथ बीकर मुंह सील। आवश्यक अल्ट्रापुरे पानी को जोड़ते हुए 100 एमएल को सही ढंग से मापने के लिए वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क का उपयोग करें। तदनुसार स्केल वॉल्यूम।
      सावधानी: हाइड्रोक्लोरिक एसिड बहुत संक्षारक है, इसलिए इसे सुरक्षात्मक उपकरणों और हुड के नीचे का उपयोग करके संभाला जाना चाहिए। इसके अलावा, एसिड को अल्ट्रापुरे पानी में जोड़ा जाना चाहिए, न कि एसिड को पानी, धुएं को कम करने और दुर्घटनाओं से बचने के लिए।
  5. ए. ए. मानक (स्टॉक और कमजोर पड़ने)
    1. वजन वास्तव में 10 मिलीग्राम ए. ए. मानक (शुद्धता: 99%) एक सटीक संतुलन का उपयोग करना और मोबाइल चरण के 90 एमएल (फोर्मिक एसिड के साथ अल्ट्रापुरे पानी पीएच 2.0) जोड़ें।
    2. एक बार चुंबकीय उभारने वाले की मदद से भंग होने के बाद, 100 मिलीएल को सटीक रूप से मापने के लिए वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क का उपयोग करें, जिसमें फोर्मिक एसिड के साथ अल्ट्रापुरे पानी पीएच 2.0 की आवश्यक मात्रा को जोड़ा जा सके।
      नोट: प्रकाश के संपर्क से इस स्टॉक समाधान की रक्षा करें।
    3. तालिका 1 में निर्देशों का पालन करने के लिए एक अंशांकन वक्र प्राप्त करने के लिए ए. ए. मानक के स्टॉक से पांच कमजोर पड़ने तैयार करें और चरण 5.2 के साथ आगे बढ़ें।
स्‍टैंडर्ड [ए. ए.] (μg mL-1) ए. ए. (100 माइक्रोन एमसीएल-1)समाधान (μL) मोबाइल चरण (μL)एक
1 0.5 5 995
2 2.5 25 975
3 5 50 950
4 10 100 900
5 25 250 750
क अल्ट्रापुरे पानी पीएच 2.0 फॉरमिक एसिड द्वारा अम्लीय।

तालिका 1: एए (एस्कॉर्बिक एसिड) के पांच मानकों को तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल। मानकों की विभिन्न सांद्रता में से प्रत्येक को तैयार करने के लिए सोल्यूट और सॉल्वेंट की मात्रा इंगित की जाती है।

3. एए और डीएचए की निकासी

नोट: निष्कर्षण चरणों के दौरान कम प्रकाश तीव्रता की शर्तों के तहत काम करने की सिफारिश की जाती है।

  1. 15 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन सेंट्रलाइज ट्यूब में 50 मिलीग्राम लियोफिलाइज्ड ग्राउंड सैंपल और एक्सट्रैक्ट सॉल्वेंट (स्टेप 2.1) का 5 एमएल जोड़ें।
  2. मिश्रण को 5 एस के लिए भंवर का उपयोग करके हिलाएं और फिर 2000 आरपीएम पर 10 मिनट के लिए एक कक्षीय शेखर।
  3. अल्ट्रासाउंड सक्रिय के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए एक अल्ट्रासोनिक स्नान में ट्यूब का परिचय दें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 4,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  5. सुपरनेटेंट लें, इसे 0.22 माइक्रोन पुनर्जीवित सेल्यूलोज फिल्टर के माध्यम से पारित करें और इसे 5 एमएल एम्बर शीशी में स्टोर करें। यह एक्सट्रैक्ट 1 है, जिसमें एए और डीएचए शामिल हैं।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां-८० डिग्री सेल्सियस पर अर्क ठंड और ए. ए. और DHAA के रूप में प्रकाश के संपर्क से बचाने के द्वारा यहां रोका जा सकता है बहुत अस्थिर और प्रकाश की उपस्थिति में आसानी से नीचा कर रहे हैं, उच्च तापमान पर या ऑक्सीकरण वायुमंडल के तहत(पूरक फ़ाइल 1)।

4. एए को DHAA कमी TAA निकालने के लिए

  1. तरल क्रोमेटोग्राफी के लिए एक्सट्रैक्ट 1 के 200 माइक्रोन को 2 एमएल एम्बर शीशी में स्थानांतरित करें और कम करने वाले समाधान (चरण 2.2) के 200 माइक्रोन जोड़ें। पूर्व खोलने के साथ एक PTFE-सिलिकॉन प्लग के साथ शीशी बंद करो और 5 एस के लिए एक भंवर के साथ हिला ।
  2. समाधान कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए खड़े होने के लिए और प्रकाश से बचाने के लिए अनुमति दें।
  3. प्रतिक्रिया को रोकने और अम्लीय पीएच में एए को स्थिर करने के लिए0.4 एम एच 2 एसओ 4 के200माइक्रोल जोड़ें। परिणामस्वरूप समाधान निकालें 2 है, जिसमें केवल एए होता है और वास्तव में टीएए होता है।

5. दृढ़ संकल्प

  1. यूपीएलसी-यूवी तैयारी
    1. टेबल 2में वर्णित कार्य समाधान तैयार करें, उपयुक्त रूप से 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें, कम से कम 10 मिनट के लिए ध्वनिकृत करें और उन्हें यूपीएलसी सिस्टम में रखें।
    2. तीन यूपीएलसी मॉड्यूल पर स्विच करें और आंतरिक अंशांकन प्रक्रिया को समाप्त करने की प्रतीक्षा करें।
    3. सॉफ्टवेयर खोलें (उदाहरण के लिए, सशक्त 3) और तालिका 2में वर्णित वाद्य कार्यक्रम लोड करें: सशक्त 3 । नमूने चलाएं । विटामिन सी विधि । UPLC_PDA । क्विकस्टार्ट का उपयोग करें।
    4. एक बार सॉफ्टवेयर सही प्रोग्राम के साथ लोड हो जाता है, यूपीएलसी प्रबंधन कंसोल का उपयोग करें: क्वाटरेरी सॉल्वेंट मैनेजर । सही माउस बटन पर क्लिक करें । लॉन्च कंसोल।
    5. यूपीएलसी उपकरण की तैयारी और स्थिरीकरण के लिए आगे बढ़ें: सिस्टम । नियंत्रण । स्टार्टअप।
      1. कम से कम 5 मिनट के लिए सभी UPLC लाइनों शुद्ध: प्राइम सॉल्वैंट्स । क्यूएसएम । ए, बी, सी, डी और सील वॉश की जांच करें । प्राइम और जीटी की अवधि 5 मिनट।
      2. इंजेक्टर को शुद्ध और साफ करें: प्राइम सॉल्वैंट्स । एसएम । चेक वॉश सॉल्वेंट (> 45 s) और चेक पर्ज सॉल्वेंट (> 35 चक्र)।
      3. विधि शर्तों के लिए UPLC समतुलिब्रेट: विधि के लिए संतुलन । क्यूएसएम । फ्लो (0.3 एमएल न्यूनतम-1)। सॉल्वेंट ए (2%) । सॉल्वेंट बी (0%) । सॉल्वेंट सी (98%) । सॉल्वेंट डी (0%), विधि को समतुल्य । एसएम । नमूना (5 डिग्री सेल्सियस) । कॉलम (30 डिग्री सेल्सियस) और विधि के लिए संतुलन । अन्य । पर दीपक की जांच करें । प्रेस स्टार्ट।
      4. उपकरण को स्थिर करने के लिए कम से कम 1 घंटे (और भी अधिक समय की सिफारिश की जाती है) के लिए प्रतीक्षा करें। स्थिरता को लॉन्च कंसोलमें कॉलम में दबाव की जांच करते हुए सत्यापित किया जा सकता है: सिस्टम । क्वाटरर्नी सॉल्वेंट मैनेजर । क्यूएसएम सिस्टम दबाव। सुनिश्चित करें कि दबाव परिवर्तन (या तो बढ़ जाती है या घटता है) में कोई पहचाने जाने योग्य रुझान नहीं हैं और डेल्टा मूल्य 10 साई से कम है।
    6. क्विकस्टार्ट स्क्रीन में, मैट्रिक्स को मानकों और नमूनों के नामों के साथ भरें।
  2. मानकों में ए. ए. दृढ़ संकल्प
    1. तरल क्रोमेटोग्राफी के लिए 2 मिलियन एम्बर शीशियों के लिए पहले तैयार किए गए पांच ए. मानकों में से प्रत्येक में से 1 एमएल (चरण 2.5.3) को स्थानांतरित करें। पूर्व खोलने के साथ एक PTFE-सिलिकॉन प्लग के साथ शीशी बंद करो और UPLC साधन में 5 μL सुई ।
    2. तालिका 2 में वर्णित प्रक्रिया के बाद क्रोमेटोग्राफी को सबसे पतला से सबसे अधिक केंद्रित करने के लिए शुरू करें।
  3. नमूनों में ए. ए. दृढ़ संकल्प
    1. पिपेट 200 एक्सट्रैक्ट 1 के 2 एमएल एम्बर शीशी में तरल क्रोमेटोग्राफी के लिए और अल्ट्रापुरे पानी के 800 माइक्रोन जोड़ें। पूर्व खोलने के साथ एक PTFE-सिलिकॉन प्लग के साथ शीशी बंद करो और UPLC साधन में 5 μL सुई ।
    2. तालिका 2में वर्णित प्रक्रिया के बाद क्रोमेटोग्राफी करें।
  4. नमूनों में TAA दृढ़ संकल्प
    1. 2 निकालने के लिए अल्ट्रापुरे पानी के 400 माइक्रोन जोड़ें। पूर्व खोलने के साथ एक PTFE-सिलिकॉन प्लग के साथ शीशी बंद करो और UPLC साधन में 5 μL सुई ।
    2. तालिका 2में वर्णित प्रक्रिया के बाद क्रोमेटोग्राफी करें।
घटक और पैरामीटर या क़िस्‍म
साधन बरी हो गए यूपीएलसी एच-क्लास
वेक्षक एए = 245 एनएम के लिए पीडीए eλ डिटेक्टर λabs
सॉफ़्टवेयर सशक्त 3
स्तंभ बरी UPLC एचएसएस T3 (150 मिमी x 2.1 मिमी x 1.8 माइक्रोन)
चैनल ए चौधरी3ओह
चैनल B/वॉश एच2O: CH3ओह (50:50 v:v)
चैनल सी अल्ट्रापुरे पानी पीएच 2.0 फॉरमिक एसिड द्वारा अम्लीयएक
चैनल डी/सील वॉश अल्ट्रापुरे पानी: एसीटोनिट्रिल (90:10 v:v)
मोबाइल चरण 0.3 एमएल न्यूनतम-1 of 2% ए + 98% सी (आइसोक्रेटिक मोड)
कॉलम तापमान 30 डिग्री सेल्सियस
ऑटोसंप्लर तापमान 5 डिग्री सेल्सियस
इंजेक्शन की मात्रा 5 माइक्रोन
ए. ए. प्रतिधारण समय 1.874 मिनट
रनिंग टाइम 3 मिनट
क पीएच समायोजन तक उपयोग किए जाने वाले फोर्मिक एसिड की अनिर्धारित मात्रा

तालिका 2: सलाद पत्ता और जंगली रिश्तेदारों से अर्क में ए. ए. (ascorbic एसिड) निर्धारित करने के लिए अनुकूलित क्रोमेग्राफिक प्रक्रिया। नियोजित घटकों, शर्तों और समाधानों का विवरण।

6. एए और डीएचए का परिमाणीकरण

  1. सांख्यिकीय विश्लेषण
    1. बर्टोलिन एट अल18 (टेबल 3)द्वारा वर्णित क्रोमेटोग्राफिक विधि के विश्लेषणात्मक मापदंडों का निर्धारण करें।
      नोट: तालिका 3 में प्रस्तुत मापदंडों के मूल्यों को विशिष्ट प्रयोगात्मक परिस्थितियों में परिभाषित करने की आवश्यकता होगी ।
विधि के विश्लेषणात्मक पैरामीटर मान
लीनियर रेंज (μg mL-1) 0.5-25
रैखिक समीकरण y=53,143.03x
आर2 0.99998
पता लगाने की सीमा (एमजी एए जी-1 शुष्क पदार्थ) 0.013
मात्राकरण की सीमा (सूखी पदार्थ की मिलीग्राम एए जी-1) 0.045
पुनरावृत्ति (सीवी,%) 1.75
मध्यवर्ती परिशुद्धता (सीवी,%) 4.22
रिकवरी (आरईसी, %)ख 95.6±2.4
क सीवी: भिन्नता का गुणांक
ख वसूली परख 10 aliquots एक ही नमूने के ५० मिलीग्राम युक्त के साथ किया गया था, 5 ए. ए. जी के 2 मिलीग्राम के साथ नुकीला-सूखी बात के1, और 5 गैर नुकीला । % आरईसी =([ए. ए.] नुकीला नमूना-[ए. ए.] नमूना)//([ए. ए.] नुकीला) x100 ।

तालिका 3: एए (एस्कॉर्बिक एसिड) और टीएए (कुल एस्कॉर्बिक एसिड) का पता लगाने और मात्राकरण के लिए अनुकूलित विश्लेषणात्मक पैरामीटर। रैखिक रेंज, समीकरण और अंशांकन (आर2)वक्र के निर्धारण के गुणांक, साथ ही एए (टीएए के लिए समान) का पता लगाने और मात्राकरण की सीमा, और 5 माइक्रोन के नमूना इंजेक्शन की मात्रा के साथ रिपीटेबिलिटी, मध्यवर्ती परिशुद्धता और वसूली प्राप्त की गई थी।

  1. ए. ए. और टीएए एकाग्रता की गणना करें।
    1. मानक और नमूना क्रोमोग्राम खोलें: क्विकस्टार्ट । परियोजना ब्राउज़ करें । चैनल । "मानक या नमूने का नाम" । पीडीए Ch1 245 nm@1.2 एनएम।
    2. मानकों और नमूनों में संबंधित चोटी (एए या टीएए) को अपने शुरुआती बिंदु (लगभग 1.790 मिनट) पर क्लिक करके और माउस के साथ अपने अंतिम बिंदु (लगभग 1.910 मिनट) तक खींचकर एकीकृत करें।
    3. ऊपर तैयार पांच ए. ए. मानकों(तालिका 1)की एकाग्रता के खिलाफ अवशोषण मूल्यों निर्धारित क्रोमोग्राफिक (चरण 5.2.) का प्रतिनिधित्व करते हुए एक अंशांकन वक्र का निर्माण करें।
    4. चरण 5.3 और 5.4 में निर्धारित नमूनों के अवशोषण मूल्यों को इंटरपोलेट करें और निम्नलिखित सूत्र के साथ क्रमशः एए और टीएए एकाग्रता प्राप्त करें:
      Equation 1
      जहां वाई एकीकृत शिखर क्षेत्र है, एक्स पीपीएम में एए या टीएए एकाग्रता है और एम और एन क्रमशः प्राप्त प्रतिगमन लाइन की ढलान और वाई-अवरोधनहैं।
    5. डीएचएए की एकाग्रता की गणना के लिए, निम्नलिखित सूत्र लागू करें:
      Equation 2
      नोट: शुष्क वजन के एमजीजी-1 में डीएचए, एए और टीएए की कुल सांद्रता प्राप्त करने के लिए, अंशांकन वक्र में सीधे इंटरपोलिंग प्राप्त मूल्यों को कुल निकालने की मात्रा और लागू कमजोर पड़ने वाले कारक से गुणा करना होगा, और फिर निष्कर्षण को पूरा करने के लिए उपयोग किए जाने वाले नमूने के वजन से विभाजित किया जाएगा।

Representative Results

लैक्टुका मैट्रिक्स में विटामिन सी क्वांटिफिकेशन के लिए क्रोमेटोग्राफिक दृष्टिकोण के विकास की आवश्यकता होती है जो विश्वसनीय परिणाम सुनिश्चित कर सकता है। चित्रा 1 ए एक क्रोमेटोग्राम दिखाता है जिसके परिणामस्वरूप एक गैर-अनुकूलित प्रोटोकॉल(पूरक फ़ाइल 2)होता है, जो एक अज्ञात नाबालिग "कंधे" के साथ एक ए. ए. चोटी प्रस्तुत करता है। फिर भी, निष्कर्षण और क्रोमेग्राफिक स्थितियों में सुधार के बाद, अज्ञात यौगिकों के हस्तक्षेप के बिना एक हल एए चोटी(चित्रा 1B)हासिल किया गया था। इसके अलावा, एचपीएलसी-यूवी के बजाय यूपीएलसी-यूवी उपकरण के उपयोग ने हमें एए के लिए प्रतिधारण समय (आरटी) को कम करने की अनुमति दी: अनुकूलित क्रोमेग्राम में 1.874 मिनट बनाम गैर-अनुकूलित लोगों में2.980 मिनट (चित्रा 1),साथ ही अनुकूलित और गैर-अनुकूलित प्रोटोकॉल के लिए क्रमशः 3 और 7 मिनट।

Figure 1
चित्रा 1: एक ही सलाद पत्ता नमूने में एए के क्रोमाटोग्राम (वाणिज्यिक खेती 'बेगोना')। (A)एचपीएलसी-यूवी क्रोमोग्राम जिसके परिणामस्वरूप एक गैर-अनुकूलित प्रोटोकॉल (पूरक फ़ाइल 2 में वर्णित शर्तें) होती हैं। (B)यूपीएलसी-यूवी क्रोमेटोग्राम अनुकूलित प्रोटोकॉल (तालिका 2में वर्णित शर्तों) के साथ प्राप्त किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

ए. ए. चोटियों में हस्तक्षेप, जैसा कि चित्रा 1 एमें मनाया गया था, लगातार क्रोमेग्राफिक प्रक्रिया के दौरान अपर्याप्त पृथक्करण के कारण विटामिन सी (एए, डीएचए और टीएए) सामग्री(चित्रा 2)का अनुमान लगातार कम करके आंका गया क्योंकि ओवरलैपिंग पीक क्षेत्रों को उनके बीच गहरे बिंदु पर एक ऊर्ध्वाधर बूंद द्वारा एकीकृत किया गया था। यह पूर्वाग्रह फसल जंगली रिश्तेदारों के मामले में विशेष रूप से डीएचएए और टीएए सामग्री(चित्रा 2)में विशेष रूप से ध्यान देने योग्य है।

Figure 2
चित्रा 2: विटामिन सी की सामग्री का वितरण। वाणिज्यिक और पारंपरिक सलाद पत्ता किस्मों और गैर-अनुकूलित और अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग करके कुछ जंगली रिश्तेदारों में डीएचएए, एए और टीएए सामग्री (सूखे वजन के एमजी जी-1) के वायलिन भूखंडों को विभाजित करें। काली रेखाएं मतलब मूल्यों को दिखाती हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

इसके अलावा, एक गैर-अनुकूलित प्रोटोकॉल के उपयोग ने हमें परिणामों से कोई उपयोगी निष्कर्ष निकालने से रोका क्योंकि उन्होंने सभी नमूनों, दोनों प्रकार के सलाद और जंगली रिश्तेदारों को दिखाया, जिसमें एक समान विटामिन सी सामग्री थी। इसके विपरीत, अनुकूलित प्रोटोकॉल ने हमें डीएचए और टीएए सामग्री(तालिका 4)के लिए उनके बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण मतभेदों का पता लगाने की अनुमति दी, जो जंगली प्रजातियों(चित्रा 2)के सबसे अमीर लोग हैं।

गैर अनुकूलित अनुकूलित
एफ-रेशियो पी-वैल्यू एफ-रेशियो पी-वैल्यू
डीएचए 0.460 0.637एनएस 5.613 0.009**
ए. ए. 0.070 0.932एनएस 1.020 0.374एनएस
टीएए 0.015 0.985एनएस 4.438 0.022*
एनएस,* * और ** क्रमशः पीएंड एलटी;0.05 और 0.01 पर गैर महत्वपूर्ण और महत्वपूर्ण संकेत देते हैं।

तालिका 4: विटामिन सी की सामग्री में भिन्नता। एफ-अनुपात (दो विचरण के भागफल, समूह के बीच भिन्नता और समूह विचरण) और एक तरह से ANOVA से महत्व मूल्यों लैक्टुका के प्रकार पर विचार (वाणिज्यिक सलाद पत्ता किस्मों, पारंपरिक सलाद पत्ता किस्मों, और फसल जंगली रिश्तेदारों) DHAA, ए. ए. और TAA सामग्री के लिए गैर अनुकूलित और अनुकूलित प्रोटोकॉल में ।

पूरक फाइल 1: एए और टीएए स्थिरता 24 घंटे से अधिक 5 डिग्री सेल्सियस पर। (ए)ए. ए. और टीएए पीक क्षेत्र पूरे 24 घंटे में (बी)एए और टीएए सामग्री (सूखे वजन की एमजीजी-1) पूरे 24 घंटे में । बार 5 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोसंप्लर में रखे गए दो तकनीकी प्रतिकृति (एन = 2) के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं और प्रकाश के संपर्क से सुरक्षित हैं। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 2: टीएए, एए और डीएचए निष्कर्षण और मात्राकरण के लिए अनुकूलित और गैर-अनुकूलित प्रोटोकॉल के बीच मुख्य अंतर। इस्तेमाल किए गए नमूने दोनों मामलों में एक ही थे । इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

विटामिन सी एक बहुत ही महत्वपूर्ण पोषक तत्व है, लेकिन यह एक बहुत ही प्रयोगशाला यौगिक भी है, इसलिए इसका यूपीएलसी-यूवी क्वांटिफिकेशन कई कारकों पर निर्भर करता है, जैसे नमूना भंडारण और तैयारी, निष्कर्षण विधि और क्रोमेग्राफिक स्थितियां। इसलिए, एए (एंटीऑक्सीडेंट पावर के साथ) को रोकने के लिए एक तेज और सरल प्रक्रिया डीएचए (एंटीऑक्सीडेंट गुणों के बिना) के लिए ऑक्सीकरण की आवश्यकता थी। यौगिक की स्थिरता को बढ़ावा देने के लिए नमूना उपचार के दौरान उच्च पीएच और तापमान की स्थिति से बचने के साथ-साथ तीव्र प्रकाश और ऑक्सीकरण वातावरण के लिए भी महत्वपूर्ण था।

एए ऑक्सीकरण को कम करने के लिए निम्नलिखित उपाय किए गए। सबसे पहले, विटामिन सी सामग्री की सटीक मात्रा सुनिश्चित करने और आसानी से नमूनों में हेरफेर करने के लिए दोनों प्रोटोकॉल के लिए एक प्रारंभिक सामग्री के रूप में नमूनों को lyophilized किया गया था। इस विकल्प को ठीक पीसने पर पसंद किया गया था, आमतौर पर पूरे साहित्य में पाया जाता है19,क्योंकि धूल बहुत जल्दी पिघल जाती है ताकि पानी फिर से उपलब्ध हो जाए। निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान, अधिक अम्लीय समाधान (8% एसिटिक एसिड और 1% एमपीए) की उच्च मात्रा का उपयोग अनुकूलित प्रोटोकॉल(पूरक फ़ाइल 2)में एक्सट्रैक्ट के रूप में किया जाता था, जिसने एए के क्षरण को रोककर स्टेबलाइजर के रूप में भी काम किया था। इस समाधान में गैर-अनुकूलित प्रोटोकॉल(पूरक फ़ाइल 2)में एक्सट्रैक्ट के विपरीत स्थिरीकरण16को बढ़ाने के लिए एक चेटिंग एजेंट के रूप में ईडीटीए भी शामिल था। इसके अलावा, हमने परीक्षण किया कि क्या निष्कर्षण प्रक्रिया को 5 एमएल के साथ एक एकल के बजाय और मानक वायुमंडलीय स्थितियों के बजाय एन 2 वायुमंडलीय वातावरण के बजाय2.5 एमएल के साथ लगातार दो निष्कर्षणों का उपयोग करके बढ़ाया जा सकता है। सबसे अच्छा परिणाम एक असंशोधित वातावरण के तहत केवल एक निष्कर्षण का उपयोग करके पहुंचे थे, जो अनावश्यक अतिरिक्त कदम (डेटा नहीं दिखाया) बनाकर प्रोटोकॉल को सरल बनाया । अन्य मामूली परिवर्तन भी प्रोटोकॉल में शुरू किए गए थे ताकि निष्कर्षण (यानी, सोनीशन) को बढ़ाने के लिए, एक स्पष्ट अर्क (महीन निस्पंदन) प्राप्त किया जा सके और प्रोटोकॉल अवधि(पूरक फ़ाइल 2)को कम किया जा सके। क्रोमेग्राफिक स्थितियों के बारे में, विधि का सत्यापन18से पहले रिपोर्ट के अनुसार किया गया था, जो अच्छे विश्लेषणात्मक मापदंडों(तालिका 3)की गारंटी देता था। इसके अलावा, 1 एमएलमिनट -1 में मोनोपॉपॉटियम फॉस्फेट 30 एमएम (पीएच 3.0) के बजाय 0.3 एमएल मिन -1 प्रवाह के साथ फॉर्मिक एसिड (पीएच2.0)और मेथनॉल (98:2 वी:वी) के साथ अल्ट्रापुरे पानी का उपयोग एक विधि में सुधार हुआ। सबसे महत्वपूर्ण उन्नति की संभावना एचपीएलसी के बजाय यूपीएलसी प्रणाली का उपयोग करके की गई थी, जिसने हमें प्रभावित करने वाली स्थितियों (तापमान की तरह) के अधिक नियंत्रण की अनुमति दी और जिसके परिणामस्वरूप अज्ञात यौगिकों द्वारा हस्तक्षेप के बिना ए. ए. चोटियों का समाधान किया गया, कम समय में और निकालने की कम मात्रा(पूरक फ़ाइल 2)का उपभोग किया गया।

फिर भी, इस विधि की दो मुख्य सीमाएं हैं। पहला यह है कि डीएचए को स्पेक्ट्रम की यूवी रेंज में कम अवशोषण के कारण यूवी डिटेक्टर का उपयोग करके सीधे नहीं मापा जा सकता है। डीएचए की सामग्री की मात्रा बताना महत्वपूर्ण है क्योंकि यह कुछ जैविक गतिविधि प्रस्तुत करता है और मानव शरीर5में ए . ए. के लिए आसानी से परिवर्तनीय है । इसके लिए, टीएए(चित्रा 3)से एए सामग्री को घटाकर परोक्ष रूप से डीएचए को एए को कम करने के लिए एक अन्य क्रोमेग्राफिक रन के साथ- साथ एक अतिरिक्त प्रतिक्रिया की आवश्यकता है। इस अर्थ में, कम करने वाले एजेंट (डीटीटी) की उच्च एकाग्रता का उपयोग करके, प्रतिक्रिया समय को 5 से 30 मिनट तक बढ़ाकर, और सल्फ्यूरिक एसिड(पूरक फ़ाइल 2)के साथ प्रतिक्रिया को रोककर, कमी के कदम को अनुकूलित किया गया है। ए. ए. की कम स्थिरता विधि की दूसरी सीमा का गठन किया । चूंकि एए निष्कर्षण(पूरक फ़ाइल 1)के बाद 4 घंटे को नीचा दिखाना शुरू कर देता है, इसलिए इस समय अंतराल में इसकी मात्रा बताना आवश्यक है। इसलिए, निकालने के लिए नमूनों की संख्या क्रोमेग्राफिक प्रक्रिया द्वारा वातानुकूलित है। यही कारण है कि हम उन्हें इस प्रोटोकॉल में उस कदम पर फ्रीज करने का प्रस्ताव करते हैं, हालांकि उस मामले में, उन सभी को यूपीएलसी ऑटोसंप्लर में स्वचालित रूप से मापा जा सकता है । सौभाग्य से, ए. ए. के लिए कम आरटी ने हमें एचपीएलसी(पूरक फ़ाइल 2)का उपयोग करके प्राप्त 7 मिनट क्रोमेटोग्राम से बहुत कम 3 मिनट क्रोमाटोग्राम प्राप्त करने की अनुमति दी। इसलिए, विटामिन सी सामग्री एक 4 एच खिड़की में नमूनों की एक उच्च संख्या में निर्धारित किया जा सकता है ।

Figure 3
चित्र 3: सलाद पत्ता और कुछ जंगली रिश्तेदारों में विटामिन सी की मात्रा का कार्यप्रवाह।
अनुकूलित प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध आरेख केवल ए. ए. या ए. ए. + DHAA (TAA) के निर्धारण के लिए दो शाखाओं दिखा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चूंकि विटामिन सी मनुष्यों के लिए एक आवश्यक पोषक तत्व है और इसके महत्वपूर्ण स्वास्थ्य लाभों के कारण, यह कई अध्ययनों का उद्देश्य बन गया है। इसलिए, इसे दुनिया भर में सबसे अधिक खपत वाली सब्जियों में से एक सलाद पत्ता सहित फसलों की एक महान विविधता में मात्रा निर्धारित की गई है। सरल शास्त्रीय विधियों को धीरे - धीरे तरल क्रोमेटोग्राफी तकनीकों द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है क्योंकि वे अधिक विशिष्ट और सटीक10हैं । हालांकि, एक अतिरिक्त प्रतिक्रिया की जरूरत के कारण दोनों मात्रा, ए. ए. और HPA के माध्यम से, सलाद पत्ता पर कुछ अध्ययनों में, केवल ए. ए.14 या केवल TAA11 (ए. में डीएचए की कमी से पहले ए. की मात्रा के बिना) मापा गया है । इसके अलावा, केवल कुछ लेखकों ने विटामिन सी एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि2में दोनों अणुओं के योगदान के बावजूद ए. ए. और डीएचए की मात्रा निर्धारित की है। फिर भी, हाल के दिनों में कई फसलों में विटामिन सी को मापने केदौरान इसकेउच्च प्रदर्शन के कारण यूपीएलसी तकनीक अधिक महत्वपूर्ण हो गई है । दो पद्धतियों, UPLC और HPLC के साथ इस अध्ययन में प्राप्त परिणामों की तुलना, इन फायदों की पुष्टि की गई है: अच्छी तरह से परिभाषित ए. ए. एक उच्च संवेदनशीलता के लिए धंयवाद चोटियों, और बहुत कम समय में, प्राप्त किया गया है, जो भी कम संसाधनों का तात्पर्य भस्म । UPLC दक्षता के बावजूद, केवल चेन एट अल20 सलाद पत्ता में विटामिन सी सामग्री को मापने के लिए इस तकनीक को लागू किया है, जो अभी भी एक कम अनुमान के रूप में केवल ए. ए. फार्म मात्रा निर्धारित किया गया था ।

संक्षेप में, यह काम न केवल विभिन्न सलाद पत्ता किस्मों में बल्कि उनके कुछ जंगली रिश्तेदारों में भी कुल विटामिन सी सामग्री का निर्धारण करने के पहले सफल प्रयास का प्रतिनिधित्व करता है। प्रजनन कार्यक्रमों के भीतर उच्च एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि के साथ सलाद पत्ता का चयन करने के लिए विटामिन सी क्वांटिफिकेशन भी आवश्यक है। इस अर्थ में, सलाद पत्ता जंगली रिश्तेदारों में वृद्धि हुई कुल विटामिन सी सामग्री यहां पाया और बढ़ी हुई ए. ए. सामग्री पिछले अध्ययनों में रिपोर्ट14,साथ ही अन्य एंटीऑक्सीडेंट यौगिकों21,सलाद पत्ता के पोषण मूल्य में सुधार करने के लिए उपयुक्त उंमीदवारों को व्यापक ।

अंत में, यहां तक कि विटामिन सी की प्रकृति के लिए निहित कुछ सीमाओं के साथ, इसके क्रमिक गिरावट कुछ घंटे के बाद निकाला जा रहा है या कम DHAA यूवी-अवशोषण के कारण एक कमी प्रतिक्रिया की जरूरत की तरह, यह एक कम श्रम तीव्र और विटामिन सी सामग्री को मापने के लिए एक कम समय लेने वाली विधि प्रदान करता है । इसके अतिरिक्त, यह भी बहुत मजबूत है और एक उच्च संवेदनशीलता और संकल्प की शक्ति से पता चलता है । इसके अलावा, यह न केवल मामूली या कोई परिवर्तन के साथ अन्य संयंत्र सामग्रियों के लिए आसानी से हस्तांतरणीय है, बल्कि प्रसंस्कृत उत्पादों के लिए भी है जो मनुष्यों को विटामिन सी के आहार सेवन की आपूर्ति करते हैं, जो विश्वसनीय खाद्य गुणवत्ता के लिए परीक्षण के उभरते क्षेत्र में भविष्य के अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला को जन्म देता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम इस काम के लिए आवश्यक बीजों की आपूर्ति के लिए ज़रागोज़ा (बीजीजेड-सीटीए, स्पेन) और सेंटर फॉर जेनेटिक रिसोर्सेज (सीएनजी, वैगनिंगन, नीदरलैंड) के सब्जी जर्मप्लाज्म बैंक को कृतज्ञता से स्वीकार करते हैं। हम तकनीकी सहायता के लिए सीटीए से जे ए अरंजुलो, ए कास्टेलानोस और "प्रयोगशाला डी वैलोरासिओन पोषक" और अंग्रेजी भाषा की समीक्षा के लिए डी एल गुडचाइल्ड का धन्यवाद करते हैं। इस काम को राष्ट्रीय कृषि और खाद्य अनुसंधान और प्रौद्योगिकी संस्थान (INIA) और अरगोन सरकार से LMP164_18 से परियोजना RTA2017-00093-00-00 द्वारा वित्त पोषित किया गया था; और परिचालन कार्यक्रम फेडरर अरगोन 2014-2020 और यूरोपीय संघ से यूरोपीय सामाजिक कोष [ग्रुपोस कंसोलिडाडोस A12-17R द्वारा: "ग्रुपो डी इन्वेस्टिगासिओन एन फ्रुटिकुल्टुरा: कैरेक्टेरिज़िओन, अनुकूलन y मेजोरा जेनेका" और A14-17R: "सिस्टेमास एग्रोगनाडोरोस एलिमेंटारियोस सोस्टेनेबल्स" (सागास)] । I.M.L. स्पेन के विज्ञान, नवाचार और विश्वविद्यालयों के मंत्रालय (MCIU) और स्पेनिश राज्य अनुसंधान एजेंसी (AEI) से डॉक्टरों के प्रशिक्षण के लिए एक पूर्वडॉक्टोरल अनुबंध द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-Dithiothreitol (DTT) ≥98% (Ellman′s reagent) Roche 10197777001
10 mm Φ stainless steel ball Euro Aznar Supplies S.L. 20112100
15 mL polypropylene tube for centrifuge Deltalab 429946
2 mL HPLC amber vial Agilent 5190-9063
2 mL syringe with needle Deltalab JS2
20 mL polypropylene tubes Deltalab 202840
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIS) ≥99.9% (titration) Roche 10708976001
50 mL polypropylene tube Deltalab 429951
Acetic acid (CH3COOH) ≥99% purity glacial, ReagentPlus Sigma-Aldrich A6283
Acetonitrile, HPLC super gradient grade (99.9+% CH3CN-0.2 µm filtrated) Chem-lab CL00.0189
Acquity UPLC HSS T3 column (150 mm x 2.1 mm x 1.8 µm) Waters 186003540
Beaker 1 L, 200 mL Deltalab 191725, 191722
Dipotassium phosphate (KH2PO4) Panreac 766384 Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium salt (EDTA x 2H2O) 99-101% assay, ACS reagent Panreac 131669
Fisherbrand Analog MultiTube Vortexer Thermo Fisher Scientific 15549004
Formic acid 98-100% for HPLC LiChropur Supelco 5438040100
Freeze dryer VirTis genesis 25EL VirTis na
Heidolph Multi Reax mixer Heidolph na
Heidolph Reax top mixer Heidolph na
Hewlett Packard HPLC 1050 equipped with an eλ Detector Hewlett Packard na Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Hydrochloric acid (HCl) 37% purity, ACS reagent Sigma-Aldrich 320331
L-Ascorbic acid ≥99%, ACS reagent Sigma-Aldrich 255564
Meta-phosphoric acid (MPA) ACS reagent, chips, 33.5-36.5% Sigma-Aldrich 239275
Methanol ≥99.9% (HPLC supergradient grade) ChemLab CL00.0189.2500
Micropipettes 10-1000 μL Socorex na
Nucleosil 120 C18 Tracer column (250 mm x 4 mm x 5 µm) Merck (Sigma-Aldrich) 54919 Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
PTFE-silicone cap with preaperture Agilent 5190-9067
Refrigerated centrifuge Gyrozen 1248R Gyrozen na
Regenerated cellulose filters 0.22 µm (13 mm) Agilent 1015190-5108
Regenerated cellulose filters 0.45-µm (13 mm) Labbox SFCA-145-100 Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Spectrophotometer Heλios β Thermo Scientific Corporation na
Sulfuric acid (H2SO4) 95.0-98.0% purity, ACS reagent Sigma-Aldrich 258105
Ultrapure water WasserLab na
Ultrasons H-D Selecta na
Volumetric flasks 1 L, 100 mL DeltaLab 191489, 191486
Waters Acquity UPLC H-Class equipped with a PDA eλ Detector Waters na

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References

  1. FAOSTAT. Statistics of the Food and Agriculture Organization of the United Nations. FAOSTAT. , Available from: http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC (2018).
  2. Llorach, R., Martínez-Sánchez, A., Tomás-Barberán, F. A., Gil, M. I., Ferreres, F. Characterisation of polyphenols and antioxidant properties of five lettuce varieties and escarole. Food Chemistry. 108 (3), 1028-1038 (2008).
  3. Carr, A. C., Frei, B. Toward a new recommended dietary allowance for vitamin C based on antioxidant and health effects in humans. American Journal of Clinical Nutrition. 69 (6), 1086-1107 (1999).
  4. Carr, A. C., Vissers, M. C. M. Synthetic or food-derived vitamin C-Are they equally bioavailable. Nutrients. 5 (11), 4284-4304 (2013).
  5. Lee, S. K., Kader, A. A. Preharvest and postharvest factors influencing vitamin C content of horticultural crops. Postharvest Biology and Technology. 20 (3), 207-220 (2000).
  6. Shekhovtsova, T. N., Muginova, S. V., Luchinina, J. A., Galimova, A. Z. Enzymatic methods in food analysis: determination of ascorbic acid. Analytica Chimica Acta. 573-574, 125-132 (2006).
  7. Zhan, L., et al. Light exposure during storage preserving soluble sugar and L-ascorbic acid content of minimally processed romaine lettuce (Lactuca sativa L.var. longifolia). Food Chemistry. 136 (1), 273-278 (2013).
  8. Malejane, D. N., Tinyani, P., Soundy, P., Sultanbawa, Y., Sivakumar, D. Deficit irrigation improves phenolic content and antioxidant activity in leafy lettuce varieties. Food Science and Nutrition. 6 (2), 334-341 (2017).
  9. Tarrago-Trani, M. T., Phillips, K. M., Cotty, M. Matrix-specific method validation for quantitative analysis of vitamin C in diverse foods. Journal of Food Composition and Analysis. 26 (1-2), 12-25 (2012).
  10. Klimczak, I., Gliszczyńska-Świgło, A. Comparison of UPLC and HPLC methods for determination of vitamin C. Food Chemistry. 175, 100-105 (2015).
  11. Złotek, U., Świeca, M., Jakubczyk, A. Effect of abiotic elicitation on main health-promoting compounds, antioxidant activity and commercial quality of butter lettuce (Lactuca sativa L.). Food Chemistry. 148, 253-260 (2014).
  12. Koh, E., Charoenprasert, S., Mitchell, A. E. Effect of organic and conventional cropping systems on ascorbic acid, vitamin C, flavonoids, nitrate, and oxalate in 27 varieties of spinach (Spinacia oleracea L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (12), 3144-3150 (2012).
  13. Kałuzewicz, A., et al. The influence of short-term storage on the content of flavonoids and vitamin C in Broccoli. European Journal of Horticultural Science. 77 (3), 137-143 (2012).
  14. van Treuren, R., van Eekelen, H. D. L. M., Wehrens, R., de Vos, R. C. H. Metabolite variation in the lettuce gene pool: towards healthier crop varieties and food. Metabolomics. 14 (11), 1-14 (2018).
  15. Swartz, M. E. UPLC: An introduction and review. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 28 (7), 1253-1263 (2005).
  16. Spínola, V., Mendes, B., Câmara, J. S., Castilho, P. C. An improved and fast UHPLC-PDA methodology for determination of L-ascorbic and dehydroascorbic acids in fruits and vegetables. Evaluation of degradation rate during storage. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (4), 1049-1058 (2012).
  17. Ball, G. F. M. Water-soluble vitamin assays in human nutrition. , Springer. Boston, MA. (1994).
  18. Bertolín, J. R., et al. Simultaneous determination of carotenoids, tocopherols, retinol and cholesterol in ovine lyophilised samples of milk, meat, and liver and in unprocessed/raw samples of fat. Food Chemistry. 257, 182-188 (2018).
  19. Spínola, V., Llorent-Martínez, E. J., Castilho, P. C. Determination of vitamin C in foods: Current state of method validation. Journal of Chromatography A. 1369, 2-17 (2014).
  20. Chen, Y., et al. radiation is beneficial for yield and quality of indoor cultivated lettuce. Frontiers in Plant Science. 10, 1-10 (2019).
  21. Damerum, A., et al. Elucidating the genetic basis of antioxidant status in lettuce (Lactuca sativa). Horticulture Research. 2 (15055), 1-13 (2015).

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बायोकेमिस्ट्री अंक 160 एस्कॉर्बिक एसिड क्रॉप वाइल्ड रिश्तेदार (सीडब्ल्यूआर) डेहिड्रोस्कोर्बिक एसिड लेट्यूस लैक्टुका सतीवा एल लिक्विड क्रोमेटोग्राफी
सलाद पत्ता किस्मों<em>(लैक्टुका सतीवा</em> एल) और क्रॉप वाइल्ड रिश्तेदारों<em>(लैक्टुका</em> स्पीप) में विटामिन सी के परिमाणीकरण के लिए यूपीएलसी-यूवी विधि में सुधार हुआ।
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Medina-Lozano, I., Bertolín, J. … More

Medina-Lozano, I., Bertolín, J. R., Zufiaurre, R., Díaz, A. Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (Lactuca sativa L.) and Crop Wild Relatives (Lactuca spp.). J. Vis. Exp. (160), e61440, doi:10.3791/61440 (2020).

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