Summary
Vi presenterer en rask og pålitelig metode for å kvantifisere vitamin C i Lactuca spp. ved hjelp av UPLC-UV, potensielt overførbar til andre planter. De viktigste trinnene er prøvepreparatet og vitamin C-ekstraksjon under stabile forhold, reduksjon av dehydroascorbinsyre til askorbinsyre og optimalisering av kromatografisk prosedyre.
Abstract
Vitaminer, spesielt vitamin C, er viktige mikronæringsstoffer som finnes i frukt og grønnsaker. Vitamin C er også en viktig bidragsyter til deres antioksidantkapasitet. Salat er en av de mest populære grønnsaker blant forbrukere over hele verden. En nøyaktig protokoll for å måle vitamin C-innhold i salat og andre relaterte arter er avgjørende. Vi beskriver her en metode ved hjelp av den ultrahøye væskekromatografi-ultrafiolette (UPLC-UV)-teknikken, der prøveforberedelse, vitaminekstraksjon og kromatografiforhold ble optimalisert.
Prøver ble samlet inn for å representere hele anlegget, frosset ved -80 °C og lyofilisert for å forhindre uønsket oksidasjon og gjøre manipulasjonen enklere. Ekstraksjon av vitamin C ble utført i sure medier, noe som også bidro til stabiliteten. Siden vitamin C kan være til stede i to forskjellige interkonvertible former, askorbinsyre (AA) og dehydroascorbinsyre (DHAA), bør begge forbindelsene måles for nøyaktig kvantifisering. DHAA ble kvantifisert indirekte etter reduksjonen til AA fordi AA viser en høyere absorptivitet enn DHAA i UV-spekteret. Fra samme ekstrakt ble det utført to målinger, en før og en etter den reduksjonsreaksjonen. I det første tilfellet kvantifiserte vi AA-innholdet, og i det andre kvantifiserte vi summen av AA og DHAA (TAA: total askorbinsyre) i form av AA. Deretter ble DHAA-mengden indirekte oppnådd ved å trekke AA fra den første målingen fra TAA. De ble bestemt av UPLC-UV, ved hjelp av en kommersiell AA-standard for å bygge en kalibreringskurve og optimalisere kromatografisk prosedyre, for å oppnå AA-topper som ble fullstendig løst på kort tid. Denne protokollen kan enkelt ekstrapoleres til noe annet plantemateriale med små eller ingen endringer. Nøyaktigheten viste statistisk signifikante forskjeller ellers ubedratt. Andre styrker og begrensninger diskuteres mer i dybden i manuskriptet.
Introduction
Dyrket salat (Lactuca sativa L.) er en av de mest produserte og konsumerte grønne grønnsaker over hele verden, med en total produksjon på ca 27,3 millioner tonn i 20181. Salat oppfattes som sunn av forbrukerne. Ernæringsmessige egenskaper tilskrives hovedsakelig kilden til antioksidantforbindelser i avlingen, for eksempel vitamin C, blant annet som polyfenoler og vitamin E2. Vitamin C er et viktig mikronæringsstoff for mennesker i motsetning til mange andre virveldyr, da vi ikke klarer å produsere det på grunn av mutasjoner tilstede i genkodingen for det siste trinnetzymet i biosyntetisk vei3. Det er nødvendig for en normal cellemetabolisme, og det spiller også en viktig rolle i immunresponser hovedsakelig på grunn av sinantioksidantaktivitet 3,4.
Total vitamin C består av askorbinsyre (AA) og dehydroascorbinsyre (DHAA). AA er den mest biologisk aktive formen av vitaminet, men DHAA (oksidasjonsproduktet) viser også biologisk aktivitet, og det kan lett konverteres til AA i menneskekroppen5. Derfor er kvantifisering av begge former viktig for å bestemme det totale vitamin C-innholdet i enhver hagebruksavling, salat inkludert.
Et bredt utvalg av tilnærminger basert på ulike analytiske teknikker har blitt brukt til å måle vitamin C i grønnsaker, for eksempel enzymatiske, spektrofotometriske og titrimetriskemetoder 6,7,8. Selv om disse metodene er enkle, er de ikke kjemisk spesifikke for AA9. Følgelig foretrekkes kromatografiske metoder, spesielt den høyytelses flytende kromatografi-ultrafiolett (HPLC-UV) teknikk, på grunn av deres høyere nøyaktighet10. HPLC-UV har blitt brukt til å bestemme vitamin C i et stort mangfold av avlinger, som brokkoli, spinat og salat11,12,13. Samtidig kvantifisering av AA og DHAA er imidlertid komplisert på grunn av den lave absorptiviteten til DHAA i UV-spekterets UV-område. Alternativt kan DHAA bestemmes indirekte ved hjelp av et reduksjonsmiddel som konverterer DHAA til AA, måler total askorbinsyre (TAA), og deretter beregner forskjellen mellom TAA og AA. På grunn av nødvendigheten av en reduksjonsreaksjon, har bare AA i noen studier blitt kvantifisert14, noe som faktisk kan representere en undervurdering av vitamin C-aktivitet. Den ekstra reduksjonsreaksjonen er også nødvendig for å bestemme DHAA indirekte selv når det siste fremskrittet i flytende kromatografiteknikker, ultrahøy ytelse flytende kromatografi (UPLC), brukes. Dette trinnet drar også nytte av fordelene som UPLC viser sammenlignet med HPLC: høyere effektivitet og oppløsning, økt følsomhet, kortere tidsanalyse og lavere løsningsmiddelforbruk15. Som følge av dette har UPLC-UV-teknikken blitt brukt til å kvantifisere vitamin C i forskjellige avlinger16.
I tillegg er AA et veldig labile molekyl; Dermed er det viktig å utvikle en protokoll som forhindrer nedbrytning under salatlagring og vitamin C-analyse9. I denne sammenheng tilbyr følgende protokoll en rask og forbedret kvantifisering av vitamin C-innhold i salat av UPLC-UV, samt en effektiv ekstraksjonsprosedyre. Ikke bare elite sorter har blitt inkludert i den nåværende studien, men også tradisjonelle landras og noen ville slektninger på grunn av deres potensielle interesse for avling, spesielt i forbedring av næringsverdien av salat.
Protocol
1. Preparat av plantemateriale
- Prøv minst to blader per plante i 50 ml polypropylenrør, en ytre (eldre) og en indre (yngre) en for å representere mer nøyaktig hele planten. Samle minst tre biologiske repliker for hver prøve.
- Frys dem umiddelbart ved hjelp av flytende nitrogen og oppbevar dem ved -80 °C til bruk. Pass på at det flytende nitrogenet ikke kommer inn i rørene; ellers kan de eksplodere når de fjernes på grunn av gassutvidelsen under fordampning.
FORSIKTIG: Hansker og ansiktsskjerm er nødvendig på grunn av de potensielle farene forbundet med bruk av flytende nitrogen. - Fjern hettene fra rørene og legg dem på brettene i frysetørkereni lyofilisatoren ( Materialsekk) programmert som følger: -25 °C i 72 timer, -10 °C i 10 timer, 0 °C i 10 h og 20 °C i minst 4 timer. Hold kondensatortemperaturen og vakuumkonstanten under frysetørkeprosessen ved henholdsvis -80,2 °C og 112 mTorr.
- Når materialet er helt tørt (mellom 4 og 7 dager avhengig av anlegget og graden av komprimering i røret), må du bevare ved 4 °C, -20 °C eller -80 °C i korte (dager til uker), henholdsvis middels (måneder) eller lang (år). Inkludering av poser som inneholder silikagelperler i prøveholdige rør anbefales.
- Plasser de lyofiliserte prøvene i 20 ml polypropylenrør sammen med 10 mm diameter i rustfritt stål og slip dem med en multitubevirvel ved hjelp av intensiteten og tiden som trengs for å få et fint støv.
MERK: Under hele prosessen beskytter du prøvene mot eksponering for direkte lys.
2. Reagens og klargjøring av oppløsning
- Klargjør løsningsmiddelekstraksjonsløsningen: 8 % eddiksyre (v/v), 1 % MPA (metafosforsyre) (w/v), 1 mM EDTA (etylendiaminetetraacetisk syre).
- Beregn det totale volumet av løsningsmiddel som trengs for å behandle hele settet med prøver som tar hensyn til at 5 ml vil bli lagt til hver. For å forberede 1 l av løsningen, legg til en kolbe: 30 g MPA, 0,372 g EDTA dehydrere, 80 ml eddiksyre og 500 ml ultrapurt vann (skalere volumer og mengder tilsvarende). Forsegle kolbenmunnen med plastfilm.
- Når den er oppløst ved hjelp av en magnetisk rører, bruk en volumetrisk kolbe for å måle nøyaktig 1 L, og tilsett det nødvendige ultrapure vannet.
- Forbered reduksjonsreaksjonsbufferen (0,5 M Tris (2-amino-2-(hydroksymetyl)-1,3-propandiol) pH 9,0) og redusere oppløsningen (40 mM DTT (1,4-Dithiothreitol) med 0,5 M Tris pH 9.0).
- Beregn det totale volumet av å redusere løsningen som trengs for å behandle hele settet med prøver som tar hensyn til at 200 μL vil bli lagt til hver av dem. For å klargjøre 100 ml av bufferen, legg til et beger: 6.055 g Tris og 90 ml ultrarent vann (skaler volumer og mengder tilsvarende). Forsegle begermunnen med plastfilm.
- Når den er oppløst ved hjelp av en magnetisk rører, justerer du løsningen til pH 9.0 ved å tilsette 2 M HCl og bruke en volumetrisk kolbe for å måle nøyaktig 100 ml, og tilsett det nødvendige ultrapure vannet.
- For å forberede 100 ml av reduksjonsløsningen, legg til et beger: 0,629 g DTT (renhet: 98%) og 90 ml av bufferen (0,5 M Tris pH 9,0) tidligere forberedt (2.2.1 til 2.2.2). Skaler volumer og mengder tilsvarende. Forsegle begermunnen med plastfilm.
- Når den er oppløst ved hjelp av en magnetisk rører, bruk en volumetrisk kolbe til å måle nøyaktig 100 ml, og tilsett det nødvendige volumet av buffer 0,5 M Tris pH 9.0.
MERK: Reduksjonsløsningen er svært ustabil. Derfor anbefales en nylaget løsning på det sterkeste.
- Svovelsyre (0,4 M H2SO4)
- Beregn det totale volumet på 0,4 M svovelsyre som trengs for å behandle hele settet med prøver som tar hensyn til at 200 μL vil bli lagt til hver. For å forberede 100 ml av løsningen, legg til et beger: 80 ml ultrarent vann og deretter 2,22 ml H2SO4 (renhet: 96%, tetthet: 1,84 g ml-1). Bruk en volumetrisk kolbe til å måle nøyaktig 100 ml, og tilsett nødvendig ultrarent vann.
FORSIKTIG: Svovelsyre er svært korroderende, så det må håndteres med verneutstyr og under hette. I tillegg bør syren tilsettes til ultrarent vann, og ikke vann til syre, for å redusere røyk og unngå ulykker.
- Beregn det totale volumet på 0,4 M svovelsyre som trengs for å behandle hele settet med prøver som tar hensyn til at 200 μL vil bli lagt til hver. For å forberede 100 ml av løsningen, legg til et beger: 80 ml ultrarent vann og deretter 2,22 ml H2SO4 (renhet: 96%, tetthet: 1,84 g ml-1). Bruk en volumetrisk kolbe til å måle nøyaktig 100 ml, og tilsett nødvendig ultrarent vann.
- Saltsyre (2 M HCl).
- For å forberede 100 ml 2 M saltsyre, legg til et beger: 80 ml ultrarent vann og deretter 6,13 ml HCl (renhet: 37%, tetthet: 1,19 g ml-1). Forsegle begermunnen med plastfilm. Bruk en volumetrisk kolbe til å måle nøyaktig 100 ml, og tilsett nødvendig ultrarent vann. Skaler volumer tilsvarende.
FORSIKTIG: Saltsyre er svært korroderende, så det må håndteres ved hjelp av verneutstyr og under hette. I tillegg bør syren tilsettes til ultrarent vann, og ikke vann til syre, for å redusere røyk og unngå ulykker.
- For å forberede 100 ml 2 M saltsyre, legg til et beger: 80 ml ultrarent vann og deretter 6,13 ml HCl (renhet: 37%, tetthet: 1,19 g ml-1). Forsegle begermunnen med plastfilm. Bruk en volumetrisk kolbe til å måle nøyaktig 100 ml, og tilsett nødvendig ultrarent vann. Skaler volumer tilsvarende.
- AA-standard (lager og fortynninger)
- Vei nøyaktig 10 mg AA-standard (renhet: 99 %) ved hjelp av en presisjonsbalanse og tilsett 90 ml mobil fase (ultrapure vann pH 2.0 med maursyre).
- Når den er oppløst ved hjelp av en magnetisk rører, bruk en volumetrisk kolbe til å måle nøyaktig 100 ml, og tilsett det nødvendige volumet av ultrarent vann pH 2.0 med maursyre.
MERK: Beskytt denne lagerløsningen mot eksponering for lys. - Forbered fem fortynninger fra lageret til AA-standarden for å oppnå en kalibreringskurve ved å følge instruksjonene i tabell 1 og fortsette med trinn 5.2.
| Standard (standard) | [AA] (μg ml-1) | AA (100 μg ml-1) oppløsning (μL) | Mobil fase (μL)og |
| 1 | 0.5 | 5 | 995 |
| 2 | 2.5 | 25 | 975 |
| 3 | 5 | 50 | 950 |
| 4 | 10 | 100 | 900 |
| 5 | 25 | 250 | 750 |
| a. Ultrapure vann pH 2.0 surgjort av maursyre. | |||
Tabell 1: Protokoll for å utarbeide fem standarder for AA (askorbinsyre). Volumer av solute og løsningsmiddel for å forberede hver av de forskjellige konsentrasjonene av standardene er indikert.
3. Ekstraksjon av AA og DHAA
MERK: Det anbefales å arbeide under forhold med lav lysintensitet under ekstraksjonstrinnene.
- Til en 15 ml polypropylen sentrifuge rør, tilsett 50 mg lyofilisert bakken prøve og 5 ml av ekstraksjon løsemiddel (trinn 2.1).
- Rist blandingen ved hjelp av en virvel i 5 s og deretter en orbital shaker i 10 min ved 2000 rpm.
- Introdder røret i et ultralydbad i 10 minutter ved romtemperatur med ultralyd aktivert.
- Sentrifuge ved 4000 x g i 10 min ved 4 °C.
- Ta det overnaturlige, send det gjennom et 0,22 μm regenerert cellulosefilter og oppbevar det i et 5 ml gult hetteglass. Dette er Extract 1, som inneholder AA og DHAA.
MERK: Protokollen kan settes på pause her ved å fryse ekstraktene ved -80 °C og beskytte dem mot eksponering for lys, da AA og DHAA er svært ustabile og degraderes lett i nærvær av lys, ved høye temperaturer eller under oksiderende atmosfærer (Tilleggsfil 1).
4. DHAA reduksjon til AA for å trekke ut TAA
- Overfør 200 μL ekstrakt 1 til et 2 ml gult hetteglass for flytende kromatografi og tilsett 200 μL av reduksjonsløsningen (trinn 2.2). Lukk hetteglasset med en PTFE-silikonplugg med foråpning og rist det med en virvel i 5 s.
- La oppløsningen stå i 30 min ved romtemperatur og beskytte mot lys.
- Tilsett 200 μL på 0,4 M H2SO4 for å stoppe reaksjonen og stabilisere AA i sur pH. Den resulterende løsningen er Extract 2, som bare inneholder AA og faktisk er TAA.
5. Besluttsomhet
- UPLC-UV-forberedelse
- Forbered arbeidsløsningene som er beskrevet i tabell 2, filtrert gjennom 0,22 μm filtre, sonikert i minst 10 minutter og plasser dem i UPLC-systemet.
- Slå på de tre UPLC-modulene og vent til den interne kalibreringsprosessen er ferdig.
- Åpne programvaren (f.eks. Empower 3) og last inn instrumentalprogrammet som er beskrevet i tabell 2: Empower 3 | Kjøre eksempler | Vitamin C-metode | UPLC_PDA | Bruk QuickStart.
- Når programvaren er lastet med riktig program, kan du gå til UPLC-administrasjonskonsollen: Quaternary Solvent Manager | Klikk høyre museknapp | Start konsollen.
- Fortsett til klargjøring og stabilisering av UPLC-instrumentet: System | Kontroll | Oppstart.
- Tøm alle UPLC-linjer i minst 5 min: Prime Solvents | QSM | Sjekk A, B, C, D og Seal Wash | Varighet av prime > 5 min.
- Rense og rengjøre injektoren: Prime løsemidler | SM | Sjekk Vask løsemiddel (> 45 s) og Sjekk Tøm tømmningsmiddel (> 35 sykluser).
- Likevekt UPLC til metodeforhold: Likevekt til metode | QSM | Strømning (0,3 ml min-1) | Løsemiddel A (2 %) | Løsemiddel B (0%) | Løsemiddel C (98 %) | Løsningsmiddel D (0%); Likevekt til metode | SM | Eksempel (5 °C) | Kolonne (30 °C) og likevekt til metode | Annet | Sjekk lampen På | Trykk på Start.
- Vent i minst 1 time (enda mer tid anbefales) til utstyret stabiliserer seg. Stabilitet kan verifiseres kontrollere trykket i kolonnen i Launch Console: System | Kvartær løsningsmiddel leder | QSM systemtrykk. Sørg for at det ikke er noen identifiserbare trender i trykkendringer (enten øker eller reduseres) og deltaverdien er mindre enn 10 psi.
- Fyll matrisen med navnene på standardene og prøvene som skal analyseres, i Hurtigstart-skjermbildet.
- AA bestemmelse i standardene
- Overfør 1 ml av hver av de fem AA-standardene som tidligere var forberedt (trinn 2,5,3) til 2 ml rav hetteglass for flytende kromatografi. Lukk hetteglasset med en PTFE-silikonplugg med foråpning og injiser 5 μL i UPLC-instrumentet.
- Utfør kromatografien etter prosedyren beskrevet i tabell 2 fra de fleste fortynnede til mest konsentrerte.
- AA-bestemmelse i prøvene
- Pipette 200 μL av ekstrakt 1 i et 2 ml gult hetteglass for flytende kromatografi og tilsett 800 μL ultrarent vann. Lukk hetteglasset med en PTFE-silikonplugg med foråpning og injiser 5 μL i UPLC-instrumentet.
- Utfør kromatografien etter fremgangsmåten som er beskrevet i tabell 2.
- TAA-bestemmelse i prøvene
- Tilsett 400 μL ultrarent vann til avtrekk 2. Lukk hetteglasset med en PTFE-silikonplugg med foråpning og injiser 5 μL i UPLC-instrumentet.
- Utfør kromatografien etter fremgangsmåten som er beskrevet i tabell 2.
| Komponenter og parametere | Beskrivelse |
| Instrument | Frikjennelse UPLC H-Klasse |
| Detektor | PDA eλ Detektor λabs for AA=245 nm |
| Programvare | Styrke 3 |
| Kolonnen | Frikjenning UPLC HSS T3 (150 mm x 2,1 mm x 1,8 μm) |
| Kanal A | CH3Å |
| Kanal B/Vask | H2O:CH3OH (50:50 v:v) |
| Kanal C | Ultrapure vann pH 2.0 surgjort av maursyrea |
| Kanal D/Tetningsvask | Ultrapure vann:acetonitrile (90:10 v:v) |
| Mobil fase | 0,3 ml min-1 av 2%A + 98%C (isokratisk modus) |
| Kolonne temperatur | 30 °C |
| Autosampler temperatur | 5 °C (andre) |
| Injeksjonsvolum | 5 μL |
| AA oppbevaringstid | 1.874 min. |
| Kjøretid | 3 min. |
| a. Ubestemt volum av maursyre som brukes til pH-justering | |
Tabell 2: Kromatografisk prosedyre optimalisert for å bestemme AA (askorbinsyre) i ekstrakter fra salat og ville slektninger. Beskrivelse av komponenter, forhold og løsninger som benyttes.
6. Kvantifisering av AA og DHAA
- Statistisk analyse
- Bestem de analytiske parametrene for den kromatografiske metoden som beskrevet av Bertolín et al.18 (tabell 3).
MERK: Verdiene for parametrene som presenteres i tabell 3 må defineres under spesifikke eksperimentelle forhold.
- Bestem de analytiske parametrene for den kromatografiske metoden som beskrevet av Bertolín et al.18 (tabell 3).
| Analytiske parametere av metoden | Verdier |
| Lineært område (μg ml-1) | 0.5-25 |
| Lineær ligning | y=53 143,03x |
| R2 (andre) | 0.99998 |
| Grense for deteksjon (mg AA g-1 av tørr materiale) | 0.013 |
| Grense for kvantifisering (mg AA g-1 av tørrmære) | 0.045 |
| Repeterbarhet (CV, %)en | 1.75 |
| Mellompresisjon (CV, %)en | 4.22 |
| Bedring (Rec, %)b | 95.6±2.4 |
| a. CV: variasjonskoeffisient | |
| B (andre) Gjenvinningsanalysen ble utført med 10 aliquots som inneholder 50 mg av samme prøve, 5 spiked med 2 mg AA g-1 av tørt materiale, og 5 ikke-piggete. %Rec=([AA]spiked sample-[AA]sample)/([AA]spiked)x100. | |
Tabell 3: Optimaliserte analytiske parametere for deteksjon og kvantifisering av AA (askorbinsyre) og TAA (total askorbinsyre). Det lineære området, ligningen og koeffisienten for bestemmelse av kalibreringskurven (R2) kurven, samt grensene for deteksjon og kvantifisering av AA (det samme for TAA), og repeterbarheten, mellompresisjonen og utvinningen ble oppnådd med et prøveinjeksjonsvolum på 5 μL.
- Beregn AA- og TAA-konsentrasjonen.
- Åpne standard- og prøvekromatrammer: QuickStart | Bla gjennom Project | Kanaler | "navn på standard eller eksempel" | PDA Ch1 245 nm@1,2 nm.
- Integrer den tilsvarende toppen (AA eller TAA) i standarder og prøver ved å klikke på startpunktet (ca. 1.790 min) og dra den med musen til sluttpunktet (ca. 1.910 min).
- Bygg en kalibreringskurve som representerer absorbansverdiene som bestemmes kromatografisk (trinn 5.2.) mot konsentrasjonen av de fem AA-standardene som er utarbeidet ovenfor (tabell 1).
- Interpolere absorbansverdiene til prøvene som er bestemt i trinn 5.3 og 5.4 og oppnå AA- og TAA-konsentrasjonen, henholdsvis med følgende formel:
hvor y er det integrerte toppområdet, x er AA eller TAA konsentrasjon i ppm og m og n er skråningen og y-avskjæringenav den oppnådde regresjonslinjen, henholdsvis. - For beregning av konsentrasjonen av DHAA, bruk følgende formel:
MERK: For å oppnå de totale konsentrasjonene av DHAA, AA og TAA i mg g-1 av tørr vekt, må verdiene som oppnås direkte interpolering i kalibreringskurven multipliseres med det totale ekstraktvolumet og fortynningsfaktoren som brukes, og deretter divideres på vekten av prøven som brukes til å utføre ekstraksjonen.
Representative Results
Vitamin C-kvantifisering i Lactuca matriser krever utvikling av en kromatografisk tilnærming som kan sikre pålitelige resultater. Figur 1A viser et kromatogramme som følge av en ikke-optimalisert protokoll (Tilleggsfil 2), som presenterer en AA-topp sammen med en uidentifisert mindre "skulder". Likevel, etter å ha forbedret utvinning og kromatografiske forhold, ble en løst AA-topp uten forstyrrelser av ukjente forbindelser oppnådd (figur 1B). I tillegg tillot bruken av UPLC-UV-utstyr i stedet for HPLC-UV oss å redusere oppbevaringstiden (RT) for AA: 1.874 min i de optimaliserte kromatrammene versus 2.980 min i de ikke-optimaliserte (figur 1), samt kjøretider, 3 og 7 minutter for de optimaliserte og ikke-optimaliserte protokollene, henholdsvis.
Figur 1: Kromatogrammer av AA i samme salatprøve (kommersiell sortiator 'Begoña'). (A) HPLC-UV-kromatrammet som følge av en ikke-optimalisert protokoll (forhold som er beskrevet i tilleggsfil 2). (B) UPLC-UV-kromatrammet oppnådd med den optimaliserte protokollen (forholdene beskrevet i tabell 2). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Forstyrrelser i AA-topper, som de som ble observert i figur 1A, resulterte konsekvent i undervurdering av vitamin C (AA, DHAA og TAA) innhold (figur 2) på grunn av utilstrekkelig separasjon under kromatografisk prosess som overlappende toppområder ble integrert av en vertikal dråpe på det dypeste punktet mellom dem. Denne skjevheten er spesielt merkbar i tilfelle av avlingen ville slektninger, spesielt i DHAA og TAA innhold (Figur 2).
Figur 2: Fordeling av innholdet av vitamin C. Split fiolin tomter av DHAA, AA og TAA innhold (mg g-1 av tørr vekt) i kommersielle og tradisjonelle salat varianter og noen ville slektninger ved hjelp av ikke-optimaliserte og optimaliserte protokoller. Svarte linjer viser gjennomsnittsverdiene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Videre forhindret bruken av en ikke-optimalisert protokoll oss fra å trekke ut noen nyttig konklusjon fra resultatene, da de viste alle prøver, både typer salater og de ville slektningene, som hadde et lignende vitamin C-innhold. I motsetning tillot den optimaliserte protokollen oss å oppdage statistisk signifikante forskjeller blant dem for DHAA- og TAA-innhold (tabell 4), de rikeste er de ville artene (figur 2).
| Ikke optimalisert | Optimalisert | |||
| F-forhold | p-verdi | F-forhold | p-verdi | |
| Dhaa | 0.460 | 0.637ns | 5.613 | 0.009** |
| Aa | 0.070 | 0.932år | 1.020 | 0.374år |
| Taa | 0.015 | 0.985år | 4.438 | 0.022* |
| ns, * og ** indikerer henholdsvis ikke signifikant og signifikant ved henholdsvis p<0,05 og 0,01. | ||||
Tabell 4: Variasjon i innholdet av vitamin C. F-ratioer (kvotienter av to avvik, mellomgruppevariiansen og variansen i gruppen) og betydningsverdier fra enveis ANOVA med tanke på typen Lactuca (kommersielle salatvarianter, tradisjonelle salatvarianter og avlingsvillige slektninger) for DHAA, AA og TAA-innhold i ikke-optimaliserte og optimaliserte protokoller.
Tilleggsfil 1: AA og TAA stabilitet ved 5 °C over 24 timer. (A) AA- og TAA-toppområder i 24 timer (B) AA- og TAA-innhold (mg g-1 tørrvekt) i 24 timer. Stolper representerer standardavvikene til to tekniske repliker (n=2) som oppbevares i autosampleren ved 5 °C og beskyttet mot eksponering for lys. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: Hovedforskjellene mellom den optimaliserte og ikke-optimaliserte protokollen for TAA, AA og DHAA utvinning og kvantifisering. Prøvene som ble brukt var de samme i begge tilfeller. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Vitamin C er et svært viktig næringsstoff, men det er også en veldig labile forbindelse, så UPLC-UV-kvantifiseringen er avhengig av flere faktorer, for eksempel prøvelagring og forberedelse, ekstraksjonsmetode og kromatografiske forhold. Derfor var det nødvendig med en rask og enkel prosedyre for å forhindre AA (med antioksidantkraft) oksidasjon til DHAA (uten antioksidantegenskaper). Det var også avgjørende å unngå høye pH- og temperaturforhold, samt intenst lys og en oksiderende atmosfære under prøvebehandling for å fremme stabiliteten til forbindelsen.
For å minimere AA-oksidasjon ble følgende tiltak iverksatt. Først av alt ble prøver lyofilisert som et startmateriale for begge protokollene for å sikre nøyaktig kvantifisering av vitamin C-innhold og for enkelt å manipulere prøver. Dette alternativet ble foretrukket fremfor finsliping, ofte funnet i helelitteraturen 19,da støvet tiner veldig raskt slik at vannet blir tilgjengelig igjen. Under ekstraksjonsprosedyren ble et høyere volum av en surere oppløsning (8% eddiksyre og 1% MPA) brukt som ekstraher i den optimaliserte protokollen (Supplerende fil 2), som også fungerte som stabilisator ved å forhindre AA-nedbrytning. Denne løsningen inneholdt også EDTA som et chelating-middel for å øke stabiliseringen16, i motsetning til ekstraheringsmiddelet i den ikke-optimaliserte protokollen (Supplerende fil 2). Videre testet vi om ekstraksjonsprosedyren kunne forbedres ved hjelp av to påfølgende ekstraksjoner med 2,5 ml ekstraherende i stedet for en enkelt med 5 ml og under en N2-atmosfære i stedet for de vanlige atmosfæriske forholdene. De beste resultatene ble nådd ved hjelp av bare en ekstraksjon under en uendret atmosfære, noe som forenklet protokollen ved å gjøre unødvendige ekstra trinn (data vises ikke). Andre mindre endringer ble også innført i protokollen for å forbedre utvinningen (det vil si sonikering), få et klarere ekstrakt (finere filtrering) og redusere protokollvarigheten (Supplerende fil 2). Når det gjelder kromatografiske forhold, ble valideringen av metoden utført som rapportertfør 18, noe som garanterer gode analytiske parametere (tabell 3). Dessuten, bruk av ultrapure vann med maursyre (pH 2.0) og metanol (98:2 v:v) med en 0,3 ml min-1 flyt, i stedet for monopotassium fosfat 30 mM (pH 3,0) ved 1 ml min-1 som mobilfase (Tilleggsfil 2), resulterte i en forbedret metode. Den viktigste utviklingen var sannsynligvis å bruke et UPLC-system i stedet for et HPLC, som tillot oss større kontroll over påvirkende forhold (som temperaturen) og resulterte i løste AA-topper uten forstyrrelser av ukjente forbindelser, på kortere tid og forbruker mindre volum av ekstrakt (Supplerende fil 2).
Likevel er det to hovedbegrensninger av denne metoden. Den første er at DHAA ikke kan måles direkte ved hjelp av en UV-detektor på grunn av sin lave absorptivitet i UV-spekteret. Det er viktig å kvantifisere DHAA-innholdet fordi det presenterer visse biologiske aktiviteter og er lett konvertible til AA i menneskekroppen5. For det er det nødvendig med en ekstra reaksjon for å redusere DHAA til AA, sammen med en annen kromatografisk kjøring for å måle TAA og deretter bestemme DHAA indirekte ved å trekke AA-innhold fra TAA (figur 3). I denne forstand har reduksjonstrinnet blitt optimalisert ved hjelp av en høyere konsentrasjon av reduksjonsmiddelet (DTT), øke reaksjonstiden fra 5 til 30 min, og stoppe reaksjonen med svovelsyre (Supplerende fil 2). Den lave stabiliteten til AA utgjør den andre begrensningen av metoden. Etter hvert som AA begynner å degradere 4 timer etter ekstraksjon (Tilleggsfil 1), er det nødvendig å kvantifisere den i dette tidsintervallet. Så, antall prøver å trekke ut er betinget av kromatografisk prosedyre. Det er derfor vi foreslår å fryse dem på dette trinnet i denne protokollen, men i så fall kan ikke alle av dem plasseres i UPLC autosampler som skal måles automatisk. Heldigvis, redusert RT for AA tillot oss å få 3 min kromatogrammer, mye kortere enn 7 min kromatatogrammer oppnådd ved hjelp av HPLC (Supplerende Fil 2). Derfor kan vitamin C-innhold bestemmes i et høyt antall prøver i et 4-roms vindu.
Figur 3: Arbeidsflyt for kvantifisering av vitamin C i salat og noen ville slektninger.
Skjematisk diagram av den optimaliserte protokollen som viser to grener for fastsettelse av bare AA eller AA + DHAA (TAA). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Som vitamin C er et viktig næringsstoff for mennesker, og på grunn av sine viktige helsemessige fordeler har det blitt gjenstand for mange studier. Derfor har det blitt kvantifisert i et stort utvalg av avlinger, inkludert salat, en av de mest konsumerte grønnsakene over hele verden. Enkle klassiske metoder har gradvis blitt erstattet av flytende kromatografi teknikker fordi de er mer spesifikke ognøyaktige 10. Men på grunn av behovet for en ekstra reaksjon for å kvantifisere både, AA og DHAA via HPLC, i noen studier på salat, er det bare AA14 eller bare TAA11 (uten å kvantifisere AA før reduksjonen av DHAA til AA) blitt målt. Videre har bare noen få forfattere kvantifisert AA og DHAA, til tross for bidrag fra begge molekylene til vitamin C antioksidantaktivitet2. Likevel har UPLC-teknikken blitt viktigere i nyere tid på grunn av sin høyere ytelse ved måling av vitamin C i flere avlinger16. Sammenligning av resultatene oppnådd i denne studien med de to metodene, UPLC og HPLC, har disse fordelene blitt bekreftet: veldefinerte AA-topper takket være en høyere følsomhet, og på svært korte tider er oppnådd, noe som også innebærer færre ressurser som forbrukes. Til tross for UPLC effektivitet, bare Chen et al.20 har brukt denne teknikken for å måle vitamin C-innholdet i salat, noe som fortsatt førte til en undervurdering som bare AA-formen ble kvantifisert.
Oppsummert representerer dette arbeidet det første vellykkede forsøket på å bestemme det totale vitamin C-innholdet, ikke bare i forskjellige salatvarianter, men også i noen av deres ville slektninger. Vitamin C-kvantifisering er også viktig for å velge salater med høyere antioksidantaktivitet i avlsprogrammer. I denne forstand utvider det økte totale vitamin C-innholdet i salat ville slektninger her og det økte AA-innholdet rapportert itidligere studier 14, samt andreantioksidantforbindelser 21, de egnede kandidatene for å forbedre næringsverdien av salater.
Til slutt, selv med noen begrensninger som ligger i vitamin C natur, som sin gradvise nedbrytning få timer etter å ha blitt ekstrahert eller behovet for en reduksjon reaksjon på grunn av lav DHAA UV-absorptivity, det tilbyr en mindre arbeids-intens og en mindre tidkrevende metode for å måle vitamin C innhold. I tillegg er det også veldig robust og viser høy følsomhet og kraft til oppløsning. Videre er det lett overførbart ikke bare til andre plantematerialer med små eller ingen endringer, men også til bearbeidede produkter som leverer diettinntaket av vitamin C til mennesker, noe som gir opphav til et bredt spekter av fremtidige applikasjoner i det fremvoksende testfeltet for pålitelig matkvalitet.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi anerkjenner takknemlig Vegetable Germplasm Bank of Zaragoza (BGHZ-CITA, Spania) og Centre for Genetic Resources (CNG, Wageningen, Nederland) for å levere frøene som trengs for dette arbeidet. Vi takker J. A. Aranjuelo, A. Castellanos og "laboratorio de valoración nutritiva" fra CITA for teknisk støtte og D. L. Goodchild for å gjennomgå det engelske språket. Dette arbeidet ble finansiert av prosjektene RTA2017-00093-00-00 fra National Institute for Agricultural and Food Research and Technology (INIA) og LMP164_18 fra regjeringen i Aragón; og av det operative programmet FEDER Aragón 2014-2020 og Det europeiske sosiale fondet fra Den europeiske union [Grupos Consolidados A12-17R: "Grupo de investigación en fruticultura: caracterización, adaptación y mejora genéica" og A14-17R: "Sistemas agroganaderos alimentarios sostenibles" (SAGAS)]. I.M.L. ble støttet av en predoktorkontrakt for opplæring av leger fra det spanske vitenskaps-, innovasjons- og universiteterdepartementet (MCIU) og det spanske statlige forskningsbyrået (AEI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) ≥98% (Ellman′s reagent) | Roche | 10197777001 | |
| 10 mm Φ stainless steel ball | Euro Aznar Supplies S.L. | 20112100 | |
| 15 mL polypropylene tube for centrifuge | Deltalab | 429946 | |
| 2 mL HPLC amber vial | Agilent | 5190-9063 | |
| 2 mL syringe with needle | Deltalab | JS2 | |
| 20 mL polypropylene tubes | Deltalab | 202840 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIS) ≥99.9% (titration) | Roche | 10708976001 | |
| 50 mL polypropylene tube | Deltalab | 429951 | |
| Acetic acid (CH3COOH) ≥99% purity glacial, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Acetonitrile, HPLC super gradient grade (99.9+% CH3CN-0.2 µm filtrated) | Chem-lab | CL00.0189 | |
| Acquity UPLC HSS T3 column (150 mm x 2.1 mm x 1.8 µm) | Waters | 186003540 | |
| Beaker 1 L, 200 mL | Deltalab | 191725, 191722 | |
| Dipotassium phosphate (KH2PO4) | Panreac | 766384 | Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2) |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium salt (EDTA x 2H2O) 99-101% assay, ACS reagent | Panreac | 131669 | |
| Fisherbrand Analog MultiTube Vortexer | Thermo Fisher Scientific | 15549004 | |
| Formic acid 98-100% for HPLC LiChropur | Supelco | 5438040100 | |
| Freeze dryer VirTis genesis 25EL | VirTis | na | |
| Heidolph Multi Reax mixer | Heidolph | na | |
| Heidolph Reax top mixer | Heidolph | na | |
| Hewlett Packard HPLC 1050 equipped with an eλ Detector | Hewlett Packard | na | Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2) |
| Hydrochloric acid (HCl) 37% purity, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 320331 | |
| L-Ascorbic acid ≥99%, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 255564 | |
| Meta-phosphoric acid (MPA) ACS reagent, chips, 33.5-36.5% | Sigma-Aldrich | 239275 | |
| Methanol ≥99.9% (HPLC supergradient grade) | ChemLab | CL00.0189.2500 | |
| Micropipettes 10-1000 μL | Socorex | na | |
| Nucleosil 120 C18 Tracer column (250 mm x 4 mm x 5 µm) | Merck (Sigma-Aldrich) | 54919 | Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2) |
| PTFE-silicone cap with preaperture | Agilent | 5190-9067 | |
| Refrigerated centrifuge Gyrozen 1248R | Gyrozen | na | |
| Regenerated cellulose filters 0.22 µm (13 mm) | Agilent | 1015190-5108 | |
| Regenerated cellulose filters 0.45-µm (13 mm) | Labbox | SFCA-145-100 | Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2) |
| Spectrophotometer Heλios β | Thermo Scientific Corporation | na | |
| Sulfuric acid (H2SO4) 95.0-98.0% purity, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Ultrapure water | WasserLab | na | |
| Ultrasons H-D | Selecta | na | |
| Volumetric flasks 1 L, 100 mL | DeltaLab | 191489, 191486 | |
| Waters Acquity UPLC H-Class equipped with a PDA eλ Detector | Waters | na |
References
- FAOSTAT. Statistics of the Food and Agriculture Organization of the United Nations. FAOSTAT. , Available from: http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC (2018).
- Llorach, R., Martínez-Sánchez, A., Tomás-Barberán, F. A., Gil, M. I., Ferreres, F. Characterisation of polyphenols and antioxidant properties of five lettuce varieties and escarole. Food Chemistry. 108 (3), 1028-1038 (2008).
- Carr, A. C., Frei, B. Toward a new recommended dietary allowance for vitamin C based on antioxidant and health effects in humans. American Journal of Clinical Nutrition. 69 (6), 1086-1107 (1999).
- Carr, A. C., Vissers, M. C. M. Synthetic or food-derived vitamin C-Are they equally bioavailable. Nutrients. 5 (11), 4284-4304 (2013).
- Lee, S. K., Kader, A. A. Preharvest and postharvest factors influencing vitamin C content of horticultural crops. Postharvest Biology and Technology. 20 (3), 207-220 (2000).
- Shekhovtsova, T. N., Muginova, S. V., Luchinina, J. A., Galimova, A. Z. Enzymatic methods in food analysis: determination of ascorbic acid. Analytica Chimica Acta. 573-574, 125-132 (2006).
- Zhan, L., et al. Light exposure during storage preserving soluble sugar and L-ascorbic acid content of minimally processed romaine lettuce (Lactuca sativa L.var. longifolia). Food Chemistry. 136 (1), 273-278 (2013).
- Malejane, D. N., Tinyani, P., Soundy, P., Sultanbawa, Y., Sivakumar, D. Deficit irrigation improves phenolic content and antioxidant activity in leafy lettuce varieties. Food Science and Nutrition. 6 (2), 334-341 (2017).
- Tarrago-Trani, M. T., Phillips, K. M., Cotty, M. Matrix-specific method validation for quantitative analysis of vitamin C in diverse foods. Journal of Food Composition and Analysis. 26 (1-2), 12-25 (2012).
- Klimczak, I., Gliszczyńska-Świgło, A. Comparison of UPLC and HPLC methods for determination of vitamin C. Food Chemistry. 175, 100-105 (2015).
- Złotek, U., Świeca, M., Jakubczyk, A. Effect of abiotic elicitation on main health-promoting compounds, antioxidant activity and commercial quality of butter lettuce (Lactuca sativa L.). Food Chemistry. 148, 253-260 (2014).
- Koh, E., Charoenprasert, S., Mitchell, A. E. Effect of organic and conventional cropping systems on ascorbic acid, vitamin C, flavonoids, nitrate, and oxalate in 27 varieties of spinach (Spinacia oleracea L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (12), 3144-3150 (2012).
- Kałuzewicz, A., et al. The influence of short-term storage on the content of flavonoids and vitamin C in Broccoli. European Journal of Horticultural Science. 77 (3), 137-143 (2012).
- van Treuren, R., van Eekelen, H. D. L. M., Wehrens, R., de Vos, R. C. H. Metabolite variation in the lettuce gene pool: towards healthier crop varieties and food. Metabolomics. 14 (11), 1-14 (2018).
- Swartz, M. E. UPLC: An introduction and review. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 28 (7), 1253-1263 (2005).
- Spínola, V., Mendes, B., Câmara, J. S., Castilho, P. C. An improved and fast UHPLC-PDA methodology for determination of L-ascorbic and dehydroascorbic acids in fruits and vegetables. Evaluation of degradation rate during storage. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (4), 1049-1058 (2012).
- Ball, G. F. M. Water-soluble vitamin assays in human nutrition. , Springer. Boston, MA. (1994).
- Bertolín, J. R., et al. Simultaneous determination of carotenoids, tocopherols, retinol and cholesterol in ovine lyophilised samples of milk, meat, and liver and in unprocessed/raw samples of fat. Food Chemistry. 257, 182-188 (2018).
- Spínola, V., Llorent-Martínez, E. J., Castilho, P. C. Determination of vitamin C in foods: Current state of method validation. Journal of Chromatography A. 1369, 2-17 (2014).
- Chen, Y., et al. radiation is beneficial for yield and quality of indoor cultivated lettuce. Frontiers in Plant Science. 10, 1-10 (2019).
- Damerum, A., et al. Elucidating the genetic basis of antioxidant status in lettuce (Lactuca sativa). Horticulture Research. 2 (15055), 1-13 (2015).
