Summary
我们提出了一种快速可靠的方法来量化维生素C在 Lactuca spp.使用 UPLC-UV，有可能转移到其他植物。关键步骤是样品制备和维生素C提取在稳定条件下，减少脱氢抗坏血酸抗坏血酸和优化色谱过程。
Abstract
维生素，特别是维生素C，是水果和蔬菜中的重要微量营养素。维生素C也是其抗氧化能力的主要贡献者。莱图斯是全世界消费者中最受欢迎的蔬菜之一。准确测量生菜和其他相关物种中的维生素C含量的准确方案至关重要。我们在此描述一种使用超高性能液相色谱-紫外线（UPLC-UV）技术的方法，其中优化了样品制备、维生素提取和色谱条件。
收集样品，代表整个植物，冷冻在-80°C和冻干，以防止不良氧化，使他们的操作更容易。维生素C的提取是在酸性介质中进行的，这也有助于其稳定性。由于维生素C可以以两种不同的可转换形式存在，即抗坏血酸（AA）和去氢坏血酸（DHAA），因此应测量这两种化合物，以进行精确的定量测量。DHAA 在还原到 AA 后间接量化，因为 AA 在光谱的紫外线范围内比 DHAA 表现出更高的吸收率。从同一提取物中，进行了两次测量，一次在还原反应之前，一次在还原反应之后。在第一种情况下，我们量化了AA含量，在第二种情况下，我们以AA的形式量化了AA和DHAA（TAA：总抗坏血酸）的总和。然后，通过从 TAA 中减去第一次测量的 AA 间接获得 DHAA 数量。它们由 UPLC-UV 确定，使用商业 AA 标准构建校准曲线并优化色谱过程，从而获得在短时间内完全解决的 AA 峰值。该协议可以很容易地推断到任何其他植物材料，略有变化或无变化。其准确性揭示了统计学上显著的差异，否则不被忽略。手稿中更深入地讨论了其他优势和局限性。
Introduction
栽培的生菜（Lactuca sativa L.）是全世界生产和消费最多的叶类蔬菜之一，2018年总产量约为2730万吨。消费者认为莱图斯是健康的。营养特性主要归因于作物中抗氧化化合物的来源，如维生素C等，如多酚和维生素E2。维生素C是人类不同于许多其他脊椎动物的基本微量营养素，因为我们无法产生它，因为基因编码中存在突变，在生物合成途径3的最后一步酶。它是正常细胞代谢所必需的，在免疫反应中也起着重要作用，这主要是因为它的抗氧化活性3，4。
维生素总C由抗坏血酸（AA）和去氢坏血酸（DHAA）组成。AA是维生素中生物活性最大的形式，但DHAA（其氧化产物）也显示出生物活性，在人体中很容易转化为AA。因此，量化这两种形式对于确定任何园艺作物（包括生菜）的总维生素C含量非常重要。
基于不同分析技术的各种方法被用来测量蔬菜中的维生素C，如酶、分光光度测量和滴定方法6、7、8。虽然这些方法很简单，但它们在化学上不是AA9特有的。因此，色谱方法是首选，特别是高性能液相色谱-紫外（HPLC-UV）技术，因为它们的精度更高10。HPLC-UV已被用来确定维生素C在多种作物，如花椰菜，菠菜和生菜11，12，13。然而，由于DHAA在光谱的紫外线范围内吸收率低，AA和DHAA的同步定量是复杂的。或者，DHAA 可以通过使用还原剂间接确定，该还原剂将 DHAA 转换为 AAA，测量总抗坏血酸 （TAA），然后计算 TAA 和 AA 之间的差值。由于减少反应的必要性，在一些研究中，只有AA被量化为14，这实际上可能代表对维生素C活性的低估。即使使用液相色谱技术（超高性能液相色谱 ）的最后进展，也需要额外的还原反应来间接确定 DHAA。与 HPLC 相比，UPLC 的优势也受益于此步骤：更高的效率和分辨率、更高的灵敏度、更短的时间分析以及更低的溶剂消耗15。因此，UPLC-UV技术已被用于量化不同作物的维生素C16。
此外，AA是一种非常脆弱的分子;因此，重要的是要制定一个协议，防止其退化期间生菜储存和维生素C分析9。在这方面，以下协议通过 UPLC-UV 快速改进了生菜中维生素 C 含量的定量，以及有效的提取程序。不仅精英品种已被列入本研究，而且传统的陆地动物和一些野生亲属，因为他们潜在的兴趣作物育种，特别是在提高生菜的营养价值。
Protocol
1. 植物材料制备
- 每个植物在 50 mL 聚丙烯管中至少采样两片叶子、一个外侧（较旧）和一个内部（较年轻）的叶子，以便更准确地表示整个植物。每个样品至少收集三个生物复制。
- 立即使用液氮冷冻，并将其储存在-80°C，直到使用。确保液氮不会进入管中;否则，由于蒸发过程中气体膨胀，它们在去除时可能会爆炸。
注意：由于使用液氮的潜在危险，需要手套和面罩。 - 从管中取出管盖，放在冻干机（材料表）冷冻干燥器的托盘上，编程如下：-25 °C，72小时，-10°C，10小时，0°C，10小时，20°C，至少4小时。在冷冻干燥过程中，分别保持 -80.2 °C 和 112 mTor 的冷凝器温度和真空常数。
- 当材料完全干燥（根据植物和压实到管中的程度，在4至7天之间），分别储存在4°C、-20°C或-80°C，分别进行短期（数周至数周）、中（月）或长（年）储存。建议将含有硅胶珠的袋子加入含样品管中。
- 将冻干样品放入 20 mL 聚丙烯管中，并放入直径为 10 mm 的不锈钢球中，并使用获得细尘所需的强度和时间用多管涡流器研磨。
注：在整个过程中，保护样品免受直接光线照射。
2. 试剂和溶液制备
- 准备溶剂萃取溶液：8%醋酸（v/v）、1%MPA（元磷酸）（w/v）、1 mM EDTA（乙酰胺四乙酸）。
- 计算处理整个样品所需的溶剂总量，同时考虑每个样品中将添加 5 mL。要准备溶液的 1 L，请加入一个烧瓶：30 克 MPA、0.372 g EDTA 脱水、80 mL 醋酸和 500 mL 超纯水（相应缩放体积和数量）。用塑料薄膜密封烧瓶口。
- 在磁力搅拌器的帮助下溶解后，使用体积烧瓶精确测量 1 L，加入必要的超纯水。
- 准备还原反应缓冲液（0.5M Tris（2-氨基-2-（羟基甲酰）-1，3-丙烷二醇）pH 9.0）和还原溶液（40 mM DTT（1，4-二磷酸酯），含0.5 M三叶酸pH 9.0）。
- 计算处理整个样品集所需的还原溶液的总量，同时考虑每个样本将添加 200 μL。要准备 100 mL 的缓冲液，请加入烧杯：6.055 g Tris 和 90 mL 的超纯水（相应缩放体积和数量）。用塑料薄膜密封烧杯口。
- 在磁力搅拌器的帮助下溶解后，通过添加 2 M HCl 将溶液调整为 pH 9.0，并使用体积烧瓶精确测量 100 mL，加入必要的超纯水。
- 要准备 100 mL 的还原溶液，请加入烧杯：0.629 g DTT（纯度：98%）和 90 mL 的缓冲液 （0.5 M Tris pH 9.0） 之前准备的 （2.2.1 到 2.2.2）。相应地缩放数量和数量。用塑料薄膜密封烧杯口。
- 一旦在磁力搅拌器的帮助下溶解，使用体积烧瓶精确测量 100 mL，添加必要的缓冲液 0.5 M Tris pH 9.0。
注：还原解决方案非常不稳定。因此，强烈建议使用新制作的解决方案。
- 硫酸 （0.4 M H2SO4）
- 计算处理整组样品所需的 0.4 M 硫酸总量，同时考虑每个样品将添加 200 μL。要准备100 mL的溶液，加入一个烧杯：80 mL的超纯水，然后2.22 mL的H2SO4（纯度：96%，密度：1.84 g mL-1 。使用体积烧瓶精确测量 100 mL，加入必要的超纯水。
注意：硫酸具有很强腐蚀性，因此必须使用防护设备和发动机罩进行处理。此外，酸应添加到超纯水中，而不是水添加到酸，以减少烟雾，避免事故。
- 计算处理整组样品所需的 0.4 M 硫酸总量，同时考虑每个样品将添加 200 μL。要准备100 mL的溶液，加入一个烧杯：80 mL的超纯水，然后2.22 mL的H2SO4（纯度：96%，密度：1.84 g mL-1 。使用体积烧瓶精确测量 100 mL，加入必要的超纯水。
- 盐酸（2 M HCl）。
- 要准备 100 mL 的 2 M 盐酸，加入烧杯：80 mL 的超纯水，然后 6.13 mL 的 HCl（纯度：37%，密度：1.19 gmL-1）。用塑料薄膜密封烧杯口。使用体积烧瓶精确测量 100 mL，加入必要的超纯水。相应地缩放卷。
注意：盐酸具有很强的腐蚀性，因此必须使用防护设备和引擎盖下进行处理。此外，酸应添加到超纯水中，而不是水添加到酸，以减少烟雾，避免事故。
- 要准备 100 mL 的 2 M 盐酸，加入烧杯：80 mL 的超纯水，然后 6.13 mL 的 HCl（纯度：37%，密度：1.19 gmL-1）。用塑料薄膜密封烧杯口。使用体积烧瓶精确测量 100 mL，加入必要的超纯水。相应地缩放卷。
- AA 标准（库存和稀释）
- 重量正好为 10 毫克 AA 标准（纯度：99%）使用精密平衡，并添加 90 mL 的移动相（超纯水 pH 2.0 与甲酸）。
- 在磁力搅拌器的帮助下溶解后，使用体积烧瓶精确测量 100 mL，加入所需的超纯水 pH 2.0 与甲酸。
注：保护此库存溶液免受光线照射。 - 准备从 AA 标准库存中稀释五个，以便按照表 1 中的说明 获得校准曲线 ，然后继续执行步骤 5.2。
| 标准 | [Aa]（μg mL-1） | AA （100 μg mL-1） 溶液 （μL） | 移动相位 （+L）a |
| 1 | 0.5 | 5 | 995 |
| 2 | 2.5 | 25 | 975 |
| 3 | 5 | 50 | 950 |
| 4 | 10 | 100 | 900 |
| 5 | 25 | 250 | 750 |
| a超纯水pH2.0由甲酸酸化。 | |||
表1：制定五项AA标准（抗坏血酸）的协议。 指示用于准备每个不同浓度标准的溶质和溶剂的体积。
3. 提取AA和DHAA
注：建议在提取步骤中低光照强度条件下工作。
- 在 15 mL 聚丙烯离心管中，加入 50 毫克冻干接地样品和 5 mL 萃取溶剂（步骤 2.1）。
- 使用涡流摇动混合物 5 秒，然后在转速为 2000 rpm 时摇动轨道摇床 10 分钟。
- 在室温下用超声波激活，将管子引入超声波浴中10分钟。
- 在 4，000 x g 下离心 10 分钟，在 4 °C 下。
- 以上清液，通过0.22μm再生纤维素过滤器，并将其存储在5 mL琥珀小瓶中。这是包含 AA 和 DHAA 的提取 1。
注：通过将提取物冻结在-80°C并保护它们免受光线照射，可以在这里暂停协议，因为AA和DHAA非常不稳定，在光的存在下，在高温或氧化气氛下很容易降解（补充文件1）。
4. DHAA 减少至AA提取AA
- 将 200 μL 的提取物 1 转移到 2 mL 琥珀小瓶，用于液相色谱，并加入 200 μL 的还原溶液（步骤 2.2）。用预开的PTFE-SILICONE插头关闭小瓶，用涡流摇动5 s。
- 让溶液在室温下站立 30 分钟，防止光线。
- 加入 200 μL 的 0.4 M H2SO4 以停止反应，稳定酸性 pH 中的 AA。生成的解决方案是提取 2，它仅包含 AA，实际上是 TAA。
5. 确定
- UPLC-UV 制备
- 准备表 2 中描述的工作解决方案，通过 0.22 μm 过滤器进行适当过滤，经过至少 10 分钟的声波处理，并将它们放在 UPLC 系统中。
- 打开三个 UPLC 模块，等待内部校准过程完成。
- 打开软件（例如，授权 3），并加载表 2中描述的工具程序： 授权 3 |运行示例 |维生素C方法 |UPLC_PDA |使用快速入门。
- 软件加载正确的程序后，访问 UPLC 管理控制台： 第四纪溶剂管理器 |单击鼠标右键 |启动控制台。
- 继续准备和稳定 UPLC 仪器： 系统 |控制 |启动。
- 清除所有 UPLC 管路至少 5 分钟 ：主要溶剂 |QSM |检查 A、B、C、D 和密封件清洗 |黄金期限 > 5 分钟.
- 净化和清洁喷油器 ：主要溶剂 |Sm |检查洗涤溶剂 （> 45 s） 和检查净化溶剂 （> 35 周期）。
- 将 UPLC 与方法条件进行均衡：与方法均衡 |QSM |流量 （0.3 mL 最小-1） |溶剂 A （2%） |溶剂 B （0%） |溶剂 C （98%） |溶剂 D （0%）;与方法平衡 |Sm |样品 （5 °C） |列 （30 °C） 和平衡到方法 |其他 |检查灯打开 |按"开始"。
- 等待至少 1 小时（建议使用更多时间），使设备稳定下来。可以验证稳定性，检查启动控制台中的列中的压力：系统 |第四纪溶剂管理器 |QSM 系统压力。确保压力变化（增加或减少）中没有可识别的趋势，并且增量值小于 10 psi。
- 在 "快速 入门"屏幕中，用要分析的标准和样本的名称填充矩阵。
- 标准中的 AA 确定
- 将以前准备的五个 AA 标准（步骤 2.5.3）中的 1 mL 转移到 2 mL 琥珀小瓶，用于液相色谱。用预开的 PTFE-硅插头关闭小瓶，并在 UPLC 仪器中注入 5 μL。
- 按照表 2 中描述的过程执行色 谱，从 最稀释到最浓缩开始。
- 样本中的 AA 测定
- 在2 mL琥珀小瓶中移液器 200 μL 提取物 1，用于液相色谱，并加入 800 μL 的超纯水。用预开的 PTFE-硅插头关闭小瓶，并在 UPLC 仪器中注入 5 μL。
- 按照表 2 中描述的过程执行 色谱。
- 样品中的 TAA 测定
- 加入400μL的超纯水到提取物2。用预开的 PTFE-硅插头关闭小瓶，并在 UPLC 仪器中注入 5 μL。
- 按照表 2 中描述的过程执行 色谱。
| 组件和参数 | 描述 |
| 仪器 | Acquity UPLC H 级 |
| 探测器 | PDA e= 探测器 μabs 用于 AA=245 nm |
| 软件 | 授权 3 |
| 列 | 交流 UPLC HSS T3 （150 毫米 x 2.1 毫米 x 1.8 μm） |
| 通道 A | Ch3哦 |
| 通道 B/洗涤 | H2O：CH3OH （50：50 v：v） |
| 通道 C | 超纯水 pH 2.0 酸化由甲酸 a |
| 通道 D/密封清洗 | 超纯水：醋酸（90：10 v：v） |
| 移动阶段 | 0.3 mL 最小-1 的 2%A = 98%C（等式模式） |
| 柱温度 | 30 °C |
| 自动采样器温度 | 5 °C |
| 喷射体积 | 5 μL |
| AA 保留时间 | 1.874 分 |
| 运行时间 | 3 分钟 |
| a在 pH 调整之前使用的未确定甲酸体积 | |
表2：色谱过程优化，以确定从生菜和野生亲的提取物中的AA（抗坏血酸）。 说明所用部件、条件和解决方案。
6. AA 和 DHAA 的量化
- 统计分析
- 确定Bertolón等人所述的色谱法的分析参数（表3）。
注：表3中所示 参数 的值需要在特定的实验条件下定义。
- 确定Bertolón等人所述的色谱法的分析参数（表3）。
| 方法的分析参数 | 值 |
| 线性范围 （μg mL-1） | 0.5-25 |
| 线性方程 | y=53，143.03x |
| R2 | 0.99998 |
| 检测限值（毫克 AA g-1 干物质） | 0.013 |
| 定量极限（毫克 AA g-1 干物质） | 0.045 |
| 可重复性 （CV，%） | 1.75 |
| 中间精度 （CV， %a | 4.22 |
| 恢复（Rec， %）b | 95.6±2.4 |
| aCV：变异系数 | |
| b恢复测定用含有50毫克相同样品的10个等分，5个用2毫克的AAg-1 的干物质进行，5个非尖峰。%Rec=（[AA]峰值样本-[AA]样本）/（[AA]峰值）x100。 | |
表3：AA（抗坏血酸）和TAA（总抗坏血酸）检测和定量的优化分析参数。 在样品注入量为5μL时，获得了校准（R2）曲线的线性范围、方程和确定系数，以及AA的检测和定量极限（TAA相同），以及可重复性、中间精度和恢复性。
- 计算AA和AA浓度。
- 打开标准和样品色谱图： 快速入门 |浏览项目 |频道 |"标准或样品名称" |PDA Ch1 245 nm@1.2 nm.
- 通过单击其起点（约 1.790 分钟）并将峰值拖动到其终点（约 1.910 分钟），将相应的峰值（AA 或 TAA）集成到标准和样本中。
- 根据上面准备的五个 AA 标准的浓度（表 1 ）构建一个校准曲线，表示色谱上确定的吸收度值（步骤5.2.）。
- 使用以下公式分别对步骤 5.3 和 5.4 中确定的样品的吸光值进行插值，并获取 AA 和 TAA 浓度：
其中 y 是集成峰值区域 ，x 是 ppm 中的 AA 或 TAA 浓度 ，m 和 n 分别是获得回归线的斜率和 y-intercept。 - 要计算 DHAA 的浓度，请应用以下公式：
注：要获得干重的mgg-1 中DHAA、AA和TAA的总浓度，在校准曲线中直接插值的值必须乘以总萃取量和应用的稀释因子，然后除以用于进行萃取的样品的重量。
Representative Results
Lactuca 基质中的维生素 C 定量需要开发色谱方法，以确保可靠的结果。图1A显示了由非优化协议（补充文件2）产生的色谱图，该方案与一个身份不明的次要"肩部"一起呈现AA峰值。然而，在改善了萃取和色谱条件后，实现了无未知化合物干扰的 AA 峰值（图1B）。此外，使用 UPLC-UV 设备代替 HPLC-UV，我们减少了 AA 的保留时间 （RT）：优化的色谱图为 1.874分钟，而在非优化的色谱中为 2.980 分钟（图 1），以及优化和非优化协议的运行时间（3 分钟和 7 分钟）。
图1：同一生菜样品中AA的色谱图（商业品种"Begoía"）。（A） 由非优化协议（补充文件 2 中所述的条件）产生的 HPLC-UV 色谱图。（B） 使用优化协议获得的 UPLC-UV 色谱图（表 2 中所述的条件）。 请单击此处查看此图的较大版本。
AA 峰值的干扰（如图1A 中观察到的干扰）一致导致维生素 C（AA、DHAA 和 TAA）含量低估（图 2），因为色谱过程中分离不足，因为重叠峰区在它们之间的最深处通过垂直下降进行整合。这种偏见在作物野生亲亲中尤为明显，特别是在DHAA和TAA含量（图2）。
图2：维生素C含量的分布。在商业和传统生菜品种中，以及使用非优化和优化协议，分离DHAA、AAA和TAA含量（mgg-1干重）的小提琴图。黑线显示平均值。 请单击此处查看此图的较大版本。
此外，使用非优化协议使我们无法从结果中提取任何有用的结论，因为它们显示了所有样本，包括生菜和野生亲亲，具有类似的维生素C含量。相比之下，优化的协议使我们能够检测它们之间的DHAA和TAA含量的统计显著差异（表4），其中最丰富的是野生物种（图2）。
| 未优化 | 优化 | |||
| F 比 | p- 值 | F 比 | p- 值 | |
| 达阿 | 0.460 | 0.637ns | 5.613 | 0.009** |
| 机 管 局 | 0.070 | 0.932ns | 1.020 | 0.374ns |
| Taa | 0.015 | 0.985ns | 4.438 | 0.022* |
| ns、* 和 ** 分别表示 p<0.05 和 0.01 中无显著和显著。 | ||||
表4：维生素C含量的变化。 考虑到非优化和优化协议的 DHAA、AAA 和 TAA 含量的 Lactuca（ 商业生菜品种、传统生菜品种和作物野生亲），来自 ANOVA 的 F 比率（两个方差、组间方差和组内方差）和显著值。
补充文件1：AA和AA稳定性在5°C超过24小时。 （A） AA 和 TAA 峰值区域，整个 24 小时 （B） AAA 和 TAA 含量 （mg g-1 干重） 在整个 24 小时。条形表示在 5 °C 自动采样器中保存并避免暴露在光线下两个技术复制器 （n=2） 的标准偏差。 请点击这里下载此文件。
补充文件2：TAA、AA 和 DHAA 提取和定量的优化协议和非优化协议之间的主要区别。 在这两种情况下使用的样本是相同的。 请点击这里下载此文件。
Discussion
维生素C是一种非常重要的营养物质，但它也是一种非常脆弱的化合物，因此其 UPLC-UV 定量取决于多种因素，如样品储存和制备、提取方法和色谱条件。因此，需要一个快速和简单的程序，以防止AA（具有抗氧化能力）氧化到DHAA（没有抗氧化性能）。在样品处理过程中，避免高pH值和温度条件，以及强烈的光线和氧化气氛，以促进化合物的稳定性也至关重要。
为了尽量减少 AA 氧化，采取了以下措施。首先，样品作为两种协议的起始材料进行冻干，以确保准确定量维生素C含量，并轻松操作样品。此选项比精细研磨更可取，通常存在于文献 19中，因为灰尘解冻非常快，因此水再次可用。在萃取过程中，在优化的协议（补充文件2）中，使用更高体积的酸性溶液（8%醋酸和1%MPA）作为萃取剂，通过防止AA降解，该溶液也作为稳定剂。此解决方案还包含 EDTA 作为溷合剂来增加稳定 16，与非优化协议中的提取剂（补充文件 2） 不同。此外，我们测试了，如果使用两个连续萃取与2.5 mL的萃取剂，而不是一个单一的5 mL和N2 大气下，而不是标准大气条件，提取过程可以增强。在未修改的大气中，仅使用一次提取，从而简化了协议，并采取了不必要的附加步骤（未显示数据）。协议中还引入了其他细微的更改，以增强提取（即声波化）、获得更清晰的提取（更精细的过滤）并缩短协议持续时间（补充文件2）。关于色谱条件，该方法的验证是18号前报告的，保证了良好的分析参数（表3）。此外，使用超纯水与甲酸（pH 2.0）和甲醇（98：2 v：v）与0.3 mLmin-1 流量，而不是单波西磷酸盐30mM（pH 3.0）在1mLmin-1 作为移动相（补充文件2），导致改进的方法。最重要的进步可能是使用 UPLC 系统而不是 HPLC，这使我们能够更好地控制影响条件（如温度），从而在更短的时间内在更短的时间内使用更少的提取量（补充文件2），从而在不受未知化合物干扰的情况下解决 AA 峰值， 消耗更少的提取物量 。
然而，这种方法有两个主要限制。第一个是DHAA不能直接使用UV探测器测量，因为它在光谱的紫外线范围中吸收率低。重要的是要量化DHAA含量，因为它呈现某些生物活性，很容易在人体中转换为AA5。为此，需要额外反应，将DHAA降低为AA，并结合第二次色谱运行，以测量TAA，然后通过从AA中减去AA（图3）中减去AA含量间接确定DHAA（图3）。从这个意义上说，通过使用浓度较高的还原剂（DTT），将反应时间从5分钟增加至30分钟，并停止硫酸反应（补充文件2），对还原步骤进行了优化。AA的低稳定性构成了该方法的第二个限制。由于 AA 在提取后 4 小时开始降解 （补充文件1），因此有必要在此时间间隔内量化它。因此，要提取的样品数量受色谱过程条件的制约。这就是为什么我们建议在该协议的这一步骤中冻结它们，尽管在这种情况下，并非所有它们都可以放在要自动测量的 UPLC 自动采样器中。幸运的是，AA 的 RT 减少，使我们能够获得 3 分钟色谱图，比使用 HPLC （补充文件 2） 获得的 7 分钟色谱短得多。因此，维生素C含量可以在4小时窗口的大量样品中确定。
图3：生菜和一些野生亲亲维生素C定量的工作流程。
优化协议的示意图显示两个分支，用于仅确定 AA 或 AA = DHAA （TAA）。 请单击此处查看此图的较大版本。
由于维生素C是人类必需的营养物质，由于其重要的健康益处，它已成为许多研究的对象。因此，它已被量化在各种各样的作物，包括生菜，全世界消费最多的蔬菜之一。简单的经典方法已逐渐被液相色谱技术所取代，因为它们更具体、更准确。然而，由于需要额外的反应来量化，AA和DHAA通过HPLC，在一些研究中生菜，只有AA 14 或只有AA11（ 没有量化AA之前DHAA减少到AA）已经测量。此外，只有少数作者量化了AA和DHAA，尽管这两种分子对维生素C抗氧化活性2的贡献。然而，UPLC技术在最近一些时期变得越来越重要，因为它在测量几种作物中的维生素C时性能更高。将本研究的结果与 UPLC 和 HPLC 这两种方法进行比较，这些优势得到了证实：由于灵敏度较高，并且在很短的时间内实现了定义良好的 AA 峰值，这也意味着消耗的资源更少。尽管 UPLC 效率高，但只有 Chen 等人应用了这种 技术来测量生菜中的维生素 C 含量，这仍然导致低估，因为只有 AA 形式被量化。
总之，这项工作是第一次成功尝试，以确定总维生素C含量不仅在不同的生菜品种，而且在他们的一些野生亲属。维生素C定量对于在育种计划中选择具有较高抗氧化活性的生菜也是必不可少的。从这个意义上说，这里发现的生菜野生亲的维生素C总含量增加，以及先前研究14年报告的AA含量增加，以及其他抗氧化化合物21，拓宽了合适的候选物，以提高生菜的营养价值。
总之，即使维生素C的性质固有的一些限制，如在提取后几个小时逐渐退化，或由于DHAA紫外线吸收率低而需要减少反应，它提供了一种较少的劳动强度和不太耗时的方法来测量维生素C含量。此外，它也是非常强大的，并表现出高灵敏度和分辨率。此外，它不仅容易转移到其他植物材料，且变化轻微或无变化，而且可转移到向人类提供维生素C膳食摄入量的加工产品，从而在新兴可靠的食品质量测试领域产生广泛的未来应用。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢萨拉戈萨蔬菜种质银行（BGHZ-CITA，西班牙）和遗传资源中心（CNG，荷兰瓦格宁根）提供这项工作所需的种子。我们感谢CITA的J.A.Aranjuelo、A.Castellanos和"营养学劳动者"的技术支持和D.L.Goodchild对英语的复习。这项工作由国家农业和食品研究与技术研究所（INIA）和阿拉贡政府LMP164_18项目RTÉ2017-00093-00-00-00资助;由2014-2020年联邦投资局和欧洲社会基金（Grupos Consolidados A12-17R）的《FER Aragón》行动方案："Fruticultura投资集团：编者用商， 改编和梅约拉基因"和A14-17R："西斯特玛斯农业加纳德罗斯食品补充可教"（SAGAS）]。I.M.L. 得到了西班牙科学、创新和大学部（MCIU）和西班牙国家研究机构（AEI）的一份博士培训前科合同的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) ≥98% (Ellman′s reagent) | Roche | 10197777001 | |
| 10 mm Φ stainless steel ball | Euro Aznar Supplies S.L. | 20112100 | |
| 15 mL polypropylene tube for centrifuge | Deltalab | 429946 | |
| 2 mL HPLC amber vial | Agilent | 5190-9063 | |
| 2 mL syringe with needle | Deltalab | JS2 | |
| 20 mL polypropylene tubes | Deltalab | 202840 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIS) ≥99.9% (titration) | Roche | 10708976001 | |
| 50 mL polypropylene tube | Deltalab | 429951 | |
| Acetic acid (CH3COOH) ≥99% purity glacial, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Acetonitrile, HPLC super gradient grade (99.9+% CH3CN-0.2 µm filtrated) | Chem-lab | CL00.0189 | |
| Acquity UPLC HSS T3 column (150 mm x 2.1 mm x 1.8 µm) | Waters | 186003540 | |
| Beaker 1 L, 200 mL | Deltalab | 191725, 191722 | |
| Dipotassium phosphate (KH2PO4) | Panreac | 766384 | Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2) |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium salt (EDTA x 2H2O) 99-101% assay, ACS reagent | Panreac | 131669 | |
| Fisherbrand Analog MultiTube Vortexer | Thermo Fisher Scientific | 15549004 | |
| Formic acid 98-100% for HPLC LiChropur | Supelco | 5438040100 | |
| Freeze dryer VirTis genesis 25EL | VirTis | na | |
| Heidolph Multi Reax mixer | Heidolph | na | |
| Heidolph Reax top mixer | Heidolph | na | |
| Hewlett Packard HPLC 1050 equipped with an eλ Detector | Hewlett Packard | na | Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2) |
| Hydrochloric acid (HCl) 37% purity, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 320331 | |
| L-Ascorbic acid ≥99%, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 255564 | |
| Meta-phosphoric acid (MPA) ACS reagent, chips, 33.5-36.5% | Sigma-Aldrich | 239275 | |
| Methanol ≥99.9% (HPLC supergradient grade) | ChemLab | CL00.0189.2500 | |
| Micropipettes 10-1000 μL | Socorex | na | |
| Nucleosil 120 C18 Tracer column (250 mm x 4 mm x 5 µm) | Merck (Sigma-Aldrich) | 54919 | Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2) |
| PTFE-silicone cap with preaperture | Agilent | 5190-9067 | |
| Refrigerated centrifuge Gyrozen 1248R | Gyrozen | na | |
| Regenerated cellulose filters 0.22 µm (13 mm) | Agilent | 1015190-5108 | |
| Regenerated cellulose filters 0.45-µm (13 mm) | Labbox | SFCA-145-100 | Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2) |
| Spectrophotometer Heλios β | Thermo Scientific Corporation | na | |
| Sulfuric acid (H2SO4) 95.0-98.0% purity, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Ultrapure water | WasserLab | na | |
| Ultrasons H-D | Selecta | na | |
| Volumetric flasks 1 L, 100 mL | DeltaLab | 191489, 191486 | |
| Waters Acquity UPLC H-Class equipped with a PDA eλ Detector | Waters | na |
References
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