Summary
Vi presenterar en snabb och tillförlitlig metod för att kvantifiera C-vitamin i Lactuca spp. med hjälp av UPLC-UV, potentiellt överförbara till andra växter. Nyckelstegen är provberedningen och C-vitaminutvinningen under stabila förhållanden, reduktionen av dehydroaskorbinsyra till askorbinsyra och optimering av det kromatografiska förfarandet.
Abstract
Vitaminer, särskilt C-vitamin, är viktiga mikronäringsämnen som finns i frukt och grönsaker. C-vitamin är också en stor bidragande orsak till deras antioxidant kapacitet. Sallad är en av de mest populära grönsaker bland konsumenter över hela världen. Ett korrekt protokoll för att mäta C-vitaminhalten i sallat och andra besläktade arter är avgörande. Vi beskriver här en metod med hjälp av ultra-högpresterande flytande kromatografi-ultraviolett (UPLC-UV) teknik, där prov beredning, vitamin extraktion och kromatografi villkor optimerades.
Prover samlades in för att representera hela anläggningen, fryst vid -80 °C och lyophilized att förhindra oönskad oxidation och göra deras manipulation lättare. Utvinningen av C-vitamin utfördes i sura medier, vilket också bidrog till dess stabilitet. Eftersom C-vitamin kan förekomma i två olika interkonvertibla former, askorbinsyra (AA) och dehydroascorbic acid (DHAA), bör båda föreningarna mätas för noggrann kvantifiering. DHAA kvantifierades indirekt efter dess minskning till AA eftersom AA visar en högre absorptivity än DHAA i UV-intervallet av spektrumet. Från samma extrakt utfördes två mätningar, en före och en efter den reduktionsreaktionen. I det första fallet kvantifierade vi AA-halten, och i det andra kvantifierade vi summan av AA och DHAA (TAA: total askorbinsyra) i form av AA. Sedan erhölls DHAA-kvantitet indirekt genom att AA subtraheras från den första mätningen från TAA. De bestämdes av UPLC-UV, med hjälp av en kommersiell AA-standard för att bygga en kalibreringskurva och optimera det kromatografiska förfarandet, för att erhålla AA-toppar som löstes helt på kort tid. Detta protokoll skulle lätt kunna extrapoleras till något annat växtmaterial med små eller inga förändringar. Dess noggrannhet visade statistiskt signifikanta skillnader annars unperceived. Andra styrkor och begränsningar diskuteras mer ingående i manuskriptet.
Introduction
Odlad sallad (Lactuca sativa L.) är en av de mest producerade och konsumerade bladgrönsaker världen över, med en total produktion på cirka 27,3 miljoner ton 20181. Sallad uppfattas som hälsosamt av konsumenterna. De näringsmässiga egenskaper är främst tillskrivas källan till antioxidant föreningar i grödan, såsom C-vitamin, bland andra som polyfenoler och vitamin E2. C-vitamin är en viktig mikronäringsämnen för människor till skillnad från många andra ryggradsdjur, eftersom vi inte kan producera det på grund av mutationer som finns i genen kodning för det sista steget enzym i den biosyntetiska vägen3. Det krävs för en normal cellmetabolism och det spelar också en viktig roll i immunsvar främst på grund av dess antioxidant aktivitet3,4.
Totalt C-vitamin består av askorbinsyra (AA) och dehydroaskorbinsyra (DHAA). AA är den mest biologiskt aktiva formen av vitaminet, men DHAA (dess oxidationsprodukt) visar också biologisk aktivitet och den kan lätt omvandlas till AA imänniskokroppen 5. Därför är kvantifiera båda formerna viktigt att bestämma den totala C-vitaminhalten i någon horticultural gröda, sallad ingår.
En stor variation av tillvägagångssätt baserade på olika analystekniker har använts för att mäta C-vitamin i grönsaker, såsom enzymatisk, spektrofotometriska, och titrimetriskametoder 6,7,8. Även om dessa metoder är enkla, är de inte kemiskt specifika för AA9. Följaktligen är kromatografisk metoder att föredra, särskilt den högpresterande vätskekromatografi-ultraviolett (HPLC-UV) teknik, på grund av deras högre noggrannhet10. HPLC-UV har använts för att bestämma C-vitamin i en stor mångfald av grödor, som broccoli, spenat och sallad11,12,13. Den samtidiga kvantifieringen av AA och DHAA är dock komplicerad på grund av den låga absorptiviteten av DHAA i spektrumets UV-omfång. Alternativt kan DHAA bestämmas indirekt genom att använda ett reduktionsmedel som omvandlar DHAA till AA, mäter total askorbinsyra (TAA), och sedan beräknar skillnaden mellan TAA och AA. På grund av nödvändigheten av en minskning reaktion, i vissa studier, endast AA har kvantifierats14, som faktiskt skulle kunna utgöra en underskattning av C-vitamin aktivitet. Att ytterligare minskning reaktion behövs också för att bestämma DHAA indirekt även när det sista förskottet i vätskekromatografi tekniker, ultra-high performance vätskekromatografi (UPLC), används. Det steget drar också nytta av de fördelar som UPLC uppvisar vid jämförelse med HPLC: högre effektivitet och upplösning, ökad känslighet, kortare tidsanalys och lägre lösningsmedelsförbrukning15. Till följd av detta har UPLC-UV-teknik utnyttjats för att kvantifiera C-vitamin i olika grödor16.
Dessutom är AA en mycket labil molekyl; således är det viktigt att utveckla ett protokoll som förhindrar dess nedbrytning under sallat lagring och C-vitamin analys9. I detta sammanhang erbjuder följande protokoll en snabb och förbättrad kvantifiering av C-vitaminhalten i sallat av UPLC-UV, samt ett effektivt extraktionsförfarande. Inte bara elit sorter har tagits med i den aktuella studien, men också traditionella landraces och några vilda släktingar på grund av deras potentiella intresse för gröda avel, särskilt i förbättring av näringsvärdet av sallad.
Protocol
1. Beredning av växtmaterial
- Prov minst två blad per planta i 50 mL polypropylenrör, en yttre (äldre) och en inre (yngre) en för att mer exakt representera hela anläggningen. Samla in minst tre biologiska replikat för varje prov.
- Frys dem omedelbart med flytande kväve och förvara dem vid -80 °C tills användning. Se till att det flytande kvävet inte kommer in i rören; annars kunde de explodera när de tas bort på grund av gasexpansionen under förångningen.
VAR FÖRSIKTIG: Handskar och en ansiktsskydd krävs på grund av de potentiella faror som är förknippade med användning av flytande kväve. - Ta bort locken från rören och placera dem på brickorna inom frystorkare kammaren av lyofilatören (Tabell över material) programmerad enligt följande: -25 °C för 72 h, -10 °C i 10 h, 0 °C för 10 h, och 20 °C i minst 4 h. Bibehåll kondensortemperaturen och vakuumkonstanten under frystorkningsprocessen vid -80,2 °C respektive 112 mTorr.
- När materialet är helt torrt (mellan 4 och 7 dagar beroende på växt och graden av kompaktering i röret), bevara vid 4 °C, -20 °C eller -80 °C för kort (dagar till veckor), mellan (månader) respektive lång (år) lagring. Att påse med kiselgelpärlor inkluderas i de provhaltiga rören rekommenderas.
- Placera de lyofilaterade proverna i 20 mL polypropylenrör tillsammans med 10 mm diameter rostfria kulor och slipa dem med en flerrörsvirvel med hjälp av intensitet och tid som behövs för att erhålla ett fint damm.
OBS: Under hela processen, skydda proverna mot exponering för direkt ljus.
2. Reagens- och lösningspreparat
- Bered lösningslösningen extraktionslösning: 8% ättiksyra (v/v), 1% MPA (meta-fosforsyra) (w/v), 1 mM EDTA (etylendiaminetetraättiksyra).
- Beräkna den totala volymen lösningsmedel som behövs för att bearbeta hela uppsättningen prover med hänsyn till att 5 mL kommer att läggas till varje. För att förbereda 1 L av lösningen, tillsätt till en kolv: 30 g MPA, 0,372 g EDTA dehydrate, 80 mL ättiksyra och 500 mL ultrarent vatten (skalvolymer och mängder i enlighet med detta). Täta kolvmunnen med plastfilm.
- När löst med hjälp av en magnetisk omrörare, använd en volymetrisk kolv för att noggrant mäta 1 L, tillsätt nödvändigt ultrarent vatten.
- Förbered reduktionsreaktionsbufferten (0,5 M Tris (2-amino-2-(hydroxymetyl)-1,3-propanediol) pH 9,0) och reducerande lösning (40 mM DTT (1,4-Dithiothreitol) med 0,5 M Tris pH 9.0).
- Beräkna den totala volymen för reducerande lösning som behövs för att bearbeta hela uppsättningen prover med hänsyn till att 200 μL kommer att tillsättas i var och en av dem. För att förbereda 100 mL av bufferten, tillsätt i en bägare: 6.055 g Tris och 90 mL ultrarent vatten (skalvolymer och mängder i enlighet med detta). Täta bägare munnen med plastfilm.
- När lösningen har lösts upp med hjälp av en magnetisk omrörare, justera lösningen till pH 9.0 genom att tillsätta 2 M HCl och använd en volymetrisk kolv för att noggrant mäta 100 mL, tillsätta nödvändigt ultrarent vatten.
- För att förbereda 100 mL av den reducerande lösningen, lägg till en bägare: 0,629 g DTT (renhet: 98%) och 90 mL av bufferten (0,5 M Tris pH 9,0) som tidigare förberetts (2,2,1 till 2,2,2). Skala volymer och kvantiteter i enlighet med detta. Täta bägare munnen med plastfilm.
- När du har lösts upp med hjälp av en magnetomrörare, använd en volymetrisk kolv för att noggrant mäta 100 mL, och tillsätt den nödvändiga volymen av buffert 0,5 M Tris pH 9.0.
OBS: Reducerlösningen är mycket instabil. Det är därför en nygjord lösning rekommenderas starkt.
- Svavelsyra (0,4 M H2SO4)
- Beräkna den totala volymen 0,4 M svavelsyra som behövs för att bearbeta hela uppsättningen prover med hänsyn till att 200 μL kommer att tillsättas i varje. För att förbereda 100 mL av lösningen, lägg till en bägare: 80 mL ultrapure vatten och sedan 2,22 mL av H2SO4 (renhet: 96%, densitet: 1,84 g mL-1). Använd en volymetrisk kolv för att noggrant mäta 100 mL, tillsätt nödvändigt ultrarent vatten.
VAR FÖRSIKTIG: Svavelsyra är mycket frätande, så den måste hanteras med hjälp av skyddsutrustning och under huva. Dessutom bör syran läggas till ultrarent vatten, och inte vatten till syra, för att minska ångor och undvika olyckor.
- Beräkna den totala volymen 0,4 M svavelsyra som behövs för att bearbeta hela uppsättningen prover med hänsyn till att 200 μL kommer att tillsättas i varje. För att förbereda 100 mL av lösningen, lägg till en bägare: 80 mL ultrapure vatten och sedan 2,22 mL av H2SO4 (renhet: 96%, densitet: 1,84 g mL-1). Använd en volymetrisk kolv för att noggrant mäta 100 mL, tillsätt nödvändigt ultrarent vatten.
- Saltsyra (2 M HCl).
- För att förbereda 100 mL av 2 M saltsyra, tillsätt i en bägare: 80 mL ultrarent vatten och sedan 6,13 mL HCl (renhet: 37%, densitet: 1,19 g mL-1). Täta bägare munnen med plastfilm. Använd en volymetrisk kolv för att noggrant mäta 100 mL, tillsätt nödvändigt ultrarent vatten. Skala volymer i enlighet med detta.
VAR FÖRSIKTIG: Saltsyra är mycket frätande, så det måste hanteras med hjälp av skyddsutrustning och under huva. Dessutom bör syran läggas till ultrarent vatten, och inte vatten till syra, för att minska ångor och undvika olyckor.
- För att förbereda 100 mL av 2 M saltsyra, tillsätt i en bägare: 80 mL ultrarent vatten och sedan 6,13 mL HCl (renhet: 37%, densitet: 1,19 g mL-1). Täta bägare munnen med plastfilm. Använd en volymetrisk kolv för att noggrant mäta 100 mL, tillsätt nödvändigt ultrarent vatten. Skala volymer i enlighet med detta.
- AA-standard (lager och utspädningar)
- Väg exakt 10 mg AA-standard (renhet: 99%) med hjälp av en precisionsbalans och tillsätt 90 mL mobil fas (ultrarent vatten pH 2.0 med myrsyra).
- När löst med hjälp av en magnetisk omrörare, använd en volymetrisk kolv för att noggrant mäta 100 mL, tillsätt den nödvändiga volymen av ultrarent vatten pH 2.0 med myrsyra.
OBS: Skydda denna stamlösning mot exponeringen för ljus. - Förbered fem spädningar från beståndet av AA-standarden för att erhålla en kalibreringskurva som följer instruktionerna i tabell 1 och fortsätt med steg 5.2.
| Standard | [AA] (μg mL-1) | AA (100 μg mL-1) lösning (μL) | Mobil fas (μL)a |
| 1 | 0.5 | 5 | 995 |
| 2 | 2.5 | 25 | 975 |
| 3 | 5 | 50 | 950 |
| 4 | 10 | 100 | 900 |
| 5 | 25 | 250 | 750 |
| ett Ultrarent vatten pH 2.0 försurat genom myrsyra. | |||
Tabell 1: Protokoll för att förbereda fem standarder för AA (askorbinsyra). Volymer av solute och lösningsmedel för att förbereda var och en av de olika koncentrationerna av standarderna anges.
3. Utvinning av AA och DHAA
OBS: Det rekommenderas att arbeta under förhållanden med låg ljusintensitet under extraktionsstegen.
- Till ett 15 mL polypropylencentrifugeringsrör, tillsätt 50 mg lyofilat markprov och 5 mL av extraktionslösningsmedlet (steg 2.1).
- Skaka blandningen med hjälp av en virvel i 5 s och sedan en orbital shaker i 10 min vid 2000 rpm.
- Introducera röret i ett ultraljudsbad i 10 min vid rumstemperatur med ultraljud aktiverad.
- Centrifugera vid 4 000 x g i 10 min vid 4 °C.
- Ta supernatanten, för den genom ett 0,22 μm regenererat cellulosafilter och förvara det i en 5 mL bärnstensflaska. Detta är Extrakt 1, som innehåller AA och DHAA.
OBS: Protokollet kan pausas här genom att frysa extrakten vid -80 °C och skydda dem från exponering för ljus eftersom AA och DHAA är mycket instabila och bryts ned lätt i närvaro av ljus, vid höga temperaturer eller under oxiderande atmosfärer (Supplemental File 1).
4. DHAA-reduktion till AA för att utvinna TAA
- Överför 200 μL av Extrakt 1 till en 2 mL bärnstensfärgad injektionsflaska för vätskekromatografi och tillsätt 200 μL av reducerlösningen (steg 2.2). Stäng injektionsflaskan med en PTFE-silikonplugg med föröppning och skaka den med en virvel i 5 s.
- Låt lösningen stå i 30 min i rumstemperatur och skydda mot ljus.
- Tillsätt 200 μL på 0,4 M H2SO4 för att stoppa reaktionen och stabilisera AA i sura pH-värde. Den resulterande lösningen är Extract 2, som innehåller endast AA och är faktiskt TAA.
5. Fastställande
- UPLC-UV-beredning
- Förbered arbetslösningarna som beskrivs i tabell 2, lämpligt filtrerad genom 0,22 μm filter, sonikerat i minst 10 min och placera dem i UPLC-systemet.
- Slå på de tre UPLC-modulerna och vänta tills den interna kalibreringsprocessen är klar.
- Öppna programvaran (t.ex. Empower 3) och ladda det instrumentala programmet som beskrivs i tabell 2: Empower 3 | Kör Prover | C-vitaminmetod | UPLC_PDA | Använd Snabbstart.
- När programvaran är laddad med rätt program, tillgång till UPLC hanteringskonsol: Kvartär solvent Manager | Klicka höger musknapp | Lanseringskonsol.
- Gå vidare till förberedelser och stabilisering av UPLC-instrumentet: System | Kontroll | Start.
- Rensa alla UPLC-linjer i minst 5 min: Prime Solvents | QSM | Kontrollera A, B, C, D och Seal Wash | Varaktighet av prime > 5 min.
- Rensa ut och rengör injektorn: Prime Solvents | SM | Kontrollera Wash solvent (> 45 s) och Kontrollera Purge-lösningsmedel (> 35 cykler).
- Equilibrate UPLC till metodförhållanden: Jämvikt till metod | QSM | Flöde (0,3 mL min-1) | Lösningsmedel A (2%) | Lösningsmedel B (0%) | Lösningsmedel C (98%) | Lösningsmedel D (0%); Jämvikt till metod | SM | Prov (5 °C) | Kolumn (30 °C) och Jämvikt till metod | Övrigt | Kontrollera lampa på | Tryck på Start.
- Vänta i minst 1 h (ännu mer tid rekommenderas) för att utrustningen ska stabiliseras. Stabilitet kan verifieras kontrollera trycket i kolumnen i Launch Console: System | Kvartär solvent manager | QSM-systemtryck. Se till att det inte finns några identifierbara trender i tryckförändringar (antingen ökar eller minskar) och deltavärdet är mindre än 10 psi.
- I skärmen Snabbstart fyller du matrisen med namnen på de standarder och prover som ska analyseras.
- AA-bestämning i normerna
- Överför 1 mL av var och en av de fem AA-standarder som tidigare förberetts (steg 2.5.3) till 2 mL bärnstensfärgade injektionsflaska för vätskekromatografi. Stäng injektionsflaskan med en PTFE-silikonplugg med föröppning och injicera 5 μL i UPLC-instrumentet.
- Utför kromatografin efter det förfarande som beskrivs i tabell 2 med början från de flesta utspädda till mest koncentrerade.
- AA-bestämning i proverna
- Pipett 200 μL av Extrakt 1 i en 2 mL bärnstensfärgad injektionsflaska för vätskekromatografi och tillsätt 800 μL ultrapure vatten. Stäng injektionsflaskan med en PTFE-silikonplugg med föröppning och injicera 5 μL i UPLC-instrumentet.
- Genomföra kromatografin efter det förfarande som beskrivs i tabell 2.
- TAA-bestämning i proverna
- Tillsätt 400 μL ultrarent vatten till Extrakt 2. Stäng injektionsflaskan med en PTFE-silikonplugg med föröppning och injicera 5 μL i UPLC-instrumentet.
- Genomföra kromatografin efter det förfarande som beskrivs i tabell 2.
| Komponenter och parametrar | Beskrivning |
| Instrument | Acquity UPLC H-klass |
| Detektor | PDA eλ Detektor λabs för AA=245 nm |
| Programvara | Ge 3 |
| Kolumn | Acquity UPLC HSS T3 (150 mm x 2,1 mm x 1,8 μm) |
| Kanal A | CH3OH |
| Kanal B/Tvätt | H2O:CH3OH (50:50 v:v) |
| Kanal C | Ultrapure vatten pH 2.0 försurade av myrsyraa |
| Kanal D/Tätningstvätt | Ultrarent vatten:acetonitril (90:10 v:v) |
| Mobil fas | 0,3 mL min-1 av 2%A + 98%C (isokratiskt läge) |
| Kolonntemperatur | 30 °C |
| Autosampler temperatur | 5 °C |
| Injektionsvolym | 5 μL |
| AA retentionstid | 1,874 min |
| Speltid | 3 min |
| ett Obestämd volym av myrsyra som används tills pH-justering | |
Tabell 2: Kromatografiskt förfarande optimerat för att bestämma AA (askorbinsyra) i extrakt från sallad och vilda släktingar. Beskrivning av de komponenter, villkor och lösningar som används.
6. Kvantifiering av AA och DHAA
- Statistisk analys
- Bestäm den kromatografiska metodens analytiska parametrar enligt beskrivningen av Bertolín et al.18 (tabell 3).
OBS: Värdena för de parametrar som presenteras i tabell 3 kommer att behöva definieras under särskilda experimentella förhållanden.
- Bestäm den kromatografiska metodens analytiska parametrar enligt beskrivningen av Bertolín et al.18 (tabell 3).
| Metodens analytiska parametrar | Värden |
| Linjärt område (μg mL-1) | 0.5-25 |
| Linjär ekvation | y=53 143,03x |
| R2 | 0.99998 |
| Gräns för detektion (mg AA g-1 av torrsubstans) | 0.013 |
| Kvantifieringsgräns (mg AA g-1 av torrsubstans) | 0.045 |
| Repeterbarhet (CV, %)a | 1.75 |
| Mellanprecision (CV, %)a | 4.22 |
| Återhämtning (Rec, %)b | 95,6 ±2,4 |
| ett CV: variationskoefficient | |
| b Återhämtningsanalysen utfördes med 10 alikvoter som innehöll 50 mg av samma prov, 5 spikade med 2 mg AA g-1 torrsubstans och 5 icke-spikade. %Rec=([AA]spikat prov-[AA]-prov)/([AA]spikade)x100. | |
Tabell 3: Optimerade analytiska parametrar för detektion och kvantifiering av AA (askorbinsyra) och TAA (total askorbinsyra). Det linjära intervallet, ekvationen och bestämningskoefficienten för kalibreringen (R2) kurva, samt gränserna för detektion och kvantifiering av AA (samma för TAA), och repeterbarheten, mellanprecisionen och återvinningen erhölls med en provinjiceringsvolym på 5 μL.
- Beräkna AA- och TAA-koncentrationen.
- Öppna standard- och provkromatogrammen: Snabbstart | Bläddra i Project | Kanaler | "namn på standard eller prov" | PDA Ch1 245 nm@1,2 nm.
- Integrera motsvarande topp (AA eller TAA) i standarderna och proverna genom att klicka på dess startpunkt (ungefär 1,790 min) och dra den med musen till dess slutpunkt (cirka 1,910 min).
- Bygg en kalibreringskurva som representerar de absorbansvärden som bestämts kromatografiskt (steg 5.2.) mot koncentrationen av de fem AA-standarder som beretts ovan (tabell 1).
- Interpolera absorbansvärdena för de prov som bestämts i steg 5.3 och 5.4 och erhålla AA- respektive TAA-koncentrationen med följande formel:
där y är det integrerade toppområdet, x är AA- eller TAA-koncentrationen i ppm och m och n är lutningen respektive y-intercept av den erhållna regressionslinjen. - För beräkning av koncentrationen av DHAA, tillämpa följande formel:
OBS: För att få de totala koncentrationerna av DHAA, AA och TAA i mg g-1 torrvikt, måste de värden som erhålls direkt interpolerande i kalibreringskurvan multipliceras med den totala extraktvolymen och den applicerade utspädningsfaktorn, och sedan divideras med vikten på det prov som används för att utföra extraktionen.
Representative Results
C-vitamin kvantifiering i Lactuca matrixes kräver utveckling av en kromatografisk metod som kan säkerställa tillförlitliga resultat. Bild 1A visar ett kromatogram som är resultatet av ett icke-optimerat protokoll (Supplemental File 2), som presenterar en AA-topp tillsammans med en oidentifierad mindre "axel". Trots det uppnåddes efter förbättring av extraktionen och kromatografiska tillstånd, en löst AA-topp utan interferens av okända föreningar (Figur 1B). Dessutom, användning av UPLC-UV-utrustning i stället för HPLC-UV tillät oss att minska retentionstiden (RT) för AA: 1.874 min i optimerade kromatogram jämfört med 2,980 min i de icke-optimerade (Figur 1), samt de gångtider, 3 och 7 minuter för den optimerade och icke-optimerade protokoll, respektive.
Figur 1: Kromatogram av AA i samma salladsprov (kommersiella sorten "Begoña"). (A) HPLC-UV-kromatogram som härrör från ett icke-optimerat protokoll (villkor som beskrivs i Supplemental File 2). (B) UPLC-UV-kromatogram som erhållits med det optimerade protokollet (förhållanden som beskrivs i tabell 2). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Interferenser i AA-toppar, som de som observerats i figur 1A, resulterade konsekvent i underskattning av C-vitamin (AA, DHAA och TAA) innehåll (Figur 2) på grund av en otillräcklig separation under den kromatografiska processen då de överlappande toppområdena integrerades av en vertikal droppe på den djupaste punkten mellan dem. Denna bias är särskilt märkbar när det gäller grödan vilda släktingar, särskilt i DHAA och TAA innehåll (Figur 2).
Figur 2: Fördelning av innehållet av C-vitamin. Split violin tomter av DHAA, AA och TAA innehåll (mg g-1 av torr vikt) i kommersiella och traditionella salladssorter och några vilda släktingar med hjälp av icke-optimerade och optimerade protokoll. Svarta linjer visar medelvärdena. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Vidare hindrade användningen av ett icke-optimerat protokoll oss från att utvinna någon användbar slutsats från resultaten som de visade alla prover, båda typerna av sallat och de vilda släktingar, med en liknande C-vitaminhalt. Däremot gjorde det optimerade protokollet oss att upptäcka statistiskt signifikanta skillnader mellan dem för DHAA och TAA innehåll (Tabell 4), de rikaste är de vilda arterna (Figur 2).
| Icke optimerad | Optimerad | |||
| F-förhållande | p-värde | F-förhållande | p-värde | |
| DHAA | 0.460 | 0,637ns | 5.613 | 0.009** |
| Aa | 0.070 | 0,932ns | 1.020 | 0,374ns |
| Taa | 0.015 | 0,985ns | 4.438 | 0.022* |
| ns, * och ** anger icke signifikant och betydande vid p<0,05 respektive 0,01. | ||||
Tabell 4: Variation i innehållet av C-vitamin. F-förhållanden (kvoter av två varianser, mellan-gruppvariansen och variansen inom gruppen) och signifikansvärden från envägs-ANOVA med tanke på typen av Lactuca (kommersiella salladssorter, traditionella salladssorter och beskära vilda släktingar) för DHAA-, AA- och TAA-innehåll i icke-optimerade och optimerade protokoll.
Kompletterande Fil 1: AA- och TAA-stabilitet vid 5 °C över 24 h. (A) AA- och TAA-toppområden i hela 24 h. (B) AA- och TAA-halten (mg g-1 av torrvikt) i hela 24 h. Staplar representerar standardavvikelserna för två tekniska replikat (n=2) som hålls i autosamplern vid 5 °C och skyddas från exponering för ljus. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Supplemental File 2: Huvudsakliga skillnader mellan det optimerade och det icke-optimerade protokollet för utvinning och kvantifiering av TAA, AA och DHAA. De prover som användes var desamma i båda fallen. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Discussion
C-vitamin är ett mycket viktigt näringsämne, men det är en mycket labile förening också, så dess UPLC-UV kvantifiering är beroende av flera faktorer, såsom prov lagring och beredning, extraktion metod och kromatografiska förhållanden. Därför behövdes en snabb och enkel procedur för att förhindra AA (med antioxidantkraft) oxidation till DHAA (utan antioxiderande egenskaper). Det var också avgörande för att undvika höga pH och temperaturförhållanden, samt intensivt ljus och en oxiderande atmosfär under provbehandling för att främja stabiliteten i föreningen.
För att minimera AA-oxidation vidtogs följande åtgärder. Först och främst var prover lyophilized som ett utgångsmaterial för båda protokollen för att säkerställa korrekt kvantifiering av C-vitamin innehåll och att enkelt manipulera prover. Detta alternativ var att föredra framför fin slipning, vanligt förekommande i helalitteraturen 19, som dammet tinar mycket snabbt så vattnet blir tillgänglig igen. Under extraktionsförfarandet användes en högre volym av en surare lösning (8% ättiksyra och 1% MPA) som extraktionsmedel i det optimerade protokollet (Supplemental File 2), som också fungerade som en stabilisator genom att förhindra AA nedbrytning. Denna lösning innehöll också EDTA som en kelatbildare för att öka stabilisering16, till skillnad från extraheringsmedel i icke-optimerade protokollet (Supplemental File 2). Dessutom testade vi om extraktionsförfarandet kunde förstärkas genom att två på varandra följande extraktioner med 2,5 mL extraktionsmedel i stället för en enda med 5 mL och under en N2-atmosfär i stället för de atmosfäriska standardförhållandena. De bästa resultaten nåddes med hjälp av endast en extrahering under en omodifierad atmosfär, vilket förenklade protokollet genom att göra onödiga ytterligare steg (data visas inte). Andra mindre ändringar infördes också i protokollet för att förstärka extraktionen (dvs, ultraljudsbehandling), få en tydligare extrakt (finare filtrering) och minska protokollet varaktighet (Supplemental File 2). Angående de kromatografiska förhållandena genomfördes valideringen av metoden enligt18- 1 ,somgaranterade goda analysparametrar (tabell 3). Förutom, användning av ultrarena vatten med myrsyra (pH 2.0) och metanol (98:2 v:v) med en 0.3 mL min-1 flöde, i stället för monopotassiumfosfat 30 mM (pH 3.0) vid 1 mL min-1 som den mobila fasen (Supplemental File 2), resulterade i en förbättrad metod. Den viktigaste avancemang var sannolikt med hjälp av ett UPLC-system i stället för en HPLC, vilket gjorde att vi större kontroll av påverkar villkor (som temperaturen) och resulterar i löst AA toppar utan störningar av okända föreningar, i en kortare tid och förbrukar mindre volym av extrakt (Supplemental File 2).
Trots detta finns det två huvudsakliga begränsningar av denna metod. Den första är att DHAA inte kan mätas direkt med hjälp av en UV-detektor på grund av dess låga absorptivitet i spektrumets UV-omfång. Det är viktigt att kvantifiera DHAA-innehållet eftersom det presenterar viss biologisk aktivitet och är lätt konvertibel till AA i människokroppen5. För det behövs en ytterligare reaktion för att minska DHAA till AA, tillsammans med en andra kromatografisk körning för att mäta TAA och sedan bestämma DHAA indirekt genom att subtrahera AA-innehåll från TAA (figur 3). I denna mening har reduktionssteget optimerats genom att använda en högre koncentration av reduktionsmedlet (DTT), öka reaktionstiden från 5 till 30 min, och stoppa reaktionen med svavelsyra (Supplemental File 2). Den låga stabiliteten i AA utgör den andra begränsningen av metoden. Som AA börjar försämra 4 h efter extraktion (Supplemental File 1), är det nödvändigt att kvantifiera det i detta tidsintervall. Så, antalet prover att extrahera är betingat av det kromatografiska förfarandet. Det är därför vi föreslår att frysa dem vid det steget i detta protokoll, men i så fall kunde inte alla av dem placeras i UPLC autosampler för att mätas automatiskt. Lyckligtvis, den reducerade RT för AA tillät oss att erhålla 3 min kromatogram, mycket kortare än de 7 min kromatogram som erhållits med hjälp av HPLC (Supplemental File 2). Därav, C-vitaminhalt kunde bestämmas i ett stort antal prover i en 4 h fönster.
Figur 3: Workflow av kvantifieringen av C-vitamin i sallad och några vilda släktingar.
Schematiskt diagram över det optimerade protokollet som visar två grenar för bestämning av endast AA eller AA + DHAA (TAA). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Som C-vitamin är ett viktigt näringsämne för människor och på grund av dess viktiga hälsofördelar, det har blivit föremål för många studier. Därför har det kvantifierats i en stor mängd olika grödor, inklusive sallad, en av de mest konsumerade grönsaker över hela världen. Enkla klassiska metoder har gradvis ersatts av vätskekromatografi tekniker eftersom de är mer specifika och korrekta10. På grund av behovet av ytterligare en reaktion för att kvantifiera båda, AA och DHAA via HPLC, har dock i vissa studier på sallat endast AA14 eller endast TAA11 (utan att kvantifiera AA före minskningen av DHAA till AA) mätts. Vidare har endast ett fåtal författare kvantifierade AA och DHAA, trots bidraget från båda molekylerna till C-vitamin antioxidant aktivitet2. Ändå har UPLC teknik blivit viktigare på senare tid på grund av dess högre prestanda vid mätning av C-vitamin i flera grödor16. Om man jämför de resultat som erhållits i denna studie med de två metodikerna, UPLC och HPLC, har dessa fördelar bekräftats: väldefinierade AA-toppar tack vare en högre känslighet, och på mycket korta tider, har uppnåtts, vilket också innebär färre förbrukade resurser. Trots UPLC-effektivitet har endast Chen et al.20 tillämpat denna teknik för att mäta C-vitaminhalten i sallat, vilket fortfarande ledde till en underskattning eftersom endast AA-formen kvantifierades.
Sammanfattningsvis utgör detta arbete det första lyckade försöket att bestämma det totala C-vitamininnehållet inte bara i olika salladssorter utan också hos några av deras vilda släktingar. C-vitamin kvantifiering är också viktigt att välja sallat med högre antioxidant aktivitet inom avelsprogram. I denna mening, den ökade totala C-vitaminhalten i sallat vilda släktingar finns här och den ökade AA innehåll som rapporterats itidigare studier 14, liksom andra antioxidant föreningar21, breddar de lämpliga kandidaterna för att förbättra näringsvärdet av sallat.
Sammanfattningsvis, även med vissa begränsningar inneboende till C-vitamin karaktär, som dess gradvisa nedbrytning några timmar efter att ha utvunnits eller behovet av en minskning reaktion på grund av den låga DHAA UV-absorptivity, det erbjuder en mindre arbetsintensiv och en mindre tidskrävande metod för att mäta C-vitaminhalt. Dessutom är det också mycket robust och visar en hög känslighet och makt upplösning. Dessutom kan den lätt överföras inte bara till andra växtmaterial med små eller inga förändringar, utan även för bearbetade produkter som levererar intaget av vitamin C via kosten till människor, vilket ger upphov till ett brett spektrum av framtida tillämpningar inom det framväxande området för testning för tillförlitlig livsmedelskvalitet.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi erkänner tacksamt Grönsaks- germplasmbanken i Zaragoza (BGHZ-CITA, Spanien) och Centre for Genetic Resources (CNG, Wageningen, Nederländerna) för att ha levererat de frön som behövs för detta arbete. Vi tackar J. A. Aranjuelo, A. Castellanos och "laboratorio de valoración nutritiva" från CITA för teknisk support och D. L. Goodchild för att ha granskat det engelska språket. Detta arbete finansierades av projekten RTA2017-00093-00-00 från Det nationella institutet för jordbruks- och livsmedelsforskning och -teknik (INIA) och LMP164_18 från Aragóns regering; och genom det operativa programmet FEDER Aragón 2014–2020 och Europeiska socialfonden från Europeiska unionen [Grupos Consolidados A12–17R: "Grupo de investigación en fruticultura: caracterización, adaptación y mejora genéica" och A14-17R: "Sistemas agroganaderos alimentarios sostenibles" (SAGAS)]. I.M.L. fick stöd av ett predoktoralt kontrakt för utbildning av läkare från det spanska ministeriet för vetenskap, innovation och universitet (MCIU) och den spanska statliga forskningsmyndigheten (AEI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) ≥98% (Ellman′s reagent) | Roche | 10197777001 | |
| 10 mm Φ stainless steel ball | Euro Aznar Supplies S.L. | 20112100 | |
| 15 mL polypropylene tube for centrifuge | Deltalab | 429946 | |
| 2 mL HPLC amber vial | Agilent | 5190-9063 | |
| 2 mL syringe with needle | Deltalab | JS2 | |
| 20 mL polypropylene tubes | Deltalab | 202840 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIS) ≥99.9% (titration) | Roche | 10708976001 | |
| 50 mL polypropylene tube | Deltalab | 429951 | |
| Acetic acid (CH3COOH) ≥99% purity glacial, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Acetonitrile, HPLC super gradient grade (99.9+% CH3CN-0.2 µm filtrated) | Chem-lab | CL00.0189 | |
| Acquity UPLC HSS T3 column (150 mm x 2.1 mm x 1.8 µm) | Waters | 186003540 | |
| Beaker 1 L, 200 mL | Deltalab | 191725, 191722 | |
| Dipotassium phosphate (KH2PO4) | Panreac | 766384 | Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2) |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium salt (EDTA x 2H2O) 99-101% assay, ACS reagent | Panreac | 131669 | |
| Fisherbrand Analog MultiTube Vortexer | Thermo Fisher Scientific | 15549004 | |
| Formic acid 98-100% for HPLC LiChropur | Supelco | 5438040100 | |
| Freeze dryer VirTis genesis 25EL | VirTis | na | |
| Heidolph Multi Reax mixer | Heidolph | na | |
| Heidolph Reax top mixer | Heidolph | na | |
| Hewlett Packard HPLC 1050 equipped with an eλ Detector | Hewlett Packard | na | Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2) |
| Hydrochloric acid (HCl) 37% purity, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 320331 | |
| L-Ascorbic acid ≥99%, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 255564 | |
| Meta-phosphoric acid (MPA) ACS reagent, chips, 33.5-36.5% | Sigma-Aldrich | 239275 | |
| Methanol ≥99.9% (HPLC supergradient grade) | ChemLab | CL00.0189.2500 | |
| Micropipettes 10-1000 μL | Socorex | na | |
| Nucleosil 120 C18 Tracer column (250 mm x 4 mm x 5 µm) | Merck (Sigma-Aldrich) | 54919 | Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2) |
| PTFE-silicone cap with preaperture | Agilent | 5190-9067 | |
| Refrigerated centrifuge Gyrozen 1248R | Gyrozen | na | |
| Regenerated cellulose filters 0.22 µm (13 mm) | Agilent | 1015190-5108 | |
| Regenerated cellulose filters 0.45-µm (13 mm) | Labbox | SFCA-145-100 | Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2) |
| Spectrophotometer Heλios β | Thermo Scientific Corporation | na | |
| Sulfuric acid (H2SO4) 95.0-98.0% purity, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Ultrapure water | WasserLab | na | |
| Ultrasons H-D | Selecta | na | |
| Volumetric flasks 1 L, 100 mL | DeltaLab | 191489, 191486 | |
| Waters Acquity UPLC H-Class equipped with a PDA eλ Detector | Waters | na |
References
- FAOSTAT. Statistics of the Food and Agriculture Organization of the United Nations. FAOSTAT. , Available from: http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC (2018).
- Llorach, R., Martínez-Sánchez, A., Tomás-Barberán, F. A., Gil, M. I., Ferreres, F. Characterisation of polyphenols and antioxidant properties of five lettuce varieties and escarole. Food Chemistry. 108 (3), 1028-1038 (2008).
- Carr, A. C., Frei, B. Toward a new recommended dietary allowance for vitamin C based on antioxidant and health effects in humans. American Journal of Clinical Nutrition. 69 (6), 1086-1107 (1999).
- Carr, A. C., Vissers, M. C. M. Synthetic or food-derived vitamin C-Are they equally bioavailable. Nutrients. 5 (11), 4284-4304 (2013).
- Lee, S. K., Kader, A. A. Preharvest and postharvest factors influencing vitamin C content of horticultural crops. Postharvest Biology and Technology. 20 (3), 207-220 (2000).
- Shekhovtsova, T. N., Muginova, S. V., Luchinina, J. A., Galimova, A. Z. Enzymatic methods in food analysis: determination of ascorbic acid. Analytica Chimica Acta. 573-574, 125-132 (2006).
- Zhan, L., et al. Light exposure during storage preserving soluble sugar and L-ascorbic acid content of minimally processed romaine lettuce (Lactuca sativa L.var. longifolia). Food Chemistry. 136 (1), 273-278 (2013).
- Malejane, D. N., Tinyani, P., Soundy, P., Sultanbawa, Y., Sivakumar, D. Deficit irrigation improves phenolic content and antioxidant activity in leafy lettuce varieties. Food Science and Nutrition. 6 (2), 334-341 (2017).
- Tarrago-Trani, M. T., Phillips, K. M., Cotty, M. Matrix-specific method validation for quantitative analysis of vitamin C in diverse foods. Journal of Food Composition and Analysis. 26 (1-2), 12-25 (2012).
- Klimczak, I., Gliszczyńska-Świgło, A. Comparison of UPLC and HPLC methods for determination of vitamin C. Food Chemistry. 175, 100-105 (2015).
- Złotek, U., Świeca, M., Jakubczyk, A. Effect of abiotic elicitation on main health-promoting compounds, antioxidant activity and commercial quality of butter lettuce (Lactuca sativa L.). Food Chemistry. 148, 253-260 (2014).
- Koh, E., Charoenprasert, S., Mitchell, A. E. Effect of organic and conventional cropping systems on ascorbic acid, vitamin C, flavonoids, nitrate, and oxalate in 27 varieties of spinach (Spinacia oleracea L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (12), 3144-3150 (2012).
- Kałuzewicz, A., et al. The influence of short-term storage on the content of flavonoids and vitamin C in Broccoli. European Journal of Horticultural Science. 77 (3), 137-143 (2012).
- van Treuren, R., van Eekelen, H. D. L. M., Wehrens, R., de Vos, R. C. H. Metabolite variation in the lettuce gene pool: towards healthier crop varieties and food. Metabolomics. 14 (11), 1-14 (2018).
- Swartz, M. E. UPLC: An introduction and review. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 28 (7), 1253-1263 (2005).
- Spínola, V., Mendes, B., Câmara, J. S., Castilho, P. C. An improved and fast UHPLC-PDA methodology for determination of L-ascorbic and dehydroascorbic acids in fruits and vegetables. Evaluation of degradation rate during storage. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (4), 1049-1058 (2012).
- Ball, G. F. M. Water-soluble vitamin assays in human nutrition. , Springer. Boston, MA. (1994).
- Bertolín, J. R., et al. Simultaneous determination of carotenoids, tocopherols, retinol and cholesterol in ovine lyophilised samples of milk, meat, and liver and in unprocessed/raw samples of fat. Food Chemistry. 257, 182-188 (2018).
- Spínola, V., Llorent-Martínez, E. J., Castilho, P. C. Determination of vitamin C in foods: Current state of method validation. Journal of Chromatography A. 1369, 2-17 (2014).
- Chen, Y., et al. radiation is beneficial for yield and quality of indoor cultivated lettuce. Frontiers in Plant Science. 10, 1-10 (2019).
- Damerum, A., et al. Elucidating the genetic basis of antioxidant status in lettuce (Lactuca sativa). Horticulture Research. 2 (15055), 1-13 (2015).
