Summary
Vi præsenterer en hurtig og pålidelig metode til kvantificering af C-vitamin i Lactuca spp. ved hjælp af UPLC-UV, potentielt kan overføres til andre planter. De vigtigste trin er prøvepræparatet og C-vitaminekstraktion under stabile forhold, reduktion af dehydroascorbinsyre til ascorbinsyre og optimering af den kromatografiske procedure.
Abstract
Vitaminer, især C-vitamin, er vigtige mikronæringsker findes i frugt og grøntsager. C-vitamin er også en stor bidragyder til deres antioxidant kapacitet. Salat er en af de mest populære grøntsager blandt forbrugere over hele verden. En nøjagtig protokol til måling af C-vitaminindhold i salat og andre beslægtede arter er afgørende. Vi beskriver her en metode ved hjælp af den ultra-højtydende flydende kromatografi-ultraviolet (UPLC-UV) teknik, hvor prøvepræparat, vitaminekstraktion og kromatografi betingelser blev optimeret.
Prøverne blev indsamlet for at repræsentere hele planten, frosset ved -80 °C og frysede for at forhindre uønsket oxidation og gøre deres manipulation lettere. Ekstraktionen af C-vitamin blev udført i sure medier, hvilket også bidrog til dets stabilitet. Da C-vitamin kan være til stede i to forskellige interkonvertible former, ascorbinsyre (AA) og dehydroascorbinsyre (DHAA), skal begge forbindelser måles for nøjagtig kvantificering. DHAA blev kvantificeret indirekte efter reduktionen til AA, fordi AA udviser en højere absorptivitet end DHAA i spektrets UV-område. Af samme ekstrakt blev der foretaget to målinger, en før og en efter denne reduktionsreaktion. I det første tilfælde kvantificerede vi AA-indholdet, og i det andet kvantificerede vi summen af AA og DHAA (TAA: total ascorbinsyre) i form af AA. Derefter blev DHAA-mængden indirekte opnået ved at trække AA fra den første måling fra TAA. De blev bestemt af UPLC-UV, ved hjælp af en kommerciel AA standard til at opbygge en kalibreringskurve og optimere den kromatografiske procedure, for at opnå AA toppe, der blev fuldstændig løst på kort tid. Denne protokol kan let ekstrapoleres til ethvert andet plantemateriale med små eller ingen ændringer. Dens nøjagtighed afslørede statistisk signifikante forskelle ellers upåled. Andre styrker og begrænsninger diskuteres mere indgående i manuskriptet.
Introduction
Dyrket salat (Lactuca sativa L.) er en af de mest producerede og forbruges bladgrøntsager på verdensplan, med en samlet produktion på omkring 27.300 tusind tons i 20181. Salat opfattes som sund af forbrugerne. De ernæringsmæssige egenskaber er hovedsageligt tilskrives kilden til antioxidant forbindelser i afgrøden, såsom C-vitamin, blandt andet som polyfenoler og vitamin E2. C-vitamin er et vigtigt mikronæringsant for mennesker i modsætning til mange andre hvirveldyr, da vi ikke er i stand til at producere det på grund af mutationer til stede i genet kodning for det sidste trin enzym i den biosyntetiske vej3. Det er nødvendigt for en normal celle metabolisme, og det spiller også en vigtig rolle i immunrespons hovedsagelig på grund af sin antioxidant aktivitet3,4.
C-vitamin i alt består af ascorbinsyre (AA) og dehydroascorbinsyre (DHAA). AA er den mest biologisk aktive form af vitamin, men DHAA (dens oxidation produkt) viser også biologisk aktivitet, og det kan nemt omdannes til AA i den menneskelige krop5. Derfor kvantificere begge former er vigtigt at bestemme det samlede C-vitamin indholdet af enhver gartneri afgrøde, salat inkluderet.
Der er anvendt en lang række forskellige tilgange baseret på forskellige analyseteknikker til at måle C-vitamin i grøntsager, såsom enzymatiske, spektrofotometriske og titrimetriskemetoder 6,7,8. Selv om disse metoder er enkle, er de ikke kemisk specifikke for AA9. Derfor foretrækkes kromatografiske metoder, især den højtydende flydende kromatografi-ultraviolet (HPLC-UV) teknik, på grund af deres højere nøjagtighed10. HPLC-UV er blevet brugt til at bestemme C-vitamin i en stor mangfoldighed af afgrøder, som broccoli, spinat og salat11,12,13. Den samtidige kvantificering af AA og DHAA er imidlertid kompliceret på grund af DEN lave absorptivity af DHAA i spektrets UV-område. Alternativt kan DHAA bestemmes indirekte ved hjælp af et reduktionsmiddel, der konverterer DHAA til AA, måle total ascorbinsyre (TAA) og derefter beregne forskellen mellem TAA og AA. På grund af nødvendigheden af en reduktion reaktion, i nogle undersøgelser, kun AA er blevetkvantificeret 14, som faktisk kunne repræsentere en undervurdering af C-vitamin aktivitet. Denne yderligere reduktionsreaktion er også nødvendig for at bestemme DHAA indirekte, selv når det sidste fremskridt inden for flydende kromatografiteknikker, ultrahøjtydende væskekromatografi (UPLC), anvendes. Dette trin nyder også godt af de fordele, som UPLC udviser sammenlignet med HPLC: højere effektivitet og opløsning, øget følsomhed, kortere tidsanalyse og lavere forbrug afopløsningsmidler 15. Som følge heraf er UPLC-UV-teknikken blevet anvendt til at kvantificere C-vitamin i forskellige afgrøder16.
Desuden er AA et meget labile molekyle; Det er derfor vigtigt at udvikle en protokol, der forhindrer nedbrydning under salatoplagring og C-vitaminanalyse9. I denne forbindelse giver følgende protokol en hurtig og forbedret kvantificering af C-vitaminindholdet i salat ved UPLC-UV samt en effektiv ekstraktionsprocedure. Ikke kun elite sorter er blevet inkluderet i denne undersøgelse, men også traditionelle landraces og nogle vilde slægtninge på grund af deres potentielle interesse i avl af afgrøder, specielt i forbedringen af næringsværdien af salat.
Protocol
1. Fremstilling af plantemateriale
- Prøve mindst to blade pr plante i 50 ml polypropylenrør, en ydre (ældre) og en indre (yngre) en for at repræsentere mere præcist hele planten. Der indsamles mindst tre biologiske replikater for hver prøve.
- De fryses straks ved hjælp af flydende nitrogen, og de opbevares ved -80 °C, indtil de anvendes. Sørg for, at det flydende kvælstof ikke kommer ind i rørene; ellers kan de eksplodere, når de fjernes på grund af gasudvidelsen under fordampning.
FORSIGTIG: Handsker og ansigtsskærm er påkrævet på grund af de potentielle farer, der er forbundet med brug af flydende nitrogen. - Lyophilizerens(Materialetabel), der er programmeret på følgende måde: -25 °C i 72 timer, -10 °C i 10 timer, 0 °C i 10 timer og 20 °C i mindst 4 timer. Kondensatortemperaturen og vakuumkonstanten under frysetørringen fastholdes ved henholdsvis -80,2 °C og 112 mTorr.
- Når materialet er helt tørt (mellem 4 og 7 dage afhængigt af planten og graden af komprimering i røret), skal du bevare ved henholdsvis 4 °C, -20 °C eller -80 °C i korte (dage til uger), medium (måneder) eller lang (år) opbevaring. Det anbefales at medtage poser, der indeholder silicagelperler, i de prøveholdige rør.
- Placer de frysetørrede prøver i 20 ml polypropylenrør sammen med 10 mm diameter rustfrit stål kugler og male dem med en multitube vortexer ved hjælp af intensitet og tid er nødvendig for at opnå et fint støv.
BEMÆRK: Under hele processen skal prøverne beskyttes mod direkte lys.
2. Reagens og opløsningspræparat
- Opløsningsmiddelekstraktionsopløsningen klar: 8% eddikesyre (v/v), 1% MPA (meta-fosforsyre) (w/v), 1 mM EDTA (ethylenediamintetraaceticsyre).
- Den samlede mængde opløsningsmiddel, der er nødvendigt for at behandle hele prøvesættet, beregnes under hensyntagen til, at der tilsættes 5 ml til hver. For at forberede 1 L af opløsningen tilsættes til en kolbe: 30 g MPA, 0,372 g EDTA-dehydrering, 80 ml eddikesyre og 500 ml ultrarent vand (skalamængder og -mængder i overensstemmelse hermed). Kolben mund med plastfolie.
- Når den er opløst ved hjælp af en magnetisk omrører, skal du bruge en målekolbe til nøjagtigt at måle 1 L og tilsætte det nødvendige ultrarent vand.
- Der klargør reduktionsreaktionsbufferen (0,5 M Tris (2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) pH 9,0) og reduktionsopløsning (40 mM DTT (1,4-Dithiothreitol) med 0,5 M Tris pH 9,0).
- Den samlede reduktionsopløsning beregnes, som er nødvendig for at behandle hele prøvesættet, idet der tages hensyn til, at der vil blive tilsat 200 μL til hver af dem. For at forberede 100 ml buffer, tilsættes til et bægerglas: 6,055 g Tris og 90 ml ultrarent vand (skalamængder og mængder i overensstemmelse hermed). Nægl bægermunden med plastfilm.
- Når opløsningen er opløst ved hjælp af en magnetisk omrører, justeres opløsningen til pH 9.0 ved tilsætning af 2 M HCl, og der anvendes en målekolbe til nøjagtigt at måle 100 ml og tilsætte det nødvendige ultrarent vand.
- For at forberede 100 ml af reduktionsopløsningen skal du tilføje til et bægerglas: 0,629 g DTT (renhed: 98%) og 90 ml af bufferen (0,5 M Tris pH 9,0), der tidligere er tilberedt (2.2.1 til 2.2.2). Skaler mængder og mængder i overensstemmelse hermed. Nægl bægermunden med plastfilm.
- Når den er opløst ved hjælp af en magnetisk omrører, anvendes en målekolbe til nøjagtig måling af 100 ml, og den nødvendige stødpudemængde 0,5 M Tris pH 9.0 tilsættes.
BEMÆRK: Reduktionsopløsningen er meget ustabil. Derfor anbefales en frisklavet løsning kraftigt.
- Svovlsyre (0,4 M H2SO4)
- Det samlede volumen på 0,4 M svovlsyre, der er nødvendigt for at forarbejde hele sættet af prøver, idet der tages hensyn til, at der tilsættes 200 μL til hver. Til fremstilling af 100 ml af opløsningen skal du tilsætte et bægerglas: 80 ml ultrarent vand og derefter 2,22 ml H2SO4 (renhed: 96 %, tæthed: 1,84 g ml-1). Brug en målekolbe til nøjagtigt at måle 100 ml og tilsætte det nødvendige ultrarent vand.
FORSIGTIG: Svovlsyre er meget ætsende, så den skal håndteres med beskyttelsesudstyr og under kølerhjelmen. Desuden bør syren tilsættes ultrarent vand, og ikke vand til syre, for at reducere dampe og undgå ulykker.
- Det samlede volumen på 0,4 M svovlsyre, der er nødvendigt for at forarbejde hele sættet af prøver, idet der tages hensyn til, at der tilsættes 200 μL til hver. Til fremstilling af 100 ml af opløsningen skal du tilsætte et bægerglas: 80 ml ultrarent vand og derefter 2,22 ml H2SO4 (renhed: 96 %, tæthed: 1,84 g ml-1). Brug en målekolbe til nøjagtigt at måle 100 ml og tilsætte det nødvendige ultrarent vand.
- Saltsyre (2 M HCl).
- Til fremstilling af 100 ml 2 M saltsyre tilsættes et bægerglas: 80 ml ultrarent vand og derefter 6,13 ml HCL (renhed: 37%, tæthed: 1,19 g ml-1). Nægl bægermunden med plastfilm. Brug en målekolbe til nøjagtigt at måle 100 ml og tilsætte det nødvendige ultrarent vand. Skaler diskenheder i overensstemmelse hermed.
FORSIGTIG: Saltsyre er meget ætsende, så den skal håndteres med beskyttelsesudstyr og under kølerhjelmen. Desuden bør syren tilsættes ultrarent vand, og ikke vand til syre, for at reducere dampe og undgå ulykker.
- Til fremstilling af 100 ml 2 M saltsyre tilsættes et bægerglas: 80 ml ultrarent vand og derefter 6,13 ml HCL (renhed: 37%, tæthed: 1,19 g ml-1). Nægl bægermunden med plastfilm. Brug en målekolbe til nøjagtigt at måle 100 ml og tilsætte det nødvendige ultrarent vand. Skaler diskenheder i overensstemmelse hermed.
- AA-standard (lager og udvanding)
- Nøjagtig 10 mg AA-standard (renhed: 99 %) ved hjælp af en præcisionsbalance og tilsættes 90 ml mobil fase (ultrarent vand pH 2.0 med myresyre).
- Når den er opløst ved hjælp af en magnetisk omrører, anvendes en målekolbe til nøjagtigt at måle 100 ml og tilsættes den nødvendige mængde ultrarent vand pH 2.0 med myresyre.
BEMÆRK: Beskyt denne lageropløsning mod lyseksponering. - Der forbereds fem fortyndinger fra aa-standardens lager for at opnå en kalibreringskurve efter instruktionerne i tabel 1, og fortsæt med trin 5.2.
| Standard | [AA] (μg ml-1) | AA -opløsning (100 μg ml-1)(μL) | Mobil fase (μL)a |
| 1 | 0.5 | 5 | 995 |
| 2 | 2.5 | 25 | 975 |
| 3 | 5 | 50 | 950 |
| 4 | 10 | 100 | 900 |
| 5 | 25 | 250 | 750 |
| a. Ultrarent vand pH 2.0 forsuret af myresyre. | |||
Tabel 1: Protokol til fremstilling af fem standarder for AA (ascorbinsyre). De mængder opløste og opløsningsmidler, der skal forberede hver af de forskellige koncentrationer af standarderne, er angivet.
3. Udvinding af AA og DHAA
BEMÆRK: Det anbefales at arbejde under forhold med lav lysintensitet under udsugningstrinene.
- Til et 15 ml polypropylencentrifugerør tilsættes 50 mg frysetørret bundprøve og 5 ml ekstraktionsopløsningsmiddel (trin 2.1).
- Ryst blandingen ved hjælp af en vortex i 5 s og derefter en orbital shaker i 10 min ved 2000 rpm.
- Indfør røret i et ultralydsbad i 10 minutter ved stuetemperatur med ultralyd aktiveret.
- Centrifuge ved 4.000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Tag supernatanten, før den gennem et 0,22 μm regenereret cellulosefilter og opbevar det i et 5 ml ravglas. Dette er Uddrag 1, som indeholder AA og DHAA.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her ved at fryse ekstrakterne ved -80 °C og beskytte dem mod lyseksponering, da AA og DHAA er meget ustabile og nedbrydes let ved tilstedeværelse af lys, ved høje temperaturer eller under oxiderende atmosfærer (supplerende fil 1).
4. DHAA reduktion til AA at udtrække TAA
- 200 μL ekstrakt 1 overføres til et 2 ml ravhætteglas til væskekromatografi og tilsættes 200 μL af reduktionsopløsningen (trin 2.2). Luk hætteglasset med et PTFE-silikonestik med foråbning og ryst det med en vortex i 5 s.
- Lad opløsningen stå i 30 minutter ved stuetemperatur og beskyt mod lys.
- Der tilsættes 200 μL på 0,4 M H2SO4 for at stoppe reaktionen og stabilisere AA i sur pH. Den resulterende løsning er Uddrag 2, som kun indeholder AA og er faktisk TAA.
5.
- UPLC-UV-præparat
- Forbered de arbejdsløsninger, der er beskrevet i tabel 2, og filtreres på passende vis gennem 0,22 μm-filtre, sonikeres i mindst 10 minutter, og de sættes i UPLC-systemet.
- Tænd for de tre UPLC-moduler, og vent på, at den interne kalibreringsproces er.
- Åbn softwaren (f.eks. Kør prøver | Vitamin C-metoden | UPLC_PDA | Brug Hurtig introduktion.
- Når softwaren er fyldt med det korrekte program, skal du få adgang til UPLC-administrationskonsollen: Quaternary Solvent Manager | Klik på højre museknap | Start konsol.
- Forberedelse og stabilisering af UPLC-instrumentet: System | Kontrol | Start.
- Fjern alle UPLC-linjer i mindst 5 min. : Prime Solvents | QSM | Kontrol A, B, C, D og Seal Wash | Varighed af prime > 5 min.
- Rengør og rengør injektoren: Prime Solvents | SM | Kontroller vaskeopløsningsmiddel (> 45 s) og Kontroller renset opløsningsmiddel (> 35 cyklusser).
- Ligevægt UPLC til metodebetingelser: Ligevægt til metode | QSM | Flow (0,3 ml min-1) | Opløsningsmiddel A (2 %) | Opløsningsmiddel B (0%) | Opløsningsmiddel C (98%) | Opløsningsmiddel D (0%) Ligevægt efter metode | SM | Prøve (5 °C) | Kolonne (30 °C) og ligevægt efter metode | Andet | Kontrollampe på | Tryk på Start.
- Vent i mindst 1 time (endnu mere tid anbefales) for udstyret til at stabilisere. Stabilitet kan verificeres kontrol af trykket i kolonnen i Launch Console: System | Kvremanær Solvent Manager | QSM-systemtryk. Sørg for, at der ikke er nogen identificerbare tendenser i trykændringer (enten stigninger eller fald), og at deltaværdien er mindre end 10 psi.
- På værktøjslinjen Hurtig introduktion skal du udfylde matrixen med navnene på de standarder og prøver, der skal analyseres.
- AA-bestemmelse i standarderne
- 1 ml af hver af de fem tidligere udarbejdede AA-standarder (trin 2.5.3) overføres til 2 ml ravhætteglas til flydende kromatografi. Hætteglasset lukkes med et PTFE-silikonestik med foråbning, og injicer 5 μL i UPLC-instrumentet.
- Kromatografien udføres efter fremgangsmåden i tabel 2, der starter fra den mest fortyndede til mest koncentrerede.
- AA-bestemmelse i prøverne
- Der pipetteres 200 μL ekstrakt 1 i et 2 ml ravglas til flydende kromatografi og tilsættes 800 μL ultrarent vand. Hætteglasset lukkes med et PTFE-silikonestik med foråbning, og injicer 5 μL i UPLC-instrumentet.
- Kromatografien udførs efter fremgangsmåden i tabel 2.
- TAA-bestemmelse i prøverne
- Tilsæt 400 μL ultrarent vand til ekstrakt 2. Hætteglasset lukkes med et PTFE-silikonestik med foråbning, og injicer 5 μL i UPLC-instrumentet.
- Kromatografien udførs efter fremgangsmåden i tabel 2.
| Komponenter og parametre | Beskrivelse |
| Instrument | Acquity UPLC H-klasse |
| Detektor | PDA eλ Detektor λabs for AA=245 nm |
| Software | Giv 3 |
| Kolonne | Acquity UPLC HSS T3 (150 mm x 2,1 mm x 1,8 μm) |
| Kanal A | CH3OH |
| Kanal B/Vask | H2O:CH3OH (50:50 v:v) |
| Kanal C | Ultrarent vand pH 2.0 forsuret af myresyreen |
| Kanal D/Seal Vask | Ultrapure vand:acetonitrile (90:10 v:v) |
| Mobil fase | 0,3 ml min-1 af 2%A + 98%C (isokratisk tilstand) |
| Kolonnetemperatur | 30 °C |
| Autosampler temperatur | 5 °C |
| Injektionsvolumen | 5 μL |
| AA opbevaring tid | 1.874 min. |
| Spilletid | 3 min. |
| a. Ubestemt volumen af myresyre, der anvendes indtil pH-justering | |
Tabel 2: Kromatografisk procedure, der er optimeret til bestemmelse af AA (ascorbinsyre) i ekstrakter fra salat og vilde slægtninge. Beskrivelse af de anvendte komponenter, betingelser og løsninger.
6. Kvantificering af AA og DHAA
- Statistisk analyse
- De analytiske parametre for den kromatografiske metode som beskrevet af Bertolín et al.18 (tabel 3).
BEMÆRK: Værdierne af de parametre, der præsenteres i tabel 3, skal defineres under særlige forsøgsbetingelser.
- De analytiske parametre for den kromatografiske metode som beskrevet af Bertolín et al.18 (tabel 3).
| Metodens analytiske parametre | Værdier |
| Lineært område (μg ml-1) | 0.5-25 |
| Lineær ligning | y=53.143,03x |
| R2 | 0.99998 |
| Detektionsgrænse (mg AA g-1 tørstof) | 0.013 |
| Kvantificeringsgrænse (mg AA g-1 tørstof) | 0.045 |
| Repeterbarhed (CV, %)en | 1.75 |
| Mellemliggende præcision (CV, %)en | 4.22 |
| Genopretning (Rec, %)b | 95,6±2,4 |
| a. CV: variationskoefficient | |
| b. Genindvindingsanalysen blev udført med 10 aliquoter indeholdende 50 mg af samme prøve, 5 tilsat 2 mg AA g-1 tørstof og 5 ikke-spiked. %Rec=([AA]spiked sample-[AA]sample)/([AA]spiked)x100. | |
Tabel 3: Optimerede analyseparametre til påvisning og kvantificering af AA (ascorbinsyre) og TAA (total ascorbinsyre). Det lineære område, ligningen og bestemmelseskoefficienten for kalibreringskurven (R2)samt grænserne for påvisning og kvantificering af AA (det samme for TAA) og repeterbarheden, den mellemliggende præcision og restitutionen blev opnået med et prøveinjektionsvolumen på 5 μL.
- AA- og TAA-koncentrationen beregnes.
- Åbn standard- og eksempelkromatogrammer: Hurtig introduktion | Gennemse projekt | Kanaler | "Standardens eller prøvens navn" | PDA Ch1 245 nm@1,2 nm.
- Integrer den tilsvarende top (AA eller TAA) i standarder og prøver ved at klikke på udgangspunktet (ca. 1.790 min) og trække den med musen til slutpunktet (ca. 1.910 min).
- Der opbygges en kalibreringskurve, der repræsenterer absorbansværdierne bestemt kromatografisk (trin 5.2.) i forhold til koncentrationen af de fem ovennævnte AA-standarder (Tabel 1).
- Absorbansværdierne for prøverne, der er bestemt i trin 5.3 og 5.4, interpoleres, og AA- og TAA-koncentrationen opnås med følgende formel:
hvor y er det integrerede topområde, x er AA- eller TAA-koncentrationen i ppm og m og n er henholdsvis hældningen og y-interceptenaf den opnåede regressionslinje. - Ved beregning af koncentrationen af DHAA anvendes følgende formel:
BEMÆRK: For at opnå de samlede koncentrationer af DHAA, AA og TAA i mg g-1 af tørvægt skal de værdier, der opnås direkte interpoleres i kalibreringskurven, multipliceres med det samlede ekstraktvolumen og den anvendte fortyndingsfaktor og derefter divideres med vægten af den prøve, der anvendes til at udføre ekstraktionen.
Representative Results
C-vitamin kvantificering i Lactuca matrixer kræver udvikling af en kromatografisk tilgang, der kan sikre pålidelige resultater. Figur 1A viser et kromatogram som følge af en ikke-optimeret protokol (Supplerende Fil 2), som præsenterer en AA-top sammen med en uidentificeret mindre "skulder". Efter at have forbedret ekstraktionen og kromatografiske forhold blev der dog opnået en løst AA-top uden interferens af ukendte forbindelser (figur 1B). Desuden gav brugen af UPLC-UV-udstyr i stedet for HPLC-UV os mulighed for at reducere retentionstiden (RT) for AA: 1,874 min i de optimerede kromatogrammer versus 2.980 min i de ikke-optimerede(Figur 1)samt køretiderne, henholdsvis 3 og 7 minutter for de optimerede og ikke-optimerede protokoller.
Figur 1: Chromatograms af AA i samme salatprøve (handelssorten »Begoña«). (A) HPLC-UV-kromatogram som følge af en ikke-optimeret protokol (betingelser beskrevet i supplerende fil 2). b) UPLC-UV-kromatogram opnået med den optimerede protokol (betingelser beskrevet i tabel 2). Klik her for at se en større version af dette tal.
Interferenser i AA-toppe som dem, der er observeret i figur 1A, resulterede konsekvent i undervurdering af C-vitamin (AA, DHAA og TAA)pågrund af utilstrækkelig adskillelse under den kromatografiske proces, da de overlappende topområder blev integreret med et lodret fald på det dybeste punkt mellem dem. Denne skævhed er især mærkbar for de vilde slægtninge, især i DHAA- og TAA-indholdet (figur 2).
Figur 2: Fordeling af indholdet af C-vitamin. Split violin plots af DHAA, AA og TAA indhold (mg g-1 af tør vægt) i kommercielle og traditionelle salat sorter og nogle vilde slægtninge ved hjælp af ikke-optimerede og optimerede protokoller. Sorte linjer viser middelværdierne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Desuden forhindrede brugen af en ikke-optimeret protokol os i at udtrække nogen nyttig konklusion fra resultaterne, da de viste alle prøver, begge typer af salat og de vilde slægtninge, der har et lignende C-vitaminindhold. I modsætning hertil gav den optimerede protokol os mulighed for at opdage statistisk signifikante forskelle mellem dem for DHAA- og TAA-indhold (Tabel 4), de rigeste er de vilde arter (Figur 2).
| Ikke optimeret | Optimeret | |||
| F-forholdet | p-værdi | F-forholdet | p-værdi | |
| DHAA | 0.460 | 0,637ns | 5.613 | 0.009** |
| Aa | 0.070 | 0,932ns | 1.020 | 0.374kr. |
| Taa | 0.015 | 0,985ns | 4.438 | 0.022* |
| ns, * og ** angiver ikke signifikant og signifikant ved henholdsvis p<0,05 og 0,01. | ||||
Tabel 4: Variation i indholdet af C-vitamin. F-forhold (kvotienter af to varianser, variansen mellem gruppen og afvigelsen inden for gruppen) og betydningsværdierne fra envejs-ANOVA i betragtning af typen af Lactuca (kommercielle salatsorter, traditionelle salatsorter og beskære vilde slægtninge) for DHAA-, AA- og TAA-indhold i ikke-optimerede og optimerede protokoller.
Supplerende fil 1: AA- og TAA-stabilitet ved 5 °C over 24 timer. a) AA- og TAA-topområder i hele 24 h.B) AA- og TAA-indholdet (mg g-1 af tørvægt) i hele 24 timer. Stænger repræsenterer standardafvigelserne for to tekniske replikater (n=2), der holdes i autosampleren ved 5 °C og beskyttet mod lyseksponering. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: De vigtigste forskelle mellem den optimerede og den ikke-optimerede protokol til TAA, AA og DHAA ekstraktion og kvantificering. De anvendte prøver var de samme i begge tilfælde. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
C-vitamin er et meget vigtigt næringsstof, men det er en meget labile sammensatte også, så dens UPLC-UV kvantificering er afhængig af flere faktorer, såsom prøve opbevaring og forberedelse, ekstraktion metode og kromatografiske forhold. Derfor var der behov for en hurtig og enkel procedure for at forhindre AA (med antioxidant effekt) oxidation til DHAA (uden antioxidantegenskaber). Det var også afgørende at undgå høje pH-og temperaturforhold, samt intenst lys og en oxiderende atmosfære under prøvebehandling for at fremme stabiliteten af forbindelsen.
For at minimere AA oxidation, følgende foranstaltninger blev truffet. Først og fremmest blev prøverne lyophilized som udgangsmateriale til begge protokoller for at sikre nøjagtig kvantificering af C-vitaminindhold og for nemt at manipulere prøver. Denne mulighed blev foretrukket frem for finslibning, almindeligt forekommende i helelitteraturen 19, da støvet tør meget hurtigt, så vandet bliver tilgængeligt igen. Under ekstraktionsproceduren blev en større mængde af en mere sur opløsning (8% eddikesyre og 1% MPA) anvendt som emhætte i den optimerede protokol (supplerende fil 2), som også fungerede som stabilisator ved at forhindre AA-nedbrydning. Denne løsning indeholdt også EDTA som et chelaterende middel til at øge stabiliseringen16, i modsætning til emhætte i den ikke-optimerede protokol (Supplerende Fil 2). Desuden testede vi, om ekstraktionsproceduren kunne forbedres ved hjælp af to på hinanden følgende ekstraktioner med 2,5 ml udvindingsmiddel i stedet for en enkelt med 5 ml og under en N2 atmosfære i stedet for de normale atmosfæriske forhold. De bedste resultater blev opnået ved kun at bruge én ekstraktion under en uændret atmosfære, hvilket forenklede protokollen ved at foretage unødvendige yderligere trin (data ikke vist). Andre mindre ændringer blev også indført i protokollen for at forbedre ekstraktionen (dvs. sonikering), opnå et klarere ekstrakt (finere filtrering) og reducere protokollens varighed (Supplerende fil 2). Med hensyn til de kromatografiske forhold blev valideringen af metoden udført som rapporteretførden 18. Desuden resulterede brugen af ultrarent vand med myresyre (pH 2.0) og methanol (98:2 v:v) med et 0,3 mlmin -1 flow i stedet for monopotassiumphosphat 30 mM (pH 3.0) ved 1 mlmin -1 som den mobile fase (supplerende fil 2) i en forbedret metode. Den vigtigste avancement var sandsynligvis ved hjælp af et UPLC-system i stedet for en HPLC, som tillod os større kontrol over påvirker betingelser (som temperaturen) og resulterer i løst AA toppe uden forstyrrelser af ukendte forbindelser, i en kortere tid og forbrugende mindre volumen af ekstrakt (Supplerende File 2).
Ikke desto mindre er der to hovedbegrænsninger ved denne metode. Den første er, at DHAA ikke kan måles direkte ved hjælp af en UV-detektor på grund af sin lave absorptivity i UV-området af spektret. Det er vigtigt at kvantificere DHAA indhold, fordi det præsenterer visse biologiske aktivitet og er let konvertible til AA i den menneskelige krop5. Til dette formål er der behov for en yderligere reaktion for at reducere DHAA til AA sammen med en anden kromatografisk kørsel for at måle TAA og derefter bestemme DHAA indirekte ved at trække AA-indhold fra TAA (Figur 3). I denne forstand er reduktionstrinnet blevet optimeret ved hjælp af en højere koncentration af reduktionsmidlet (DTT), hvilket øger reaktionstiden fra 5 til 30 min og stopper reaktionen med svovlsyre (Supplerende fil 2). AA's lave stabilitet udgør metodens anden begrænsning. Da AA begynder at nedbryde 4 timer efter udtrækning (Supplerende Fil 1), er det nødvendigt at kvantificere det i dette tidsinterval. Så antallet af prøver til at udtrække er betinget af den kromatografiske procedure. Det er derfor, vi foreslår at fastfryse dem på dette trin i denne protokol, men i så fald, ikke alle af dem kunne placeres i UPLC autosampler, der skal måles automatisk. Heldigvis, den reducerede RT for AA tillod os at opnå 3 min kromatogrammer, meget kortere end de 7 min kromatograms opnået ved hjælp af HPLC (Supplerende File 2). Derfor kan C-vitaminindholdet bestemmes i et stort antal prøver i et 4 timers vindue.
Figur 3: Arbejdsgang for kvantificeringen af C-vitamin i salat og nogle vilde slægtninge.
Skematisk diagram over den optimerede protokol, der viser to grene til bestemmelse af kun AA eller AA + DHAA (TAA). Klik her for at se en større version af dette tal.
Som C-vitamin er et vigtigt næringsstof for mennesker og på grund af dens vigtige sundhedsmæssige fordele, er det blevet genstand for mange undersøgelser. Derfor er det blevet kvantificeret i en lang række afgrøder, herunder salat, en af de mest forbrugte grøntsager på verdensplan. Simple klassiske metoder er gradvist blevet erstattet af flydende kromatografi teknikker, fordi de er mere specifikke og præcise10. På grund af behovet for en yderligere reaktion for at kvantificere både AA og DHAA via HPLC er der i nogle undersøgelser af salat kun målt AA14 eller kun TAA11 (uden kvantificering af AA før reduktion af DHAA til AA). Desuden har kun få forfattere kvantificeret AA og DHAA, på trods af bidraget fra begge molekyler til C-vitamin antioxidant aktivitet2. Ikke desto mindre, UPLC teknik er blevet vigtigere i den seneste tid på grund af sin højere ydeevne ved måling af C-vitamin i flereafgrøder 16. Hvis man sammenligner de resultater, der er opnået i denne undersøgelse, med de to metoder, UPLC og HPLC, er disse fordele blevet bekræftet: veldefinerede AA-toppe takket være en højere følsomhed og på meget korte tidspunkter er opnået, hvilket også indebærer færre ressourcer, der forbruges. På trods af UPLC's effektivitet har kun Chen et al.20 anvendt denne teknik til at måle C-vitaminindholdet i salat, hvilket stadig førte til en undervurdering, da kun AA-formularen blev kvantificeret.
Sammenfattende repræsenterer dette arbejde det første vellykkede forsøg på at bestemme det samlede C-vitaminindhold ikke kun i forskellige salatsorter, men også i nogle af deres vilde slægtninge. C-vitamin kvantificering er også afgørende for at vælge salat med højere antioxidant aktivitet inden for avlsprogrammer. I denne forstand udvider det øgede samlede C-vitaminindhold i salat vilde slægtninge findes her, og den øgede AA indhold rapporteret i tidligereundersøgelser 14, samt andre antioxidantforbindelser 21, udvider de egnede kandidater til at forbedre næringsværdien af salat.
Afslutningsvis, selv med nogle begrænsninger iboende til C-vitamin karakter, ligesom dens gradvise nedbrydning få timer efter at være blevet udvundet eller behovet for en reduktion reaktion på grund af den lave DHAA UV-absorptivity, det giver en mindre arbejdskraft-intens og en mindre tidskrævende metode til at måle C-vitamin indhold. Derudover er det også meget robust og viser en høj følsomhed og magt opløsning. Desuden er det let at overføre ikke blot til andre plantematerialer med små eller ingen ændringer, men også til forarbejdede produkter, der leverer indtagelse af C-vitamin gennem kosten til mennesker, hvilket giver anledning til en lang række fremtidige anvendelser inden for det nye testområde for pålidelig fødevarekvalitet.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi anerkender taknemmeligt Vegetabilske Germplasm Bank of Zaragoza (BGHZ-CITA, Spanien) og Center for Genetiske Ressourcer (CNG, Wageningen, Holland) for at levere de frø, der er nødvendige for dette arbejde. Vi takker J. A. Aranjuelo, A. Castellanos og "laboratorio de valoración nutritiva" fra CITA for teknisk support og D. L. Goodchild for at have gennemgået det engelske sprog. Dette arbejde blev finansieret af projekterne RTA2017-00093-00-00 fra Det Nationale Institut for Forskning og Teknologi inden for Landbrug og Fødevarer (INIA) og LMP164_18 fra Aragóns regering; og ved det operationelle program FEDER Aragón 2014-2020 og Den Europæiske Socialfond fra Den Europæiske Union [Grupos Consolidados A12-17R: "Grupo de investigación en fruticultura: caracterización adaptación y mejora genéica" og A14-17R: "Sistemas agroganaderos alimentarios sostenibles" (SAGAS)]. I.M.L. blev støttet af en predoctoral kontrakt for uddannelse af læger fra det spanske ministerium for videnskab, innovation og universiteter (MCIU) og det spanske statslige forskningsagentur (AEI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) ≥98% (Ellman′s reagent) | Roche | 10197777001 | |
| 10 mm Φ stainless steel ball | Euro Aznar Supplies S.L. | 20112100 | |
| 15 mL polypropylene tube for centrifuge | Deltalab | 429946 | |
| 2 mL HPLC amber vial | Agilent | 5190-9063 | |
| 2 mL syringe with needle | Deltalab | JS2 | |
| 20 mL polypropylene tubes | Deltalab | 202840 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIS) ≥99.9% (titration) | Roche | 10708976001 | |
| 50 mL polypropylene tube | Deltalab | 429951 | |
| Acetic acid (CH3COOH) ≥99% purity glacial, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Acetonitrile, HPLC super gradient grade (99.9+% CH3CN-0.2 µm filtrated) | Chem-lab | CL00.0189 | |
| Acquity UPLC HSS T3 column (150 mm x 2.1 mm x 1.8 µm) | Waters | 186003540 | |
| Beaker 1 L, 200 mL | Deltalab | 191725, 191722 | |
| Dipotassium phosphate (KH2PO4) | Panreac | 766384 | Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2) |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium salt (EDTA x 2H2O) 99-101% assay, ACS reagent | Panreac | 131669 | |
| Fisherbrand Analog MultiTube Vortexer | Thermo Fisher Scientific | 15549004 | |
| Formic acid 98-100% for HPLC LiChropur | Supelco | 5438040100 | |
| Freeze dryer VirTis genesis 25EL | VirTis | na | |
| Heidolph Multi Reax mixer | Heidolph | na | |
| Heidolph Reax top mixer | Heidolph | na | |
| Hewlett Packard HPLC 1050 equipped with an eλ Detector | Hewlett Packard | na | Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2) |
| Hydrochloric acid (HCl) 37% purity, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 320331 | |
| L-Ascorbic acid ≥99%, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 255564 | |
| Meta-phosphoric acid (MPA) ACS reagent, chips, 33.5-36.5% | Sigma-Aldrich | 239275 | |
| Methanol ≥99.9% (HPLC supergradient grade) | ChemLab | CL00.0189.2500 | |
| Micropipettes 10-1000 μL | Socorex | na | |
| Nucleosil 120 C18 Tracer column (250 mm x 4 mm x 5 µm) | Merck (Sigma-Aldrich) | 54919 | Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2) |
| PTFE-silicone cap with preaperture | Agilent | 5190-9067 | |
| Refrigerated centrifuge Gyrozen 1248R | Gyrozen | na | |
| Regenerated cellulose filters 0.22 µm (13 mm) | Agilent | 1015190-5108 | |
| Regenerated cellulose filters 0.45-µm (13 mm) | Labbox | SFCA-145-100 | Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2) |
| Spectrophotometer Heλios β | Thermo Scientific Corporation | na | |
| Sulfuric acid (H2SO4) 95.0-98.0% purity, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Ultrapure water | WasserLab | na | |
| Ultrasons H-D | Selecta | na | |
| Volumetric flasks 1 L, 100 mL | DeltaLab | 191489, 191486 | |
| Waters Acquity UPLC H-Class equipped with a PDA eλ Detector | Waters | na |
References
- FAOSTAT. Statistics of the Food and Agriculture Organization of the United Nations. FAOSTAT. , Available from: http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC (2018).
- Llorach, R., Martínez-Sánchez, A., Tomás-Barberán, F. A., Gil, M. I., Ferreres, F. Characterisation of polyphenols and antioxidant properties of five lettuce varieties and escarole. Food Chemistry. 108 (3), 1028-1038 (2008).
- Carr, A. C., Frei, B. Toward a new recommended dietary allowance for vitamin C based on antioxidant and health effects in humans. American Journal of Clinical Nutrition. 69 (6), 1086-1107 (1999).
- Carr, A. C., Vissers, M. C. M. Synthetic or food-derived vitamin C-Are they equally bioavailable. Nutrients. 5 (11), 4284-4304 (2013).
- Lee, S. K., Kader, A. A. Preharvest and postharvest factors influencing vitamin C content of horticultural crops. Postharvest Biology and Technology. 20 (3), 207-220 (2000).
- Shekhovtsova, T. N., Muginova, S. V., Luchinina, J. A., Galimova, A. Z. Enzymatic methods in food analysis: determination of ascorbic acid. Analytica Chimica Acta. 573-574, 125-132 (2006).
- Zhan, L., et al. Light exposure during storage preserving soluble sugar and L-ascorbic acid content of minimally processed romaine lettuce (Lactuca sativa L.var. longifolia). Food Chemistry. 136 (1), 273-278 (2013).
- Malejane, D. N., Tinyani, P., Soundy, P., Sultanbawa, Y., Sivakumar, D. Deficit irrigation improves phenolic content and antioxidant activity in leafy lettuce varieties. Food Science and Nutrition. 6 (2), 334-341 (2017).
- Tarrago-Trani, M. T., Phillips, K. M., Cotty, M. Matrix-specific method validation for quantitative analysis of vitamin C in diverse foods. Journal of Food Composition and Analysis. 26 (1-2), 12-25 (2012).
- Klimczak, I., Gliszczyńska-Świgło, A. Comparison of UPLC and HPLC methods for determination of vitamin C. Food Chemistry. 175, 100-105 (2015).
- Złotek, U., Świeca, M., Jakubczyk, A. Effect of abiotic elicitation on main health-promoting compounds, antioxidant activity and commercial quality of butter lettuce (Lactuca sativa L.). Food Chemistry. 148, 253-260 (2014).
- Koh, E., Charoenprasert, S., Mitchell, A. E. Effect of organic and conventional cropping systems on ascorbic acid, vitamin C, flavonoids, nitrate, and oxalate in 27 varieties of spinach (Spinacia oleracea L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (12), 3144-3150 (2012).
- Kałuzewicz, A., et al. The influence of short-term storage on the content of flavonoids and vitamin C in Broccoli. European Journal of Horticultural Science. 77 (3), 137-143 (2012).
- van Treuren, R., van Eekelen, H. D. L. M., Wehrens, R., de Vos, R. C. H. Metabolite variation in the lettuce gene pool: towards healthier crop varieties and food. Metabolomics. 14 (11), 1-14 (2018).
- Swartz, M. E. UPLC: An introduction and review. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 28 (7), 1253-1263 (2005).
- Spínola, V., Mendes, B., Câmara, J. S., Castilho, P. C. An improved and fast UHPLC-PDA methodology for determination of L-ascorbic and dehydroascorbic acids in fruits and vegetables. Evaluation of degradation rate during storage. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (4), 1049-1058 (2012).
- Ball, G. F. M. Water-soluble vitamin assays in human nutrition. , Springer. Boston, MA. (1994).
- Bertolín, J. R., et al. Simultaneous determination of carotenoids, tocopherols, retinol and cholesterol in ovine lyophilised samples of milk, meat, and liver and in unprocessed/raw samples of fat. Food Chemistry. 257, 182-188 (2018).
- Spínola, V., Llorent-Martínez, E. J., Castilho, P. C. Determination of vitamin C in foods: Current state of method validation. Journal of Chromatography A. 1369, 2-17 (2014).
- Chen, Y., et al. radiation is beneficial for yield and quality of indoor cultivated lettuce. Frontiers in Plant Science. 10, 1-10 (2019).
- Damerum, A., et al. Elucidating the genetic basis of antioxidant status in lettuce (Lactuca sativa). Horticulture Research. 2 (15055), 1-13 (2015).
