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Biology

Visualizzazione dell'interazione delle proteine di riparazione del DNA per immunofluorescenza

doi: 10.3791/61447 Published: June 26, 2020

Summary

In seguito al danno al DNA, le cellule umane attivano percorsi di riparazione essenziali per ripristinare l'integrità del loro genoma. Qui, descriviamo il metodo dell'immunofluorescenza indiretta come mezzo per rilevare le proteine di riparazione del DNA, analizzare il loro reclutamento spaziale e temporale e contribuire a interrogare l'interazione proteina-proteina nei siti di danno al DNA.

Abstract

Le cellule dei mammiferi sono costantemente esposte a sostanze chimiche, radiazioni e sotto-prodotti metabolici naturali, che creano tipi specifici di insulti al DNA. Gli agenti genotossici possono danneggiare la spina dorsale del DNA, romperla o modificare la natura chimica delle singole basi. In seguito all'insulto al DNA, vengono attivati percorsi di risposta al danno del DNA (DDR) e vengono reclutate proteine coinvolte nella riparazione. Una pletora di fattori sono coinvolti nel rilevamento del tipo di danno e nell'attivazione della risposta di riparazione appropriata. La mancata attivazione e reclutamento dei fattori DDR può portare all'instabilità genomica, che sta alla base di molte patologie umane, tra cui il cancro. Studi sulle proteine DDR possono fornire informazioni sulla risposta ai farmaci genotossici e sui meccanismi cellulari della resistenza ai farmaci.

Ci sono due modi principali per visualizzare le proteine in vivo:l'osservazione diretta, etichettando la proteina di interesse con una proteina fluorescente e seguendola mediante imaging dal vivo, o immunofluorescenza indiretta su campioni fissi. Mentre la visualizzazione delle proteine con tag fluorescenti consente un monitoraggio preciso nel tempo, l'etichettatura diretta in N- o C-terminus può interferire con la localizzazione o la funzione delle proteine. L'osservazione delle proteine nella loro versione non modificata ed endogena è preferita. Quando le proteine di riparazione del DNA vengono reclutate nell'insulto del DNA, la loro concentrazione aumenta localmente e formano gruppi, o "foci", che possono essere visualizzati dall'immunofluorescenza indiretta utilizzando anticorpi specifici.

Anche se il rilevamento di proteine foci non fornisce una prova definitiva di interazione diretta, la co-localizzazione delle proteine nelle cellule indica che si raggruppano al sito del danno e possono informare della sequenza degli eventi necessari per la formazione complessa. Un'attenta analisi della sovrapposizione spaziale dei foci nelle cellule che esprimono versioni di tipo selvaggio o mutante di una proteina può fornire preziosi indizi su domini funzionali importanti per la funzione di riparazione del DNA. Infine, la co-localizzazione delle proteine indica possibili interazioni dirette che possono essere verificate dalla co-immunoprecipizione nelle cellule o dal pulldown diretto utilizzando proteine purificate.

Introduction

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Le cellule umane sono costantemente esposte a una varietà di agenti dannosi per il DNA di varie origini. Le fonti esogene sono per lo più costituite da esposizione a radiazioni, sostanze chimiche (compresi agenti chemioterapici e alcuni antibiotici), e virus, mentre le principali fonti endogene includono errori nella replicazione del DNA e nello stress ossidativo. Gli effetti diretti dell'esposizione genotossica possono variare da una base modificata a una rottura del doppio filamento del DNA potenzialmente letale (DSB), a seconda dello stress e della dose di esposizione. In definitiva, danni al DNA non riparati o riparati in modo improprio possono portare all'accumulo di mutazioni, riarrangiamenti genomici, instabilità del genoma e alla fine portare alla carcinogenesi1. Le cellule dei mammiferi hanno sviluppato percorsi complessi per riconoscere specifici tipi di danni al DNA2,3 e ripararli in modo tempestivo, sincronizzati con la progressione del ciclo cellulare.

Le radiazioni ionizzanti (IR) danneggiano la doppia elica del DNA e creano rotture a doppio filamento (DSB), una delle forme più deleteri di danno al DNA. Il complesso MRN (MRE11, RAD50, NBS1) funziona come un sensore di DNA termina e attiva la proteina chinasi ataxia telangiectasia mutato (ATM)4,5. Dopo l'attivazione iniziale di ATM da fini dna, ATM innesca una cascata di eventi DDR sul sito della rottura, avviando con un evento chiave, la fosforilazione della variante istone H2AX6. La fosforilazione H2AX sui residui S139 la attiva in γH2AX, che si estende su regioni fino a megabase intorno alla lesione del DNA6,7,8,9. Questo evento aumenta l'accessibilità del DNA, portando al reclutamento e all'accumulo di altre proteine di riparazione del DNA7. Poiché γH2AX è abbondantemente e specificamente indotto DSBs circostanti, può essere facilmente visualizzata utilizzando anticorpi specifici, ed è comunemente usato come marcatore surrogato per DSB nel campo di riparazione del DNA. Una volta segnalata la rottura, le cellule attivano le loro vie di riparazione del DNA ed elaborano il danno al DNA. La proteina MDC1 (mediatore della proteina checkpoint del danno al DNA 1) lega direttamente γH2AX10,interagisce con ATM11 e anche con NBS112,,13. Contribuisce ad aumentare la concentrazione del complesso MRN presso il DSB e ad avviare un ciclo di feedback ATM positivo. γH2AX viene rapidamente rimosso una volta riparata la rottura, consentendo di conseguenza il monitoraggio dell'autorizzazione DSB. Seguita dalla microscopia, la diminuzione della γH2AX nel tempo fornisce una misurazione indiretta delle rotture residue e dell'efficienza di riparazione del DNA.

Le cellule eucariotiche possono riparare i DSB da diversi percorsi, mentre le due principali sono l'unione finale non omologa (NHEJ) e la ricombinazione omologa (HR) (Figura 1). NHEJ lega essenzialmente il DNA a doppio filamento termina senza l'uso di omologia estesa e opera per tutto il ciclocellulare 14,15. HR diventa predominante durante le fasi S e G2, ed è altrimenti represso, dal momento che richiede una sorella cromata come modello omologa per lariparazione 14,16. La scelta del percorso tra NHEJ e HR dipende non solo dalla vicinanza fisica della sorella cromatica, ma anche dall'estensione della resezione finale del DNA17, che inibisce NHEJ.

La riparazione DSB dipendente dall'omologia inizia con la degradazione nucleolitica del filamento 5' dalle estremità di rottura per generare code di DNA a 3' filamento singolo (ssDNA), un processo denominato resezione 5'-3'. Il complesso MRN avvia la resezione finale del DNA e l'ulteriore resezione viene elaborata in combinazione con BLM/EXO1 (Proteina sindrome di Bloom/esonucleasi 1) o BLM/DNA2 (replicazione del DNA Elicase/nucleasi dipendente da ATP)18,19,20,21,22. La resezione finale del DNA è potenziata dal CtIP (proteina che interagisce con il CtBP) attraverso la sua interazione diretta con il complesso MRN23 e il reclutamento di BRCA1 (proteina di suscettibilità al tipo 1 del cancro al seno)24,25. La proteina di replica A (RPA) si lega prontamente alla ssDNA esposta e viene quindi spostata dalla proteina ricombinata RAD51 per formare un filamento nucleoproteina che catalizza la ricerca omologa e l'invasionedel filamento 26,27,28.

L'avvio della resezione è un passo critico per la scelta del percorso di riparazione. Una volta avviata la resezione, le estremità del DNA diventano substrati poveri per la legazione da parte dell'eterodimero Ku70/Ku80 (componente del percorso NHEJ) e le cellule sono impegnate in HR17,29,30. L'eterodimero Ku70/Ku80 si lega alle estremità DSB, reclutando DNA-PKcs e p53 Binding Protein 1 (53BP1)29,30. 53BP1 agisce come una barriera alla resezione in G1, bloccando così le risorse umane durante la promozione di NHEJ31,32, ma viene rimosso in modo dipendente da BRCA1 nella fase S, consentendo di conseguenza la resezione33,34. Pertanto, 53BP1 e BRCA1 svolgono ruoli opposti nella riparazione DSB, con 53BP1 essendo un facilitatore NHEJ mentre BRCA1 agisce consentendo interruzioni per la riparazione attraverso HR.

In laboratorio, la formazione di DSB può essere indotta da radiazioni ionizzanti (IR). Mentre questo esempio utilizza una dose elevata di 4 Gy, 1 Gy e 2 Gy anche creare una quantità significativa di DSB, adatto per l'analisi della formazione di foci da proteine abbondanti. È importante notare che il tipo e la dose di radiazioni utilizzate possono portare a diverse lesioni nel DNA e nella cellula: mentre l'IR induce ISB, può anche causare rotture di singoli filamenti o modificazione della base (vedi35,36 per un riferimento sul trasferimento di energia lineare di irradiazione (LET) e sul tipo di danno al DNA). Per determinare la cinetica della formazione di foci ionizzanti indotta da radiazioni (IRIF) e la loro distanza, che indicano la riparazione del danno e l'inversione del DDRattivato 8,9,37,38, la formazione di foci può essere monitorata in diversi punti di tempo dopo la radiazione ionizzante. La tempistica di attivazione e di sgombero di tutte le principali proteine danno del DNAè nota 39, e molti sono studiati come marcatori surrogati di eventi chiave. Ad esempio, pRPA, che possiede un'elevata affinità per ssDNA viene utilizzato come surrogato della resezione di rottura, le proteine MRN (MRE11, RAD50, NBS1) e le esonucleasi possono essere utilizzate anche per valutare l'efficienza della resezione. Mentre RAD51, BRCA1, BRCA2 (proteina di suscettibilità al cancro al seno 2) e PALB2 (partner e localizzatore di BRCA2) possono essere monitorati per valutare l'efficienza delle risorse umane, la presenza delle proteine Ku o 53BP1, vengono utilizzati come marcatori di NHEJ(Figura 1).

Poiché le proteine del macchinario per la riparazione del DNA si reclutano a vicenda per la rottura e l'assemblaggio in super-complessi, le interazioni DNA-proteina e proteina-proteina possono essere dedotte seguendo la loro localizzazione individuale nel tempo e analizzando la co-localizzazione delle proteine, come viene visualizzazioneto da segnali sovrapposti nella cella40,41,42. Nelle linee cellulari, l'introduzione di mutazioni puntino o la cancellazione in specifici geni di riparazione del DNA sia attraverso l'editing del genoma, sia per sovraespressione di mutanti a base di plasmidi, consente di eseguire lo studio di residui specifici e del loro possibile ruolo nel riconoscimento del danno al DNA (ad esempio, la co-localizzazione con γH2AX) o di un assemblaggio complesso (co-localizzazione con un'altra o più proteine), nonché il loro impatto sulla riparazione del DNA. Qui, usiamo l'immunofluorescenza indiretta come mezzo per studiare la formazione e la risoluzione dei DSB seguendo γH2AX foci nel tempo. Presentiamo anche un esempio di formazione di foci e analisi di co-localizzazione da parte di un attore importante nella riparazione DSB: p53 Binding Protein 1 (53BP1)32. Come accennato in precedenza, 53BP1 è considerato centrale per la scelta del percorso di riparazione del DNA. Dopo l'accumulo di 53BP1 e la sua co-localizzazione con γH2AX fornisce preziose informazioni sulla fase del ciclo cellulare, l'accumulo di danni al DNA e il percorso utilizzato per riparare i DSB. Lo scopo dell'immunolocalizzazione indiretta è quello di valutare l'efficienza della riparazione dei danni al DNA nelle linee cellulari, seguendo IR come in questo studio, o dopo l'esposizione a varie sollecitazioni nelle cellule, dal collegamento incrociato del DNA al blocco della forchetta di replica (un elenco di agenti dannosi per il DNA è fornito nella tabella 1).

Figure 1
Figura 1: Vie di riparazione del doppio filamento del DNA (DSB).
La riparazione DSB prevede due percorsi principali: la ricombinazione omologa (HR, a sinistra) e l'end-joining non omologho (NHEJ, a destra). Dopo la pausa, le proteine si attivano per contrassegnare la rottura (γH2AX), partecipare alla resezione finale (MRN), rivestire la ssDNA resected (pRPA), promuovere la ricombinazione (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) o limitare la resezione e promuovere NHEJ (53BP1). Altre proteine partecipano alla riparazione dei danni, ma le proteine elencate sono regolarmente seguite dall'immunofluorescenza indiretta. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Agente dannoso del DNA Meccanismo d'azione Dose raccomandata
γ/raggi X Radiazione
Formazione di rotture a doppio filamento con alcuni effetti cellulari incontrollati
1-4 Gy
Il numero 36 del 36 Ar ioni Radiazione
Formazione di rotture a doppio filamento
270 keV/m
particelle z Radiazione
Formazione di rotture a doppio filamento
116 keV/m
Bleomicina Inibitore della sintesi del DNA 0,4-2 g/mL
Camptothecin Inibitore della topoisomerasi I 10-200 nM
Cisplatino Agente di Alkylating
(inducendo collegamenti incrociati intrastranti)
0,25-2 M
Doxorubicina Agente intercalante
Inibitore della topoisomera II
10-200 nM
Etoposide Inibitore della topoisomera II 10 SM
Hydroxyurea Inibitore della sintesi del DNA
(per ribonucleotide reductase)
10-200 M
Metano metilesulfonato Agente di Alkylating 0,25-2 mM
Mitomicina C Agente di Alkylating 0,25-2 M
Luce ultravioletta (UV) Formazione di dimeri di timodina
(generando distorsione della catena del DNA)
50-100 mJ/cm2

Tabella 1: agenti genotossici. Esempi di agenti dannosi per il DNA, il loro meccanismo d'azione e il danno indotto sulla base della concentrazione di lavoro suggerita.

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Protocol

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1. Coltura cellulare HeLa

  1. Il vetro rotondo pre-trattamento copre le coperture con 1 M HCl a 50 gradi centigradi per 16-18 ore. Risciacquare con ddH2O e conservare al 100% EtOH.
  2. Preparare il supporto di coltura cellulare: aggiungere il 10% (v/v) FBS al supporto DMEM.
  3. Crescere 4,0 x 104 celle/bene in una piastra sterile a 12 possidetti con un coperture rotonde da 18 mm a 37 gradi centigradi e 5% di CO2 in un'incubatrice umida. Coltivare le cellule fino all'80% di confluenza (circa 24 ore).

2. Trattamento cellulare con radiazioni (IR)

  1. Per indurre la formazione di rotture a doppio filamento, esporre le cellule a 4 Gy γ-irradiazione (controllo: Nessuna irradiazione, t-0). Nella cella gamma -40, questo corrisponde a 4,54 min, a 0,815 Gy al minuto.
  2. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi e al 5% di CO2 in un'incubatrice umidificata per la durata appropriata (punti di tempo scelti qui t, 2, 4, 16 h).

3. Estrazione nucleare e fissazione cellulare

  1. Preparare le soluzioni stock: 0,2 M PIPES (pH 6.8), 5 M NaCl, 2 M saccarosio, 1 M MgCl2, 0,1 M EGTA (pH 8.0).
  2. Preparare il buffer di estrazione nucleare (NEB): sciogliere 10 mM PIPES (pH 6.8), 100 mM NaCl, 300 mM sacrose, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA (pH 8.0) e 0.5% (v/v) Triton X-100 in ddH2O. Mix fino a quando non si dissoled completamente.
  3. Preparare la paraformaldeide (PFA) del 4% (v/v): sciogliere 10 mL della soluzione aques PFA del 16% in 30 mL PBS. Mescolare fino a quando non si dissolva completamente.
  4. Al momento opportuno (t- 0, 1, 2, 4, 16 h), lavare le celle due volte con 1 mL di PBS. Rimuovere completamente PBS.
  5. Aggiungere 200 L di NEB ad ogni pozzo per l'estrazione dei nuclei cellulari (il citoplasma è degradato, rimane solo il nucleo) (Figura 2). Incubare per 2 minuti a temperatura ambiente e rimuovere completamente.
    NOTA: non superare i 2 minuti.

Figure 2
Figura 2: Estrazione nucleare.
Immagini rappresentative delle cellule prima dell'estrazione nucleare (a sinistra) e post (a destra). Il citoplasma deve essere digerito, ma la struttura nucleare dovrebbe rimanere intatta dopo l'estrazione (a destra). (A) ingrandimento 20x; barra della scala : 20 m e (B) 40x ingrandimento; barra della scala : 10 m. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Lavare le celle con 1 mL di PBS. Rimuovere completamente PBS. Aggiungere PBS con attenzione, le cellule sono molto fragili in questo passaggio.
  2. Aggiungere 200 L del 4% (v/v) PFA ad ogni pozzo per la fissazione delle cellule. Incubare per 10 minuti a 4 gradi centigradi. Rimuovere completamente PFA.
  3. Aggiungere 1 mL di PBS.
    NOTA: le celle possono essere conservate in PBS a 4 gradi centigradi.

4. Colorazione immunofluorescenza

  1. Preparare la soluzione di blocco: sciogliere il 5% BSA (w/v) in PBS e aggiungere lo 0,3% (v/v) Triton X-100. Mescolare fino a quando completamente sciolto.
  2. Preparare il buffer di diluizione: sciogliere 1% BSA (w/v) in PBS e aggiungere 0,3% (v/v) Triton X-100. Mescolare fino a quando completamente sciolto.
  3. Per il blocco, aggiungere 200 L di soluzione di blocco a ciascun pozzo. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente o 16-18 ore a 4 gradi centigradi.
    NOTA: Se verrà utilizzato un anticorpo di capra, aggiungere il 5% di siero di capra alla soluzione di blocco.
  4. Diluire l'anticorpo primario nel buffer di diluizione (1:500; vedere la tabella 2 per la lista degli anticorpi) e il vortice fino a quando non è ben miscelato.
    NOTA: Se si usa l'anticorpo di capra, aggiungere l'1% di siero di capra al tampone di diluizione.
  5. In una scatola di umidità / incubazione, aderire un pezzo di parafilm. Aggiungere 10 L di anticorpi primari (in una singola goccia). Allineare un bordo del coperture con la goccia e abbassare lentamente sul parafilm, affinché il liquido si diffonda in tutto (evitare le bolle se possibile). Incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
  6. Lavare le coperture tre volte in PBS per 1 minuto.
  7. Diluire l'anticorpo secondario nel buffer di diluizione (concentrazione finale: 2 g/mL) e nel vortice fino a quando non è ben miscelato.
  8. Applicare 10 L di anticorpi secondari come descritto per gli anticorpi primari. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
    NOTA: Proteggere dalla luce.
Anticorpo Azienda Riferimento fonte
53BP1 Segnalazione cellulare 4937 Coniglio
Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) Abcam ab150103 Asino
Antifosfo-Histone H2A. X (Ser139), clone JBW301 Millipore 05-636 Mouse
Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam ab150081 Capra

Tabella 2: Anticorpi utilizzati. Elenco degli anticorpi utilizzati in questo studio.

  1. Lavare le coperture tre volte in PBS per 1 minuto.
  2. Lavare i coperture con H2O per 1 minuto.
  3. Controteni il DNA con DAPI: applicare 10 L di 300 nM DAPI (come descritto per gli anticorpi), incubare per 30 minuti a temperatura ambiente e quindi montare su vetrino con un supporto di montaggio a base di glicerolo. In alternativa, aggiungere una goccia (10 L) di supporti di montaggio antifadi commerciali contenenti DAPI su una diapositiva e applicare un coverslip. Premere delicatamente il coverslip e rimuovere il liquido in eccesso intorno ad esso con un tovagliolo di carta.
  4. Sigillare i coperture con smalto trasparente e lasciarli asciugare per 20 minuti.
  5. Conservare le diapositive a 4 gradi centigradi.

5. Acquisizione di immagini

  1. Posizionare una goccia di olio di immersione sulla lente obiettivo 60x. Utilizzare DAPI per individuare i nuclei attraverso il pezzo oculari.
    1. Per l'acquisizione di immagini XY, aprire il software di acquisizione e selezionare i parametri: Tipo di scanner: Galvano; Modalità scanner: Andata e ora; Dimensioni dell'immagine: 512-512; Modalità PMT: VBF; Media PMT: telaio (4 volte); Scansione sequenziale PMT: linea.
    2. Selezionare il colorante e i rilevatori:
      Canale (CH1), Colorare (DAPI), Rilevatore (SD1)
      Canale (CH2), Dye (Alexa Fluor 488), Rilevatore (HSD3)
      Canale (CH3), Dye (Alexa Fluor 647), Rilevatore (HSD4)
    3. Selezionare ON in "z".
  2. Regolare l'immagine dal vivo. Premere il pulsante Live nella finestra Live.
    1. Regolare la messa a fuoco e impostare l'intensità laser (%), la sensibilità (HV), il guadagno e l'offset sulla finestra degli strumenti "PMT".
      1. Regolare l'intensità del laser (%): per la luminosità e lo sbiancamento. Più alta è l'intensità del laser, più forte è il segnale, ma il campione fotoseguita'.
      2. Regolare la sensibilità (HV): livello di rumore. Più alto è l'HV, più forte è il segnale, ma l'immagine sarà rumorosa se troppo alta.
        NOTA: mantenere sempre costante la tensione.
      3. Regolare l'offset: livello di sfondo.
    2. Selezionate Inizio/Fine (15 sezioni) per Pile .
  3. Avviare l'acquisizione.
    1. Selezionare la cartella in cui salvare le immagini. Premere il pulsante Start di LSM per avviare l'acquisizione dell'immagine. Premere il pulsante Fine serie per completare l'acquisizione dell'immagine.

6. Analisi dei dati

  1. Per l'analisi delle immagini, aprire il software di analisi.
    1. Premere la finestra degli strumenti Batch, selezionare le immagini da analizzare e selezionare la cartella di output.
    2. Premere la finestra degli strumenti Analisi e selezionare Proiezione (verrà visualizzata la proiezione di intensità massima da 15 sezioni).
    3. In Impostazione di input/outputselezionare il batch creato.
    4. Premere Processo per l'elaborazione delle immagini.
    5. Esportare le immagini come file .tiff.
  2. Per la quantificazione di foci nucleare, aprire CellProfiler.
    1. Aprire la γH2AX e la pipeline di quantificazione dei criteri di vendita (vedere Informazioni aggiuntive).
    2. Grafico dei dati utilizzando un software di tabella.
  3. Per l'analisi della co-localizzazione, aprire CellProfiler.
    1. Aprire la pipeline di colocalizzazione (vedere Informazioni aggiuntive). Un file di foglio di calcolo verrà creato e salvato nella posizione preferita. Tuttavia, i grafici stessi non verranno salvati automaticamente. Si suggerisce di scattare un'istantanea delle finestre da tenere per la registrazione dei risultati.
    2. Grafico dei dati utilizzando un software di tabella.

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Representative Results

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Il giorno 2, o 24 h dopo le cellule di semina su coverslips, le cellule hanno subito una divisione e sono 80% confluente. Specifici abbattimenti o mutazioni nelle proteine di riparazione del DNA possono aumentare il tempo di raddoppio, o sensibilizzare le cellule al trattamento genotossico, e la densità di semina e le dosi di trattamento devono essere regolate di conseguenza. Per determinare le migliori condizioni di lavoro, la tempistica della risposta al danno del DNA può essere stabilita dal gonfiore occidentale di γH2AX nel tempo, e la sensibilità all'irradiazione può essere identificata da un'analisi formante della colonia.

Le cellule non trattate con irradiazione presentano poco, se non γH2AX foci (Figura 3A). Tuttavia, la formazione di γH2AX foci può essere innescata nelle cellule coltivate da vari stress inerenti alle condizioni di crescita: cellule lasciate confluenti nei media acidificati, presenza di endotossina genotossica nell'FBS, concentrazione di ossigeno utilizzata per la coltura, per citane alcune.

Figure 3
Figura 3: Foci nucleari senza stress.
In assenza di fattori di stress esterni, si osservano pochissimi γH2AX o meno (A). In assenza di proteine essenziali per la riparazione del DNA, l'accumulo γH2AX può essere osservato come rotture che si verificano a causa di fonti endogene non vengono riparate (B). L'accumulo di interruzioni non riparate può portare le cellule a diventare pre-apoptotico, che è contrassegnato da una colorazione "solida" γH2AX nuclei (C). Barra della scala di 5 m. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Inoltre, nelle cellule esaurite per le proteine chiave del danno del DNA, come le cellule mutanti BRCA1 o BRCA2, le rotture di DNA che si verificano a seguito di sollecitazioni endogene non vengono riparate come nelle cellule di tipo selvatico e si accumulano. Di conseguenza, è possibile γH2AX elevati nelle cellule carenti di HR, anche in condizioni di crescita normali (Figura 3B). Una sottofioculazione di cellule può presentare una colorazione nucleare "solida" con γH2AX (Figura 3C). La macchia pan-nucleare può indicare che una cellula è sopraffatta da danni irreparabili e/o è pre-apoptotica. Tali cellule sono tipicamente caratterizzate da nuclei allargati e dalla presenza di vacuole citoplasmiche. Inoltre, γH2AX possono essere attivate da stress replicativo in fase S e forche di replica in stallo, o da arresto G2/M. Se necessario, le fasi del ciclo cellulare possono essere identificate colorando il contenuto di DNA o co-colorando con marcatori specifici. Quando si esegue l'analisi della riparazione dei danni al DNA, la pan-nucleare può essere quantificata indipendentemente dai foci individualizzati.

Dopo l'irradiazione, i nuclei presentano un gran numero di rotture del doppio filamento a cui γH2AX si localizza molto rapidamente (Figura 4). In condizioni ottimali, in assenza di γH2AX si osservano pochi o γH2AX foci. Dopo l'irradiazione, la formazione γH2AX foci aumenta bruscamente. Se le rotture vengono elaborate e riparate, il numero di foci per nuclei è diminuito, così come il numero di cellule positive per i foci. L'intensità e il numero di foci variano a seconda della linea cellulare utilizzata e della dose di irradiazione somministrata. Nelle cellule HeLa a basso passaggio, coltivate in siero privo di endotossina, abbiamo osservato regolarmente un forte aumento di foci a 30 minuti e 1 h dopo l'irradiazione, che raggiunge un picco tra 1 e 2 h, quindi diminuisce progressivamente fino a 16 h. Per questo motivo, i punti di tempo rappresentativi di 0, 1, 2, 4 e 16 h dopo l'irradiazione sono presentati qui. Il comportamento della segnalazione, della riparazione e della sopravvivenza all'irradiazione di rottura può variare notevolmente tra le linee cellulari, nonché in caso di esaurimento o mutazione dei geni. Per questo motivo, i punti di tempo più appropriati saranno gli esperimenti e le celle. Nell'esperimento, a 16 h γH2AX foci residui hanno raggiunto lo stesso livello basale rispetto alle cellule non irradiate. Se si lavora con linee cellulari di divisione lenta, si suggerisce di monitorare i foci residui per includere i punti di tempo successivi.

Figure 4
Figura 4: Foci nucleari e quantificazione a seguito di stress (tempo-corso).
γH2AX formazione di foci a t-0 (senza irradiazione) e ai punti di tempo indicati dopo l'irradiazione (4 Gy, t, 1, 2, 4, 16 h). (A) Vengono visualizzate le immagini del rappresentante. DAPI indica i nuclei. Barra della scala di 5 m. (B) I foci nucleari di γH2AX a seguito dell'esposizione all'irradiazione γ sono stati segnati dalla quantificazione automatizzata (CellProfiler) in 100 nuclei per ogni punto di tempo. A seconda della questione biologica sollevata e del tipo di dati acquisiti, sono disponibili diverse opzioni per presentare i dati grezzi, al fine di facilitare il confronto e la comprensione critica. (i) Il grafico delle nuvole mostra la media : il simbolo SD indica la significatività statistica rispetto al controllo, utilizzando il test t a due code di Student: la curva di induzione (ii) di SD indica la media seM, (iii) più di 10 foci per nucleo. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Al contrario, nelle cellule carenti per le funzioni di riparazione dei danni al DNA, i foci di γH2AX si accumulano in assenza di irradiazione (t-0 h) e la riparazione può essere ritardata, o assente anche in punti a lungo termine (t-16 h, t-24 h) dopo l'irradiazione. Il confronto diretto tra il tipo selvaggio e le cellule mutanti può fornire preziose informazioni sulla funzione di riparazione del DNA del gene mutato e suggerire il tipo di riparazione. Mentre una carenza in NHEJ può forzare la rottura per essere riparato da HR in fase S, DSB che sono stati resected e devono essere riparati da HR non sarà riparato da NHEJ. Per questo motivo, l'accumulo di danni dopo la fase S potrebbe indicare una carenza di HR, e alti γH2AX di livello post divisione suggeriscono difetti NHEJ.

Quando più proteine sono studiate nelle stesse cellule, la co-localizzazione può essere studiata mediante l'avamazione di anticorpi primari allevati in diverse specie animali e rivelandoli con anticorpi secondari etichettati con fluorofori distinti (Figura 5). La co-localizzazione indica se le proteine (i) vengono reclutate per la rottura (ii) sono reclutate in modo tempestivo, (iii) assemblano in complessi di riparazione del DNA. Quando si cerca la co-localizzazione, un metodo qualitativo comunemente accettato è quello di presentare i risultati come una semplice sovrapposizione dei diversi canali (ad esempio, verde e rosso). La sovrapposizione di verde e rosso darà origine a punti caldi gialli, dove le due proteine di interesse sono presenti negli stessi pixel (Figura 5A). Tuttavia, questo metodo ha limitazioni, poiché dipende dall'intensità del segnale relativa raccolta in entrambi i canali e le due fluorecromi possono avere differenze nella potenza del segnale. Pertanto, i metodi di sovrapposizione consentono di generare una stima visiva degli eventi di co-localizzazione, ma non sono appropriati per scopi quantitativi. L'analisi quantitativa della co-localizzazione può essere ottenuta da un approccio basato su oggetti (Figura5B (i-iii) o da un approccio statistico che esegue analisi basate sul coefficiente di correlazione di intensità (ICCB)(Figura 5B (iv)). Sono disponibili diversi strumenti per l'analisi della co-localizzazione, tra cui JACoP (Just Another Co-localization Plugin; https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/jacop.html) e la pipeline "Colocalization" (CellProfiler) utilizzata qui, che può essere utilizzata come strumento ICCB, al fine di valutare la relazione tra intensità di fluorescenza. Ciò viene fatto principalmente calcolando il coefficiente di correlazione (coefficiente di Pearson) che misura la forza della relazione lineare tra due variabili. La co-localizzazione della fluorescenza può essere rappresentata graficamente in grafici a dispersione, dove l'intensità di un fluorochromo (verde) viene tracciata rispetto all'intensità del secondo fluorochromo (rosso) per ogni pixel. La co-localizzazione completa si traduce in punti raggruppati intorno a una linea retta, la cui pendenza riflette il rapporto della fluorescenza dei due colori. Al contrario, la mancanza di co-localizzazione comporta la distribuzione dei punti in due gruppi separati (distribuiti lungo gli assi), ognuno dei quali mostra livelli di segnale variabili di un colore con poco o nessun segnale dall'altro colore. Il valore del coefficiente di Pearson varia da 1 a -1, con 1 in piedi per la correlazione positiva completa, -1 per una correlazione negativa e zero che indica nessuna correlazione. In alternativa, è possibile utilizzare il metodo Pclc. Questo metodo è stato applicato in una varietà di radiazioni (vedi36 per i dettagli e il metodo liberamente disponibile).

Figure 5
Figura 5: Analisi della co-localizzazione.
Utilizzando diversi anticorpi allevati contro diverse specie (qui, γH2AX anti-topo (rosso) e anti-coniglio 53BP1 (verde),diverse proteine possono essere studiate. (A) Vengono visualizzate le immagini del rappresentante. DAPI indica i nuclei. La co-localizzazione è visualizzata per colore e sovrapposizione dell'area (qui rosso - verde e giallo). Barra della scala di 5 m. (B) I foci individuali e di co-localizzazione possono essere quantificati singolarmente utilizzando uno dei diversi software (qui CellProfiler, vedi altre opzioni nel testo principale) e tracciati. (i-iii) Approccio basato su oggetti utilizzato per determinare i risultati di correlazione della co-localizzazione (iv) ottenuti per la co-localizzazione, utilizzando un approccio basato su pixel (analisi ICCB). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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L'analisi dei tempi e dell'efficienza della riparazione dei danni al DNA tramite microscopia si è dimostrata essenziale per capire come funziona il macchinario per la riparazione del DNA, nelle cellule normali e nelle patologie umane come il cancro.

Lo sviluppo di anticorpi specifici che consentono il rilevamento di proteine attivate nella loro versione fosforicolata (come γH2AX, pRPA, pRAD50 e altri10,,23,39,43) ha svolto un ruolo centrale nell'ottenere una migliore comprensione della tempistica di riparazione del DNA degli eventi e della sua sincronizzazione con il ciclo cellulare. Questo successo è esemplificato dall'analisi dei residui fosforilati 53BP1, da spettrometria di massa e immunolocalizzazione(vedi 32 per la revisione), che ha contribuito a comprendere la funzione di questa proteina fortemente modificata. Con l'ascesa della tecnica microscopica ad alta risoluzione come STORM e l'aumento dell'uso di piccoli anticorpi (nanocorpi) l'interazione diretta delle proteine nelle cellule sta diventando più accessibile e accurata. Tuttavia, l'immunofluorescenza indiretta descritta qui rimane un esperimento essenziale da eseguire quando si studia una nuova proteina potenziale di riparazione del DNA e si cercano tempi di azione e partner proteici.

Il successo dell'immunofluorescenza indiretta si basa interamente su due criteri: (i) la qualità dei reagenti, in particolare gli anticorpi utilizzati per rilevare i residui di fosfo sulle proteine di riparazione del DNA attivate e (ii) la tempistica dell'esperimento. L'uso di protocolli e anticorpi pubblicati dovrebbe essere incoraggiato quando disponibile. Quando si utilizza un nuovo anticorpo o si studia una nuova proteina, l'anticorpo deve essere convalidato e la specificità deve essere stabilita abbattendo la proteina bersaglio nelle cellule (il segnale dovrebbe essere perso) o l'esaurimento delle proteine (uso di proteine purificate per esaurire anticorpi specifici prima dell'incubazione, come eseguito nel44 per RAD51AP1).

Le condizioni di blocco ottimali e la diluizione degli anticorpi devono essere stabilite per ridurre al minimo gli artefatti e la colorazione non specifica. I tamponi saranno preparati freschi e, se viene eseguita l'estrazione nucleare, devono essere programmati per evitare nuclei dannosi. Nello studiare l'efficienza di riparazione nelle cellule umane, dovrebbe essere eseguita la quantificazione dei foci nucleari e l'estrazione nucleare può aiutare ad escludere le proteine citoplasmiche. Tuttavia, può essere utile non eseguire la fase di estrazione nucleare, ad esempio per studiare se una proteina mutante sospettata di non interagire con il suo partner cellulare non riesce a traslocare al nucleo in caso di danno al DNA.

Inoltre, la qualità dell'imaging è di fondamentale importanza per garantire che i dati possano essere correttamente acquisiti, analizzati e accurati. I parametri per il controllo sono molti e includono: specificità degli anticorpi primari, spettro di eccitazione dei fluorofori scelti (anticorpi secondari), protezione dei campioni contro la fotobleaching, scelta del supporto per le cellule di semina, buon campionamento (minimo da 30 a 300 nuclei, a seconda della domanda), e in alcuni casi post-trattamento come la decontidifica o la spettrale di non miscelazione. Quando possibile, viene suggerita l'imaging automatico di un coperture completo, che consente di immagini di migliaia di cellule. Il coinvolgimento di specialisti di imaging come una struttura di base prima di impostare l'esperimento dovrebbe essere considerato in quanto migliorerà notevolmente la qualità dei risultati.

Infine, in base alle linee cellulari utilizzate, al trattamento eseguito e alle proteine studiate, i livelli basali di foci possono variare notevolmente e rendere i risultati difficili da interpretare. Per questo motivo, è importante che i dati grezzi vengano riassunte, elaborati, analizzati e presentati in un formato efficace in una luce che i lettori possano comprendere; facilitando il confronto e rivelando tendenze e relazioni all'interno dei dati. Nella figura 4B, la stessa quantificazione dei foci è tracciata in tre versioni separate: (i) numero totale di foci (trama nuvolosa) dopo dSB indotta dall'irradiazione (ii) induzione di foci nel tempo -cinetica- (iii) % di cellule positive (>10 foci/nucleo).

I grafici cloud devono essere preferiti quando possibile (Figura 4B (i)) in quanto mostrano tutti i punti dati senza discriminazioni e offrono quindi la panoramica più completa dell'esperimento. Tuttavia, tracciare informazioni più selettive e pertinenti, come il numero di cellule positive al di sopra di uno sfondo arbitrario tagliato (5 foci nella maggior parte delle linee cellulari), il numero di foci co-localizzando, foci induzione nel tempo, o la misurazione della qualità dei foci, come la dimensione o l'intensità dei pixel, può essere più appropriato in alcuni casi, ed è responsabilità degli autori.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della Fondazione Area San Antonio. Il Mays Cancer Center è supportato dalla sovvenzione core di supporto al centro oncologico NCI P30 CA054174. Vorremmo ringraziare Stephen Holloway per il suo aiuto nell'approvvigionamento delle reagenti e il laboratorio Sung per aver fornito spazio e capacità di microscopia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% (v/v) paraformaldehyde (PFA) aqueous solution Electron Microscopy Sciences 15710 Microscopy quality of the PFA ensures best images. If using "home-made PFA", filter prior to use.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059 Heat-shock fraction is recommended, to avoid precipitation/background.
Coverglass #1, 18 mm round (coverslips) Neuvitro NC0308920 Coverslips need to be cleaned and sterilized prior using, with HCl or ethanol.
DMEM, High Glucose [(+) 4.5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Sodium Pyruvate] Gibco 11965118 Adjust the growing media to the needs of cell line used.
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144 PBS for tissue culture.
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Research Products International E57060 Nuclear extraction buffer.
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 104370028 The quality of FBS can be assessed by testing gH2AX foci formation. If traces of genotoxic endotoxin are present in the batch, gH2AX will be positive in the absence of stress.
Magnesium chloride (MgCl2) Research Products International M24000 Nuclear extraction buffer.
Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) Research Products International P40150 Nuclear extraction buffer.
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI Invitrogen S36973 300 nM DAPI with VECTASHIELD Antifade Mounting Medium can be used instead.
Sodium chloride (NaCl) Research Products International S23020 Nuclear extraction buffer.
Sucrose Research Products International S24060 Nuclear extraction buffer.
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 1255015 Polysine Slides can be used instead.
TC-Treated Multiple Well Plates, size 12 wells Costar 3513 Seeding on coverslips is done in 12-wells plate.
Triton X-100 AmericanBio AB02025 Nuclear extraction buffer.
TrypLE Express Enzyme (1X), No Phenol Red Gibco 12604021 Trypsin-EDTA can be used instead.
Trypsin-EDTA (0.5%), No Phenol Red Gibco 15400054 TrypLE can be used instead.

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References

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Visualizzazione dell'interazione delle proteine di riparazione del DNA per immunofluorescenza
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de la Peña Avalos, B., Dray, E. Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (160), e61447, doi:10.3791/61447 (2020).More

de la Peña Avalos, B., Dray, E. Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (160), e61447, doi:10.3791/61447 (2020).

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