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Biology

इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा डीएनए मरम्मत प्रोटीन इंटरैक्शन का दृश्य

doi: 10.3791/61447 Published: June 26, 2020

Summary

डीएनए क्षति के बाद, मानव कोशिकाओं को उनके जीनोम की अखंडता को बहाल करने के लिए आवश्यक मरम्मत रास्तों को सक्रिय । यहां, हम डीएनए मरम्मत प्रोटीन का पता लगाने, उनके स्थानिक और लौकिक भर्ती का विश्लेषण करने और डीएनए क्षति की साइटों पर प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत से पूछताछ करने में मदद करने के साधन के रूप में अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस की विधि का वर्णन करते हैं ।

Abstract

स्तनधारी कोशिकाओं को लगातार रसायनों, विकिरणों, और स्वाभाविक रूप से होने वाले मेटाबोलिक बाय-उत्पादों के संपर्क में आते हैं, जो विशिष्ट प्रकार के डीएनए अपमान बनाते हैं। जेनोटॉक्सिक एजेंट डीएनए बैकबोन को नुकसान पहुंचा सकते हैं, इसे तोड़ सकते हैं, या व्यक्तिगत ठिकानों की रासायनिक प्रकृति को संशोधित कर सकते हैं। डीएनए अपमान के बाद, डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) रास्ते सक्रिय होते हैं और मरम्मत में शामिल प्रोटीन की भर्ती की जाती है । नुकसान के प्रकार को भांपने और उचित मरम्मत प्रतिक्रिया को सक्रिय करने में कारकों की अधिकता शामिल है। डीडीआर कारकों को सही ढंग से सक्रिय करने और भर्ती करने में विफलता जीनोमिक अस्थिरता का कारण बन सकती है, जो कैंसर सहित कई मानव विकृतियों को रेखांकित करती है। डीडीआर प्रोटीन के अध्ययन जेनोटॉक्सिक दवा प्रतिक्रिया और दवा प्रतिरोध के सेलुलर तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं।

वीवो मेंप्रोटीन की कल्पना करने के दो प्रमुख तरीके हैं: प्रत्यक्ष अवलोकन, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ ब्याज के प्रोटीन को टैग करके और निश्चित नमूनों पर लाइव इमेजिंग, या अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा इसका पालन करके। जबकि फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्रोटीन का विज़ुअलाइज़ेशन समय के साथ सटीक निगरानी की अनुमति देता है, एन-या सी-टर्मिनस में प्रत्यक्ष टैगिंग प्रोटीन स्थानीयकरण या कार्य में हस्तक्षेप कर सकती है। उनके असंशोधित, अंतर्जात संस्करण में प्रोटीन का अवलोकन पसंद किया जाता है। जब डीएनए मरम्मत प्रोटीन डीएनए अपमान करने के लिए भर्ती कर रहे हैं, उनकी एकाग्रता स्थानीय रूप से बढ़ जाती है और वे समूहों, या "foci" फार्म, कि विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा कल्पना की जा सकती है ।

हालांकि प्रोटीन फोसी का पता लगाने से प्रत्यक्ष बातचीत का एक निश्चित प्रमाण प्रदान नहीं होता है, कोशिकाओं में प्रोटीन का सह-स्थानीयकरण इंगित करता है कि वे क्षति की साइट पर फिर से समूहीकृत होते हैं और जटिल गठन के लिए आवश्यक घटनाओं के अनुक्रम के बारे में सूचित कर सकते हैं। एक प्रोटीन के जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती संस्करणों को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में फोसी स्थानिक ओवरलैप का सावधानीपूर्वक विश्लेषण डीएनए मरम्मत कार्य के लिए महत्वपूर्ण कार्यात्मक डोमेन पर कीमती सुराग प्रदान कर सकता है। अंतिम, प्रोटीन का सह-स्थानीयकरण संभावित प्रत्यक्ष बातचीत को इंगित करता है जिसे कोशिकाओं में सह-इम्यूनोप्रिपिपिटेशन द्वारा सत्यापित किया जा सकता है, या शुद्ध प्रोटीन का उपयोग करके प्रत्यक्ष पुलडाउन।

Introduction

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मानव कोशिकाओं को लगातार विभिन्न मूल के डीएनए हानिकारक एजेंटों की एक किस्म के संपर्क में हैं। बहिर्जात स्रोतों में ज्यादातर विकिरण, रसायन (कीमोथैरेपी एजेंटों और कुछ एंटीबायोटिक दवाओं सहित) और वायरस के संपर्क में होते हैं, जबकि मुख्य अंतर्जात स्रोतों में डीएनए प्रतिकृति और ऑक्सीडेटिव तनाव में त्रुटियां शामिल हैं। जेनोटॉक्सिक एक्सपोजर का सीधा प्रभाव तनाव और एक्सपोजर खुराक के आधार पर एक संशोधित आधार से संभावित घातक डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) तक हो सकता है। अंततः, बिना मरम्मत या गलत मरम्मत किए गए डीएनए क्षति से उत्परिवर्तन, जीनोमिक पुनर्व्यवस्था, जीनोम अस्थिरता का संचय हो सकता है और अंततः कार्सिनोजेनेसिस 1 का कारणबन सकताहै। स्तनधारी कोशिकाओं ने विशिष्ट प्रकार के डीएनए क्षति2, 3,को पहचानने और उन्हें समय पर फैशन में मरम्मत करने के लिए जटिलरास्ते विकसित किए हैं, जो सेल चक्र प्रगति के साथ सिंक्रोनाइज्ड हैं।

आयनीकरण विकिरण (आईआर) डीएनए डबल हेलिक्स को नुकसान पहुंचाता है और डीएनए क्षति के सबसे हानिकारक रूपों में से एक डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) बनाता है। एमआरएन (एमआरएन (एमआरए11, आरए 50, एनबीएस 1) जटिल कार्य डीएनए के सेंसर के रूप में समाप्त होता है और प्रोटीन किनेज़ एटैक्सिया तेलंगिए म्यूटेड (एटीएम)4,,5को सक्रिय करता है। डीएनए समाप्त होता है द्वारा एटीएम के प्रारंभिक सक्रियण के बाद, एटीएम को तोड़ने की साइट पर DDR घटनाओं का झरना चलाता है, एक महत्वपूर्ण घटना के साथ शुरू, हिस्टोन संस्करण H2AX6के फॉस्फोरिलेशन । अवशेष S139 पर एच2एक्स फॉस्फोरिलेशन इसे γH2AX में सक्रिय करता है, जो डीएनए घाव,,6, 7,8,9 के आसपास मेगाबेस तक फैले,7हुएहैं। इस घटना से डीएनए पहुंच बढ़ जाती है, जिससे अन्य डीएनए मरम्मत प्रोटीन7की भर्ती और संचय होता है । क्योंकि γH2AX बहुतायत से और विशेष रूप से DSBs आसपास प्रेरित है, यह आसानी से विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर कल्पना की जा सकती है, और आमतौर पर डीएनए मरम्मत क्षेत्र में DSBs के लिए एक किराए मार्कर के रूप में प्रयोग किया जाता है । एक बार तोड़ संकेत दिया है, कोशिकाओं को अपने डीएनए की मरंमत के रास्ते सक्रिय और डीएनए क्षति की प्रक्रिया । प्रोटीन एमडीसी1 (डीएनए क्षति चेकपॉइंट प्रोटीन 1 का मध्यस्थ) सीधे10γH2AX बांधता है , एटीएम11 के साथ और एनबीएस112,13के साथ भी बातचीत करता है । यह डीएसबी में एमआरएन कॉम्प्लेक्स की एकाग्रता बढ़ाने और एक सकारात्मक एटीएम फीडबैक लूप शुरू करने में योगदान देता है। ब्रेक की मरम्मत होने के बाद γH2AX को तेजी से हटा दिया जाता है, नतीजतन, डीएसबी क्लीयरेंस की निगरानी की अनुमति दी जाती है। माइक्रोस्कोपी के बाद, समय के साथ γH2AX में कमी अवशिष्ट टूटता है और डीएनए मरम्मत दक्षता का एक अप्रत्यक्ष माप प्रदान करता है ।

यूकेरियोटिक कोशिकाएं कई रास्तों से डीएसबी की मरम्मत कर सकती हैं, दो मुख्य गैर-मुताबिक़ एंड-जॉइनिंग (एनएचईजे) और मुताबिक़ पुनर्संयोजन (एचआर)(चित्रा 1)जा रहे हैं। एनएचईजे अनिवार्य रूप से विस्तारित होमोलॉजी के उपयोग के बिना डीएनए डबल-स्ट्रैंड समाप्त होता है और पूरे सेल चक्र14,,15में संचालित होता है। मानव संसाधन एस और जी 2 चरणों के दौरान प्रमुख हो जाता है, और अन्यथा दमित होता है, क्योंकि इसे मरम्मत14,,16के लिए एक समरूप टेम्पलेट के रूप में एक बहन क्रोमटिड की आवश्यकता होती है। एनएचईजे और एचआर के बीच पाथवे विकल्प न केवल सिस्टर क्रोमैटिड की शारीरिक निकटता पर निर्भर करता है, बल्कि डीएनए एंड रिसेक्शन17के विस्तार पर भी निर्भर करता है, जो एनएचईजे को रोकता है।

होमोलॉजी-निर्भर डीएसबी मरम्मत 3 'सिंगल-स्ट्रैंड डीएनए (एसएसडीएनए) पूंछ उत्पन्न करने के लिए समाप्त होता है, एक प्रक्रिया जिसे 5'-3' रिसेक्शन के रूप में संदर्भित किया जाता है, ब्रेक से 5 'स्ट्रैंड के न्यूक्लियोलिटिकिक क्षरण द्वारा शुरू किया जाता है। एमआरएन परिसर डीएनए एंड रिसेक्शन शुरू करता है और आगे की रीसेक्शन को बीएलएम/एक्सओ1 (ब्लूम सिंड्रोम प्रोटीन/एक्सोन्यूलेस 1) या बीएलएम/डीएनए2 (डीएनए प्रतिकृति,एटीपी-निर्भर हेलीकेस/न्यूक्लियेज)18,19,20,,,21, 22के संयोजन में संसाधित कियाजाताहै ।, डीएनए एंड रिसेक्शन को सीटीआईपी (सीटीबीपी-इंटरैक्टिंग प्रोटीन) द्वारा एमआरएन कॉम्प्लेक्स 23 के साथअपनी सीधी बातचीत और बीआरसीए1 (स्तन कैंसर टाइप 1 संवेदनशीलता प्रोटीन)24, 25,के साथ अपनी भर्ती के माध्यम से बढ़ायाजाताहै । प्रतिकृति प्रोटीन ए (आरपीए) तुरंत उजागर एसएसडीएनए से बांधता है और फिर पुनः संयोजन प्रोटीन RAD51 द्वारा विस्थापित किया जाता है ताकि एक न्यूकोप्रोटीन फिलामेंट बन,सके जो26, 27,28केमुताबिक़ खोज और कतरा आक्रमण को उत्प्रेरित करता है।28

resection की शुरुआत मरम्मत मार्ग विकल्प के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। एक बार resection शुरू हो गया है, डीएनए समाप्त होता है Ku70/Ku80 heterodimer (NHEJ मार्ग के घटक) द्वारा बाध्यकारी के लिए गरीब सब्सट्रेट्स बन जाते हैं और कोशिकाएं एचआर17,29,,30के लिए प्रतिबद्ध हैं ।, Ku70/Ku80 heterodimer DSB समाप्त होता है, डीएनए-PKcs और p53 बाध्यकारी प्रोटीन 1 (53BP1)29,30की भर्ती करनेकेलिए बांधता है । 53BP1 जी 1 में पुनर्सेक्शन के लिए एक बाधा के रूप में कार्य करता है, इस प्रकार एनएचईजे31, 32,को बढ़ावा देतेहुएमानव संसाधन को अवरुद्ध करता है, लेकिन इसे एस चरण में बीआरसीए1-निर्भर तरीके से हटा दिया जाता है, नतीजतन रिसेक्शन33, 34,होनेकीअनुमति देता है। इसलिए, 53BP1 और BRCA1 डीएसबी मरम्मत में विरोधी भूमिकाएं निभाते हैं, जिसमें 53बीपी1 एनएचईजे फैसिलिटेटर है जबकि बीआरसीए1 मानव संसाधन के माध्यम से मरम्मत के लिए ब्रेक को सक्षम करने के लिए कार्य करता है।

प्रयोगशाला में, डीएसबी गठन आयनीकरण विकिरण (आईआर) द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। जबकि यह उदाहरण 4 जीवाई, 1 जीवाई और 2 जीवाई की उच्च खुराक का उपयोग करता है, जो प्रचुर मात्रा में प्रोटीन द्वारा फोसी गठन के विश्लेषण के लिए उपयुक्त डीएसबी की एक महत्वपूर्ण मात्रा भी बनाते हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि उपयोग किए जाने वाले विकिरण के प्रकार और खुराक डीएनए और कोशिका में विभिन्न घावों का कारण बन सकते हैं: जबकि आईआर डीएसबी को प्रेरित करता है, यह एकल स्ट्रैंड ब्रेक या बेस संशोधन का कारण बन सकता है (विकिरण रैखिक ऊर्जा हस्तांतरण (एलईटी) और डीएनए क्षति के प्रकार पर संदर्भ के लिए35,,36 देखें)। आयनीकरण विकिरण-प्रेरित फोसी (आईआरआईएफ) गठन और उनकी मंजूरी के काइनेटिक्स का निर्धारण करने के लिए, जो सक्रिय डीडीआर,8, 9,37, 38के नुकसान और उत्क्रमण की मरम्मत का संकेत देता है, आयनीकरण विकिरण के बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर फोसीगठनकी निगरानी की जा सकती है।,9, सक्रियण और सभी प्रमुख डीएनए क्षति प्रोटीन की मंजूरी के समय३९जाना जाता है, और कई प्रमुख घटनाओं के किराए मार्कर के रूप में जांच कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, PRPA, जो ssDNA के लिए उच्च आत्मीयता के पास तोड़ resection के एक किराए के रूप में प्रयोग किया जाता है, MRN प्रोटीन (MRE11, RAD50, NBS1) और exonucleases भी resection दक्षता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । जबकि RAD51, BRCA1, BRCA2 (स्तन कैंसर प्रकार 2 संवेदनशीलता प्रोटीन), और PALB2 (साथी और BRCA2 के स्थानीयता) मानव संसाधन दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए निगरानी की जा सकती है, केयू प्रोटीन या 53BP1 की उपस्थिति, NHEJ(चित्रा 1)के मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है ।

डीएनए मरम्मत मशीनरी के प्रोटीन के रूप में एक दूसरे को तोड़ने के लिए भर्ती और सुपर परिसरों में इकट्ठा, डीएनए प्रोटीन और प्रोटीन प्रोटीन बातचीत समय के साथ अपने व्यक्तिगत स्थानीयकरण का पालन करके अनुमानित किया जा सकता है और प्रोटीन के सह स्थानीयकरण का विश्लेषण, के रूप में सेल४०,४१,,४२में ओवरलैपिंग संकेतों द्वारा कल्पना ।, सेल लाइनों में, जीनोम संपादन के माध्यम से या प्लाज्मिड-आधारित म्यूटेंट की अधिकव्यक्तता के माध्यम से विशिष्ट डीएनए मरम्मत जीन में बिंदु उत्परिवर्तन या विलोपन की शुरूआत, विशिष्ट अवशेषों की जांच और डीएनए क्षति की मान्यता में उनकी संभावित भूमिका की अनुमति देती है (उदाहरण के लिए, γH2AX के साथ सह-स्थानीयकरण) या जटिल असेंबली (सह-स्थानीयकरण दूसरे, या कई, प्रोटीन के साथ), साथ ही डीएनए मरम्मत पर उनके प्रभाव। यहां, हम समय के साथ γH2AX फोसी का पालन करके डीएसबी के गठन और संकल्प की जांच करने के लिए एक मतलब के रूप में अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करते हैं। हम डीएसबी मरम्मत में एक प्रमुख खिलाड़ी द्वारा फोसी गठन और सह-स्थानीयकरण विश्लेषण का एक उदाहरण भी प्रस्तुत करते हैं: p53 बाध्यकारी प्रोटीन 1 (53BP1)32। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, 53BP1 को डीएनए मरम्मत मार्ग विकल्प के लिए केंद्रीय माना जाता है। 53BP1 संचय और γH2AX के साथ इसके सह-स्थानीयकरण के बाद सेल चक्र चरण, डीएनए क्षति संचय, और DSBs की मरम्मत के लिए इस्तेमाल किया मार्ग के बारे में कीमती जानकारी प्रदान करता है । अप्रत्यक्ष इम्यूनोलोकेलाइजेशन का उद्देश्य सेल लाइनों में डीएनए क्षति की मरम्मत की दक्षता का आकलन करना है, इस अध्ययन में आईआर के बाद, या कोशिका में विभिन्न तनावों के संपर्क में आने के बाद, डीएनए क्रॉसलिंकिंग से प्रतिकृति कांटा की रुकावट तक (डीएनए हानिकारक एजेंटों की एक सूची तालिका 1में प्रदान की जाती है)।

Figure 1
चित्रा 1: डीएनए डबल स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) मरम्मत के रास्ते।
डीएसबी मरम्मत में दो प्रमुख मार्ग शामिल हैं: मुताबिक़ पुनर्संयोजन (एचआर, बाएं) और गैर-मुताबिक़ एंड-जॉइनिंग (एनएचईजे, दाएं)। ब्रेक के बाद, प्रोटीन ब्रेक (γH2AX) को चिह्नित करने के लिए सक्रिय हो जाते हैं, अंत रिसेक्शन (एमआरएन) में भाग लेते हैं, पुनः प्राप्त एसएसडीएनए (PRPA) कोट करते हैं, पुनर्संयोजन को बढ़ावा देते हैं (बीआरसीए1, पाल्ब 2, बीआरसीए2, RAD51) या सीमा resection और NHEJ (53BP1) को बढ़ावा देते हैं। अन्य प्रोटीन क्षति मरम्मत में भाग लेते हैं, लेकिन सूचीबद्ध प्रोटीन नियमित रूप से अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस के बाद होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

डीएनए हानिकारक एजेंट कार्रवाई का तंत्र अनुशंसित खुराक
γ-रे/एक्स-रे विकिरण
कुछ अनियंत्रित सेलुलर प्रभावों के साथ डबल-फंसे ब्रेक का गठन
1-4 जीए
36 एआर आयन विकिरण
डबल फंसे ब्रेक का गठन
270 केवी/माइक्रोन
α-कण विकिरण
डबल फंसे ब्रेक का गठन
116 केवी/माइक्रोन
ब्लेओमाइसिन डीएनए संश्लेषण का अवरोधक 0.4-2 μg/mL
कैम्पटोथेसिन टोपोसोमरेसी I का अवरोधक 10-200 एनएम
सिस्प्लैटिन एल्किलेटिंग एजेंट
(उत्प्रेरण इंट्रास्ट्रैंड क्रॉसलिंक)
0.25-2 माइक्रोन
डॉक्सोरुबिसिन इंटरकैलिंग एजेंट
टोपोसोमरेस द्वितीय का अवरोधक
10-200 एनएम
ईटीओपोसाइड टोपोसोमरेस द्वितीय का अवरोधक 10 माइक्रोन
हाइड्रोक्सीयूरिया डीएनए संश्लेषण का अवरोधक
(राइबोन्यूक्लियोटाइड रिडक्शन द्वारा)
10-200 माइक्रोन
मिथाइल मीथेनसुलफोनेट एल्किलेटिंग एजेंट 0.25-2 mM
माइटोमाइसिन सी एल्किलेटिंग एजेंट 0.25-2 माइक्रोन
पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश थाइमिडीन डिमर्स का गठन
(डीएनए श्रृंखला की विकृति पैदा करना)
50-100 mJ/सेमी2

तालिका 1: जेनोटॉक्सिक एजेंट। डीएनए हानिकारक एजेंटों के उदाहरण, कार्रवाई के उनके तंत्र और सुझाए गए काम एकाग्रता के आधार पर प्रेरित नुकसान ।

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Protocol

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1. हेला सेल संस्कृति

  1. 16-18 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर 1 एम एचसीएल के साथ प्री-ट्रीट राउंड ग्लास कवरलिप। डीडीएच2ओ के साथ कुल्ला और 100% EtOH में स्टोर करें।
  2. सेल कल्चर मीडियम तैयार करें: डीएमईएम मीडियम में 10% (v/v) एफबीएस जोड़ें ।
  3. 4.0 x 104 कोशिकाओं /अच्छी तरह से बाँझ 12-वेल प्लेट में 37 डिग्री सेल्सियस पर 18 मिमी गोल ग्लास कवरलिप और एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 5% सीओ2 के साथ बढ़ें। कोशिकाओं को 80% तक बढ़ाएं (लगभग 24 घंटे)।

2. विकिरण के साथ सेल उपचार (आईआर)

  1. डबल-स्ट्रैंड ब्रेक के गठन को प्रेरित करने के लिए, कोशिकाओं को 4 जीआई γ-विकिरण (नियंत्रण: कोई विकिरण नहीं, टी = 0) में बेनकाब करें। गामा सेल -40 में, यह 0.815 जीवाई प्रति मिनट पर 4.54 मिनट से मेल खाता है।
  2. उचित समय-लंबाई के लिए एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट कोशिकाएं (यहां चुने गए समय अंक टी = 1, 2, 4, 16 घंटे)।

3. परमाणु निष्कर्षण और सेल निर्धारण

  1. स्टॉक समाधान तैयार करें: 0.2 मीटर पाइप (पीएच 6.8), 5 एम एनएसीएल, 2 एम सुक्रोज, 1 एम एमजीसीएल2,0.1 एम ईजीटीए (पीएच 8.0)।
  2. परमाणु निष्कर्षण बफर (एनईबी): डीडीएच 2 ओ मिक्स में 10 एमएमएम पाइप (पीएच 6.8), 100 एमएमएम एनएसीएल, 300 एमएमएम सुक्रोज, 3 एमएमएम एमजीसीएल2,1 एमएम ईजीटीए (पीएच 8.0) और 0.5% (v/v) ट्राइटनएक्स-100को भंग करने तक भंग करें।
  3. 4% (v/v) पैराफॉर्मल्डिहाइड (पीएफए): 30 एमएल पीबीएस में 16% पीएफए जलीय समाधान के 10 एमएल को भंग करें । पूरी तरह से भंग होने तक मिलाएं।
  4. उचित समय बिंदु पर (टी = 0, 1, 2, 4, 16 एच), पीबीएस के 1 एमएल के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं। पीबीएस को पूरी तरह से हटा दें।
  5. सेल नाभिक निष्कर्षण के लिए प्रत्येक कुएं में एनईबी के 200 माइक्रोन जोड़ें (साइटोप्लाज्म अपमानित है, केवल नाभिक रहता है)(चित्रा 2)। कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट और पूरी तरह से हटा दें।
    नोट: 2 मिनट से अधिक मत करो।

Figure 2
चित्रा 2: परमाणु निष्कर्षण।
(बाएं) और पोस्ट (दाएं) परमाणु निष्कर्षण से पहले कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां। साइटोप्लाज्म को पचाया जाना चाहिए लेकिन परमाणु संरचना निष्कर्षण (दाएं) के बाद बरकरार रहनी चाहिए। (क) 20x आवर्धन; स्केल बार = 20 माइक्रोन और (बी) 40x आवर्धन; स्केल बार = 10 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. पीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोएं। पीबीएस को पूरी तरह से हटा दें। पीबीएस को ध्यान से जोड़ें, इस कदम पर कोशिकाएं बहुत नाजुक होती हैं।
  2. सेल निर्धारण के लिए प्रत्येक कुएं में 4% (v/v) पीएफए का 200 माइक्रोन जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट। पीएफए को पूरी तरह से हटा दें।
  3. पीबीएस का 1 एमएलए जोड़ें।
    नोट: कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में संग्रहीत किया जा सकता है।

4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

  1. ब्लॉकिंग समाधान तैयार करें: पीबीएस में 5% बीएसए (w/v) को भंग करें और 0.3% (v/v) ट्राइटन एक्स-100 जोड़ें। पूरी तरह से भंग होने तक मिलाएं।
  2. कमजोर पड़ने का बफर तैयार करें: पीबीएस में 1% बीएसए (w/v) को भंग करें और 0.3% (v/v) ट्राइटन एक्स-100 जोड़ें। पूरी तरह से भंग होने तक मिलाएं।
  3. ब्लॉक करने के लिए, प्रत्येक कुएं में अवरुद्ध समाधान के 200 माइक्रोन जोड़ें। कमरे के तापमान पर 2 घंटे या 4 डिग्री सेल्सियस पर 16-18 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
    नोट: यदि बकरी एंटीबॉडी का उपयोग किया जाएगा, तो समाधान को अवरुद्ध करने के लिए 5% बकरी सीरम जोड़ें।
  4. तनु प्राथमिक एंटीबॉडी में कमजोर पड़ने बफर (1:500; एंटीबॉडी सूची के लिए तालिका 2 देखें) और भंवर जब तक अच्छी तरह से मिश्रित ।
    नोट: यदि बकरी एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है, तो बफर को कमजोर करने के लिए 1% बकरी सीरम जोड़ें।
  5. एक आर्द्रता/इनक्यूबेशन बॉक्स में, पैराफिल्म के एक टुकड़े का पालन करें। प्राथमिक एंटीबॉडी के 10 माइक्रोन जोड़ें (एक बूंद में)। ड्रॉप के साथ कवरस्लिप के एक किनारे को संरेखित करें और धीरे-धीरे पैराफिल्म पर कम करें, तरल को भर में फैलने के लिए (यदि संभव हो तो बुलबुले से बचें)। कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
  6. 1 मिनट के लिए पीबीएस में तीन बार कवरस्लिप धोएं।
  7. कमजोर पड़ने बफर में माध्यमिक एंटीबॉडी पतला (अंतिम एकाग्रता: 2 μg/mL) और भंवर जब तक अच्छी तरह से मिश्रित ।
  8. प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए वर्णित माध्यमिक एंटीबॉडी के 10 माइक्रोन लागू करें। कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
    नोट: प्रकाश से रक्षा करें।
एंटीबॉडी कंपनी संदर्भ स्रोत
53बीपी1 सेल सिग्नलिंग 4937 खरगोश
एंटी-माउस आईजीजी एच एंड एल (एलेक्सा फ्लोर 647) अबाकम अब150103 गधा
एंटी-फॉस्फो-हिस्टोन H2A। एक्स (Ser139), क्लोन JBW301 मिलिपोर 05-636 माउस
एंटी-रैबिट आईजीजी एच एंड एल (एलेक्सा फ्लोर 488) अबाकम एबी150081 बकरी

तालिका 2: एंटीबॉडी का उपयोग किया जाताहै। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी की सूची।

  1. 1 मिनट के लिए पीबीएस में तीन बार कवरस्लिप धोएं।
  2. 1 मिनट के लिए एच2ओ के साथ कवरस्लिप धोएं।
  3. DAPI के साथ काउंटरदाग डीएनए: 300 एनएम DAPI के 10 माइक्रोन लागू करें (जैसा कि एंटीबॉडी के लिए वर्णित है), कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट और फिर एक ग्लिसरोल आधारित बढ़ते मीडिया के साथ ग्लास स्लाइड पर माउंट। वैकल्पिक रूप से, एक स्लाइड पर DAPI युक्त वाणिज्यिक एंटीफैड बढ़ते मीडिया की एक बूंद (10 माइक्रोन) जोड़ें और एक कवरस्लिप लागू करें। धीरे-धीरे कवरस्लिप दबाएं और पेपर तौलिया के साथ इसके चारों ओर अतिरिक्त तरल पदार्थ हटा दें।
  4. पारदर्शी नेल पॉलिश के साथ सील कवर्लिप्स और उन्हें 20 मिनट के लिए सूखने दें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड स्टोर करें।

5. छवि अधिग्रहण

  1. 60x उद्देश्य लेंस पर विसर्जन तेल की एक बूंद रखें। आंख के टुकड़े के माध्यम से नाभिक का पता लगाने के लिए DAPI का उपयोग करें।
    1. XYZ छवि अधिग्रहण के लिए, खुला अधिग्रहण सॉफ्टवेयर और मापदंडों का चयन करें: स्कैनर प्रकार: Galvano; स्कैनर मोड: राउंडट्रिप; छवि आकार: 512 × 512; पीएमटी मोड: वीबीएफ; पीएमटी औसत: फ्रेम (4 बार); पीएमटी अनुक्रमिक स्कैन: रेखा।
    2. डाई और डिटेक्टरों का चयन करें:
      चैनल (CH1), डाई (DAPI), डिटेक्टर (SD1)
      चैनल (CH2), डाई (एलेक्सा फ्लोर 488), डिटेक्टर (HSD3)
      चैनल (CH3), डाई (एलेक्सा फ्लोर 647), डिटेक्टर (HSD4)
    3. "जेड" में चुनें।
  2. लाइव इमेज को एडजस्ट करें। लाइव विंडो पर लाइव बटन दबाएं।
    1. फोकस को समायोजित करें और लेजर तीव्रता (%), संवेदनशीलता (एचवी), लाभ और "पीएमटी" टूल विंडो पर ऑफसेट सेट करें।
      1. लेजर तीव्रता (%): चमक और ब्लीचिंग के लिए समायोजित करें। लेजर तीव्रता जितनी अधिक होगी, सिग्नल उतना ही मजबूत होगा, लेकिन नमूना फोटोब्लाच होगा।
      2. संवेदनशीलता (एचवी): शोर स्तर को समायोजित करें। उच्च एचवी, मजबूत संकेत है, लेकिन छवि शोर हो जाएगा अगर बहुत अधिक है ।
        नोट: हमेशा वोल्टेज स्थिर रखें।
      3. ऑफसेट समायोजित करें: पृष्ठभूमि स्तर।
    2. जेड स्टैक के लिए स्टार्ट/एंड (15 स्लाइस) का चयन करें ।
  3. अधिग्रहण शुरू करें।
    1. छवियों को सहेजने के लिए फ़ोल्डर का चयन करें। छवि प्राप्त करने के लिए एलएसएम स्टार्ट बटन दबाएं। छवि अधिग्रहण को पूरा करने के लिए श्रृंखला किया बटन दबाएं।

6. डेटा विश्लेषण

  1. छवि विश्लेषण के लिए, विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें।
    1. बैच टूल विंडो दबाएं, आउटपुट फ़ोल्डर का विश्लेषण करने और चयन करने के लिए छवियों का चयन करें।
    2. विश्लेषण उपकरण खिड़की दबाएं और प्रक्षेपण का चयन करें (15 स्लाइस से अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण प्रदर्शित करेगा)।
    3. इनपुट/आउटपुट सेटिंग केतहत, बनाए गए बैच का चयन करें।
    4. छवियों को संसाधित करने के लिए प्रेस प्रक्रिया।
    5. निर्यात छवियों के रूप में .tiff फ़ाइलें।
  2. परमाणु मात्रा के लिए, ओपन सेलप्रोफिलर।
    1. γH2AX और 53BP1 foci मात्राकरण पाइपलाइन खोलें (पूरक जानकारीदेखें)।
    2. टेबल सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेटा ग्राफ करें।
  3. सह-स्थानीयकरण विश्लेषण के लिए, ओपन सेलप्रोफिलर।
    1. कोलोकैलाइजेशन पाइपलाइन खोलें (पूरक जानकारीदेखें)। एक स्प्रेडशीट फ़ाइल बनाई जाएगी और पसंदीदा स्थान में सेव किया जाएगा। हालांकि, रेखांकन स्वयं सेव नहीं होंगे। परिणामों के रिकॉर्ड के लिए रखने के लिए खिड़कियों का स्नैपशॉट लेने का सुझाव दिया जाता है।
    2. टेबल सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेटा ग्राफ करें।

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Representative Results

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2 दिन, या कवरस्लिप पर 24 घंटे पोस्ट सीडिंग कोशिकाओं पर, कोशिकाओं को एक विभाजन आया है और ८०% ढुलमुल हैं । डीएनए मरम्मत प्रोटीन में विशिष्ट दस्तक चढ़ाव या उत्परिवर्तन दोगुना समय बढ़ा सकते हैं, या कोशिकाओं को जीनोटॉक्सिक उपचार के लिए संवेदनशील कर सकते हैं, और सीडिंग घनत्व के साथ-साथ उपचार खुराक को तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। सबसे अच्छा काम करने की स्थिति निर्धारित करने के लिए, डीएनए क्षति प्रतिक्रिया के समय के साथ γH2AX के पश्चिमी दाग द्वारा स्थापित किया जा सकता है, और विकिरण के प्रति संवेदनशीलता परख बनाने कॉलोनी द्वारा पहचाना जा सकता है ।

विकिरण के साथ इलाज नहीं कोशिकाओं थोड़ा प्रदर्शन, यदि कोई हो, γH2AX foci(चित्रा 3A)। हालांकि, γH2AX फोसी गठन को बढ़ती स्थितियों में निहित विभिन्न तनावों द्वारा सुसंस्कृत कोशिकाओं में ट्रिगर किया जा सकता है: कोशिकाओं को अम्लीय मीडिया में संकुचित छोड़ दिया जाता है, एफबीएस में जेनोटॉक्सिक एंडोटॉक्सिन की उपस्थिति, संस्कृति के लिए उपयोग की जाने वाली ऑक्सीजन एकाग्रता, कुछ का हवाला देते हैं।

Figure 3
चित्रा 3: कोई तनाव के साथ परमाणु foci ।
बाहरी तनाव के अभाव में, बहुत कम यदि किसी भी γH2AX फोसी (ए) मनाया जाता है। आवश्यक डीएनए मरम्मत प्रोटीन के अभाव में, γH2AX संचय को देखा जा सकता है क्योंकि अंतर्जात स्रोतों के कारण होने वाले ब्रेक (बी) की मरम्मत नहीं की जाती है। अनरैयर ब्रेक के संचय से कोशिकाएं प्री-एपोटोटिक हो सकती हैं, जो "ठोस" γH2AX नाभिक धुंधला (सी) द्वारा चिह्नित है। स्केल बार = 5 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

इसके अलावा, प्रमुख डीएनए क्षति प्रोटीन के लिए समाप्त कोशिकाओं में, जैसे BRCA1 या BRCA2 उत्परिवर्ती कोशिकाओं, डीएनए टूटता है कि अंतर्जात तनाव का एक परिणाम के रूप में होते है जंगली प्रकार की कोशिकाओं में के रूप में मरंमत नहीं कर रहे हैं, और जमा । नतीजतन, मानव संसाधन की कमी कोशिकाओं में ऊंचा γH2AX देखा जा सकता है, यहां तक कि सामान्य बढ़ती स्थितियों(चित्रा 3 बी)में भी। कोशिकाओं की एक उप-आबादी γH2AX(चित्रा 3C)के साथ "ठोस" परमाणु धुंधला प्रदर्शन कर सकती है। अखिल परमाणु दाग संकेत कर सकते है कि एक सेल की मरंमत से परे नुकसान से अभिभूत है, और/या पूर्व apoptotic है । ऐसी कोशिकाओं को आम तौर पर बढ़े हुए नाभिक और साइटोप्लाज्मिक वैक्यूल्स की उपस्थिति की विशेषता होती है। इसके अतिरिक्त, γH2AX एस चरण में प्रतिकृति तनाव और ठप प्रतिकृति कांटे, या G2/M गिरफ्तारी से शुरू किया जा सकता है । यदि आवश्यक हो, तो डीएनए सामग्री को धुंधला करके या विशिष्ट मार्कर के साथ सह-धुंधला करके सेल चक्र चरणों की पहचान की जा सकती है। डीएनए क्षति मरम्मत विश्लेषण आयोजित करते समय, अखिल परमाणु को व्यक्तिगत फोसी से स्वतंत्र रूप से निर्धारित किया जा सकता है।

विकिरण के बाद, नाभिक बड़ी संख्या में डबल स्ट्रैंड ब्रेक प्रदर्शित करता है जिसके लिए γH2AX बेहद तेजी से स्थानीयकरण करताहै (चित्र 4)। इष्टतम परिस्थितियों में, कुछ यदि विकिरण के अभाव में किसी भी γH2AX फोसी देखे जाते हैं। विकिरण के बाद, γH2AX फोसी का गठन तेजी से बढ़ता है। यदि ब्रेक को संसाधित और मरम्मत किया जाता है, तो प्रति नाभिक फोसी गिनती कम हो जाती है, साथ ही फोसी के लिए सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या भी कम हो जाती है। फोसी की तीव्रता और संख्या उपयोग की गई सेल लाइन और विकिरण की खुराक के आधार पर भिन्न होती है। कम मार्ग HeLa कोशिकाओं में, एंडोटॉक्सिन मुक्त सीरम में उगाया जाता है, हम नियमित रूप से 30 मिनट और 1 घंटे के बाद विकिरण, जो 1 और 2 घंटे के बीच चोटियों पर फोसी की एक तेज वृद्धि देखी, तो उत्तरोत्तर 16 घंटे तक कम हो जाती है । इस कारण से, 0, 1, 2, 4 और 16 घंटे के बाद विकिरण पर प्रतिनिधि समय अंक यहां प्रस्तुत किए जाते हैं। विकिरण के लिए ब्रेक सिग्नलिंग, मरम्मत और अस्तित्व का व्यवहार सेल लाइनों के साथ-साथ जीन की कमी या उत्परिवर्तन के बीच बहुत भिन्न हो सकता है। इस कारण से, सबसे उपयुक्त समय अंक प्रयोग-और सेल पर निर्भर किया जाएगा । प्रयोग में, 16 घंटे γH2AX अवशिष्ट foci गैर विकिरणित कोशिकाओं की तुलना में एक ही बेसल स्तर तक पहुंच गए हैं । बाद के समय अंक शामिल करने के लिए अवशिष्ट foci की निगरानी अगर धीरे से सेल लाइनों को विभाजित करने के साथ काम करने का सुझाव दिया है ।

Figure 4
चित्रा 4: परमाणु foci और मात्राकरण तनाव के बाद (समय पाठ्यक्रम) ।
टी = 0 (कोई विकिरण) पर γH2AX फोसी गठन और विकिरण के बाद संकेतित समय बिंदुओं पर (4 जीआई, टी = 1, 2, 4, 16 एच)। (क) प्रतिनिधि चित्र दिखाए जाते हैं । DAPI नाभिक इंगित करता है। स्केल बार = 5 माइक्रोन। (ख) γ-विकिरण के संपर्क में आने के बाद γH2AX के नाभिक फोसी को प्रत्येक बार के लिए 100 नाभिक में स्वचालित मात्राकरण (सेलप्रोफिलर) द्वारा अर्जित किया गया था । उठाए गए जैविक प्रश्न और प्राप्त किए गए डेटा के प्रकार के आधार पर, तुलना और महत्वपूर्ण समझ को सुविधाजनक बनाने के लिए कच्चे डेटा को प्रस्तुत करने के लिए विभिन्न विकल्प उपलब्ध हैं। (i) क्लाउड प्लॉट शो का मतलब ± एसडी प्रतीक (*) छात्र के दो पूंछ वाले टी-टेस्ट का उपयोग करके नियंत्रण के सापेक्ष सांख्यिकीय महत्व को इंगित करता है: *** पी ≤ ०.०००१, (ii) प्रेरण वक्र से पता चलता है ± एसईएम, (iii) 10 से अधिक फोसी प्रति नाभिक । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

इसके विपरीत, डीएनए क्षति मरम्मत कार्यों के लिए कमी कोशिकाओं में, विकिरण (टी = 0 एच) के अभाव में γH2AX फोसी जमा होता है और मरम्मत में देरी हो सकती है, या लंबे समय के बिंदुओं पर भी अनुपस्थित हो सकता है (टी = 16 एच, टी = 24 एच) विकिरण के बाद। जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती कोशिकाओं के बीच सीधी तुलना जीन उत्परिवर्तित के डीएनए मरम्मत समारोह के बारे में बहुमूल्य जानकारी दे सकती है, और मरम्मत के प्रकार पर संकेत दे सकती है। जबकि NHEJ में एक कमी को तोड़ने के लिए एस चरण में मानव संसाधन द्वारा मरंमत के लिए मजबूर कर सकते हैं, DSBs कि फिर से काट दिया गया है और मानव संसाधन द्वारा मरंमत की जानी चाहिए NHEJ द्वारा मरंमत नहीं की जाएगी । इस कारण से, नुकसान के बाद एस चरण के संचय एक मानव संसाधन की कमी का संकेत हो सकता है, और उच्च γH2AX स्तर NHEJ दोषों पर विभाजन संकेत के बाद ।

जब एक ही कोशिकाओं में कई प्रोटीन की जांच की जाती है, तो विभिन्न जानवरों की प्रजातियों में उठाए गए प्राथमिक एंटीबॉडी को मल्टीप्लेक्सिंग द्वारा सह-स्थानीयकरण का अध्ययन किया जा सकता है और इन्हें अलग फ्लोरोफोरस(चित्रा 5)के साथ लेबल द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ प्रकट किया जा सकता है। सह-स्थानीयकरण इंगित करता है कि क्या प्रोटीन (i) को तोड़ने के लिए भर्ती किया जाता है (ii) को समय पर फैशन में भर्ती किया जाता है, (iii) डीएनए मरम्मत परिसरों में इकट्ठा होते हैं। सह-स्थानीयकरण की तलाश करते समय, आमतौर पर स्वीकार्य गुणात्मक विधि विभिन्न चैनलों (यानी, हरे और लाल) के सरल ओवरले के रूप में परिणाम पेश करना है। हरे और लाल रंग के सुपरपोजिशन पीले हॉटस्पॉट को जन्म देंगे, जहां ब्याज के दो प्रोटीन एक हीपिक्सल (चित्रा 5A)में मौजूद हैं । हालांकि, इस विधि की सीमाएं हैं, क्योंकि यह दोनों चैनलों में एकत्र सापेक्ष संकेत तीव्रता पर निर्भर है, और दो फ्लोरोक्रोम में सिग्नल ताकत में अंतर हो सकता है। इसलिए, ओवरले विधियां सह-स्थानीयकरण घटनाओं का एक दृश्य अनुमान उत्पन्न करने में मदद करती हैं, लेकिन मात्रात्मक उद्देश्यों के लिए उपयुक्त नहीं हैं। सह-स्थानीयकरण का मात्रात्मक विश्लेषण ऑब्जेक्ट-आधारित दृष्टिकोण(चित्रा 5B (आई-iii) या एक आंकड़ा दृष्टिकोण द्वारा प्राप्त किया जा सकता है जो तीव्रता सहसंबंध गुणांक-आधारित (आईसीसीबी) विश्लेषण(चित्रा 5B (iv)) करता है। सह-स्थानीयकरण विश्लेषण के लिए कई उपकरण उपलब्ध हैं, जिनमें JACoP (बस एक और सह-स्थानीयकरण प्लगइन; https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/jacop.html) और "कोलोकलाइजेशन" पाइपलाइन (सेलप्रोफिलर) यहां उपयोग किया जाता है, जिसका उपयोग आईसीसीबी उपकरण के रूप में किया जा सकता है, ताकि फ्लोरेसेंस तीव्रता के बीच संबंधों का आकलन किया जा सके। यह ज्यादातर सहसंबंध गुणांक (पियर्सन के गुणांक) की गणना करके किया जाता है जो दो चरों के बीच रैखिक संबंधों की ताकत को मापता है। फ्लोरेसेंस सह-स्थानीयकरण को स्कैटर भूखंडों में रेखांकन रूप से दर्शाया जा सकता है, जहां प्रत्येक पिक्सेल के लिए दूसरे फ्लोरोक्रोम (लाल) की तीव्रता के खिलाफ एक फ्लोरोक्रोम (हरे रंग) की तीव्रता की साजिश रची जाती है। एक सीधी रेखा के चारों ओर संकुल बिंदुओं में पूर्ण सह-स्थानीयकरण परिणाम होता है, जिसकी ढलान दो रंगों के फ्लोरेसेंस के अनुपात को दर्शाती है। इसके विपरीत, सह-स्थानीयकरण की कमी के परिणामस्वरूप दो अलग-अलग समूहों (कुल्हाड़ियों के साथ वितरित) में अंकों के वितरण में परिणाम होते हैं, प्रत्येक दूसरे रंग से कम या कोई संकेत नहीं के साथ एक रंग के अलग-अलग सिग्नल स्तर दिखाता है। पियर्सन का गुणांक मूल्य 1 से -1 तक होता है, जिसमें 1 पूर्ण सकारात्मक सहसंबंध के लिए खड़ा होता है, -1 नकारात्मक सहसंबंध के लिए और शून्य कोई संबंध नहीं दर्शाता है। वैकल्पिक रूप से, पीसीएलसी विधि का उपयोग किया जा सकता है। इस विधि को विभिन्न प्रकार के विकिरणों में लागू किया गया है (विवरण के लिए36 देखें और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध विधि)।

Figure 5
चित्रा 5: सह-स्थानीयकरण विश्लेषण।
विभिन्न प्रजातियों (यहां, एंटी-माउस γH2AX (लाल) और एंटी-रैबिट 53BP1 (ग्रीन)) के खिलाफ उठाए गए कई एंटीबॉडी का उपयोग करके, कई प्रोटीन की जांच की जा सकती है। (क) प्रतिनिधि चित्र दिखाए जाते हैं । DAPI नाभिक इंगित करता है। सह-स्थानीयकरण रंग और क्षेत्र ओवरलैप (यहां लाल + हरा = पीला) द्वारा कल्पना की जाती है। स्केल बार = 5 माइक्रोन। (ख) व्यक्तिगत और सह-स्थानीयकरण फोसी को कई सॉफ्टवेयरों में से एक (यहां, सेलप्रोफिलर, मुख्य पाठ में अन्य विकल्प देखें) का उपयोग करके व्यक्तिगत रूप से निर्धारित किया जा सकता है और प्लॉट किया जा सकता है । (i-iii) पिक्सेल-आधारित दृष्टिकोण (आईसीसीबी विश्लेषण) का उपयोग करके सह-स्थानीयकरण (iv) सह-स्थानीयकरण के लिए प्राप्त सह-स्थानीयकरण (iv) सहसंबंध परिणामों को निर्धारित करने के लिए ऑब्जेक्ट-आधारित संपर्क किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक जानकारी। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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माइक्रोस्कोपी द्वारा डीएनए क्षति की मरम्मत के समय और दक्षता का विश्लेषण यह समझने के लिए आवश्यक साबित हुआ है कि डीएनए मरम्मत मशीनरी सामान्य कोशिकाओं में और कैंसर जैसी मानव विकृतियों में कैसे कार्य करती है।

विशिष्ट एंटीबॉडी का विकास जो उनके फॉस्फोरिलेटेड संस्करण (जैसे γH2AX, पीएफए, पीआरए 50 और अन्य10,23, 39,,3943)में सक्रिय प्रोटीन का पता लगाने की अनुमति देताहै,ने घटनाओं के डीएनए मरम्मत समय और कोशिका चक्र के साथ इसके समकालिकीकरण की बेहतर समझ प्राप्त करने में केंद्रीय भूमिका निभाई है।, इस सफलता का उदाहरण 53BP1 फॉस्फोरिलेटेड अवशेषों के विश्लेषण द्वारा, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री और इम्यूनोलोकेलाइजेशन (समीक्षा के लिए32 देखें) द्वारा किया जाता है, जिसने इस भारी संशोधित प्रोटीन के कार्य को समझने में मदद की है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन सूक्ष्म तकनीक जैसे तूफान और कोशिकाओं में छोटे एंटीबॉडी (नैनोबॉडी) के बढ़ते उपयोग के साथ कोशिकाओं में प्रत्यक्ष प्रोटीन इंटरैक्शन अधिक सुलभ और सटीक होता जा रहा है। हालांकि, अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस के रूप में यहां वर्णित एक उपन्यास संभावित डीएनए मरम्मत प्रोटीन की जांच करते समय प्रदर्शन करने के लिए एक आवश्यक प्रयोग बना हुआ है और कार्रवाई और प्रोटीन भागीदारों के समय की तलाश में है ।

अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस की सफलता पूरी तरह से दो मानदंडों पर टिकी हुई है: (i) अभिकर्मकों की गुणवत्ता - विशेष रूप से सक्रिय डीएनए मरम्मत प्रोटीन पर फॉस्फो-अवशेषों का पता लगाने के लिए उपयोग की जाने वाली एंटीबॉडी, और (ii) प्रयोग का समय। प्रकाशित प्रोटोकॉल और एंटीबॉडी का उपयोग कर जब उपलब्ध प्रोत्साहित किया जाना चाहिए । उपन्यास एंटीबॉडी का उपयोग करते समय या उपन्यास प्रोटीन की जांच करते समय, एंटीबॉडी को मान्य किया जाना चाहिए, और विशिष्टता को कोशिकाओं में लक्षित प्रोटीन के नीचे दस्तक द्वारा स्थापित किया जाना चाहिए (संकेत खो जाना चाहिए) या प्रोटीन की कमी (इनक्यूबेशन से पहले विशिष्ट एंटीबॉडी को कम करने के लिए शुद्ध प्रोटीन का उपयोग, जैसा कि RAD51AP1 के लिए44 में किया गया था)।

कलाकृतियों और गैर-विशिष्ट धुंधला को कम करने के लिए इष्टतम अवरुद्ध स्थितियों और एंटीबॉडी कमजोर पड़ने की स्थापना की जानी चाहिए। बफ़र्स ताजा तैयार किया जाएगा और अगर परमाणु निष्कर्षण किया जाता है, यह हानिकारक नाभिक से बचने के लिए समय पर किया जाना चाहिए । मानव कोशिकाओं में मरम्मत दक्षता की जांच में, परमाणु फोसी का मात्राकरण किया जाना चाहिए, और परमाणु निष्कर्षण साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन को छोड़कर मदद कर सकता है। हालांकि, यह परमाणु निष्कर्षण कदम प्रदर्शन नहीं करने के लिए फायदेमंद हो सकता है, उदाहरण के लिए जांच करने के लिए कि क्या एक उत्परिवर्ती प्रोटीन अपने सेलुलर साथी के साथ बातचीत नहीं करने के लिए डीएनए क्षति पर नाभिक को स्थानांतरित करने में विफल रहता है ।

इसके अलावा, इमेजिंग की गुणवत्ता यह सुनिश्चित करने के लिए सर्वोपरि महत्व की है कि डेटा को ठीक से प्राप्त किया जा सकता है, विश्लेषण किया जा सकता है, और सटीक डेटा प्लॉट किया जा सकता है। नियंत्रित करने के लिए पैरामीटर कई हैं और इसमें शामिल हैं: प्राथमिक एंटीबॉडी की विशिष्टता, चुने गए फ्लोरोफोरस (माध्यमिक एंटीबॉडी) के उत्तेजना का स्पेक्ट्रम, फोटोब्लैचिंग के खिलाफ नमूनों की रक्षा करना, सीडिंग कोशिकाओं के लिए समर्थन का विकल्प, अच्छा नमूना (प्रश्न के आधार पर न्यूनतम 30 से 300 नाभिक), और कुछ मामलों में पोस्ट-ट्रीटमेंट जैसे डीकॉन्वोल्यूशन या स्पेक्ट्रल-मिक्सिंग। जब संभव हो, एक पूर्ण कवरस्लिप की स्वचालित इमेजिंग, जो हजारों कोशिकाओं को इमेज्ड करने की अनुमति देता है, का सुझाव दिया जाता है। इस तरह के प्रयोग की स्थापना से पहले एक कोर सुविधा के रूप में इमेजिंग विशेषज्ञों को शामिल करने पर विचार किया जाना चाहिए के रूप में यह बहुत परिणामों की गुणवत्ता में वृद्धि होगी ।

पिछले, उपयोग की जाने वाली सेल लाइनों के आधार पर, उपचार किया गया, और प्रोटीन की जांच की गई, फोसी के बेसल स्तर बहुत भिन्न हो सकते हैं और परिणामों को व्याख्या करना मुश्किल बना सकता है। इस कारण से, यह महत्वपूर्ण है कि कच्चे डेटा को संक्षेप में, संसाधित, विश्लेषण और एक प्रभावी प्रारूप में प्रस्तुत किया जाता है जिसे पाठक समझ सकते हैं; डेटा के भीतर तुलना और खुलासा प्रवृत्तियों और संबंधों को सुविधाजनक बनाने। चित्रा 4 बीमें, फोसी का एक ही मात्रा तीन अलग-अलग संस्करणों में प्लॉट किया गया है: (i) विकिरण (ii) द्वारा प्रेरित डीएसबी द्वारा प्रेरित होने के बाद फोसी (क्लाउड प्लॉट) की कुल संख्या -काइनेटिक्स- (iii) % सकारात्मक कोशिकाओं (>10 foci/नाभिक) ।

क्लाउड प्लॉट्स को जब भी संभव हो पसंद किया जाना चाहिए(चित्रा 4B (i)) क्योंकि वे बिना भेदभाव के सभी डेटा बिंदु दिखाते हैं और इस प्रकार प्रयोग का सबसे व्यापक अवलोकन प्रदान करते हैं। हालांकि, अधिक चयनात्मक और प्रासंगिक जानकारी की साजिश रचने, जैसे कि मनमाने ढंग से पृष्ठभूमि से ऊपर सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या (अधिकांश सेल लाइनों में 5 फोसी), फोसी सह-स्थानीयकरण की संख्या, समय के साथ फोसी प्रेरण, या फॉसी की गुणवत्ता माप, जैसे पिक्सेल आकार या तीव्रता, कुछ मामलों में अधिक उपयुक्त हो सकते हैं, और लेखकों की जिम्मेदारी है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को सैन एंटोनियो एरिया फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। Mays कैंसर केंद्र एनसीआई कैंसर सेंटर समर्थन कोर अनुदान P30 CA054174 द्वारा समर्थित है । हम स्टीफन होलोवे को उनकी मदद के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, जो अभिकर्षकों को सोर्सिंग करते हैं, और अंतरिक्ष और माइक्रोस्कोपी क्षमता प्रदान करने के लिए सुंग प्रयोगशाला ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% (v/v) paraformaldehyde (PFA) aqueous solution Electron Microscopy Sciences 15710 Microscopy quality of the PFA ensures best images. If using "home-made PFA", filter prior to use.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059 Heat-shock fraction is recommended, to avoid precipitation/background.
Coverglass #1, 18 mm round (coverslips) Neuvitro NC0308920 Coverslips need to be cleaned and sterilized prior using, with HCl or ethanol.
DMEM, High Glucose [(+) 4.5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Sodium Pyruvate] Gibco 11965118 Adjust the growing media to the needs of cell line used.
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144 PBS for tissue culture.
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Research Products International E57060 Nuclear extraction buffer.
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 104370028 The quality of FBS can be assessed by testing gH2AX foci formation. If traces of genotoxic endotoxin are present in the batch, gH2AX will be positive in the absence of stress.
Magnesium chloride (MgCl2) Research Products International M24000 Nuclear extraction buffer.
Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) Research Products International P40150 Nuclear extraction buffer.
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI Invitrogen S36973 300 nM DAPI with VECTASHIELD Antifade Mounting Medium can be used instead.
Sodium chloride (NaCl) Research Products International S23020 Nuclear extraction buffer.
Sucrose Research Products International S24060 Nuclear extraction buffer.
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 1255015 Polysine Slides can be used instead.
TC-Treated Multiple Well Plates, size 12 wells Costar 3513 Seeding on coverslips is done in 12-wells plate.
Triton X-100 AmericanBio AB02025 Nuclear extraction buffer.
TrypLE Express Enzyme (1X), No Phenol Red Gibco 12604021 Trypsin-EDTA can be used instead.
Trypsin-EDTA (0.5%), No Phenol Red Gibco 15400054 TrypLE can be used instead.

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References

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de la Peña Avalos, B., Dray, E. Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (160), e61447, doi:10.3791/61447 (2020).

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