Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

B&#225;rbara de la Pe&#241;a Avalos; Elo&#239;se Dray

doi:10.3791/61447

JoVE Journal > Biology

Biology

Visualisering av DNA Reparasjon Proteiner Interaksjon ved Immunofluorescence

Published: June 26, 2020

doi:

10.3791/61447

Bárbara de la Peña Avalos², Eloïse Dray²

¹Department of Biochemistry and Structural Biology,University of Texas Health Science Center at San Antonio, ²Mays Cancer Center at UT Health San Antonio MD Anderson Cancer Center

Summary

Etter DNA-skade aktiverer menneskelige celler viktige reparasjonsveier for å gjenopprette integriteten til genomet. Her beskriver vi metoden for indirekte immunofluorescence som et middel til å oppdage DNA-reparasjonsproteiner, analysere deres romlige og timelige rekruttering, og bidra til å avhøre proteinproteininteraksjon på DNA-skadestedene.

Abstract

Pattedyrceller blir stadig utsatt for kjemikalier, stråling, og naturlig forekommende metabolske byprodukter, som skaper bestemte typer DNA-fornærmelser. Gentoksiske midler kan skade DNA-ryggraden, bryte den eller endre den kjemiske karakteren til individuelle baser. Etter DNA-fornærmelse aktiveres DNA-skaderespons (DDR) veier og proteiner som er involvert i reparasjonen, rekrutteres. En mengde faktorer er involvert i å føle typen skade og aktivere riktig reparasjonsrespons. Unnlatelse av å aktivere og rekruttere DDR-faktorer på riktig måte kan føre til genomisk ustabilitet, noe som ligger til grunn for mange menneskelige patologier, inkludert kreft. Studier av DDR-proteiner kan gi innsikt i gentoksisk legemiddelrespons og cellulære mekanismer for legemiddelresistens.

Det er to viktige måter å visualisere proteiner in vivo: direkte observasjon, ved å merke protein av interesse med et fluorescerende protein og følge det ved levende avbildning, eller indirekte immunofluorescens på faste prøver. Mens visualisering av fluorescerende merkede proteiner tillater nøyaktig overvåking over tid, kan direkte merking i N- eller C-terminus forstyrre protein lokalisering eller funksjon. Observasjon av proteiner i deres umodifiserte, endogene versjon foretrekkes. Når DNA reparasjon proteiner er rekruttert til DNA fornærmelse, deres konsentrasjon øker lokalt og de danner grupper, eller “foci”, som kan visualiseres ved indirekte immunofluorescence ved hjelp av bestemte antistoffer.

Selv om påvisning av proteinfoci ikke gir et definitivt bevis på direkte interaksjon, indikerer samtidig lokalisering av proteiner i celler at de omgrupperer seg til skadestedet og kan informere om hendelsesforløpet som kreves for kompleks dannelse. Nøye analyse av foci romlig overlapping i celler som uttrykker vill type eller muterte versjoner av et protein kan gi dyrebare ledetråder om funksjonelle domener som er viktige for DNA reparasjon funksjon. Sist, co-lokalisering av proteiner indikerer mulige direkte interaksjoner som kan verifiseres ved co-immunoprecipitation i celler, eller direkte pulldown ved hjelp av rensede proteiner.

Introduction

Menneskelige celler blir stadig utsatt for en rekke DNA-skadelige midler av forskjellig opprinnelse. Eksogene kilder består for det meste av eksponering for stråling, kjemikalier (inkludert kjemoterapeutiske midler og noen antibiotika), og virus, mens de viktigste endogene kildene inkluderer feil i DNA-replikering og oksidativt stress. De direkte effektene av gentoksisk eksponering kan variere fra en modifisert base til en potensielt dødelig DNA-dobbelttrådbrudd (DSB), avhengig av stress og eksponeringsdose. Til syvende og sist kan ureparerte eller feilreparerte DNA-skader føre til akkumulering av mutasjoner, genomiske omorganiseringer, ustabilitet i genomet og til slutt føre til karsinogenese¹. Pattedyrceller har utviklet komplekse veier for å gjenkjenne bestemte typer DNA-skade²^,³ og reparere dem i tide, synkronisert med cellesyklusprogresjonen.

Iioniserende stråling (IR) skader DNA dobbel helix og skaper dobbel-strand pauser (DSBs), en av de mest skadelige former for DNA-skade. MRN (MRE11, RAD50, NBS1) komplekset fungerer som en sensor av DNA-ender og aktiverer protein kinase ataksi telangiectasia mutert (ATM)⁴^,⁵. Etter den første aktiveringen av ATM av DNA-ender, atm utløser en kaskade av DDR hendelser på stedet av pausen, initiere med en viktig hendelse, fosforylering av histone variant H2AX⁶. H2AX fosforylering på rester S139 aktiverer den i γH2AX, som strekker seg over regioner opp til megabaser rundt DNA-lesjonen^6,^,^7,^,^8,^,⁹. Denne hendelsen øker DNA tilgjengelighet, fører til rekruttering og akkumulering av andre DNA reparasjon proteiner⁷. Fordi γH2AX er rikelig og spesielt indusert omkringliggende DSBer, det kan lett visualiseres ved hjelp av bestemte antistoffer, og brukes vanligvis som en surrogat markør for DSBs i DNA reparasjon feltet. Når pausen er signalisert, aktiverer cellene sine DNA-reparasjonsveier og behandler DNA-skaden. Proteinet MDC1 (mediator av DNA skade sjekkpunkt protein 1) binder direkte γH2AX^10,samhandler med ATM¹¹ og også med NBS1¹²^,¹³. Det bidrar til å øke konsentrasjonen av MRN-komplekset ved DSB og initiere en positiv tilbakemeldingssløyfe i minibanker. γH2AX fjernes raskt når pausen er reparert, slik at overvåking av DSB-clearance. Etterfulgt av mikroskopi gir reduksjonen i γH2AX over tid en indirekte måling av restpauser og DNA-reparasjonseffektivitet.

Eukaryotiske celler kan reparere DSBs ved flere veier, de to viktigste er ikke-homolog ende-joining (NHEJ) og homolog rekombinasjon (HR) (Figur 1). NHEJ i hovedsak ligates DNA dobbel-tråd ender uten bruk av utvidet homologi og opererer gjennom celle syklus¹⁴^,¹⁵. HR blir dominerende under S- og G2-faser, og er ellers undertrykt, siden det krever en søsterkromtid som homolog mal for reparasjon¹⁴^,¹⁶. Pathway valg mellom NHEJ og HR ikke bare avhenger av den fysiske nærheten til søsteren chromatid, men også på utvidelse av DNA end resection¹⁷, som hemmer NHEJ.

Homologi-avhengig DSB reparasjon initierer ved nukleolytisk nedbrytning av 5 ‘strand fra break endene for å generere 3′ single-strand DNA (ssDNA) haler, en prosess referert til som 5’-3 ‘reseksjon. MRN-komplekset initierer DNA-sluttreseksjon og ytterligere reseksjon behandles i kombinasjon med BLM/EXO1 (Bloom syndrom protein/exonuclease 1) eller BLM/DNA2 (DNA-replikering ATP-avhengig helikase/kjerne)^18,^,^19,^,^20,^,^21,^,²². DNA end resection forsterkes av CtIP (CtBP-interagerende protein) gjennom sin direkte interaksjon med MRN kompleks²³ og rekruttering av BRCA1 (brystkreft type 1 følsomhet protein)^24,^,²⁵. Replikering protein A (RPA) binder seg umiddelbart til ssDNA eksponert og blir deretter forskjøvet av rekombinaseproteinet RAD51 for å danne en nukleoproteinfilament som katalyser homolog søk og strandinvasjon²⁶^,²⁷^,²⁸.

Initiering av reseksjon er et kritisk skritt for reparasjonsveivalg. Når reseksjon har initiert, DNA-endene blir fattige substrater for binding av Ku70/Ku80 heterodimer (komponent av NHEJ pathway) og celler er forpliktet til HR¹⁷^,²⁹^,³⁰. Ku70/Ku80 heterodimer binder seg til DSB-endene, rekrutterer DNA-PKcer og p53 Binding Protein 1 (53BP1)^29,^,³⁰. 53BP1 fungerer som en barriere for reseksjon i G1, og blokkerer dermed HR mens du fremmer NHEJ³¹^,³², men det fjernes på en BRCA1-avhengig måte i S-fase, slik at reseksjon kan skje³³^,³⁴. Derfor spiller 53BP1 og BRCA1 motstridende roller i DSB reparasjon, med 53BP1 som en NHEJ tilrettelegger mens BRCA1 fungerer slik at pauser for å reparere gjennom HR.

I laboratoriet kan DSB-formasjon induseres ved irasjonsstråling (IR). Mens dette eksemplet benytter en høy dose av 4 Gy, 1 Gy og 2 Gy også skape en betydelig mengde DSBs, egnet for analyse av foci dannelse av rikelig proteiner. Det er viktig å merke seg at typen og dosen av stråling som brukes kan føre til forskjellige lesjoner i DNA og i cellen: mens IR induserer DSBer, kan det også føre til enkelt trådbrudd eller basemodifisering (se³⁵^,³⁶ for en referanse på bestråling lineær energioverføring (LET) og type DNA-skade). For å bestemme kinetikken til irioniseringsstråleindusert foci (IRIF) formasjon og deres klaring, noe som indikerer reparasjon av skade og reversering av den aktiverte DDR⁸^,^9,^,^37,^,^38,kan foci formasjon overvåkes på forskjellige tidspunkter etter irioniserende stråling. Tidspunktet for aktivering og clearance av alle store DNA-skadeproteiner er^{kjent 39}, og mange undersøkes som surrogatmarkører for viktige hendelser. For eksempel brukes pRPA, som har høy affinitet for ssDNA som surrogat for bruddreseksjonen, MRN-proteiner (MRE11, RAD50, NBS1) og exonucleases kan også brukes til å vurdere reseksjonseffektivitet. Mens RAD51, BRCA1, BRCA2 (brystkreft type 2 følsomhet protein), og PALB2 (partner og lokalisator av BRCA2) kan overvåkes for å evaluere HR effektivitet, tilstedeværelsen av Ku proteiner eller 53BP1, brukes som markører av NHEJ (Figur 1).

Som proteiner av DNA reparasjon maskiner rekruttere hverandre til pause og montere i super-komplekser, DNA-protein og protein-protein interaksjoner kan utledes ved å følge sin individuelle lokalisering over tid og analysere co-lokalisering av proteiner, som visualisert ved overlappende signaler i celle⁴⁰^,⁴¹^,⁴². I cellelinjer tillater innføring av punktmutasjoner eller sletting i spesifikke DNA-reparasjonsgener enten gjennom genomredigering, eller ved overuttrykk av plasmidbaserte mutanter, undersøkelse av spesifikke rester og deres mulige rolle i anerkjennelse av DNA-skade (f.eks. sam lokalisering med γH2AX) eller kompleks montering (sam lokalisering med en annen, eller flere, proteiner), samt deres innvirkning på DNA-reparasjon. Her bruker vi indirekte immunofluorescence som et middel til å undersøke dannelsen og oppløsningen av DSBer ved å følge γH2AX foci over tid. Vi presenterer også ett eksempel på foci dannelse og co-lokalisering analyse av en stor aktør i DSB reparasjon: p53 Binding Protein 1 (53BP1)³². Som nevnt tidligere, 53BP1 anses sentralt for DNA reparasjon pathway valg. Etter 53BP1 akkumulering og dens co-lokalisering med γH2AX gir dyrebar informasjon om celle syklus fase, DNA skade akkumulering, og veien som brukes til å reparere DSBs. Formålet med indirekte immunolokalisering er å vurdere effektiviteten av DNA-skadereparasjon i cellelinjer, etter IR som i denne studien, eller etter eksponering for ulike påkjenninger i cellen, fra DNA-krysskobling til blokkering av replikeringsgaffelen (en liste over DNA-skadelige midler er gitt i tabell 1).

Figur 1: DNA dobbel tråd bryter (DSB) reparasjonsveier.
DSB reparasjon innebærer to store veier: Homolog rekombinasjon (HR, venstre) og ikke-homolog end-joining (NHEJ, høyre). Etter pausen aktiveres proteiner for å markere pausen (γH2AX), delta i sluttreseksjon (MRN), belegge den nye sekteringen ssDNA (pRPA), fremme rekombinasjon (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) eller begrense reseksjon og fremme NHEJ (53BP1). Andre proteiner deltar i skadereparasjon, men proteiner som er oppført, etterfølges rutinemessig av indirekte immunofluorescence. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

DNA-skadelig middel	Virkningsmekanisme	Anbefalt dose
γ-stråler / røntgenstråler	Stråling Dannelse av dobbelttrådet pauser med noen ukontrollerte cellulære effekter	1-4 Gy
^36. Ar ioner	Stråling Dannelse av dobbelttrådet pauser	270 keV/μm
α-partikler	Stråling Dannelse av dobbelttrådet pauser	116 keV/μm
Bleomycin	Hemmer av DNA-syntese	0,4-2 μg/ml
Camptothecin	Hemmer av topoisomerase I	10-200 nM
Cisplatin (andre enn de 1500	Alkylating agent (indusere intrastrand krysskoblinger)	0,25-2 μM
Doksorubicin	Intercalating agent Hemmer av topoisomerase II	10-200 nM
Etoposide	Hemmer av topoisomerase II	10 μM
Hydroksyurea	Hemmer av DNA-syntese (ved ribonucleotide reduktase)	10-200 μM
Metylmetansulfonat	Alkylating agent	0,25-2 mM
Mitomycin C	Alkylating agent	0,25-2 μM
Ultrafiolett (UV) lys	Dannelse av tymidin dimers (genererer forvrengning av DNA-kjede)	50-100 mJ/cm²

Tabell 1: Gentoksiske midler. Eksempler på DNA-skadelige midler, deres virkningsmekanisme og skaden indusert basert på foreslått arbeidskonsentrasjon.

Protocol

1. HeLa cellekultur Pre-treat runde glass dekkerlips med 1 M HCl ved 50 °C i 16-18 timer. Skyll med ddH2O og oppbevar i 100 % EtOH. Forbered cellekulturmedium: Tilsett 10% (v / v) FBS til DMEM medium. Vokse 4,0 x 104 celler/ brønn i steril 12-brønns plate med en 18 mm rund glassdeksler ved 37 °C og 5 % CO2 i en fuktet inkubator. Grow celler til 80% samløpet (ca 24 timer). 2. Cellebehandling med stråling (IR) F…

Representative Results

På dag 2, eller 24 h post seeding celler på coverslips, celler har gjennomgått en divisjon og er 80% samløpet. Spesifikke knock downs eller mutasjoner i DNA reparasjon proteiner kan øke dobling tid, eller sensibilisere celler til gentoksisk behandling, og seeding tetthet samt behandlingsdoser bør justeres tilsvarende. For å fastslå de beste arbeidsforholdene kan tidspunktet for DNA-skaderesponsen etableres ved vestlig blotting av γH2AX over tid, og følsomhet for bestråling kan identifiseres ved koloniformingsa…

Discussion

Analyse av tidspunktet og effektiviteten av DNA-skadereparasjon ved mikroskopi har vist seg å være avgjørende for å forstå hvordan DNA-reparasjonsmaskineriet fungerer, i normale celler og i menneskelige patologier som kreft.

Utviklingen av spesifikke antistoffer som tillater påvisning av aktiverte proteiner i deres fosforylert versjon (som γH2AX, pRPA, pRAD50 og andre¹⁰^,²³^,³⁹^,<sup cl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra San Antonio Area Foundation. Mays Cancer Center støttes av NCI kreftsenter støtte kjerne tilskudd P30 CA054174. Vi vil gjerne takke Stephen Holloway for hans hjelp til å skaffe reagensene, og Sung-laboratoriet for å gi plass og mikroskopikapasitet.

Materials

16% (v/v) paraformaldehyde (PFA) aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	15710	Microscopy quality of the PFA ensures best images. If using "home-made PFA", filter prior to use.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	Heat-shock fraction is recommended, to avoid precipitation/background.
Coverglass #1, 18 mm round (coverslips)	Neuvitro	NC0308920	Coverslips need to be cleaned and sterilized prior using, with HCl or ethanol.
DMEM, High Glucose [(+) 4.5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Sodium Pyruvate]	Gibco	11965118	Adjust the growing media to the needs of cell line used.
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144	PBS for tissue culture.
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Research Products International	E57060	Nuclear extraction buffer.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	104370028	The quality of FBS can be assessed by testing gH2AX foci formation. If traces of genotoxic endotoxin are present in the batch, gH2AX will be positive in the absence of stress.
Magnesium chloride (MgCl₂)	Research Products International	M24000	Nuclear extraction buffer.
Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)	Research Products International	P40150	Nuclear extraction buffer.
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI	Invitrogen	S36973	300 nM DAPI with VECTASHIELD Antifade Mounting Medium can be used instead.
Sodium chloride (NaCl)	Research Products International	S23020	Nuclear extraction buffer.
Sucrose	Research Products International	S24060	Nuclear extraction buffer.
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	1255015	Polysine Slides can be used instead.
TC-Treated Multiple Well Plates, size 12 wells	Costar	3513	Seeding on coverslips is done in 12-wells plate.
Triton X-100	AmericanBio	AB02025	Nuclear extraction buffer.
TrypLE Express Enzyme (1X), No Phenol Red	Gibco	12604021	Trypsin-EDTA can be used instead.
Trypsin-EDTA (0.5%), No Phenol Red	Gibco	15400054	TrypLE can be used instead.

References

Prakash, R., Zhang, Y., Feng, W., Jasin, M. Homologous recombination and human health: the roles of BRCA1, BRCA2, and associated proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), 016600 (2015).
Jalan, M., Olsen, K. S., Powell, S. N. Emerging Roles of RAD52 in Genome Maintenance. Cancers (Basel). 11 (7), (2019).
Oh, J., Symington, L. S. Role of the Mre11 Complex in Preserving Genome Integrity. Genes (Basel). 9 (12), (2018).
Uziel, T., et al. Requirement of the MRN complex for ATM activation by DNA damage. The EMBO Journal. 22 (20), 5612-5621 (2003).
Lee, J. H., Paull, T. T. ATM activation by DNA double-strand breaks through the Mre11-Rad50-Nbs1 complex. Science. 308 (5721), 551-554 (2005).
Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273, 5858-5868 (1998).
Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. γ-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Research. 36 (17), 5678-5694 (2008).
Martin, O. A., Pilch, D. R., Redon, C., Bonner, W. M. Histone H2AX in DNA damage repair. Cancer Biology & Therapy. 2 (3), 233-235 (2003).
Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. Journal of Cell Biology. 146 (5), 905-916 (1999).
Stucki, M., et al. MDC1 directly binds phosphorylated histone H2AX to regulate cellular responses to DNA double-strand breaks. Cell. 123 (7), 1213-1226 (2005).
Lou, Z., et al. MDC1 maintains genomic stability by participating in the amplification of ATM-dependent DNA damage signals. Molecular Cell. 21 (2), 187-200 (2006).
Chapman, J. R., Jackson, S. P. Phospho-dependent interaction between NBS1 and MDC1 mediate chromatin retention of the MRN complex at sites of DNA damage. EMBO Reports. 9 (8), 795-801 (2008).
Melander, F., et al. Phosphorylation of SDT repeats in the MDC1 N terminus triggers retention of NBS1 at the DNA damage-modified chromatin. Journal of Cell Biology. 181 (2), 213-226 (2008).
Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nature Review. Molecular Cell Biology. 9 (4), 297-308 (2008).
Chiruvella, K. K., Liang, Z., Wilson, T. E. Repair of double-strand breaks by end joining. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (5), 012757 (2013).
Mehta, A., Haber, J. E. Sources of DNA double-strand breaks and models of recombinational DNA repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (9), 016428 (2014).
Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45, 247-271 (2011).
Huertas, P. DNA resection in eukaryotes: deciding how to fix the break. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (1), 11-16 (2010).
Nimonkar, A. V., et al. BLM-DNA2-RPA-MRN and EXO1-BLM-RPA-MRN constitute two DNA end resection machineries for human DNA break repair. Genes & Development. 25 (4), 350-362 (2011).
Garcia, V., Phelps, S. E. L., Gray, S., Neale, M. J. Bidirectional resection of DNA double-strand breaks by Mre11 and Exo1. Nature. 479 (7372), 241-244 (2011).
Sturzenegger, A., et al. DNA2 cooperates with the WRN and BLM RecQ helicases to mediate long-range DNA end resection in human cells. Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 27314-27326 (2014).
Daley, J. M., Niu, H., Miller, A. S., Sung, P. Biochemical mechanism of DSB end resection and its regulation. DNA Repair. 32, 66-74 (2015).
Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).
Chen, L., Nievera, C. J., Lee, A. Y. L., Wu, X. Cell cycle-dependent complex formation of BRCA1-CtIP-MRN is important for DNA double-strand break repair. Journal of Biological Chemistry. 283, 7713-7720 (2008).
Yun, M. H., Hiom, K. CtIP-BRCA1 modulates the choice of DNA double-strand break repair pathway throughout the cell cycle. Nature. 459 (7245), 460-463 (2009).
Sung, P., Klein, H. Mechanism of homologous recombination: mediators and helicases take on regulatory functions. Nature Review. Molecular Cell Biology. 7, 739-750 (2006).
San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanisms of eukaryotic homologous recombination. Annual Review of Biochemistry. 77, 229-257 (2008).
Jasin, M., Rothstein, R. Repair of strand breaks by homologous recombination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (11), 012740 (2013).
Dynan, W. S., Yoo, S. Interaction of Ku protein and DNA-dependent protein kinase catalytic subunit with nucleic acids. Nucleic Acids Research. 26 (7), 1551-1559 (1998).
Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
Cejka, P. DNA end resection: nucleases team up with the right partners to initiate homologous recombination. Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 22931-22938 (2015).
Mirman, Z., de Lange, T. 53BP1: a DSB escort. Genes & Development. 34, 7-23 (2020).
Cao, L., et al. A selective requirement for 53BP1 in the biological response to genomic instability induces by BRCA1 deficiency. Molecular Cell. 35 (4), 534-541 (2009).
Zimmermann, M., de Lange, T. 53BP1: Pro choice in DNA repair. Trends in Cell Biology. 24 (2), 108-117 (2014).
Mavragani, I. V., Nikitaki, Z., Kalospyros, S. A., Georgakilas, A. G. Ionizing Radiation and Complex DNA Damage: From Prediction to Detection Challenges and Biological Significance. Cancers (Basel). 11 (11), (2019).
Nikitaki, Z., et al. Measurement of complex DNA damage induction and repair in human cellular systems after exposure to ionizing radiations of varying linear energy transfer (LET). Free Radical Research. 50, 64-78 (2016).
Redon, C., et al. Histone H2A variants H2AX and H2AZ. Current Opinion in Genetics & Development. 12 (2), 162-169 (2002).
Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA Repair. 3 (8-9), 959-967 (2004).
Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
Sy, S. M. H., Huen, M. S. Y., Chen, J. PALB2 is an integral component of the BRCA complex required for homologous recombination repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (17), 7155-7160 (2009).
Buisson, R., Masson, J. Y. PALB2 self-interaction controls homologous recombination. Nucleic Acids Research. 40 (20), 10312-10323 (2012).
Belotserkovskaya, R., et al. PALB2 chromatin recruitment restores homologous recombination in BRCA1-deficient cells depleted of 53BP1. Nature Communications. 11 (1), 819 (2020).
Betts, J. A., et al. Long noncoding RNAs CUPID1 and CUPID2 mediate breast cancer risk at 11q13 by modulating the response to DNA damage. American Journal of Human Genetics. 101 (2), 255-266 (2017).
Dray, E., et al. Molecular basis for enhancement of the meiotic DMC1 recombinase by RAD51 associated protein 1 (RAD51AP1). Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (9), 3560-3565 (2011).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

de la Peña Avalos, B., Dray, E. Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (160), e61447, doi:10.3791/61447 (2020).