Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Visualisering av DNA Reparasjon Proteiner Interaksjon ved Immunofluorescence

doi: 10.3791/61447 Published: June 26, 2020

Summary

Etter DNA-skade aktiverer menneskelige celler viktige reparasjonsveier for å gjenopprette integriteten til genomet. Her beskriver vi metoden for indirekte immunofluorescence som et middel til å oppdage DNA-reparasjonsproteiner, analysere deres romlige og timelige rekruttering, og bidra til å avhøre proteinproteininteraksjon på DNA-skadestedene.

Abstract

Pattedyrceller blir stadig utsatt for kjemikalier, stråling, og naturlig forekommende metabolske byprodukter, som skaper bestemte typer DNA-fornærmelser. Gentoksiske midler kan skade DNA-ryggraden, bryte den eller endre den kjemiske karakteren til individuelle baser. Etter DNA-fornærmelse aktiveres DNA-skaderespons (DDR) veier og proteiner som er involvert i reparasjonen, rekrutteres. En mengde faktorer er involvert i å føle typen skade og aktivere riktig reparasjonsrespons. Unnlatelse av å aktivere og rekruttere DDR-faktorer på riktig måte kan føre til genomisk ustabilitet, noe som ligger til grunn for mange menneskelige patologier, inkludert kreft. Studier av DDR-proteiner kan gi innsikt i gentoksisk legemiddelrespons og cellulære mekanismer for legemiddelresistens.

Det er to viktige måter å visualisere proteiner in vivo: direkte observasjon, ved å merke protein av interesse med et fluorescerende protein og følge det ved levende avbildning, eller indirekte immunofluorescens på faste prøver. Mens visualisering av fluorescerende merkede proteiner tillater nøyaktig overvåking over tid, kan direkte merking i N- eller C-terminus forstyrre protein lokalisering eller funksjon. Observasjon av proteiner i deres umodifiserte, endogene versjon foretrekkes. Når DNA reparasjon proteiner er rekruttert til DNA fornærmelse, deres konsentrasjon øker lokalt og de danner grupper, eller "foci", som kan visualiseres ved indirekte immunofluorescence ved hjelp av bestemte antistoffer.

Selv om påvisning av proteinfoci ikke gir et definitivt bevis på direkte interaksjon, indikerer samtidig lokalisering av proteiner i celler at de omgrupperer seg til skadestedet og kan informere om hendelsesforløpet som kreves for kompleks dannelse. Nøye analyse av foci romlig overlapping i celler som uttrykker vill type eller muterte versjoner av et protein kan gi dyrebare ledetråder om funksjonelle domener som er viktige for DNA reparasjon funksjon. Sist, co-lokalisering av proteiner indikerer mulige direkte interaksjoner som kan verifiseres ved co-immunoprecipitation i celler, eller direkte pulldown ved hjelp av rensede proteiner.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Menneskelige celler blir stadig utsatt for en rekke DNA-skadelige midler av forskjellig opprinnelse. Eksogene kilder består for det meste av eksponering for stråling, kjemikalier (inkludert kjemoterapeutiske midler og noen antibiotika), og virus, mens de viktigste endogene kildene inkluderer feil i DNA-replikering og oksidativt stress. De direkte effektene av gentoksisk eksponering kan variere fra en modifisert base til en potensielt dødelig DNA-dobbelttrådbrudd (DSB), avhengig av stress og eksponeringsdose. Til syvende og sist kan ureparerte eller feilreparerte DNA-skader føre til akkumulering av mutasjoner, genomiske omorganiseringer, ustabilitet i genomet og til slutt føre til karsinogenese1. Pattedyrceller har utviklet komplekse veier for å gjenkjenne bestemte typer DNA-skade2,3 og reparere dem i tide, synkronisert med cellesyklusprogresjonen.

Iioniserende stråling (IR) skader DNA dobbel helix og skaper dobbel-strand pauser (DSBs), en av de mest skadelige former for DNA-skade. MRN (MRE11, RAD50, NBS1) komplekset fungerer som en sensor av DNA-ender og aktiverer protein kinase ataksi telangiectasia mutert (ATM)4,5. Etter den første aktiveringen av ATM av DNA-ender, atm utløser en kaskade av DDR hendelser på stedet av pausen, initiere med en viktig hendelse, fosforylering av histone variant H2AX6. H2AX fosforylering på rester S139 aktiverer den i γH2AX, som strekker seg over regioner opp til megabaser rundt DNA-lesjonen6,,7,,8,,9. Denne hendelsen øker DNA tilgjengelighet, fører til rekruttering og akkumulering av andre DNA reparasjon proteiner7. Fordi γH2AX er rikelig og spesielt indusert omkringliggende DSBer, det kan lett visualiseres ved hjelp av bestemte antistoffer, og brukes vanligvis som en surrogat markør for DSBs i DNA reparasjon feltet. Når pausen er signalisert, aktiverer cellene sine DNA-reparasjonsveier og behandler DNA-skaden. Proteinet MDC1 (mediator av DNA skade sjekkpunkt protein 1) binder direkte γH2AX10,samhandler med ATM11 og også med NBS112,13. Det bidrar til å øke konsentrasjonen av MRN-komplekset ved DSB og initiere en positiv tilbakemeldingssløyfe i minibanker. γH2AX fjernes raskt når pausen er reparert, slik at overvåking av DSB-clearance. Etterfulgt av mikroskopi gir reduksjonen i γH2AX over tid en indirekte måling av restpauser og DNA-reparasjonseffektivitet.

Eukaryotiske celler kan reparere DSBs ved flere veier, de to viktigste er ikke-homolog ende-joining (NHEJ) og homolog rekombinasjon (HR) (Figur 1). NHEJ i hovedsak ligates DNA dobbel-tråd ender uten bruk av utvidet homologi og opererer gjennom celle syklus14,15. HR blir dominerende under S- og G2-faser, og er ellers undertrykt, siden det krever en søsterkromtid som homolog mal for reparasjon14,16. Pathway valg mellom NHEJ og HR ikke bare avhenger av den fysiske nærheten til søsteren chromatid, men også på utvidelse av DNA end resection17, som hemmer NHEJ.

Homologi-avhengig DSB reparasjon initierer ved nukleolytisk nedbrytning av 5 'strand fra break endene for å generere 3' single-strand DNA (ssDNA) haler, en prosess referert til som 5'-3 'reseksjon. MRN-komplekset initierer DNA-sluttreseksjon og ytterligere reseksjon behandles i kombinasjon med BLM/EXO1 (Bloom syndrom protein/exonuclease 1) eller BLM/DNA2 (DNA-replikering ATP-avhengig helikase/kjerne)18,,19,,20,,21,,22. DNA end resection forsterkes av CtIP (CtBP-interagerende protein) gjennom sin direkte interaksjon med MRN kompleks23 og rekruttering av BRCA1 (brystkreft type 1 følsomhet protein)24,,25. Replikering protein A (RPA) binder seg umiddelbart til ssDNA eksponert og blir deretter forskjøvet av rekombinaseproteinet RAD51 for å danne en nukleoproteinfilament som katalyser homolog søk og strandinvasjon26,27,28.

Initiering av reseksjon er et kritisk skritt for reparasjonsveivalg. Når reseksjon har initiert, DNA-endene blir fattige substrater for binding av Ku70/Ku80 heterodimer (komponent av NHEJ pathway) og celler er forpliktet til HR17,29,30. Ku70/Ku80 heterodimer binder seg til DSB-endene, rekrutterer DNA-PKcer og p53 Binding Protein 1 (53BP1)29,,30. 53BP1 fungerer som en barriere for reseksjon i G1, og blokkerer dermed HR mens du fremmer NHEJ31,32, men det fjernes på en BRCA1-avhengig måte i S-fase, slik at reseksjon kan skje33,34. Derfor spiller 53BP1 og BRCA1 motstridende roller i DSB reparasjon, med 53BP1 som en NHEJ tilrettelegger mens BRCA1 fungerer slik at pauser for å reparere gjennom HR.

I laboratoriet kan DSB-formasjon induseres ved irasjonsstråling (IR). Mens dette eksemplet benytter en høy dose av 4 Gy, 1 Gy og 2 Gy også skape en betydelig mengde DSBs, egnet for analyse av foci dannelse av rikelig proteiner. Det er viktig å merke seg at typen og dosen av stråling som brukes kan føre til forskjellige lesjoner i DNA og i cellen: mens IR induserer DSBer, kan det også føre til enkelt trådbrudd eller basemodifisering (se35,36 for en referanse på bestråling lineær energioverføring (LET) og type DNA-skade). For å bestemme kinetikken til irioniseringsstråleindusert foci (IRIF) formasjon og deres klaring, noe som indikerer reparasjon av skade og reversering av den aktiverte DDR8,9,,37,,38,kan foci formasjon overvåkes på forskjellige tidspunkter etter irioniserende stråling. Tidspunktet for aktivering og clearance av alle store DNA-skadeproteiner erkjent 39, og mange undersøkes som surrogatmarkører for viktige hendelser. For eksempel brukes pRPA, som har høy affinitet for ssDNA som surrogat for bruddreseksjonen, MRN-proteiner (MRE11, RAD50, NBS1) og exonucleases kan også brukes til å vurdere reseksjonseffektivitet. Mens RAD51, BRCA1, BRCA2 (brystkreft type 2 følsomhet protein), og PALB2 (partner og lokalisator av BRCA2) kan overvåkes for å evaluere HR effektivitet, tilstedeværelsen av Ku proteiner eller 53BP1, brukes som markører av NHEJ (Figur 1).

Som proteiner av DNA reparasjon maskiner rekruttere hverandre til pause og montere i super-komplekser, DNA-protein og protein-protein interaksjoner kan utledes ved å følge sin individuelle lokalisering over tid og analysere co-lokalisering av proteiner, som visualisert ved overlappende signaler i celle40,41,42. I cellelinjer tillater innføring av punktmutasjoner eller sletting i spesifikke DNA-reparasjonsgener enten gjennom genomredigering, eller ved overuttrykk av plasmidbaserte mutanter, undersøkelse av spesifikke rester og deres mulige rolle i anerkjennelse av DNA-skade (f.eks. sam lokalisering med γH2AX) eller kompleks montering (sam lokalisering med en annen, eller flere, proteiner), samt deres innvirkning på DNA-reparasjon. Her bruker vi indirekte immunofluorescence som et middel til å undersøke dannelsen og oppløsningen av DSBer ved å følge γH2AX foci over tid. Vi presenterer også ett eksempel på foci dannelse og co-lokalisering analyse av en stor aktør i DSB reparasjon: p53 Binding Protein 1 (53BP1)32. Som nevnt tidligere, 53BP1 anses sentralt for DNA reparasjon pathway valg. Etter 53BP1 akkumulering og dens co-lokalisering med γH2AX gir dyrebar informasjon om celle syklus fase, DNA skade akkumulering, og veien som brukes til å reparere DSBs. Formålet med indirekte immunolokalisering er å vurdere effektiviteten av DNA-skadereparasjon i cellelinjer, etter IR som i denne studien, eller etter eksponering for ulike påkjenninger i cellen, fra DNA-krysskobling til blokkering av replikeringsgaffelen (en liste over DNA-skadelige midler er gitt i tabell 1).

Figure 1
Figur 1: DNA dobbel tråd bryter (DSB) reparasjonsveier.
DSB reparasjon innebærer to store veier: Homolog rekombinasjon (HR, venstre) og ikke-homolog end-joining (NHEJ, høyre). Etter pausen aktiveres proteiner for å markere pausen (γH2AX), delta i sluttreseksjon (MRN), belegge den nye sekteringen ssDNA (pRPA), fremme rekombinasjon (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) eller begrense reseksjon og fremme NHEJ (53BP1). Andre proteiner deltar i skadereparasjon, men proteiner som er oppført, etterfølges rutinemessig av indirekte immunofluorescence. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

DNA-skadelig middel Virkningsmekanisme Anbefalt dose
γ-stråler / røntgenstråler Stråling
Dannelse av dobbelttrådet pauser med noen ukontrollerte cellulære effekter
1-4 Gy
36. Ar ioner Stråling
Dannelse av dobbelttrådet pauser
270 keV/μm
α-partikler Stråling
Dannelse av dobbelttrådet pauser
116 keV/μm
Bleomycin Hemmer av DNA-syntese 0,4-2 μg/ml
Camptothecin Hemmer av topoisomerase I 10-200 nM
Cisplatin (andre enn de 1500 Alkylating agent
(indusere intrastrand krysskoblinger)
0,25-2 μM
Doksorubicin Intercalating agent
Hemmer av topoisomerase II
10-200 nM
Etoposide Hemmer av topoisomerase II 10 μM
Hydroksyurea Hemmer av DNA-syntese
(ved ribonucleotide reduktase)
10-200 μM
Metylmetansulfonat Alkylating agent 0,25-2 mM
Mitomycin C Alkylating agent 0,25-2 μM
Ultrafiolett (UV) lys Dannelse av tymidin dimers
(genererer forvrengning av DNA-kjede)
50-100 mJ/cm2

Tabell 1: Gentoksiske midler. Eksempler på DNA-skadelige midler, deres virkningsmekanisme og skaden indusert basert på foreslått arbeidskonsentrasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. HeLa cellekultur

  1. Pre-treat runde glass dekkerlips med 1 M HCl ved 50 °C i 16-18 timer. Skyll med ddH2O og oppbevar i 100 % EtOH.
  2. Forbered cellekulturmedium: Tilsett 10% (v / v) FBS til DMEM medium.
  3. Vokse 4,0 x 104 celler/ brønn i steril 12-brønns plate med en 18 mm rund glassdeksler ved 37 °C og 5 % CO2 i en fuktet inkubator. Grow celler til 80% samløpet (ca 24 timer).

2. Cellebehandling med stråling (IR)

  1. For å indusere dannelsen av dobbelttrådbrudd, utsett cellene for 4 Gy γ-bestråling (kontroll: Ingen bestråling, t = 0). I Gamma Cell -40 tilsvarer dette 4,54 min, ved 0,815 Gy per min.
  2. Inkuber celler ved 37 °C og 5 % CO2 i en fuktet inkubator for riktig tidslengde (tidspunkter valgt her t=1, 2, 4, 16 timer).

3. Kjernefysisk utvinning og cellefiksering

  1. Klargjør lagerløsninger: 0,2 M RØR (pH 6,8), 5 M NaCl, 2 M sukrose, 1 M MgCl2,0,1 M EGTA (pH 8,0).
  2. Klargjør kjernefysisk ekstraksjonsbuffer (NEB): oppløs 10 mM RØR (pH 6,8), 100 mM NaCl, 300 mM sukrose, 3 mM MgCl2,1 mM EGTA (pH 8,0) og 0,5% (v/v) Triton X-100 i ddH2O. Mix til den er oppløst helt.
  3. Forbered 4 % (v/v) paraformaldehyd (PFA): oppløs 10 ml 16 % PFA vandig oppløsning i 30 ml PBS. Bland til den er helt oppløst.
  4. Ved passende tidspunkt (t= 0, 1, 2, 4, 16 h), vask celler to ganger med 1 ml PBS. Fjern PBS helt.
  5. Tilsett 200 μL NEB til hver brønn for cellekjerner ekstraksjon (cytoplasma er degradert, bare kjerne gjenstår) (Figur 2). Inkuber i 2 minutter ved romtemperatur og fjern helt.
    MERK: Ikke oversteg 2 minutter.

Figure 2
Figur 2: Kjernefysisk utvinning.
Representative bilder av celler før (venstre) og post (høyre) kjernefysisk utvinning. Cytoplasma bør fordøyes, men atomstrukturen bør forbli intakt post utvinning (høyre). (A) 20x forstørrelse; skala bar = 20 μm og (B) 40x forstørrelse; vektstangen = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Vask celler med 1 ml PBS. Fjern PBS helt. Legg pbs nøye, celler er svært skjøre på dette trinnet.
  2. Tilsett 200 μL på 4 % (v/v) PFA i hver brønn for cellefiksering. Inkuber i 10 minutter ved 4 °C. Fjern PFA helt.
  3. Legg til 1 ml PBS.
    MERK: Celler kan lagres i PBS ved 4 °C.

4. Immunofluorescence flekker

  1. Klargjør blokkeringsløsning: Oppløs 5 % BSA (w/v) i PBS og tilsett 0,3 % (v/v) Triton X-100. Bland til den er helt oppløst.
  2. Klargjør fortynningsbuffer: oppløs 1 % BSA (w/v) i PBS og tilsett 0,3 % (v/v) Triton X-100. Bland til den er helt oppløst.
  3. For blokkering, tilsett 200 μL blokkerende løsning til hver brønn. Inkuber i 2 timer ved romtemperatur eller 16-18 timer ved 4 °C.
    MERK: Hvis geiteantistoff vil bli brukt, tilsett 5% geiteserum til blokkeringsløsning.
  4. Fortynn primærantistoff i fortynningsbuffer (1:500; se tabell 2 for antistoffliste) og virvel til det er godt blandet.
    MERK: Hvis geiteantistoff brukes, tilsett 1% geiteserum til fortynningsbufferen.
  5. I en fuktighets-/inkubasjonsboks, hold et stykke parafilm. Tilsett 10 μL primært antistoff (i en enkelt dråpe). Juster den ene kanten av dekkglasset etter dråpen og senk sakte ned på parafilmen, slik at væsken skal spre seg over hele (unngå bobler hvis mulig). Inkuber i 2 timer ved romtemperatur.
  6. Vask dekkglass tre ganger i PBS i 1 minutt.
  7. Fortynn sekundært antistoff i fortynningsbuffer (endelig konsentrasjon: 2 μg/ml) og virvel til det er godt blandet.
  8. Påfør 10 μL sekundært antistoff som beskrevet for de primære antistoffene. Inkuber i 2 timer ved romtemperatur.
    MERK: Beskytt mot lys.
Antistoff Selskapet Referanse Kilde
53BP1 Leilighet Cellesignalering 4937 Kanin
Anti-mus IgG H & L (Alexa Fluor 647) Abcam 150103 Leilighet Esel
Antifosfo-Histone H2A. X (Ser139), klone JBW301 Millipore (andre) 05-636 Mus (mus)
Anti-kanin IgG H & L (Alexa Fluor 488) Abcam 150081 150081 Geit

Tabell 2: Antistoffer som brukes. Liste over antistoffer som brukes i denne studien.

  1. Vask dekkglass tre ganger i PBS i 1 minutt.
  2. Vask dekkglass med H2O i 1 minutt.
  3. Motvirke DNA med DAPI: påfør 10 μL på 300 nM DAPI (som beskrevet for antistoffer), inkuber i 30 minutter ved romtemperatur og monter deretter på glasssklie med et glyserolbasert monteringsmedie. Alternativt kan du legge til en dråpe (10 μL) av kommersielle antifademonteringsmedier som inneholder DAPI på et lysbilde og bruke en dekkslips. Trykk forsiktig på dekkslippen og fjern overflødig væske rundt den med et papirhåndkle.
  4. Forsegle dekkglass med gjennomsiktig neglelakk og la dem tørke i 20 minutter.
  5. Oppbevar lysbildene ved 4 °C.

5. Bildeanskaffelse

  1. Legg en dråpe nedsenkingsolje på 60x objektivobjektiven. Bruk DAPI til å lokalisere kjernene gjennom øyestykket.
    1. For XYZ bilde oppkjøp, åpen oppkjøp programvare og velg parametere: Skanner type: Galvano; Skannermodus: Rundtur; Bilde størrelse: 512 × 512; PMT-modus: VBF; PMT gjennomsnitt: ramme (4 ganger); PMT sekvensiell skanning: linje.
    2. Velg fargestoffet og detektorene:
      Kanal (CH1), Fargestoff (DAPI), Detektor (SD1)
      Kanal (CH2), Fargestoff (Alexa Fluor 488), Detektor (HSD3)
      Kanal (CH3), Fargestoff (Alexa Fluor 647), Detektor (HSD4)
    3. Velg i "Z".
  2. Juster det direktesendte bildet. Trykk på Live-knappen i Live-vinduet.
    1. Juster fokus og angi laserintensitet (%), følsomhet (HV), forsterkning og offset på "PMT" verktøyvinduet.
      1. Juster laserintensiteten (%): for lysstyrke og bleking. Jo høyere laserintensiteten er, desto sterkere er signalet, men prøven vil fotobleach.
      2. Juster følsomheten (HV): støynivå. Jo høyere HV, jo sterkere signalet, men bildet vil være støyende hvis for høyt.
        MERK: Hold alltid spenningen konstant.
      3. Juster forskyvningen: bakgrunnsnivå.
    2. Velg Start/slutt (15 skiver) for Z-stabler.
  3. Start oppkjøpet.
    1. Velg mappen for å lagre bilder. Trykk på LSM Start-knappen for å begynne å anskaffe bildet. Trykk på Serie ferdig-knappen for å fullføre bildeanskaffelsen.

6. Dataanalyse

  1. Åpne analyseprogramvaren for bildeanalyse.
    1. Trykk batchverktøyvinduet, velg bildene du vil analysere, og velg utdatamappe.
    2. Trykk på analyseverktøyvinduet, og velg Projeksjon (vil vise maksimal intensitetsprojeksjon fra 15 skiver).
    3. Velg den partiopprettedeunder Inndata-/utdatainnstilling.
    4. Trykk prosess for bilder som skal behandles.
    5. Eksporter bilder som TIFF-filer.
  2. For kjernefysisk foci kvantifisering, åpne CellProfiler.
    1. Åpne γH2AX og 53BP1 foci kvantifiseringsrørledningen (se Tilleggsinformasjon).
    2. Grafer data ved hjelp av en tabellprogramvare.
  3. Åpne CellProfiler for analyse av sam lokalisering.
    1. Åpne colocalization-rørledningen (se Tilleggsinformasjon). En regnearkfil opprettes og lagres på foretrukket sted. Grafer selv lagres imidlertid ikke automatisk. Det anbefales å ta et øyeblikksbilde av vinduene for å holde oversikt over resultatene.
    2. Grafer data ved hjelp av en tabellprogramvare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

På dag 2, eller 24 h post seeding celler på coverslips, celler har gjennomgått en divisjon og er 80% samløpet. Spesifikke knock downs eller mutasjoner i DNA reparasjon proteiner kan øke dobling tid, eller sensibilisere celler til gentoksisk behandling, og seeding tetthet samt behandlingsdoser bør justeres tilsvarende. For å fastslå de beste arbeidsforholdene kan tidspunktet for DNA-skaderesponsen etableres ved vestlig blotting av γH2AX over tid, og følsomhet for bestråling kan identifiseres ved koloniformingsanalyse.

Celler som ikke behandles med bestråling viser lite, om noen, γH2AX foci (figur 3A). ΓH2AX foci dannelse kan imidlertid utløses i kultiverte celler av ulike påkjenninger som er iboende til vekstforholdene: celler igjen samtidig i sure medier, tilstedeværelse av gentoksisk endotoksin i FBS, oksygenkonsentrasjon som brukes til kultur, for å sitere noen.

Figure 3
Figur 3: Kjernefysiske foci uten stress.
I fravær av ekstern stressor observeres svært få hvis noen γH2AX foci (A). I fravær av essensielle DNA reparasjon proteiner, γH2AX akkumulering kan observeres som pauser som oppstår på grunn av endogene kilder ikke er reparert (B). Akkumulering av ureparerte pauser kan føre til at celler blir pre-apoptotiske, som er preget av en "solid" γH2AX kjernefarging (C). Vektstangen = 5 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

I tillegg, i celler utarmet for viktige DNA skade proteiner, som BRCA1 eller BRCA2 mutant celler, DNA pauser som oppstår som følge av endogene påkjenninger er ikke reparert som i vill-type celler, og akkumuleres. Som et resultat kan forhøyet γH2AX observeres i HR-mangelfulle celler, selv under normale vekstforhold (figur 3B). En underpopulasjon av celler kan vise "solid" kjernefysisk farging med γH2AX (figur 3C). Pan-kjernefysisk flekk kan indikere at en celle er overveldet av skade utover reparasjon, og / eller er pre-apoptotisk. Slike celler er vanligvis preget av forstørrede kjerner, og tilstedeværelsen av cytoplasmatiske vakuoler. I tillegg kan γH2AX utløses av replikerende stress i S-fase og stoppet replikering gafler, eller ved G2/M-arrestasjon. Om nødvendig kan cellesyklusfaser identifiseres ved å farge DNA-innholdet eller co-farging med bestemte markører. Ved gjennomføring av DNA skade reparasjon analyse, pan-kjernefysisk kan kvantifiseres uavhengig av individualisert foci.

Etter bestråling viser kjerner et stort antall doble trådbrudd som γH2AX lokaliserer ekstremt raskt (figur 4). Under optimale forhold observeres få hvis noen γH2AX foci i fravær av bestråling. Etter bestråling øker dannelsen av γH2AX foci kraftig. Hvis pausene behandles og repareres, reduseres foci-tellingen per kjerner, samt antall celler som er positive for foci. Intensiteten og antall foci varierer avhengig av cellelinjen som brukes og dosen av bestråling levert. I helaceller med lav passasje, dyrket i endotoxinfritt serum, observerte vi rutinemessig en kraftig økning av foci ved 30 minutter og 1 t etter bestråling, som topper mellom 1 og 2 timer, og reduseres deretter gradvis til 16 timer. Av denne grunn presenteres representative tidspunkter på 0, 1, 2, 4 og 16 t etter bestråling her. Oppførselen til pausesignalering, reparasjon og overlevelse til bestråling kan variere sterkt mellom cellelinjer så vel som ved uttømming eller mutasjon av gener. Av denne grunn vil de mest hensiktsmessige tidspunktene være eksperiment- og celleavhengige. I forsøket, ved 16 h γH2AX gjenværende foci har nådd samme basalnivå enn ikke-bestrålte celler. Overvåking av gjenværende foci for å inkludere senere tidspunkter foreslås hvis du arbeider med sakte dele cellelinjer.

Figure 4
Figur 4: Kjernefysisk foci og kvantifisering etter stress (tidskurs).
γH2AX foci dannelse ved t = 0 (ingen bestråling) og på de angitte tidspunktene etter bestråling (4 Gy, t = 1, 2, 4, 16 h). (A) Representative bilder vises. DAPI indikerer kjernene. Vektstangen = 5 μm. (B) Kjernefysiske foci av γH2AX etter eksponering for γ-bestråling ble scoret ved automatisert kvantifisering (CellProfiler) i ≥ 100 kjerner for hvert tidspunkt. Avhengig av det biologiske spørsmålet som er reist og hvilken type data som er innhentet, er ulike alternativer tilgjengelige for å presentere rådata, for å lette sammenligning og kritisk forståelse. (i) Skyplottet viser gjennomsnitt ± SD. Symbol (*) indikerer statistisk signifikans i forhold til kontroll, ved hjelp av Studentens to tailed t-test: *** p ≤ 0,0001, (ii) induksjonskurve viser gjennomsnitt ± SEM, (iii) mer enn 10 foci per kjerne. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Omvendt, i celler mangelfull for DNA skade reparasjonsfunksjoner, γH2AX foci akkumuleres i fravær av bestråling (t = 0 h) og reparasjonen kan bli forsinket, eller fraværende selv på lange tidspunkter (t = 16 h, t = 24 h) etter bestråling. Direkte sammenligning mellom vill type og muterte celler kan gi verdifull informasjon om DNA reparasjonsfunksjonen til genet mutert, og hint på typen reparasjon. Mens en mangel på NHEJ kan tvinge pausen til å bli reparert av HR i S-fase, vil DSB-er som har blitt resected og må repareres av HR ikke bli reparert av NHEJ. Av denne grunn kan akkumulering av skade etter S-fase indikere en HR-mangel, og høye γH2AX nivåer post divisjon hint på NHEJ defekter.

Når flere proteiner undersøkes i de samme cellene, kan samtidig lokalisering studeres ved multipleksing av primære antistoffer oppvokst i forskjellige dyrearter og avsløre disse med sekundære antistoffer merket med distinkte fluoroforer (figur 5). Co-lokalisering indikerer om proteiner (i) rekrutteres til pause (ii) rekrutteres i tide, (iii) montere i DNA reparasjonskomplekser. Når du ser etter sam lokalisering, er en allment akseptert kvalitativ metode å presentere resultater som et enkelt overlegg av de forskjellige kanalene (det vil si grønt og rødt). Superposisjon av grønt og rødt vil gi opphav til gule hotspots, hvor de to proteinene av interesse er tilstede i de samme pikslene (Figur 5A). Denne metoden har imidlertid begrensninger, siden den er avhengig av den relative signalintensiteten som samles inn i begge kanalene, og de to fluorokromene kan ha forskjeller i signalstyrke. Overleggsmetoder bidrar derfor til å generere et visuelt estimat av sam lokaliseringshendelser, men er ikke egnet for kvantitative formål. Kvantitativ analyse av sam lokalisering kan oppnås ved en objektbasert tilnærming (figur 5B (i-iii) eller ved en statistikktilnærming som utfører en intensitetskorrelasjonskoeffisientbaserte (ICCB) analyser (figur 5B (iv)). Flere verktøy for co-lokalisering analyse er tilgjengelig, inkludert JACoP (Bare en annen co-lokalisering Plugin; https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/jacop.html) og "Colocalization" rørledningen (CellProfiler) benyttes her, som kan brukes som et ICCB verktøy, for å vurdere forholdet mellom fluorescens intensiteter. Dette gjøres for det meste ved å beregne korrelasjonskoeffisienten (Pearsons koeffisient) som måler styrken i det lineære forholdet mellom to variabler. Fluorescens co-lokalisering kan representeres grafisk i scatter tomter, hvor intensiteten av en fluorokrom (grønn) er plottet mot intensiteten av den andre fluorokrom (rød) for hver piksel. Komplett sam lokalisering resulterer i punkter gruppert rundt en rett linje, hvis skråning gjenspeiler forholdet mellom fluorescensen til de to fargene. Tvert imot resulterer mangel på sam lokalisering i fordelingen av punkter i to separate grupper (fordelt langs aksene), som hver viser varierende signalnivåer av en farge med lite eller ingen signal fra den andre fargen. Pearsons koeffisientverdi varierer fra 1 til -1, med 1 stående for fullstendig positiv korrelasjon, -1 for en negativ korrelasjon og null som indikerer ingen korrelasjon. Alternativt kan Pclc-metoden brukes. Denne metoden har blitt brukt i en rekke strålinger (se36 for detaljer og fritt tilgjengelig metode).

Figure 5
Figur 5: Analyse av sam lokalisering.
Ved å bruke flere antistoffer hevet mot forskjellige arter (her, anti-mus γH2AX (rød) og anti-kanin 53BP1 (grønn)), kan flere proteiner undersøkes. (A) Representative bilder vises. DAPI indikerer kjernene. Sam lokalisering visualiseres etter farge- og områdeoverlapping (her rød + grønn = gul). Vektstangen = 5 μm. (B) Individuelle og samtidige lokaliserende foci kan kvantifiseres individuelt ved hjelp av en av flere programvarer (her, CellProfiler, se andre alternativer i hovedteksten) og plottet. (i-iii) Objektbaserte tilnærminger som brukes til å bestemme sam lokaliseringsresultater (iv) Korrelasjonsresultater oppnådd for sam lokalisering, ved hjelp av en pikselbasert tilnærming (ICCB-analyse). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsinformasjon. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Analyse av tidspunktet og effektiviteten av DNA-skadereparasjon ved mikroskopi har vist seg å være avgjørende for å forstå hvordan DNA-reparasjonsmaskineriet fungerer, i normale celler og i menneskelige patologier som kreft.

Utviklingen av spesifikke antistoffer som tillater påvisning av aktiverte proteiner i deres fosforylert versjon (som γH2AX, pRPA, pRAD50 og andre10,23,39,43) har spilt en sentral rolle i å få en bedre forståelse av DNA reparasjon timing av hendelser og synkronisering med cellesyklusen. Denne suksessen er eksemplifisert av analysen av 53BP1 fosforylert rester, ved massespektrometri og immunolokalisering (se32 for gjennomgang), som har bidratt til å forstå funksjonen til dette sterkt modifiserte proteinet. Med bestigningen av høyoppløselig mikroskopisk teknikk som STORM og økt bruk av små antistoffer (nanolegemer) blir direkte proteininteraksjon i celler mer tilgjengelig og nøyaktig. Imidlertid er indirekte immunofluorescence som beskrevet her fortsatt et viktig eksperiment å utføre når du undersøker et nytt potensielt DNA-reparasjonsprotein og leter etter tidspunktet for handling og proteinpartnere.

Suksessen til indirekte immunofluorescence hviler helt på to kriterier: (i) kvaliteten på reagenser – spesielt antistoffer som brukes til å oppdage fosfo-rester på aktiverte DNA reparasjon proteiner, og (ii) tidspunktet for eksperimentet. Bruk av publiserte protokoller og antistoffer bør oppmuntres når det er tilgjengelig. Ved bruk av et nytt antistoff eller undersøke et nytt protein, bør antistoffet valideres, og spesifisitet bør etableres ved enten å slå ned målprotein i celler (signalet bør gå tapt) eller proteinuttømming (bruk av renset protein for å tømme bestemte antistoffer før inkubasjon, som utførti 44 for RAD51AP1).

Optimale blokkeringsforhold og antistofffortynning bør etableres for å minimere artefakter og ikke-spesifikk farging. Buffere vil bli forberedt friskt, og hvis kjernefysisk utvinning utføres, må det være tidsavstår for å unngå å skade kjerner. Ved å undersøke reparasjonseffektiviteten i menneskelige celler, bør kvantifisering av kjernefysiske foci utføres, og atomutvinningen kan hjelpe med å utelukke cytoplasmatiske proteiner. Det kan imidlertid være gunstig å ikke utføre kjernefysisk utvinning trinn, for eksempel for å undersøke om en mutant protein mistenkt for å ikke samhandle med sin cellulære partner unnlater å translocate til kjernen ved DNA-skade.

I tillegg er kvaliteten på bildet av avgjørende betydning for å sikre at data kan anskaffes riktig, analyseres og nøyaktige data plottes. Parametere for å kontrollere for er mange og inkluderer: spesifisitet av de primære antistoffene, spekteret av eksitasjon av fluoroforer valgt (sekundære antistoffer), beskytte prøver mot fotobleking, valg av støtte for såing celler, god prøvetaking (minimum 30 til 300 kjerner, avhengig av spørsmålet), og i noen tilfeller etter behandling som deconvolution eller spektral un-mixing. Når det er mulig, foreslås automatisert bildebehandling av en full dekkslips, som gjør at tusenvis av celler kan avbildes. Involvering av bildespesialister som et kjerneanlegg før du setter opp eksperimentet bør vurderes som det vil i stor grad forbedre kvaliteten på resultatene.

Sist, basert på cellelinjene som brukes, behandlingen utført, og proteinene undersøkt, basale nivåer av foci kan variere sterkt og gjøre resultatene vanskelig å tolke. Av denne grunn er det viktig at rådata summeres, behandles, analyseres og presenteres i et effektivt format i et lys som leserne kan forstå; tilrettelegge for sammenligning og avslørende trender og relasjoner i dataene. I figur 4Bplottes samme kvantifisering av foci i tre separate versjoner: (i) totalt antall foci (skyplott) etter DSB indusert av bestråling (ii) induksjon av foci over tid -kinetikk- (iii) % av positive celler (> 10 foci / kjerne).

Skyplott skal foretrekkes når det er mulig (Figur 4B (i)) da de viser alle datapunkter uten diskriminering og dermed tilbyr den mest omfattende oversikten over eksperimentet. Men plotting mer selektiv og relevant informasjon, for eksempel antall positive celler over en vilkårlig bakgrunn avskåret (5 foci i de fleste cellelinjer), antall foci co-lokalisering, foci induksjon over tid, eller kvalitetsmåling av foci, for eksempel pikselstørrelse eller intensitet, kan være mer hensiktsmessig i noen tilfeller, og er forfatternes ansvar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra San Antonio Area Foundation. Mays Cancer Center støttes av NCI kreftsenter støtte kjerne tilskudd P30 CA054174. Vi vil gjerne takke Stephen Holloway for hans hjelp til å skaffe reagensene, og Sung-laboratoriet for å gi plass og mikroskopikapasitet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% (v/v) paraformaldehyde (PFA) aqueous solution Electron Microscopy Sciences 15710 Microscopy quality of the PFA ensures best images. If using "home-made PFA", filter prior to use.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059 Heat-shock fraction is recommended, to avoid precipitation/background.
Coverglass #1, 18 mm round (coverslips) Neuvitro NC0308920 Coverslips need to be cleaned and sterilized prior using, with HCl or ethanol.
DMEM, High Glucose [(+) 4.5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Sodium Pyruvate] Gibco 11965118 Adjust the growing media to the needs of cell line used.
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144 PBS for tissue culture.
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Research Products International E57060 Nuclear extraction buffer.
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 104370028 The quality of FBS can be assessed by testing gH2AX foci formation. If traces of genotoxic endotoxin are present in the batch, gH2AX will be positive in the absence of stress.
Magnesium chloride (MgCl2) Research Products International M24000 Nuclear extraction buffer.
Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) Research Products International P40150 Nuclear extraction buffer.
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI Invitrogen S36973 300 nM DAPI with VECTASHIELD Antifade Mounting Medium can be used instead.
Sodium chloride (NaCl) Research Products International S23020 Nuclear extraction buffer.
Sucrose Research Products International S24060 Nuclear extraction buffer.
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 1255015 Polysine Slides can be used instead.
TC-Treated Multiple Well Plates, size 12 wells Costar 3513 Seeding on coverslips is done in 12-wells plate.
Triton X-100 AmericanBio AB02025 Nuclear extraction buffer.
TrypLE Express Enzyme (1X), No Phenol Red Gibco 12604021 Trypsin-EDTA can be used instead.
Trypsin-EDTA (0.5%), No Phenol Red Gibco 15400054 TrypLE can be used instead.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prakash, R., Zhang, Y., Feng, W., Jasin, M. Homologous recombination and human health: the roles of BRCA1, BRCA2, and associated proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (4), 016600 (2015).
  2. Jalan, M., Olsen, K. S., Powell, S. N. Emerging Roles of RAD52 in Genome Maintenance. Cancers (Basel). 11, (7), (2019).
  3. Oh, J., Symington, L. S. Role of the Mre11 Complex in Preserving Genome Integrity. Genes (Basel). 9, (12), (2018).
  4. Uziel, T., et al. Requirement of the MRN complex for ATM activation by DNA damage. The EMBO Journal. 22, (20), 5612-5621 (2003).
  5. Lee, J. H., Paull, T. T. ATM activation by DNA double-strand breaks through the Mre11-Rad50-Nbs1 complex. Science. 308, (5721), 551-554 (2005).
  6. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273, 5858-5868 (1998).
  7. Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. γ-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Research. 36, (17), 5678-5694 (2008).
  8. Martin, O. A., Pilch, D. R., Redon, C., Bonner, W. M. Histone H2AX in DNA damage repair. Cancer Biology & Therapy. 2, (3), 233-235 (2003).
  9. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. Journal of Cell Biology. 146, (5), 905-916 (1999).
  10. Stucki, M., et al. MDC1 directly binds phosphorylated histone H2AX to regulate cellular responses to DNA double-strand breaks. Cell. 123, (7), 1213-1226 (2005).
  11. Lou, Z., et al. MDC1 maintains genomic stability by participating in the amplification of ATM-dependent DNA damage signals. Molecular Cell. 21, (2), 187-200 (2006).
  12. Chapman, J. R., Jackson, S. P. Phospho-dependent interaction between NBS1 and MDC1 mediate chromatin retention of the MRN complex at sites of DNA damage. EMBO Reports. 9, (8), 795-801 (2008).
  13. Melander, F., et al. Phosphorylation of SDT repeats in the MDC1 N terminus triggers retention of NBS1 at the DNA damage-modified chromatin. Journal of Cell Biology. 181, (2), 213-226 (2008).
  14. Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nature Review. Molecular Cell Biology. 9, (4), 297-308 (2008).
  15. Chiruvella, K. K., Liang, Z., Wilson, T. E. Repair of double-strand breaks by end joining. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, (5), 012757 (2013).
  16. Mehta, A., Haber, J. E. Sources of DNA double-strand breaks and models of recombinational DNA repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6, (9), 016428 (2014).
  17. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45, 247-271 (2011).
  18. Huertas, P. DNA resection in eukaryotes: deciding how to fix the break. Nature Structural & Molecular Biology. 17, (1), 11-16 (2010).
  19. Nimonkar, A. V., et al. BLM-DNA2-RPA-MRN and EXO1-BLM-RPA-MRN constitute two DNA end resection machineries for human DNA break repair. Genes & Development. 25, (4), 350-362 (2011).
  20. Garcia, V., Phelps, S. E. L., Gray, S., Neale, M. J. Bidirectional resection of DNA double-strand breaks by Mre11 and Exo1. Nature. 479, (7372), 241-244 (2011).
  21. Sturzenegger, A., et al. DNA2 cooperates with the WRN and BLM RecQ helicases to mediate long-range DNA end resection in human cells. Journal of Biological Chemistry. 289, (39), 27314-27326 (2014).
  22. Daley, J. M., Niu, H., Miller, A. S., Sung, P. Biochemical mechanism of DSB end resection and its regulation. DNA Repair. 32, 66-74 (2015).
  23. Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450, (7169), 509-514 (2007).
  24. Chen, L., Nievera, C. J., Lee, A. Y. L., Wu, X. Cell cycle-dependent complex formation of BRCA1-CtIP-MRN is important for DNA double-strand break repair. Journal of Biological Chemistry. 283, 7713-7720 (2008).
  25. Yun, M. H., Hiom, K. CtIP-BRCA1 modulates the choice of DNA double-strand break repair pathway throughout the cell cycle. Nature. 459, (7245), 460-463 (2009).
  26. Sung, P., Klein, H. Mechanism of homologous recombination: mediators and helicases take on regulatory functions. Nature Review. Molecular Cell Biology. 7, 739-750 (2006).
  27. San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanisms of eukaryotic homologous recombination. Annual Review of Biochemistry. 77, 229-257 (2008).
  28. Jasin, M., Rothstein, R. Repair of strand breaks by homologous recombination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, (11), 012740 (2013).
  29. Dynan, W. S., Yoo, S. Interaction of Ku protein and DNA-dependent protein kinase catalytic subunit with nucleic acids. Nucleic Acids Research. 26, (7), 1551-1559 (1998).
  30. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
  31. Cejka, P. DNA end resection: nucleases team up with the right partners to initiate homologous recombination. Journal of Biological Chemistry. 290, (38), 22931-22938 (2015).
  32. Mirman, Z., de Lange, T. 53BP1: a DSB escort. Genes & Development. 34, 7-23 (2020).
  33. Cao, L., et al. A selective requirement for 53BP1 in the biological response to genomic instability induces by BRCA1 deficiency. Molecular Cell. 35, (4), 534-541 (2009).
  34. Zimmermann, M., de Lange, T. 53BP1: Pro choice in DNA repair. Trends in Cell Biology. 24, (2), 108-117 (2014).
  35. Mavragani, I. V., Nikitaki, Z., Kalospyros, S. A., Georgakilas, A. G. Ionizing Radiation and Complex DNA Damage: From Prediction to Detection Challenges and Biological Significance. Cancers (Basel). 11, (11), (2019).
  36. Nikitaki, Z., et al. Measurement of complex DNA damage induction and repair in human cellular systems after exposure to ionizing radiations of varying linear energy transfer (LET). Free Radical Research. 50, sup1 64-78 (2016).
  37. Redon, C., et al. Histone H2A variants H2AX and H2AZ. Current Opinion in Genetics & Development. 12, (2), 162-169 (2002).
  38. Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA Repair. 3, (8-9), 959-967 (2004).
  39. Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10, (15), 886-895 (2000).
  40. Sy, S. M. H., Huen, M. S. Y., Chen, J. PALB2 is an integral component of the BRCA complex required for homologous recombination repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, (17), 7155-7160 (2009).
  41. Buisson, R., Masson, J. Y. PALB2 self-interaction controls homologous recombination. Nucleic Acids Research. 40, (20), 10312-10323 (2012).
  42. Belotserkovskaya, R., et al. PALB2 chromatin recruitment restores homologous recombination in BRCA1-deficient cells depleted of 53BP1. Nature Communications. 11, (1), 819 (2020).
  43. Betts, J. A., et al. Long noncoding RNAs CUPID1 and CUPID2 mediate breast cancer risk at 11q13 by modulating the response to DNA damage. American Journal of Human Genetics. 101, (2), 255-266 (2017).
  44. Dray, E., et al. Molecular basis for enhancement of the meiotic DMC1 recombinase by RAD51 associated protein 1 (RAD51AP1). Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, (9), 3560-3565 (2011).
Visualisering av DNA Reparasjon Proteiner Interaksjon ved Immunofluorescence
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de la Peña Avalos, B., Dray, E. Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (160), e61447, doi:10.3791/61447 (2020).More

de la Peña Avalos, B., Dray, E. Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (160), e61447, doi:10.3791/61447 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter