टेट्रोडोटॉक्सिन माइक्रोइंजेक्शन द्वारा रिवर्सिबल निष्क्रियता के माध्यम से ओव्यूलेशन के नियमन में चूहे मस्तिष्क के असतत क्षेत्रों की भूमिका को सुलझाना
Summary
यह प्रोटोकॉल कम लागत वाली माइक्रोइंजेक्शन प्रणाली के निर्माण, गहरे मस्तिष्क संरचनाओं में इसके स्टीरियोटैक्सिक प्रत्यारोपण और जाग और अनर्गल चूहों में टेट्रोडोटॉक्सिन के समय पर माइक्रोइंजेक्शन की प्रक्रिया का वर्णन करता है। लक्ष्य उनकी तंत्रिका गतिविधि को बाधित करके ओव्यूलेशन के नियमन में हाइपोथैलेमिक संरचनाओं की भागीदारी को प्रकट करना है।
Abstract
ओव्यूलेशन के नियमन में मस्तिष्क की भूमिका का अध्ययन करने के लिए कई प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों का उपयोग किया गया है। उदाहरणों में न्यूरोनल समूहों का घाव और बहरापन शामिल है, जो दोनों आक्रामक तरीके हैं जो स्थायी रूप से लक्ष्य क्षेत्र की अखंडता को ख़राब करते हैं। इन तरीकों के साथ संपाश्र्वक प्रभाव होते हैं जो तीव्र और लौकिक नियामक तंत्र के विश्लेषण को प्रभावित कर सकते हैं। विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों के उद्देश्य से गाइड कैनुलास का स्टीरियोटैक्सिक प्रत्यारोपण, एक वसूली अवधि के बाद, शोधकर्ताओं को सर्जरी के अवांछित प्रभावों के गायब होने के बाद विभिन्न दवाओं को माइक्रोजेक्ट करने की अनुमति देता है। टेट्रोडोटॉक्सिन का उपयोग विविध शारीरिक प्रक्रियाओं में कई मस्तिष्क क्षेत्रों की भूमिकाओं को निर्धारित करने के लिए किया गया है क्योंकि यह क्षणिक रूप से सोडियम-निर्भर कार्रवाई क्षमता को रोकता है, इस प्रकार लक्षित क्षेत्र में सभी तंत्रिका गतिविधि को अवरुद्ध करता है। यह प्रोटोकॉल इस विधि को एस्ट्रोस चक्र और ओव्यूलेशन के आकलन के लिए रणनीतियों के साथ जोड़ता है ताकि एस्ट्रोस चक्र के किसी भी चरण के विशेष समय में ओव्यूलेशन के नियमन में असतत मस्तिष्क क्षेत्रों की भूमिका को प्रकट किया जा सके। जाग और अनर्गल चूहों(Rattus norvegicus)अवरुद्ध प्रभाव है कि एनेस्थेटिक्स और तनाव हार्मोन अंडाशय पर लागू से बचने के लिए इस्तेमाल किया गया । इस प्रोटोकॉल को विभिन्न शारीरिक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए अन्य प्रजातियों, मस्तिष्क लक्ष्यों और औषधीय एजेंटों के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। इस विधि में भविष्य में सुधार में गाइड कैनुलास के बजाय छोटे व्यास के ग्लास केशिकाओं का उपयोग करके माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम का डिजाइन शामिल है। इससे प्रत्यारोपण के दौरान क्षतिग्रस्त ऊतकों की मात्रा कम हो जाएगी और लक्ष्य क्षेत्र के बाहर संचार दवाओं का प्रसार कम हो जाएगा।
Introduction
ओव्यूलेशन वह प्रक्रिया है जिसके द्वारा हर एस्ट्रोल/मासिक धर्म चक्र में एक बार अंडाशय से एक या अधिक परिपक्व ओसाइट्स जारी किए जाते हैं । चूंकि सभी स्तनधारी प्रजातियां नस्ल के लिए गेम्टे के उत्पादन पर निर्भर करती हैं, इसलिए ओव्यूलेशन को विनियमित करने वाले तंत्रों की समझ जैव चिकित्सा, पशुधन उद्योग और लुप्तप्राय प्रजातियों के रखरखाव से लेकर क्षेत्रों में बहुत बड़ा प्रभाव डालती है। ओव्यूलेशन को हाइपोथैलेमिक-पिट्यूटरी-ओवेरियन एक्सिस द्वारा विनियमित किया जाता है, जिसमें कई हाइपोथैलेमिक और अतिरिक्त हाइपोथैलेमिक क्षेत्र शामिल हैं, पूर्वकाल पीयूष और थेका और ग्रैनुलोसा कोशिकाओं में गोंडोट्रोप्स जो ओसाइट्स के साथ, अंडाशय के अंदर अंडाशय के रोम बनाते हैं1।
ओवेरियन रोम बढ़ने, विकसित और अंततः कूप उत्तेजक हार्मोन और ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन के टॉनिक और चरणबद्ध स्राव के जवाब में अंडाशय, दो गोंडोडोपिंस गोंडोट्रॉप द्वारा स्रावित। गोंडोट्रोपिन स्राव का पैटर्न उचित कूप विकास और ओव्यूलेशन के लिए निर्णायक है और इसे गोंडोट्रोपिन-रिलीजिंग हार्मोन (जीएनआरएच)1, 2द्वारा विनियमित कियाजाताहै। इस न्यूरोपेप्टाइड को बेसल डाइएनसेफेलॉन में बिखरे हुए न्यूरॉन्स द्वारा संश्लेषित किया जाता है और फिर पोर्टल वेक्यूलेचर में स्रावित किया जाता है जो हाइपोथैलेमस और पूर्वकाल पिट्यूटरी को जोड़ता है। जीएनआरएच-न्यूरॉन्स की गुप्त गतिविधि बदले में विविध मस्तिष्क संरचनाओं से उत्पन्न होने वाले सिनैप्टिक इनपुट द्वारा संग्राहक होती है। ये संरचनाएं भोजन की उपलब्धता, फोटोपीरियोड की लंबाई और रक्त में हार्मोन की एकाग्रता सहित जीव के बाहरी और आंतरिक वातावरण की स्थिति के बारे में जानकारी व्यक्त करती हैं। इस अर्थ में, वे प्रत्येक प्रजाति के प्रजनन पैटर्न को आकार देते हैं और ओव्यूलेशन को नियंत्रित करने वाले तंत्रों को ठीक से समझने के लिए ऐसी संरचनाओं की विशिष्ट भूमिकाओं का निर्धारण किया जाना चाहिए। एक उदाहरण के रूप में, यह दिखाया गया है कि एस्ट्रोस चक्र के दौरान एस्ट्रोडियोल के स्तर में उतार-चढ़ाव जीएनआरएच के स्राव को नियंत्रित करता है; हालांकि, जीएनआरएच-न्यूरॉन्स ऐसे बदलावों का पता लगाने के लिए आवश्यक एस्ट्रडिओल रिसेप्टर आइसोफॉर्म को व्यक्त नहीं करता है। इन रिसेप्टर्स को व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स की दो आबादी तीसरे वेंट्रिकल के रोस्ट्रल पेरिवेनेट्रिकर क्षेत्र में और क्रमशः आर्क्यूएट न्यूक्लियस में स्थित हैं, और जीएनआरएच-न्यूरॉन्स के साथ स्टैबलिश सिनेप्स हैं। यह सुझाव देने के लिए सबूत हैं कि ये न्यूरॉन्स एस्ट्राडिओल की एकाग्रता की व्याख्या करते हैं और फिर जीएनआरएच स्राव3के एक शक्तिशाली प्रेरक किस्पेप्टिन को रिहा करके जीएनआरएच-न्यूरॉन्स की गतिविधि को उत्तेजित करते हैं।
तार्मिक या रासायनिक घावों के साथ-साथ यांत्रिक बहराधवहार से जुड़े प्रयोगों ने शोधकर्ताओं को ओव्यूलेशन4, 5,6,7,8,9,10, 11,12 के नियमन में कई मस्तिष्क संरचनाओं की भागीदारी निर्धारित करने की अनुमतिदी। . हालांकि, इन प्रयोगों में आक्रामक और दर्दनाक होने का नुकसान होता है, उपचार के प्रभावों का मूल्यांकन करने से पहले कई दिनों की वसूली की आवश्यकता होती है, उपचार के तीव्र प्रभावों के विश्लेषण में बाधा डालते हैं। इसके अलावा, वे स्थायी रूप से लक्षित क्षेत्रों को प्रभावित करते हैं और लंबी अवधि में अन्य शारीरिक प्रक्रियाओं को बाधित करते हैं। इन समस्याओं के कारण, इन प्रयोगों के परिणाम आमतौर पर जानवर के शरीर में होमोस्टेटिक प्रतिपूरक तंत्र से अस्पष्ट होते हैं और लौकिक नियामक गतिशीलता के बारे में सटीक जानकारी निकालते हैं जिसमें क्षेत्र शामिल है बल्कि मुश्किल है।
गाइड कैनुलास के माध्यम से न्यूरॉन्स की गतिविधि को बाधित करने वाली दवाओं का माइक्रोइंजेक्शन एक उपयुक्त विकल्प है जो ऊपर उल्लिखित नुकसान से बढ़कर है। कैनुलास को स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी द्वारा किसी भी मस्तिष्क क्षेत्र में रखा जा सकता है, जिससे शोधकर्ता को सर्जरी के जटिल प्रभाव गायब होने के बाद दवा उपचार शुरू करने की अनुमति मिल सकती है। दवाओं का समय पर माइक्रोइंजेक्शन शोधकर्ताओं को प्रक्रिया के एक विशेष कदम के लिए क्षेत्र के योगदान के बारे में परिकल्पनाओं का परीक्षण करने की अनुमति देता है और जाग संयमित या मुक्त चलती जानवरों में किया जा सकता है । स्थानीय एनेस्थेटिक्स, एगोनिस्ट, विरोधी, विलोम एगोनिस्ट और टेट्रोडोटॉक्सिन (टीटीएक्स) जैसे जैविक विषाक्त पदार्थों सहित विभिन्न प्रकार की दवाओं को विशिष्ट समय पर ब्याज के क्षेत्र में माइक्रोइंजेक्टेड किया जा सकता है।
टीटीएक्स एक जैविक विष है जो पफरफिश के शरीर में रहने वाले बैक्टीरिया के साथ-साथ अन्य कशेरुकी और अकशेरुकी से संश्लेषित होता है। टीटीएक्स सोडियम चैनलों की चयनात्मक और क्षणिक नाकाबंदी के माध्यम से तंत्रिका गतिविधि को मौन करता है, जिसके परिणामस्वरूप सोडियम-निर्भर कार्रवाई क्षमता का अवरोध होता है। टीटीएक्स की उपस्थिति में, कोशिकाएं डीपोलराइजेशन चरण में परिवर्तन का अनुभव करती हैं और इस प्रकार उत्तेजनीय नहीं होती हैं लेकिन जीवित रहती हैं। टीटीएक्स के अवरुद्ध प्रभाव को इसकी आणविक संरचना द्वारा समझाया गया है: एक ग्वानिडिनियम समूह सोडियम चैनल के बाह्रात्म पहलू से गुजरने में सक्षम है, लेकिन बाकी अणु इसके आकार के कारण पारित नहीं हो सकते हैं, इसलिए यह अटक गया है और चैनल13,14,15,16, 17 को ब्लॉक करता है . टीटीएक्स की कार्रवाई के तंत्र ने विट्रो और वीवो दोनों में तंत्रिका तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में इसके उपयोग की अनुमति दी। इस विष के इंट्रासेरेब्रल इंजेक्शन का उपयोग स्मृति प्रतिधारण 18, नींद और उत्तेजना 19, स्थान मान्यता 20, स्थानिकनेविगेशन21,नशीली दवाओं के दुरुपयोग22,थर्मोरेगुलेशन23,सिजोफ्रेनिया के विकास24,यौन व्यवहार25 और ओव्यूलेशन26 के विनियमन जैसी कई प्रक्रियाओं में असतत मस्तिष्क क्षेत्रों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए किया गया है। दूसरों के बीच। इस प्रोटोकॉल में हम जाग और अनर्गल चूहों में टीटीएक्स माइक्रोइंजेक्शन द्वारा हाइपोथैलेमिक नाभिक के क्षणिक निष्क्रियता के अंडाशय पर प्रभाव का वर्णन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह लेख किसी भी समय, जाग और अनर्गल चूहों के मस्तिष्क में एक असतत क्षेत्र, क्षणिक रूप से निष्क्रिय करने की विधि का वर्णन करता है। उनके एस्ट्रोस चक्र को ट्रैक करने और ओव्यूलेशन का आकलन करने के लिए एक सरल विध…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि संपादन में उनकी बहुमूल्य मदद के लिए वाशिंगटन विश्वविद्यालय में रेमंड सांचेज के आभारी हैं और इस तकनीक के मानकीकरण में उनकी तकनीकी सहायता के लिए जॉर्जीना कोर्टेस और M.Sc सिंटिया जेवियर को M.Sc हैं । हम संकाय डी एस्टुडियोस सुपीरियर जरगोज़ा: एमवीजेड में पशु चिकित्सक सेवाओं के सदस्यों के आभारी भी हैं। एड्रियाना अल्तामिरानो, एमवीजेड। रोमन हर्नांडेज़ और एमवीजेड। प्रयोगात्मक जानवरों के उत्कृष्ट रखरखाव और देखभाल के लिए डोलोरेस-एलिजाबेथ गुज़मान। इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोगों को डीजीएपीए-PAPIIT अनुदान संख्या: IN216015 और CONACyT अनुदान संख्या द्वारा समर्थित किया गया था: रॉबर्टो डोमिनगुएज के 236908। कार्लोस-कैमिलो सिल्वा प्रोग्रामा डी डॉक्टराडो एन सिएंसियास बायोमेडिस, यूनीवर्सिड नैसिनल ऑटोनोमा डी मेक्सिको (यूएनएएम) से डॉक्टरेट छात्र हैं और इसे कॉन्सेजो नैसिनल डी सिनेसिया वाई टेक्नोलोगिया (ग्रांट नंबर: 294555) द्वारा समर्थित किया जाता है।
Materials
| 10 μL Hamilton syringes | Hamilton | 80314 | |
| 21 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305165 | |
| 23 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle | BD | 305106 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | BASi | MD-2400 | |
| Bone trimer | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Burr for micro drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Clipper | Wahl | ||
| Cut-off disc | Dremel | SM5010 | |
| Cutting tweezers | Truper | 17367 | |
| Cyanocrylate glue | Kola loka | K-1 | |
| Dental cement | Nic Tone | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosin | Sigma | E4009 | |
| Estereoscope | Zeiss | ||
| Extra fine Bonn scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Face mask | Lanceta HG | 60036 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Hematoxilin | Sigma | H3136 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 320331 | |
| Hypromelose artificial tears | Sophia Labs | 8950015 | |
| Isoflurane | Pisa Agropecuaria | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Microinjection pump | KD Scientific | 788380 | |
| Monomer | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Nitrile gloves | Lanceta HG | 69028 | |
| Non-Rupture Ear Bars | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poly-L lysine | Sigma | P4707 | |
| Povidone-iodine | Dermo Dine | ||
| Povidone-iodine with soap | Germisin espuma | ||
| Pressure tweezers | Truper | 17371 | |
| Rat anesthesia mask | David Kopf Instruments | Model 906 | |
| Saline solution | PISA | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sodium pentobarbital | Pisa Agropecuaria | ||
| Standard electrode holder | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Stainless steel wire | American Orthodontic | 856-612 | |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments | Model 900LS | |
| Surgical Sissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Teflon connectors | Basi | MD-1510 | |
| Teflon tubing | Basi | MF-5164 | |
| Tetrodotoxin | Alomone labs | T-500 | |
| Vaporizer | Kent scientific | VetFlo |
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