Summary
本协议描述了低成本微注射系统的构建、对深脑结构的立体定向植入以及清醒和无拘无束的大鼠对四毒素定时微注射的程序。目标是通过抑制下丘脑结构的神经活动来揭示下丘脑结构参与排卵的调节。
Abstract
许多实验方法被用于研究大脑在排卵调节中的作用。例子包括神经元组的病变和耳聋，这两种侵入性方法都永久地损害了目标区域的完整性。这些方法还附带附带影响，可影响对急性和时效监管机制的分析。针对特定大脑区域的导引罐体的立体植入，然后是恢复期，使研究人员能够在手术的不良效果消失后微观注射不同的药物。四毒素已被用于确定几个大脑区域在各种生理过程中的作用，因为它暂时抑制了依赖钠的作用潜力，从而阻断了目标区域的所有神经活动。本协议将此方法与评估卵巢周期和排卵的策略相结合，以揭示离散的大脑区域在排卵调节中在最恶劣周期的任何特定阶段的作用。觉醒和无拘无束的老鼠（Rattus norvegicus）被用来避免麻醉剂和应激激素对排卵的阻塞作用。此协议可以很容易地适应其他物种，大脑目标和药理制剂，以研究不同的生理过程。该方法的未来改进包括使用小直径的玻璃毛细血管而不是导引罐体设计微型喷射系统。这将减少植入过程中受损的组织数量，并减少注入药物在目标区域外的扩散。
Introduction
排卵是每个卵巢/月经周期从卵巢中释放一个或多个成熟卵母细胞的过程。由于所有哺乳动物物种都依赖于游戏品种的生产，对调节排卵机制的理解在生物医学、畜牧业和濒危物种的维持等领域产生了巨大影响。排卵由下丘脑-垂体-卵巢轴调节，该轴涉及几个下丘脑和下垂外区域、前垂体中的角膜和肉芽细胞，这些细胞与卵母细胞一起形成卵巢内的卵巢卵泡1。
卵巢卵泡生长，发展，并最终排卵，以回应卵泡刺激激素和叶黄素化激素的补品和阶段性分泌，由卵泡激素分泌的两个卵巢激素。戈纳多特罗平分泌模式是适当的卵泡发育和排卵的关键，它是由戈纳多特罗平释放激素 （GnRH）1，2调节。这种神经肽由分散在基底脑中的神经元合成，然后分泌到连接下丘脑和前垂体的门户血管。GnRH神经元的分泌活动反过来又由不同大脑结构产生的突触输入调节。这些结构传达了有关生物体外部和内部环境状况的信息，包括食物的供应、光佩里德的长度和血液中激素的浓度。从这个意义上说，它们塑造了每个物种的生殖模式，必须确定这些结构的具体作用，以便正确理解排卵的机制。例如，已经表明，在最恶劣的周期中，雌二醇水平的波动调节了GnRH的分泌：然而，GnRH神经元并不表示检测此类变化所需的雌二醇受体等形。表达这些受体的两个神经元群分别位于第三心室的椎间垂直区域和弧形细胞核中，并且与GnRH神经元有稳定突触。有证据表明，这些神经元解释雌二醇的浓度，然后刺激GnRH神经元的活性，释放吻肽，GnRH分泌物3的有力诱导剂。
涉及热病变或化学病变以及机械耳聋的实验使研究人员能够确定几个大脑结构参与排卵4、5、6、7、8、9、10、11、12的调节.然而，这些实验具有侵入性和创伤性的缺点，在评估治疗效果之前需要几天的恢复时间，从而妨碍了对治疗急性效应的分析。此外，它们长期影响目标区域并中断其他生理过程。由于这些问题，这些实验的结果通常被动物体内的内在补偿机制所掩盖，并提取有关所涉及区域的时间调节动态的准确信息是相当困难的。
通过引导性大麻酶暂时破坏神经元活动的药物的微注射是一种适当的替代方法，可以超越上述缺点。通过立体定向手术，可以将金核酸放入任何大脑区域，使研究人员能够在手术的混淆效应消失后开始药物治疗。药物的定时微注射使研究人员能够测试有关该地区对过程特定步骤的贡献的假设，并且可以在清醒的受约束或自由移动的动物中执行。各种药物，包括局部麻醉剂、激动剂、拮抗剂、反激动剂和生物毒素，如四毒素（TTX），可在特定时间微注射到感兴趣的区域。
TTX是一种生物毒素，由生活在河豚体内的细菌以及其他脊椎动物和无脊椎动物合成。TTX通过对钠通道的选择性和瞬态封锁来抑制神经活动，从而抑制依赖钠的行为潜力。在TTX的存在下，细胞在去极化阶段经历改变，因此不能激发，但仍然活着。TTX的阻塞效应是由其分子组成解释的：一个硅基组能够通过钠通道的细胞外方面，但分子的其余部分由于其大小而无法通过，因此它被卡住并阻塞了通道13、14、15、16、17.TTX 的作用机制允许它作为研究体外和体内神经系统的工具。这种毒素的内脑注射已用于研究离散脑区在几个过程中的作用，如记忆保留18，睡眠和觉醒19，位置识别20，空间导航21，药物滥用22，热调节23，精神分裂症24的发展，性行为25和排卵调节26 除其他外。在这个协议中，我们描述了在清醒和无拘无束的大鼠中TTX微注射对下丘脑核短暂灭活排卵的影响。
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Protocol
涉及动物的程序已得到联阿特派团萨拉戈萨省高级法库塔德道德委员会的批准。该机构严格按照墨西哥动物处理规则（官方规范：NOM-062-ZOO-1999）运作，该规则符合国际准则。
1. 建设双边坎努拉斯
- 使用压力钳从两根 23 G 皮下针的中心提取不锈钢轴，然后使用手术刀刀片去除剩余的胶水。
- 绘制一条线 15 毫米，从轴的钝端与精细的永久标记。使用切割钳子去除斜面。
- 用细气管固定 15 mm 段，用连接到旋转工具的切断盘垂直按压，直到获得 14 mm 的管段。此步骤是为了消除轴的遮挡部分，创建开端和钝端。最后，在细分段中插入一根 30 G 针，以消除任何内部障碍物。
- 在大脑地图集27的帮助下，确定大脑左右半球的兴趣结构之间的距离。使用成型粘土将两个 14 mm 段连接到显微镜滑动器上，并确保两者处于相同的水平水平。通过眼部微米（10 倍）观察，并用细钳调整细段，直到获得所需的距离。
- 将焊料糊与 10% 盐酸混合，比例为 2：1，并在段的钝端以下添加 2 mm 的混合物。使用焊接铁和直径为 0.5 mm 的焊接线焊接两个段，单点焊接。确保焊接器不会妨碍细分市场的流明。
- 通过切割 10 mm 的弹性 0.3 mm 不锈钢丝段，创建支撑，将管子连接到立体式支架上。使用成型粘土将 2 mm 的电线与以前的焊接点接触，其余的铺设在罐体的钝端上方。将电线焊接到罐体上。
- 用 70% 乙醇清洁罐体表面，去除焊糊的过量。用无菌水冲洗罐装玻璃的内部，去除金属颗粒。重复此过程，直到在显微镜下无法以 10 倍的放大倍数检测到任何粒子。
2. 构造扰动器和盖
- 为了建造，修筑者切割了两条16毫米的圆形不锈钢软线段（直径0.35毫米）。拿着一个带下巴的双边管子，垂直于实验室的长凳上，并将其中一个部分插入每个管子，直到它们到达长凳。以 90° 角弯曲残余物。
- 对于盖切两个 2 mm 的硅胶管段（内径=0.76 mm），并在每个段的末端之一涂上一滴硅胶。不要让胶水进入管子。干燥至少24小时。
3. 微型喷射器的建造
- 重复步骤 1.1，使用 30 G 皮下针代替创建轴。
- 绘制一条线 18.5 mm，从轴的钝端，并删除斜面的残余与切割钳子。
- 重复步骤 1.1 与单个 23 G 针，通过从钝端开始切割两个 6 mm 长的段来构建适配器。
- 通过垂直按压截断盘，直到获得两个 4 mm 适配器，消除 6 mm 段的遮挡部分。消除任何内部障碍物。
- 将 30 G 段的斜面端插入适配器中。通过立体显微镜查看，以确保两个段和适配器的末端处于同一水平。使用棉签将氰丙烯酸酯胶水涂抹在离形接头上，让干燥 15 分钟。
- 将两个特氟隆管连接器浸泡在 70% 乙醇中 5 分钟，然后通过适配器将其连接到微喷射器上。等待，直到连接器的直径收缩至少24小时，然后用低温方法消毒微喷射器，以避免连接器的损坏（建议氧化乙烯灭菌）。
4. 动物维持和阴道涂片
- 使用周期性成年雌性戴头罩大鼠（鼠口，CIIZ-V应变），重量在230至260克之间。将老鼠分成四组，在标准聚丙烯笼中，房间内有14：10的光-暗光佩里奥。将温度和湿度分别设定为 22 ± 2 °C 和 40%。提供食物和水。
- 每天在 10：00 至 12：00 之间进行阴道涂片检查。
- 使用酒精灯对内径为1毫米的改良细菌环进行消毒，然后用无菌水冷却。用安全的抓地力抓住老鼠，将5毫米的细菌循环引入阴道，触摸其内壁。去除细菌循环。如果成功，在尖端将看到多云的下降。将此掉落放在显微镜幻灯片上。
- 重复这个过程，为每只老鼠消毒和冷却每个动物之间的循环。
- 滴干后，用血氧素-奥辛染色，并在显微镜下观察样品10倍。
- 确定白细胞、上皮核细胞和角蛋白细胞在每个涂片上的比例，并根据图1中报告的卵泡周期阶段的标准进行分类，这与先前的文献28、29一致。
5. 坎努拉斯的立体植入
注：在定期无菌立体定向手术并遵守机构规范后，进行罐头植入。
- 手术前
- 使用蒸汽高压灭菌器在手术前24小时对手术器械、罐头、手术螺丝、斜面器、纱布和木棉签进行消毒。通过用10%的过氧化氢和水清洗金属仪器的尖端，然后放入热珠消毒器中，对连续手术之间的金属仪器尖进行消毒。
- 在将动物从家庭房间移走之前，先准备好工作区域和立体定向式仪器。在尽可能远离手术台的区域为动物准备手术，以避免手术过程中的污染。
- 用 70% 乙醇清洁制备和手术区域，然后应用 10% 氯化物溶液 10 分钟。用 70% 乙醇清洁立体定型仪器的底座、框架和操纵器，并使用热珠消毒器对耳塞尖进行消毒，并在手术前对耳塞进行空气冷却。
- 手术时身穿专用实验室外套、面罩、头盖、手术袖子、鞋套和手术手套。请助手为动物准备手术，并在手术过程中检查它们的总体状态。
- 将管子连接到立体定向式支架上。请助手把第一只被手术的动物带进房间。选择大鼠进行手术，因为我们实验室的观察表明，这些动物比其他阶段的老鼠恢复适当的骨质循环更快，可能是因为压力的反应随着最恶劣的周期而改变。
- 称量动物，在连接到异黄酮蒸发器的老鼠的感应室中，用4%的异黄酮诱导麻醉。为了避免给动物压力，不要预先填充房间。通过检查瞳孔扩张和尾部和耳捏测试测量的疼痛损失，在观察到右反射损失后，确认麻醉的手术平面。
- 如果没有异黄酮蒸发器，通过腹内注射氯胺酮（100毫克/千克）和西拉津（10毫克/千克）的混合物来麻醉大鼠。
- 将大鼠从感应室中取出，在制备表中使用鼻锥，在100%氧气中保持2.5%异黄素麻醉效果。用剪子修剪头皮的头发，用绒辊去除松动的头发。分别注射2毫克/千克的梅洛西卡姆和5毫克/千克的恩罗弗洛沙辛作为非类固醇抗炎/镇痛剂和抗生素的术前皮下剂量。
- 在手术过程中，将催眠人工泪珠涂抹到每只眼睛上以避免干燥。
- 使用非破裂耳塞和麻醉面膜将动物安装在加热垫上方的立体定向压力仪器中。调整鼻夹，确保动物头部平整。在剃须区进行手术擦洗，一次用肥皂和70%乙醇在波维多尼碘之间交替，然后两次使用波维多尼碘和70%乙醇。插入直肠温度计，记录动物在手术过程中的温度，然后用无菌手术场覆盖它。
- 手术期间
- 使用手术刀在剃光区域中间的皮肤和肌肉上切开2厘米。使用涂有 2% 过氧化氢的棉签从头骨中取出腹膜，以揭示布雷格玛或兰布达，这些地标将用于计算目标坐标。用空气干燥头骨，以便更好地可视化地标。
- 使用立体定向乐器的操纵器将管子移动到所选地标正上方的位置。从立体定向仪器中登记前后坐标和中向坐标，并根据大脑地图集27计算目标区域的坐标。
- 将计算的坐标设置在立体定向定向仪器中，并将管尖放在头骨表面。注册双体-静脉坐标，并用它来计算目标区域的深度。
- 通过拧开操纵器的手臂将其从框架中拧开。使用附着在旋转工具上的牙科毛刺，速度为 15，000 rpm，以便在进行颅骨切除术的地方打上标记。然后使用毛刺打三个洞，在标记周围形成一个等边三角形。这些洞不能刺穿头骨。将手术螺丝插入孔中，确保它们被紧紧放置。
- 使颅骨切除术足够宽，以适应每个半球目标区域之间的距离。它应该尽可能小的直径，但足够大，允许降低管状不触及头骨的边界，因为这将改变轨迹。逐渐进行颅骨切除术，施加尽可能低的压力。啮齿动物头骨只有几毫米厚，保持下面组织的完整性至关重要。
- 一旦杜拉母体可见，使用无菌的21G针头，尖端弯曲在90°角，以去除骨碎片，使前后切在脑膜。如果目标区域位于中线附近，则使用 Wirtshafter 及其同事30 技术，以避免对上垂鼻窦造成损害。
- 将带管子的支架放在框架中，并使用腹腔操纵器到达腹腔坐标。检查针头在下降时是否接触边界，并在需要时增加颅骨切除术的直径。
注：指南的提示必须针对感兴趣的区域上方 0.5 到 2.0 mm 的区域。这是由于大脑对外来身体的引入和组织的破坏的反应。如果感兴趣区域较小，且必须事先经验计算工作距离，则这一点尤为重要。
- 将带管子的支架放在框架中，并使用腹腔操纵器到达腹腔坐标。检查针头在下降时是否接触边界，并在需要时增加颅骨切除术的直径。
- 涂抹牙科水泥，将管子固定在头骨上，让它干燥。确保牙科水泥不覆盖管子的钝端，因为这将不可逆转地阻碍它。等到水泥完全凝固。
- 插入扰动器以避免进一步的阻碍，并确保在研究期间的倾斜度。戴上硅胶帽以避免污染。
- 手术后
- 在生理温度下，通过1.0mL无菌盐水溶液的腹内注射来替换丢失的液体。将动物放在热支持的恢复笼中，直到它从麻醉中恢复过来。定期检查动物的温度和炉子/呼吸速率。异氟烷效应在气体通量中断后持续几分钟，而氯胺酮/西拉津效应持续40-50分钟。
- 提供48-72小时的抗生素、镇痛药和抗炎药物（剂量和路线相同）的术后注射，并在实验的其余时间里每天密切检查动物。向兽医服务机构或训练有素的实验室成员报告任何疼痛、压力或体重减轻的迹象。在此期间，不要对大鼠进行任何其他操作。
- 术后治疗后开始进行阴道涂片检查，并继续服用，直到动物连续出现三个四天的阴道涂片。
注：慢性壶导管可以手术植入，允许研究人员采取序列血液样本来分析激素的分泌，如雌二醇，黄体酮，睾酮，叶黄素激素，卵泡刺激激素和皮质激素。我们建议在动物从脑部手术中恢复过来后放置这样的导管，因为这样可以提高存活率，同时避免因恢复时间延长而堵塞导管。
6. 四毒素处理和准备解决方案
警告：TTX 是已知的毒性最大的物质之一。它作用于骨骼肌肉和神经组织。接触性醉酒是不太可能的，但任何开放性伤口是进入体内接种的潜在途径。使用TTX时，主要关心的是皮肤被刺穿，用锋利的仪器接触毒素，并产生可能到达口腔、眼睛和粘膜的气溶胶。根据剂量的不同，如果被皮肤吸入、吞咽或接种，TTX 可能是致命的。它会引起眼睛的强烈刺激。LD50通过口服和静脉注射在小鼠身上进行测试，分别为334微克/千克和7.3微克/千克。目前没有抗毒素可用。
注：灭活物质是 1.0% NaOCl，无论有无 0.25 N NaOH，或 10% 漂白液。完全失活发生在30分钟暴露后。TTX 不能完全灭活任何氯化物衍生在浓度低于 10%， 通过自动包装或干热灭菌在温度低于 500 °F. 涉及TTX的所有程序必须由两个知识渊博的人执行，他们戴着内侧和外侧的亚硝酸盐手套、专用实验室外套、安全眼镜、一次性面罩、封闭鞋和全长裤子。
- 股票解决方案的准备
- 将浸泡在烟气罩中的灭活物质浸泡的垫子，以防止发生泄漏时的污染。请务必在启动前将烟罩正常工作。准备一个带有灭活溶液的插体，以处理移液器提示。
- 根据制造商的说明，使用无菌人工脑脊液进行极其小心和缓慢的点缀，在这个过程中冲洗小瓶壁，以恢复无菌的TTX柠檬酸盐柠檬酸盐。避免形成泡沫和气溶胶。遵循无菌技术，以避免TTX溶液的污染，因为它将被注射到活体动物的大脑。如果您的TTX小瓶有外膜以防止气溶胶形成，则使用带针头的注射器，而不是微管。
- 将库存溶液放入无菌微管中。使阿利奎特尽可能小，因为冷冻/解冻周期可能会改变分子的稳定性。不要填充超过一半的管子，因为水在冻结时体积增加，这可能导致管子的开盖和容器中储存的其他样品的污染。
- 与灭活物质一起使用TTX的管子外部和表面进行净化。将管子存放在 -20 °C 的二级容器内的瓶箱中。
- 将库存解决方案稀释到工作集中度
- 准备新稀释的解决方案，因为稀释后的解决方案不太稳定。将浸泡在烟气罩中的灭活物质的垫子和顶部放置一个微型管架。准备一个带有灭活溶液的插体，以处理移液器提示。
- 在无菌微管底部的库存溶液中，加入人工脑脊液的计算量，达到 10 ng/μL 的浓度。如前所述，对于重新悬浮的TTX粉末，执行极其小心和缓慢的点缀，冲洗小瓶的墙壁，避免泡沫和气溶胶的形成。
- 如果冰柜上的样品将用于微注射，则必须在实验前至少一小时允许它们在室温下平衡。
7. 将TTX或车辆溶液微射到自由移动的老鼠体内
- 根据实验，根据输液率和注射总时间对微喷射泵进行配置。考虑到目标结构占用的体积和要注入的溶液量，提前计算这些参数。此实验以每分钟 50 nL 的速度注入 200 nL 溶液，总输液时间为 4 分钟。
- 用无菌蒸馏水填充两个 10 μL Hamilton 注射器，将一块无菌特氟隆管插入每个微喷射器的管子连接器中，确保管子的长度不会限制大鼠的运动（管道可以使用氧化乙烯进行消毒）。
- 将浸泡在灭活物质中的垫子和上面放置 2 厘米 x 2 厘米见方的石蜡薄膜。派佩特有足够的TTX来填充喷油器的针头和薄膜上方1厘米的管子。轻轻收回柱塞，吸收TTX下降。将注射器安装在微喷射泵中，并使用其控制装置操纵柱塞，直到每个微喷射器的尖端都能看到一滴TTX。将水滴丢弃到浸有灭活物质的垫子中。
- 选择将微注射的老鼠。只使用手术后至少连续出现三个周期的老鼠。考虑他们的周期阶段和一天中的时间。时间和阶段都取决于您将测试的具体假设，因为此时此时发生用于阶段性 GnRH 分泌的神经性卵巢前信号，此实验选择了 14：00 小时的突起。将他们运送到注射将在自己的住房笼子内进行的房间，以避免痛苦。
- 用坚定的抓地力抓住老鼠，从罐子里取下帽子和遮盖器，将微喷射器插入引导罐中，然后把动物放回笼子里。
- 打开泵，等待微投射完成。在此期间观察动物，以检测微喷射器的可能分离，并避免特氟隆管的扭曲。
- 将微喷射器放置两分钟，以避免溶液的倒流。取出它们，用异丙酮防腐液清洁植入物的表面，避免其在导引罐头内流动。插入无菌扰动器，戴上帽子，将动物送回殖民地房间。定期观察动物，以检测药物的任何可能的副作用。
- 打开具有与微喷射期间相同的参数的泵，并检查正确的流量，以确保在过程中保留系统的光度。
- 按下柱塞将 TTX/车辆从微喷射器中排出，直到气泡到达针尖。在显微管中回忆 TTX。将注射器装满蒸馏水，并用它来清洁管子的内部。将水丢弃到灭活物质中，并至少重复这个过程三次。用浸泡在灭活物质中的布清洁注射器、管子和微喷射器的外部。
8. 安乐死和组织处理
- 在预测或阴道确认的埃斯特鲁斯的那天，给大鼠注射腹膜内过量的五巴比妥钠（75毫克/千克）。检查是否失去知觉，并通过指南 cannulas 注射 200 nL 的 0.5% 甲基蓝溶液，如步骤 7.1 到 7.9 所述。使用脚趾或尾部捏合测试检查疼痛迹象，如果检测到，则使用啮齿动物断头台斩首大鼠。
- 用剪刀打开腹腔，找到卵巢。使用细虹膜剪刀解剖每个卵巢，在放大镜的帮助下切割子宫-输卵管交界处。避免损坏卵管，因为这将导致卵母细胞的损失。
- 将卵巢置于立体显微镜下，使用剃须刀刀片去除所有脂肪组织，而不会损害器官。尽可能从安普拉区域用剃须刀切开每个卵巢的卵巢。将每个卵样上安装在不同的滑梯上，并盖上一滴水。将卵巢存放在包含布恩溶液的瓶中。
- 用吸水纸巾轻轻干燥卵管，在立体显微镜下寻找安普拉。用非占主导地位的手，用23G针捏住远离安普拉的卵管，然后用另一根23G针在占主导地位的手，在安普拉的中间区域做一个1毫米的切口。积聚卵母细胞复合物将从切口中突出为一滴粘性液体（图2D）。使用占主导地位的手针轻轻地慢慢地拉离导管很远的滴。按下安普拉的残余物，以确保没有卵母细胞留在里面。尽可能快地从卵母细胞中提取卵母细胞，因为去氧干燥会不可逆转地将卵母细胞困在体内。
- 从滑梯中取出卵管，等待，直到含有卵母细胞的液体滴干。用血氧林-奥辛染色样品。使用安装介质覆盖唇。在显微镜下观察（10倍），以确定每个卵巢脱落的卵母细胞数量。
注：本协议中不执行心脏灌注的牺牲，因为卵母细胞将被困在卵巢中，因此需要组织学方法来评估排卵。如果用户必须香水分析其他组织，卵巢可以先切除，下降的动脉夹在肝脏下面厚厚的肝态药物，以避免固定物泄漏。 - 取出头部皮肤，用 10% 的正蛋白溶液将头骨浸入玻璃容器中。在取出管条之前，允许将头部固定至少十天，以避免组织变形。要去除管子，请使用剪刀分离头骨周围区域的所有肌肉。用骨修剪器在鼻骨和前骨之间切开，然后切除腹腔骨。将修剪器的尖端插入前兆，并开始切开到达鼻骨残余物的下垂峰。
- 头骨顶部的隔离区域必须包含正面和腹骨。通过垂直于头部缓慢地将其向上拉，取出附着在头骨顶部的植入的管状物。用细虹膜剪刀切割脑膜的任何附加部分，以避免大脑变形。
- 在脑膜上做一个前后切口，并把它们放在一边，从头骨底部取出大脑。将钝钳插入嗅球下方，轻轻拉起大脑，直到视神经可见。用细虹膜剪刀切开神经，拔出大脑。将大脑保存在固定溶液中。
- 使用颤音获得大脑50μm厚的部分，将其安装在多L-赖氨酸涂层滑梯（蒸馏水中为0.1%）中，并用Nissl技术染色。观察显微镜下的幻灯片（10倍），以确定罐头（图2A-2C）的最终位置和染料的传播与大鼠大脑地图集27的帮助。
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Representative Results
上述协议通过评估单个TTX或车辆（人工脑脊液）的影响进行了测试：ACSF）微注射成两个不同的细胞核之一，已知参与调节排卵在老鼠：超囊性原子核和弧形核。之所以选择超乳酸核，是因为它含有哺乳动物的中央昼夜起搏器。它参与循环事件的监管，作为戈纳多特罗平的分泌物。之所以选择弧形细胞核，是因为它包含大量表达雌二醇受体的神经元，在大多数绝经周期中刺激GnRH分泌。微注射是在14：00的突起阶段进行的，由于许多中央机制的发生，调节了前列腺素的预泄释放，因此被称为"关键窗口"。治疗后，每天进行阴道涂片检查，大鼠在预计的雌性日09：00被安乐死，这与雌性阴道涂片特征相吻合。作为一个额外的对照组，使用了五只在雌性阶段安乐死的完好老鼠。手术后循环动物的分数和每组排卵大鼠（排卵大鼠/n）的分数是使用费舍尔的准确概率测试计算和分析的。Kruskal-Wallis测试分析了两个卵巢脱落的卵巢数量，随后又分析了邓恩的测试。进行了适当的统计测试，以确保样本量充足。
共有30只雌性大鼠被植入了针对两个目标区域之一的导盲犬。如图 3所示，所有的动物在手术前都是循环的，但其中只有7只在放养手术后没有表现出畸形周期的改变。23种动物的周期发生了短暂的变化，其特点是白细胞涂片的天数增加。这种改变可能是由于手术引起的压力，并逐渐减少。到第五周期时，28只老鼠被认为是循环的，其余两只被从实验中丢弃。结果表明，经过四个绝缘周期（16天）的恢复时间后，大多数受精动物都适合进一步实验。
图4A 和 图4B 分别描绘了排卵动物的百分比和卵巢棚的数量，分别由完整的动物和接受ACSF或TTX治疗的群体进入超丘亚骨核。所有完好无损的老鼠都被排卵了，ACSF组也是如此。然而，没有动物微注射TTX排卵。车辆的注入并没有改变奥瓦棚的数量。然而，评估释放的卵母细胞的可行性和质量会很有趣。在 图4C 和 图4D 中，对于微射到弧形核中的大鼠，也可以观察到类似的结果。在这两种情况下，这种方法都证明了一个离散的大脑区域在突起阶段的关键窗口参与排卵的调节，这是从病变研究中首次推断出来的，但尚未得到证实。TTX微注射的影响似乎是短暂的，而不是永久性的，因为先前的实验表明，在"关键窗口"外的超囊细胞核中注射的老鼠在26日预期的一天被排卵。然而，也建议纳入控制组，其中动物牺牲24小时或直到获得明确的阴道涂片的埃斯特鲁斯也建议解决这个问题。
图5A-B中的结果代表了接受ACSF或TTX治疗的动物的排卵结果。然而，经地质确认后确定，他们的金核桃位于预定区域之外。这些罐装大部分被放置在前部或回溯区，这两个区域无助于排卵的调节。这两种结构以及超囊和弧形核都非常接近第三心室，考虑到这一点，如果药物泄漏到心室，所有动物都有望排卵。目标外的TTX微注射未能阻止排卵，这一事实表明，以所选速率注入的TTX体积没有泄漏到心室，从而揭示了TTX的区域特异性影响。为了支持这一观点，对大脑切片的组织学分析只显示指南坎努拉斯尖端附近的染色神经元。然而，我们必须澄清，没有对药物的传播进行直接评估，因此应进一步处理这一结论。
图1：阴道涂片代表大鼠最恶劣周期的每个阶段。Estrus（A） 的特点是上皮玉米化细胞的存在，没有核，可以单独发现形成积聚，由于上皮脱毛。在甲基细胞（B）中，其中一些玉米化细胞仍然存在，但数量超过白细胞，白细胞也是迪斯特鲁斯（C）的主要细胞类型。突起样本（D）的特点是粘稠度和上皮核细胞的主导地位。每个面板中的缩放条代表 10 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：安乐死后对样本的体质检查。大脑冠状动脉部分在弧形细胞核 （ARC） 和中位显赫 （EM） 区域的完整大鼠（A），双边罐装大鼠（B）和大鼠与放错地方的管状（C）。星号指向导引罐头尖所在的区域，在 B 的尖端，在腹腔核 （VMH） 的基底边缘，使突出的喷油器能够到达 ARC 的上边缘。在C中，一个管状体位于第三个心室（3V）内，导致非局部心室微喷射。当目标位于中线附近且必须丢弃来自这些动物的数据时，这是一个常见的错误。如果执行得当，卵母细胞的提取应导致一滴粘性液体，其中含有从检查的卵母细胞中取出的所有卵母细胞，如面板（D）所示。每个面板中的缩放条代表 500 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：在植入管子前后循环动物的累积百分比 （***p≤0.0001;**p=0.0003与手术前的周期，费舍尔的确切概率测试）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：排卵动物的百分比和四分位数范围（误差条）的中位数，动物微射入目标结构#1（超晶核， A-B） 或 #2 （弧核， C-D） 与人工脑脊液 （ACSF） 或四毒素 （TTX） 在 14：00 的突起阶段.完整组被添加到每个图表进行比较，条形内的数字分别表示排卵女性的分数（***p≤0.01 与赫特特和 ACSF 组、费舍尔的确切概率测试和克鲁斯卡尔-瓦利斯测试）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：排卵动物（A）的百分比和四分位数范围（误差栏）的中位数（B）由确定在目标区域外的动物排卵（B）。这些动物在14：00被微注射了人工脑脊液（ACSF）或四毒素（TTX）。为了比较目的，在每个图表中都添加了完整的组，条形内的数字表示排卵女性的分数。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
本文描述了一种在任何给定时间暂时灭活清醒和无拘无束的老鼠大脑中一个离散区域的方法。还提供了一个简单的方法来跟踪他们的排卵周期和评估排卵。此协议允许通过比较TTX处理动物的排卵结果与车辆处理动物的排卵结果，直接分析特定大脑区域对驱动排卵机制的贡献。除了神经科学实验室常见的立体定向仪器和微注射泵外，这种方法不需要昂贵的材料。商用罐体和微喷射器是这类实验的常用选择，但这里描述的易于构建的系统降低了成本，结果无法区分。通过使用此协议和本文附带的表格中列出的材料，可以花费与十种动物的商业工具包相同的金额来制造十倍以上的罐装。十个双边罐头的建设，无论研究所需的定制，都可以在几个小时内完成。此外，所有组件均可重复可用，从而提高成本效益。
除了效益成本比外，本协议还适用于任何实验室环境，因为任何人员（包括学生）都可以使用这种协议，并了解啮齿动物操作、立体税收手术以及生物毒素和相关废物的处理。此外，它可以适应用于任何种类的啮齿动物和其他小型哺乳动物，包括兔子，雪铁龙，马莫塞特，甚至在非哺乳动物物种，如鸟类和爬行动物。除了上述特征外，本协议的主要优点是，它很容易适应大脑调节下的其他过程的研究，如周围器官的活动、对环境挑战的静止反应和各种行为。
在开始实验之前，必须执行几个关键步骤，以达到预期的结果。首先，目标结构的坐标必须经验计算，因为大脑地图集中报告的坐标不一定与因其应变、性别或年龄而指定用于研究的动物相匹配。一些研究表明，植入电极和输液探头不仅通过破坏神经体和纤维，而且通过激活胶质细胞来改变受伤区域的功能。植入后立即启动的炎症反应通常会导致胶质细胞封装异物。这些细胞形成一个紧密的护套，阻碍神经递质的流动，并取代神经元，启动神经退化过程31。植入过程的有害影响是无法避免的，应小心谨慎，以确保这种影响尽可能远离大脑感兴趣的区域。应计算坐标，只有在引导罐体足够大以确保不超过 10% 的区域不会被管子损坏的情况下，才能将导引罐放入目标区域。例如，如果将研究皮层的大片区域，这种方法是有用的。即使在这种情况下，也必须对对照组进行详细分析，以解释植入物对兴趣过程的影响。对于小结构，如离散的下丘脑核，我们建议研究人员根据大脑地图集（图2B）计算坐标，将导引罐头放置在距离目标结构上界0.5至2毫米的距离。对于这种方法，喷油器必须设计成足以突出到目标边界。我们已经测试了这两个核，在这个协议中描述，发现这些老鼠恢复他们的卵巢周期和排卵能力比动物与坎努拉斯植入目标更快。
应考虑注射药理剂的溶解性，以便车辆溶液尽可能类似于脑脊液。TTX 可以单独或使用柠檬酸盐作为冻血粉购买。第一个在水中溶解性低，建议使用pH值在5.0左右的酸性缓冲器来重组它，但这可以引入单独注射车辆会损害组织的可能性。另一方面，TTX-柠檬酸盐可以溶解在水中或0.9%的盐溶液，这两种溶液都常用作车辆。我们建议不要使用这两种车辆，并建议使用人工脑脊液或林格的乳酸溶液代替。先前的研究表明，微注射到超囊细胞核中的盐水溶液在雌雄或二氧化二十六时对排卵有有害影响。几篇文章报道说，用与脑脊液的物理和化学特性不匹配的溶液灌注神经组织，会改变神经元的解剖学和生理学，促进炎症反应和细胞死亡32，33，34，35。考虑到这些结果，在所有涉及将药物微注射到大脑的实验中，强烈建议使用人工脑脊液作为载体。
在开始实验之前，研究人员应该从经验上确定要注入的溶液的最佳体积，因为泄漏到相邻的结构中和覆盖面不足都会混淆对结果的解释。这可以通过将水溶性染料微注入透明琼脂或明胶立方体来实现。然后，可以估计染料的分散性，并与大脑地图集中报告的目标的预期大小进行比较。尽管如此，大脑感兴趣的区域，如其细胞密度和纤维区或心室边界的存在，将影响扩散动力学，结果可能不同于在琼脂和明胶中发现的结果。因此，研究人员必须测试在少数动物的目标区域获得的体外参数。几种染料已成功地用于大鼠的内脑微注射，以描述给定溶液体积的扩散。最常见的例子是紫罗兰色、锡奥宁蓝、甲基蓝、埃文的蓝色、快速绿色和印度墨。这些染料以 0.5% 或更低的浓度溶解在蒸馏水中。Evan 的蓝色具有在荧光显微镜中检测到的优势（激发在 620 nm，排放在 680 nm），从而能够对传播进行更定量的分析。乳胶微珠也适合这种方法。重要的是要提到，体积大于2.0微升不应该用这种技术管理到大脑，因为机械损伤和组织位移将发生36。
溶液的流动速率也是控制的重要因素，因为高速高体积的微射会导致组织位移和机械病变40。此外，高输液率也增加了药物的传播，导致邻近结构失活。将输液率从 100 nL/5 分钟更改为 100 nL/1 分钟36，可使溶液覆盖的面积增加三倍。注射甲基蓝的大鼠大脑的组织学观察表明，50 nL/分钟的输液率不会取代组织，同时将药物限制在目标区域（个人观察）。只有在等于或低于 200 nL 的体积下进行测试，因此，如果使用更大的体积，研究人员必须进行试点实验。
确定工作量后，还建议评估每种动物的传播情况。这可以通过与药物共同注射染料或在安乐死前几分钟注射来完成，如本协议所述。前一种模型允许染料与毒素一起扩散，从而对受影响的区域进行更准确的评估。这种方法的缺点是，染料可能会干扰药物的活动，也可能是细胞毒性。最后，如果动物在注射手术后需要存活几天，则可能会从神经组织中清除，这将影响传播的估计。如果使用这种方法，必须通过比较车辆染料组的结果和完好无损的动物的结果来解决染料对正在研究的过程的影响。如果在安乐死前注射染料，建议遵循与微注射（输液率和体积）相同的参数。这应该在安乐死前至少10分钟进行，以便解决方案的传播。通过这种方法，发现 TTX/甲基蓝色溶液的 200 nL 覆盖了直径为 0.6 mm 的球体，如果在牺牲前 1 小时发生微喷射（个人观察），分散性不会显著变化。这符合弗伦德和同事37的研究，以及朱拉文和布雷斯38的研究，两者都发现1微升的TTX溶液以球形体积传播，直径约为3毫米。一般来说，已经表明，药物的分散取决于其分子量和注射量，39 和上述结果匹配的染料的扩散与分子量类似于TTX。如果需要更准确地控制分散，可以注射放射性标签TTX或对具有商业可得抗体的常规TTX实施免疫造血术。除了更好地划定药物覆盖的区域外，这两种方法还受到TTX从组织中清除的限制，如果动物在微注射后存活数天，必须考虑这一点：另一方面，放射性物质的工作和处置将带来新的步骤和安全问题，无法与所有实验室和协议兼容。
建议将一个由动物组成的对照组纳入大脑区域，该区域在研究过程的调节中不起作用。该组将帮助研究人员确定该过程调控中目标区域的特异性，并排除在任何结构中注射的药物可能触发基于更广泛机制的阻塞信号的可能性，例如激活应力或免疫轴。由于即使是大多数实验的立体定型外科医生也无法在小结构成为目标时获得 100% 的成功率，因此这些实验通常伴随着放置在所需结构之外的罐头，因此这种对照组无意中得到了实现。管内放错地方的动物的结果是有价值的，不应丢弃：相反，必须进行全面的分析，考虑注射的区域和药物的分散。特别感兴趣的是，在靠近目标的区域注射的动物中显示出不同的效果（或没有）。
此协议对长期放置坎努拉斯有内在限制。不可能避免在管子的轨迹中永久破坏通道和神经元体的纤维。使用尖端直径为几微米的玻璃毛细血管是将药物输送到大脑中，对组织损伤最小的选择方法。然而，这种方法主要用于动物麻醉和/或头部连接到立体定向器械或其他支架装置的实验中。这主要是由于毛细丝本身的脆弱性，这使得它很难连接到一个清醒和无拘无束的动物。一个系统使用玻璃毛细血管连接到渗透泵，而不是引导坎努拉斯，已经显示出相当大的改善，在脑组织受损的数量和胶质反应的伤害42。然而，在这个系统中，药物的输注是慢性的，而不是定时的，因此在必须精确控制注射时间的实验中是没有用处的。Akinori和他的同事43描述了一个基于玻璃毛细管的微射系统，该系统通过先前植入的导管插入目标区域。该系统允许在需要的时间注射清醒的动物，但它不是很健壮，在手术过程中必须限制动物，这可能导致压力反应的激活。在此协议中，可以通过比较完整和车辆组来控制导管轨迹中神经组织损伤的影响。在这里，它显示了两组类似的排卵结果，并得出结论，受影响的组织，以及车辆的注射不干扰排卵。研究人员必须进行试点研究，以确定位于目标区域的结构是否参与研究过程的调节。不过，这项工作的一个充满希望的未来方向是设计一个交付系统，利用指南罐头和玻璃毛细血管的优势。
研究人员的另一个重要考虑因素是TTX的行动时间。朱拉文和布雷斯38 已经表明，TTX需要几分钟才能达到神经传输的最大阻塞，持续约一个半小时，在几个小时内逐渐减少。这使得TTX成为需要长期灭活的药物。如果实验需要更快的灭活，可以使用局部麻醉剂，如利多卡因，因为它只需要几秒钟，达到最大的封锁。这种药物的效果持续不到20分钟，提供比TTX更精细的时间分辨率。上述特征使TTX成为探索性实验的好工具，该实验研究在定义不太明确的时间窗口中产生的神经信号的存在。另一方面，利多卡因对划划这个窗口44是有用的。这两种药物的缺点是，它们阻止通过纤维中作用电位的传输，在数据解释中引入人工制品，因为信号可能来自向注射区域发送轴向投影的不同结构。在这种情况下，仔细分析确定在目标区域之外的注射非常重要。例如，本文显示TTX输液到区域只是前兆原子核和它和弧形核之间的区域并没有阻止排卵。这些结果表明，这些区域的纤维和细胞没有参与排卵的调节，这是出乎意料的，因为存在一个相互的纤维网，将超丘亚基核与弧形核和包含GnRH神经元的前部区域连接起来。
不阻止注射区通过纤维传播的替代方案是使用钴和镁等二价酸性酸液，这两种药物都抑制了早熟末端释放神经递质。然而，这种方法的问题在于灭活动作和高毒性的时间很短。避免纤维封锁的其他选择是光遗传学和化学遗传学方法，这两种方法都是操纵特定神经元人群活动的策略。选择性是通过用病毒载体转染神经元获得的，病毒载体旨在插入编码序列，用于编码与离子通道结合的操作或在特定促进剂下表达的修饰受体。载体的微注射在麻醉动物中使用玻璃毛细血管进行，对周围组织几乎没有造成任何干扰。植入光纤或合成药物的全身注射可以非常精确地操纵目标人群45。这些技术证明在研究中是有用的，无论是单独还是结合技术，如TTX微射入本协议46中提出的。不过，必须考虑这些方法的几个方面来设计成功的实验，包括验证表达特异性、控制转染细胞数量、评估毒性以及评估光和化学刺激的副作用。
本协议的关键组成部分包括正确确定每种动物的可怕周期阶段。要成功地执行此程序，获得阴道上皮的质量样本和正确解释结果至关重要（我们建议遵循 图1）。此外，研究人员必须仔细填充注射系统，以防止气泡的结合，可能导致注射不准确的药物量。在微喷射过程中监测动物，防止它们咬管或以其他方式干扰系统，也很重要。最后，对实验条件视而不见的研究人员应分析排卵结果、管子的最终位置和溶液分散到目标区域，以确保对结果的解释是公正的。
这里描述了一种可靠、经济高效和直接的方法来分析大脑离散区域在排卵调节中的贡献。这个过程是在清醒和无拘无束的老鼠中执行的，超过了神经传递封锁的有害影响，以及压力激素，如皮质醇和皮质激素对GnRH分泌的抑制作用。这种方法是完全可定制的，可用于向大脑的任何结构输送任何药物。此外，它很容易适应实验室中使用的普通啮齿动物和非啮齿动物物种。最后，本协议可以与血液中激素和代谢物等物质的量化方法、细胞和组织中的基因表达评估、神经元活动的记录以及清醒动物在行为测试中的表现相结合，以确定特定大脑区域在不同行为和生理过程中的作用。
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Disclosures
作者对本文没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢华盛顿大学的雷蒙德·桑切斯在手稿编辑和 M.Sc 方面给予的宝贵帮助。 乔治娜·科尔特斯和辛蒂亚·哈维尔 M.Sc 在这项技术标准化方面提供了技术支持。我们也感谢萨拉戈萨省高级兽医服务机构的成员：MVZ。阿德里亚娜·阿尔塔米拉诺，MVZ罗曼·埃尔南德斯和MVZ多洛雷斯-伊丽莎白·古斯芒为实验动物提供出色的维护和护理。本协议中描述的实验得到了DGAPA-PAPIIT赠款编号：IN216015和CONACyT赠款编号的支持：236908罗伯托·多明格斯。卡洛斯-卡米洛·席尔瓦是墨西哥国立大学生物学博士项目的博士生，并得到墨西哥国家科学与技术委员会（赠款编号：294555）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL Hamilton syringes | Hamilton | 80314 | |
| 21 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305165 | |
| 23 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle | BD | 305106 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | BASi | MD-2400 | |
| Bone trimer | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Burr for micro drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Clipper | Wahl | ||
| Cut-off disc | Dremel | SM5010 | |
| Cutting tweezers | Truper | 17367 | |
| Cyanocrylate glue | Kola loka | K-1 | |
| Dental cement | Nic Tone | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosin | Sigma | E4009 | |
| Estereoscope | Zeiss | ||
| Extra fine Bonn scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Face mask | Lanceta HG | 60036 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Hematoxilin | Sigma | H3136 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 320331 | |
| Hypromelose artificial tears | Sophia Labs | 8950015 | |
| Isoflurane | Pisa Agropecuaria | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Microinjection pump | KD Scientific | 788380 | |
| Monomer | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Nitrile gloves | Lanceta HG | 69028 | |
| Non-Rupture Ear Bars | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poly-L lysine | Sigma | P4707 | |
| Povidone-iodine | Dermo Dine | ||
| Povidone-iodine with soap | Germisin espuma | ||
| Pressure tweezers | Truper | 17371 | |
| Rat anesthesia mask | David Kopf Instruments | Model 906 | |
| Saline solution | PISA | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sodium pentobarbital | Pisa Agropecuaria | ||
| Standard electrode holder | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Stainless steel wire | American Orthodontic | 856-612 | |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments | Model 900LS | |
| Surgical Sissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Teflon connectors | Basi | MD-1510 | |
| Teflon tubing | Basi | MF-5164 | |
| Tetrodotoxin | Alomone labs | T-500 | |
| Vaporizer | Kent scientific | VetFlo |
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