Summary
פרוטוקול זה מתאר את בנייתה של מערכת מיקרו-הפעלה בעלות נמוכה, את ההשתלה הסטריאוטקסית שלה לתוך מבנים עמוקים במוח ואת ההליך למיקרו-נג'קציה מתוזמנות של טטרודוטוקסין בחולדות ערות וחסרות מעצורים. המטרה היא לחשוף את ההשתתפות של מבנים היפותלמיים ברגולציה של הביוץ על ידי עיכוב הפעילות העצבית שלהם.
Abstract
גישות ניסיוניות רבות שימשו לחקר תפקיד המוח בוויסות הביוץ. דוגמאות כוללות את הנגע ואת חירשות של קבוצות עצביות, שהן שתי שיטות פולשניות שפוגעות לצמיתות בשלמות אזור היעד. שיטות אלה מלוות בהשפעות בטחונות שיכולות להשפיע על ניתוח מנגנוני רגולציה חריפים וטמפורליים. ההשתלה הסטריאוטקסית של קנולות מדריך המכוונות לאזורי מוח ספציפיים, ואחריה תקופת התאוששות, מאפשרת לחוקרים למיקרו-זרם תרופות שונות לאחר היעלמות ההשפעות הבלתי רצויות של הניתוח. Tetrodotoxin שימש כדי לקבוע את התפקידים של מספר אזורי מוח בתהליכים פיזיולוגיים מגוונים כי זה מעכב באופן חולף את פוטנציאל הפעולה תלוי נתרן, ובכך חוסם את כל הפעילות העצבית באזור היעד. פרוטוקול זה משלב שיטה זו עם אסטרטגיות להערכת מחזור estrous וביוץ כדי לחשוף את התפקיד של אזורי מוח נפרדים בוויסות הביוץ בזמנים מסוימים של כל שלב נתון של מחזור אסטרוס. חולדות ערות וחסרות מעצורים (Rattus norvegicus) שימשו כדי למנוע את השפעות החסימה כי הרדמה והורמוני מתח להפעיל על הביוץ. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות למינים אחרים, מטרות המוח וסוכנים פרמקולוגיים ללמוד תהליכים פיזיולוגיים שונים. שיפורים עתידיים בשיטה זו כוללים את העיצוב של מערכת microinjection באמצעות נימים זכוכית בקוטר קטן במקום קנולות מדריך. זה יפחית את כמות הרקמה שניזוקה במהלך ההשתלה ויפחית את התפשטות התרופות המושרות מחוץ לאזור היעד.
Introduction
הביוץ הוא התהליך שבו ביציות בוגרות אחת או יותר משתחררות מהשחלות אחת ל-estral/מחזור החודשי. מכיוון שכל מיני היונקים תלויים בייצור הגמטים להתרבות, להבנת המנגנונים המסדירים את הביוץ יש השפעה עצומה בתחומים החל מביו-רפואה, תעשיית בעלי החיים ותחזוקת מינים בסכנת הכחדה. הביוץ מוסדר על ידי ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-השחלות, אשר כרוך במספר אזורים היפותלמיים ואקסטרה-ההיפותלמיים, הגונדוטרופים בבלוטת יותרת המוח העורפית והתקה ותאי הגרנולוזה, יחד עם הביצים, יוצרים את זקיקי השחלות בתוך השחלות1.
זקיקי השחלות לגדול, לפתח ובסופו של דבר לביוץ בתגובה הפרשת טוניק פאזי של ההורמון מגרה זקיק ואת ההורמון נוהם, שני גונדוטרופינים מופרש על ידי gonadotropes. התבנית של הפרשת גונדוטרופין היא מרכזית להתפתחות זקיקית נכונה וביוץ והוא מוסדר על ידי הורמון משחרר גונדוטרופין (GnRH)1,2. נוירופפטיד זה מסונתז על ידי נוירונים הפזורים ברחבי הדיאנספלון הבזלי ולאחר מכן מופרש לערם השער המקשר את ההיפותלמוס ואת בלוטת יותרת המוח הצפונית. הפעילות הפרשתית של נוירוני GnRH מווסת על ידי קלט סינפטי הנובע ממבנים מוחיים מגוונים. מבנים אלה מעבירים מידע על מצב הסביבה החיצונית והפנימית של האורגניזם כולל זמינות המזון, אורך הפוטופריודה וריכוז ההורמונים בדם. במובן זה, הם מעצבים את דפוס הרבייה של כל מין ואת התפקידים הספציפיים של מבנים כאלה חייב להיקבע על מנת להבין כראוי את המנגנונים השולטים בביוץ. כדוגמה, הוכח כי התנודתיות ברמות אסטרדיול במהלך מחזור אסטרוס מסדירה את הפרשת GnRH; עם זאת, GnRH-נוירונים אינו מבטא את isoform קולטן אסטרדיול הדרוש כדי לזהות שינויים כאלה. שתי אוכלוסיות של נוירונים המבטאים קולטנים אלה ממוקמים באזור periventricular rostral של החדר השלישי ובגרעין arcuate, בהתאמה, וסינפסות ייצוב עם נוירונים GnRH. יש ראיות להציע כי נוירונים אלה לפרש את הריכוז של אסטרדיול ולאחר מכן לעורר את הפעילות של GnRH-נוירונים על ידי שחרור kisspeptin, משרן חזק של הפרשת GnRH3.
ניסויים הכוללים נגעים תרמיים או כימיים, כמו גם חירשות מכנית, אפשרו לחוקרים לקבוע את מעורבותם של מספר מבני מוח בוויסות הביוץ4,5,6,7,8,9,10,11,12 . ניסויים אלה, עם זאת, יש את החיסרון של להיות פולשני וטראומטי, הדורש כמה ימים של התאוששות לפני הערכת ההשפעות של הטיפול, לעכב את הניתוח של ההשפעות החריפות של הטיפול. בנוסף, הם משפיעים לצמיתות על האזורים הממוקדים ומשבשים תהליכים פיזיולוגיים אחרים בטווח הארוך. בשל בעיות אלה, התוצאות של ניסויים אלה מוסתרות בדרך כלל על ידי מנגנוני פיצוי הומיאוסטטיים בגוף החיה וחילוץ מידע מדויק על הדינמיקה הרגולטורית הזמנית שבה האזור מעורב הוא די קשה.
המיקרו-נסיגה של תרופות שמשבשות באופן חולף את פעילותם של נוירונים באמצעות קנולס מדריך היא חלופה מתאימה העולה על החסרונות שהוזכרו לעיל. הקנולות יכולות להיות ממוקמות בכל אזור במוח על ידי ניתוח סטריאוטקסי, המאפשר לחוקר להתחיל את הטיפול התרופתי לאחר שההשפעות המבלבלות של הניתוח נעלמות. המיקרו-הזדקנות המתוזמנות של התרופות מאפשרת לחוקרים לבחון השערות לגבי תרומת האזור לשלב מסוים של התהליך וניתן לבצען בבעלי חיים ערים מרוסנים או חופשיים. מגוון רחב של תרופות כולל הרדמה מקומית, אגוניסטים, אנטגוניסטים, אגוניסטים הפוכים ורעלים ביולוגיים כגון tetrodotoxin (TTX) ניתן microinjected לתוך אזור עניין בזמנים ספציפיים.
TTX הוא רעלן ביולוגי מסונתז על ידי חיידקים החיים בגוף של דגי הנפוחיות, כמו גם בעלי חוליות אחרים חסרי חוליות. TTX משתיק פעילות עצבית באמצעות המצור הסלקטיבי והחולף של ערוצי נתרן, אשר גורם לעיכוב של פוטנציאל פעולה תלוי נתרן. בנוכחות TTX, תאים חווים שינוי בשלב ההפחתה ולכן אינם נרגשים אך נשארים בחיים. אפקט החסימה של TTX מוסבר על ידי ההרכב המולקולרי שלה: קבוצת guanidinium הוא מסוגל לעבור דרך ההיבט החוץ תאי של ערוץ נתרן, אבל שאר המולקולה לא יכול לעבור בשל גודלו, ולכן הוא תקוע וחוסם את ערוץ13,14,15,16,17 . מנגנון הפעולה של TTX אפשר את השימוש בו ככלי ללמוד את מערכת העצבים הן במבחנה והן ב- vivo. הזרקה תוך מוחית של רעלן זה שימשה כדי לחקור את התפקיד של אזורי מוח נפרדים במספר תהליכים כמו שימור זיכרון18, שינה וגירוי19, זיהוי מקום20, ניווט מרחבי21, שימוש בסמים22, thermoregulation23, התפתחות של סכיזופרניה24, התנהגות מינית25 ורגולציה של הביוץ26 בין היתר. בפרוטוקול זה אנו מתארים את ההשפעות על הביוץ של חוסר הפעילות החולפת של גרעינים היפותלמיים על ידי מיקרו-בייג'ן TTX בחולדות ערות וחסרות מעצורים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הליכים הנוגעים לבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה של הפקולטה לסוסות סרגוס סרגוסה, UNAM. מוסד זה פועל בהתאם לחוקים המקסיקניים לטיפול בבעלי חיים, נורמה רשמית: NOM-062-ZOO-1999, אשר מסכים עם הנחיות בינלאומיות.
1. בניית קנולס דו-צדדיות
- לחלץ את פיר נירוסטה מהרכזת של שתי מחטים hypodermic 23 G באמצעות פינצטה לחץ ולאחר מכן להסיר כל דבק שנותר באמצעות להב אזמל.
- צייר קו 15 מ"מ מלבד הקצה הקהה של הפירים עם סמן קבוע בסדר. השתמש פינצטה חיתוך כדי להסיר את הקצוות משופעים.
- החזק את מקטעי 15 מ"מ עם hemostats בסדר ולחץ עליהם בניצב עם דיסק מנותק מחובר לכלי מסתובב עד 14 מ"מ קטעים של צינורות מתקבלים. צעד זה נעשה על מנת לחסל את החלק החנוק של הפירים, יצירת קצוות פתוחים ובוטים. לבסוף, הכנס מחט 30 G דרך המקטעים כדי לחסל כל חסימה פנימית.
- לקבוע את המרחק בין המבנים של עניין בחצי הכדור השמאלי והיומי של המוח בעזרת אטלס המוח27. השתמש בחימר עובש כדי לחבר את שני מקטעי 14 מ"מ לשקופית מיקרוסקופ ולהבטיח ששניהם נמצאים באותה רמה אופקית. התבונן דרך מיקרומטר עיני (10x) ולהתאים את המקטעים עם פינצטה עדינה עד המרחק הרצוי מתקבל.
- מערבבים ממרח הלחמה עם 10% חומצה הידרוכלורית בפרופורציה של 2:1 ומוסיפים טיפה של התערובת 2 מ"מ מתחת לקצה הקהה של המקטעים. הלחמה שני מקטעים עם נקודה אחת באמצעות ברזל הלחמה חוט הלחמה בקוטר 0.5 מ"מ. ודא כי ההלחמה אינה חוסמת את לומן של המקטעים.
- צור תמיכה כדי לחבר את הצינורית למחזיק סטריאוטקסי על ידי חיתוך קטע 10 מ"מ של חוט נירוסטה גמיש 0.3 מ"מ. השתמש חימר עובש למקם 2 מ"מ של החוט במגע עם נקודת הלחמה הקודמת ואת השאר שוכב מעל הקצה קהה של קנולס. הלחמיץ את החוט לקנולס.
- לנקות את פני השטח של קנולה עם 70% אתנול כדי להסיר את עודף של הדבק הלחמה. לשטוף את הפנים של קנולות עם מים סטריליים כדי להסיר חלקיקים מתכתיים. חזור על תהליך זה עד שלא ניתן יהיה לזהות חלקיקים מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של פי 10.
2. בניית אומתים וכובעים
- כדי לבנות את obturators לחתוך שני קטעים 16 מ"מ של חוט רך נירוסטה עגול (0.35 מ"מ של קוטר). החזק צינורית דו-צדדית עם hemostats, מאונך לספסל מעבדה, ולהכניס אחד מקטעים אלה לתוך כל צינורית עד שהם מגיעים לספסל. לכופף את השריד בזווית של 90°.
- עבור המכסים לחתוך שני מקטעים 2 מ"מ של צינורות סיליקון (קוטר פנימי = 0.76 מ"מ) ולהחיל טיפה של דבק סיליקון באחד הקצוות של כל קטע. אל תתנו לדבק להיכנס לצינורות. תן להתייבש לפחות 24 שעות.
3. בניית מיקרו-מנג'רים
- חזור על שלב 1.1, באמצעות 30 G מחטים hypodermic במקום כדי ליצור את פירים.
- צייר קו 18.5 מ"מ מלבד הקצה הקהה של הפירים ולהסיר את שריד הקצוות משופעים עם פינצטה חיתוך.
- חזור על שלב 1.1 עם מחט יחיד 23 G לבניית מתאמים על ידי חיתוך שני מקטעים באורך 6 מ"מ החל מהקצה הקהה.
- לחסל את החלקים החסומים של קטעי 6 מ"מ על ידי לחיצה עליהם בניצב נגד הדיסק לחתוך עד שני מתאמי 4 מ"מ מתקבלים. לחסל כל חסימה פנימית.
- הוסף את הקצה משופע של מקטעי 30 G לתוך המתאמים. הסתכל דרך סטריאומיקוסקופ כדי להבטיח שהסוף של שניהם, מקטעים ומתאמים, נמצאים באותה רמה. יש למרוח דבק ציאנואקרילט על המפרק הדיסטלי בעזרת צמר גפן ולייבש במשך 15 דקות.
- השרו שני מחברי צינורות טפלון ב-70% אתנול למשך 5 דקות ואז חברו אותם למיקרו-מזרקים דרך המתאמים. המתן עד שקוטר המחברים יתכווץ לפחות 24 שעות ולאחר מכן עקר את המיקרו-נג'ר בשיטת טמפרטורה נמוכה כדי למנוע נזק למחברים (מומלץ לעקר את תחמוצת האתילן).
4. תחזוקת בעלי חיים והכפשות בנרתיק
- השתמש בחולדות ברדס נקבה בוגרת מחזורית(Rattus norvegicus, זן CIIZ-V) במשקל בין 230 ל 260 גרם. בית החולדות בקבוצות של ארבעה בכלובי פוליפרופילן סטנדרטיים בחדר עם פוטופריוד 14: 10 בהיר-כהה. הגדר את הטמפרטורה והלחות ב 22 ± 2 °C (50 °F) ו ב 40%, בהתאמה. ספקו מזון ומים עד ליביטום.
- קח מריחות בנרתיק כל יום בין השעות 10:00-12:00.
- לחטא לולאה בקטריולוגית שונה עם קוטר פנימי של 1 מ"מ באמצעות מנורת אלכוהול ולקרר אותו עם מים סטריליים. החזק את החולדה עם אחיזה מאובטחת והכנס 5 מ"מ של הלולאה הבקטריולוגית לתוך הנרתיק, נוגע בקירות הפנימיים שלה. הסר את הלולאה הבקטריולוגית. אם תצליח, טיפה מעוננת תיראה בקצה. הנח ירידה זו על שקופית מיקרוסקופ.
- חזור על תהליך זה עבור כל חולדה מעקר וקירור הלולאה בין כל בעל חיים.
- לאחר הטיפות להתייבש, כתם עם המטוקסילין-אאוזין להתבונן בדגימות תחת מיקרוסקופ ב 10x.
- קבעו את שיעור הלוקוציטים, תאי הגרעין האפיתל והתאים הקראטיניים על כל מריחה וסיווגו לפי הקריטריונים של שלבי מחזור אסטרוס שדווחו באיור 1, אשר מסכים עם הספרותהקודמת 28,29.
5. השתלה סטריאוטקסית של הקנולות
הערה: בצע את ההשתלה של הקנולות לאחר ניתוח סטריאוטקסי אספטי רגיל וציות לנורמות מוסדיות.
- לפני הניתוח
- לחטא מכשירים כירורגיים, קנולות, ברגים כירורגיים, obturators, גזה וצמר גפן עץ 24 שעות לפני הניתוח באמצעות autoclave קיטור. לחטא את קצות המכשירים המתכתיים בין ניתוחים רצופים על ידי ניקוי אותם עם 10% מי חמצן ואחריו מים ולאחר מכן למקם אותם מעקר חרוזים חם.
- הכן את אזורי העבודה ואת המכשיר הסטריאוטקסי לפני הסרת החיה מהכיתה. הכן את החיה לניתוח באזור הממוקם רחוק ככל האפשר משולחן הניתוח כדי למנוע זיהום במהלך ההליך.
- לנקות את אזורי ההכנה והניתוח עם 70% אתנול ואחריו יישום של פתרון 10% כלוריד במשך עשר דקות. נקו את הבסיס, המסגרת והמניפולטורים של המכשיר הסטריאוטקסי עם 70% אתנול ועקרו את קצות מוטות האוזניים באמצעות מחטא חרוזים חם וקררו אותם באוויר לפני הניתוח.
- בצע את הניתוח לובש חלוק מעבדה ייעודי, מסכת פנים, מצנפת ראש, שרוולים כירורגיים, כיסויי נעליים וכפפות כירורגיות. בקשו מהעוזר להכין את בעלי החיים לניתוח ולבדוק את מצבם הכללי במהלך ההליך.
- חבר את הצינורית למחזיק הסטריאוטקסי. בקשו מהעוזר להביא את החיה הראשונה המופעלת לחדר. חולדות נבחרות ב diestrus לניתוח, שכן תצפיות מהמעבדה שלנו מצביעות על כך שבעלי חיים אלה לשחזר מחזורי estrous נאות מהר יותר מאשר חולדות פעלו בשלבים אחרים, כנראה בגלל התגובה לשינויים מתח יחד עם מחזור estrous.
- שקול את החיה, ולעורר הרדמה עם 4% איזופלוראן ב 100% חמצן בתוך תא אינדוקציה לחולדות המחוברות לאידוי איזופלוראן. כדי למנוע הדגשת בעלי החיים, לא למלא מראש את החדר. אשר מישור כירורגי של הרדמה על ידי בדיקת התפשטות האישון ואובדן הכאב כפי שנמדד על ידי בדיקות צביטת הזנב והאוזן לאחר שתבחין באובדן רפלקס ההצדקה.
- להרגיז את החולדה על ידי הזרקה תוך-קרקעית של תערובת של קטמין (100 מ"ג/ק"ג) וקסילאצין (10 מ"ג/ק"ג) אם אידוי איזופלוראן אינו זמין.
- הסר את החולדה מתא האינדוקציה ולהשתמש חרוט האף בשולחן ההכנה כדי לשמור על ההשפעות של הרדמה עם 2.5% איזופלוראן ב 100% חמצן. לקצץ את השיער של הקרקפת עם קוצץ ולהסיר שיער רפוי עם רולר מוך. הזריק מינון תת עורי לפני הניתוח של 2 מ"ג/ק"ג של Meloxicam ו 5 מ"ג/ק"ג של Enrofloxacin כמו נוגד דלקתיות/משכך ים ואנטיביוטיקה, בהתאמה.
- יש למרוח דמעות מלאכותיות של היפרומלס על כל עין כדי למנוע ייבוש במהלך הניתוח.
- הר את החיה בכלי הסטריאוטקסי מעל כרית חימום באמצעות מוטות אוזניים שאינם מקרע ומסכת הרדמה. התאימו את מהדק האף כדי להבטיח שראש החיה שטוח. בצע קרצוף כירורגי באזור המגולח לסירוגין בין פובידון-יוד עם סבון ו 70% אתנול פעם אחת ולאחר מכן באמצעות פוידון-יוד ו 70% אתנול פעמיים. הכנס מדחום רקטלי כדי לתעד את הטמפרטורה של החיה במהלך ההליך ולאחר מכן לכסות אותו עם שדה כירורגי סטרילי.
- במהלך הניתוח
- השתמש באזמל כדי לבצע חתך 2 ס"מ בעור ובשריר באמצע האזור המגולח. הסר את periosteum מהגולגולת באמצעות צמר גפן מצופה 2% מי חמצן כדי לחשוף ברגמה או lambda, ציוני הדרך שישמשו לחישוב קואורדינטות היעד. יבש את הגולגולת עם אוויר להדמיה טובה יותר של ציון הדרך.
- השתמש במניפולציטורים של המכשיר הסטריאוטקסי כדי להזיז את הצינורית למיקום ישירות מעל ציון הדרך של בחירה. רשום את הקואורדינטות הקדמיות-אחוריות ואת הקואורדינטות המהודל-לרוחב מהמכשיר הסטריאוטקסי והשתמש בהן כדי לחשב את הקואורדינטות של אזור היעד על פי אטלס המוח27.
- הגדר את הקואורדינטות המחושבות במכשיר הסטריאוטקסי והצב את קצה הצינורית על פני הגולגולת. רשום את קואורדינטת הגחון-גחון-גחון והשתמש בה כדי לחשב את העומק לאזור היעד.
- הסר את זרועו של המניפולטור על ידי הסרתו מהמסגרת. השתמש בר שיניים המחובר לכלי סיבוב במהירות של 15,000 סל"ד כדי להטביע חותם במקום שבו תבוצע הגולגולת. ואז להשתמש בר לעשות שלושה חורים, יצירת משולש שווה צלעות סביב הסימן. אסור החורים האלה לנקב את הגולגולת. הכנס את הברגים הכירורגיים לתוך החורים, להבטיח כי הם ממוקמים בחוזקה.
- הפוך את הגולגולת רחבה מספיק כדי להתאים את המרחק בין אזורי היעד בכל חצי כדור הארץ. זה צריך להיות קטן ככל האפשר קוטר אבל גדול מספיק כדי לאפשר את הנמכת הצינורית מבלי לגעת בגבולות הגולגולת, שכן זה ישנה את המסלול. בצע את הגולגולת בהדרגה, החלת הלחץ הנמוך ביותר האפשרי. גולגולת המכרסם היא רק כמה מילימטרים עובי וזה מרכזי כדי לשמור על שלמות הרקמות מתחת.
- ברגע dura mater גלוי, להשתמש מחט סטרילי 21 G עם הקצה מעוקל בזווית של 90 ° כדי להסיר שבבים של העצם ולעשות חתך הקדמי-אחורי בקרום החם. השתמש Wirtshafter ועמיתיו30 טכניקה כדי למנוע נזק לסינוס קשת מעולה אם אזור היעד ממוקם קרוב לקו האמצע.
- מניחים את המחזיק עם הצינורית במסגרת והשתמשו במניפולציה-גחון-גחון כדי להגיע לקואורדינטת הגחון. בדוק כי המחט אינה נוגעת בגבולות בעת הירידה ולהגדיל את הקוטר של גולגולת במידת הצורך.
הערה: חשוב כי קצה המדריך קנולס מכוון לאזור הנע בין 0.5 ל 2.0 מ"מ מעל אזור העניין. זאת בשל התגובה הדלקתית של המוח בתגובה להכנסת גופים זרים ולהרס הרקמה. זה קריטי במיוחד אם אזור העניין קטן ויש לחשב מראש את מרחק העבודה אמפירית.
- מניחים את המחזיק עם הצינורית במסגרת והשתמשו במניפולציה-גחון-גחון כדי להגיע לקואורדינטת הגחון. בדוק כי המחט אינה נוגעת בגבולות בעת הירידה ולהגדיל את הקוטר של גולגולת במידת הצורך.
- יש למרוח מלט דנטלי כדי לחבר את הצינורית לגולגולת ולתת לה להתייבש. ודא כי מלט השיניים אינו מכסה את הקצה הבוטה של הצינורית שכן זה יחסום אותו באופן בלתי הפיך. חכה עד שהמלט יתמצה לחלוטין.
- הכנס את החסימות כדי למנוע חסימות נוספות כדי להבטיח טפיחה במהלך המחקר. שים על כובע הסיליקון כדי למנוע זיהום.
- לאחר הניתוח
- החלף נוזלים אבודים על ידי הזרקה תוך-פריטונית של 1.0 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית בטמפרטורה פיזיולוגית. מניחים את החיה בכלוב התאוששות עם תמיכה תרמית עד שהיא מתאוששת מהרדמה. בדוק את הטמפרטורה ואת האח / קצב הנשימה של החיה מעת לעת. אפקטים איזופלוריין להימשך כמה דקות לאחר הפרעה של שטף הגז בעוד אפקטים קטמין/קסילסילאזין נמשך 40-50 דקות.
- לספק זריקות לאחר הניתוח של תרופות אנטיביוטיות, משכך משכך ואנטי דלקתיות (באותם מינונים ומסלולים כאמור) עבור 48-72 שעות ולבדוק מקרוב את בעלי החיים על בסיס יומי עבור שאר הניסוי. דווח על כל סימן לכאב, מתח או ירידה במשקל לשירותי וטרינר או לחבר מיומן במעבדה. אין לבצע כל מניפולציה אחרת לחולדות בתקופה זו.
- התחל לקחת מריחות בנרתיק לאחר הטיפול לאחר הניתוח ולהמשיך לעשות את זה עד החיה מראה שלושה מחזורים אסטרוס רצופים של ארבעה ימים.
הערה: צנתרים וריד הצוואר כרוניים ניתן להשתיל בניתוח, המאפשר לחוקר לקחת דגימות דם סדרתיות כדי לנתח את הפרשת הורמונים כגון אסטרדיול, פרוגסטרון, טסטוסטרון, הורמון מחלמן, הורמון מגרה זקיק קורטיקוסטרון. אנו ממליצים להציב קטטר כזה ברגע שבעל החיים מתאושש מניתוח המוח, שכן זה ישפר את שיעור ההישרדות תוך הימנעות סתימה של הקטטר שעלול לנבוע מזמן התאוששות ממושך.
6. טיפול והכנת פתרונות טטרודוטוקסין
זהירות: TTX הוא אחד החומרים הרעילים ביותר הידועים. הוא פועל על שרירי השלד ורקמת העצבים. שיכרון על ידי מגע אינו סביר אבל כל פצע פתוח הוא מסלול פוטנציאלי לחיסון לתוך הגוף. החששות העיקריים בעת עבודה עם TTX הם ניקוב העור עם מכשירים חדים שהיו במגע עם הרעלן ואת הדור של אירוסולים שעלולים להגיע לפה, לעיניים וריריות. בהתאם למינון, TTX עשוי להיות קטלני אם נשאף, נבלע או מחוסן על ידי העור. זה יגרום לגירוי חזק של העיניים. ה- LD50 נבדק בעכברים על ידי מתן אוראלי ותוך ורידי והוא 334 מיקרוגרם/ק"ג ו-7.3 מיקרוגרם/ק"ג, בהתאמה. אין אנטיטוקסין זמין בשלב זה.
הערה: חומר לא פעילים הוא 1.0% NaOCl עם או בלי 0.25 N NaOH, או פתרון אקונומיקה 10%. אי-הפעלה מלאה מתרחשת לאחר חשיפה של 30 דקות. TTX לא יכול להיות מומת לחלוטין על ידי כלוריד נגזר בריכוז מתחת 10%, על ידי autoclaving ולא על ידי עיקור חום יבש בטמפרטורה נמוכה מ 500 °F. כל ההליכים הקשורים TTX חייב להתבצע על ידי שני אנשים בקיאים לובשים זוגות פנימיים וחיציניים של כפפות ניטריל, חלוק מעבדה ייעודי, משקפי בטיחות, מסכת פנים חד פעמית, נעליים סגורות ומכנסיים באורך מלא.
- הכנת פתרון המניה
- מניחים כרית ספוגה בחומר ההמתה במכסה המנוע כדי למנוע זיהום במקרה של דליפה. ודא כי מכסה המנוע האדים עובד כראוי לפני תחילת. הכן כלי קיבול עם הפתרון המשפיל כדי להיפטר טיפים פיפטה.
- TTX סטרילי Resuspend אבקת ליופילית ציטוט על פי הוראות היצרן על ידי טיטרציה זהירה ואיטית מאוד עם נוזל השדרתי מלאכותי סטרילי, שטיפה במורד הקירות של המשחקון בתהליך. הימנע היווצרות של קצף ותרסיס. בצע טכניקה אספטית כדי למנוע זיהום של פתרון TTX מאז זה יהיה מוזרק לתוך המוח של בעלי חיים חיים. השתמש מזרק עם מחט במקום micropipette אם בקבוקוני TTX שלך יש קרום חיצוני כדי למנוע היווצרות תרסיס.
- Aliquot פתרון המלאי לתוך צינורות מיקרו סטריליים. הפוך aliquots קטן ככל האפשר מאז הקפאה / הפשרה מחזורים עשויים לשנות את היציבות של המולקולות. אין למלא יותר ממחצית הצינורות כי מים גדל נפח כאשר קפוא, אשר יכול להוביל לפתיחת המכסה וזיהום של הצינור ודגימות אחרות המאוחסנות במיכל.
- לטהר את החלק החיצוני של הצינורות ואת המשטחים שבהם TTX שימש עם החומר המנטרל. לאחסן את הצינורות ב -20 °C בקופסת מיקויים בתוך מיכל משני.
- דילול תמיסה של המניה לריכוז עבודה
- הכן פתרונות מדוללים טריים ביום שבו הם ישמשו מכיוון שפתרונות מדוללים פחות יציבים. מניחים משטח ספוג בחומר ההמתה במכסה המנוע של האדים ומתלה צינור מיקרו עליו. הכן כלי קיבול עם הפתרון המשפיל כדי להיפטר טיפים פיפטה.
- Pipette פתרון המלאי בתחתית microtube סטרילי ולאחר מכן להוסיף את הכמות המחושבת של נוזל השדרתי מלאכותי כדי להשיג ריכוז של 10 ננוגרם / μL. כפי שתואר להשעות מחדש של אבקת TTX, לבצע טיטציה זהירה ואיטית מאוד, שטיפה במורד קירות של המשחקון והימנעות היווצרות של קצף ותרסיס.
- אם דגימות שהיו על המקפיא ישמשו למיקרו-ינון, יש לאפשר להן להתפלות בטמפרטורת החדר לפחות שעה אחת לפני הניסוי.
7. מיקרו-נסיגה של פתרונות TTX או רכב לחולדות הנעות בחופשיות
- הגדר את משאבת microinjection עם קצב עירוי וזמן ההזרקה הכולל על פי הניסוי. חשב פרמטרים אלה מראש בהתחשב בנפח הכבוש על ידי מבנה היעד וכמות הפתרון שיש להזריק. לניסוי זה להזריק 200 nL של פתרון בקצב של 50 nL לדקה עבור זמן עירוי כולל של 4 דקות.
- מלא שני מזרקי 10 μL המילטון במים מזוקקים סטריליים, הכנס חתיכת צינורות טפלון סטריליים לתוך מחבר הצינורות של כל מיקרו-מזרק, והבטיח כי אורך הצינורות אינו מגביל את תנועת החולדה (צינורות יכולים להיות מעוקרים באמצעות תחמוצת אתילן).
- מניחים משטח ספוג בחומר ההמתי ובמרבע 2 ס"מ על 2 ס"מ של סרט פרפין מעליו. Pipette כמות מספקת של TTX כדי למלא את המחט של המזרק ו 1 ס"מ של צינורות מעל הסרט. ספג את טיפת TTX על ידי ביטול עדין של הבוכנה. הר את המזרקים במשאבת microinjection ולהשתמש בפקדים שלה כדי לתפעל את הבוכנה עד טיפה של TTX ניתן לראות בקצה של כל microinjector. יש להשליך את הטיפות לתוך הכרית הספוגה בחומר לא פעילים.
- בחר את החולדות שימיקרו-ינוחו. השתמש רק חולדות שהראו לפחות שלושה מחזורים רצופים לאחר הניתוח. שקול את שלב המחזור שלהם ואת השעה של היום. הן הזמן והן השלב תלויים בהשערה הספציפית שתבדקו, לניסוי זה 14:00 שעות של בלטו שנבחרו מאז אותות טרום הביוץ העצבניים השולטים בהפרשת GnRH פאזית מתרחשים ברגע זה. להעביר אותם לחדר שבו הזריקה תתבצע בתוך כלובי הדיור שלהם כדי למנוע מצוקה.
- החזק את החולדה עם אחיזה מוצקה, להסיר את הכובע ואת obturators מן הקנולות, להכניס את microinjectors לתוך קנולס המדריך ולהחזיר את החיה לכלוב.
- הפעל את המשאבה והמתן עד שהמיקרו-ינון יסתיים. התבונן בבעלי החיים בתקופה זו על מנת לזהות ניתוק אפשרי של microinjectors וכדי למנוע את פיתול של צינורות טפלון.
- השאירו את microinjectors במקום במשך שתי דקות נוספות כדי למנוע reflux של הפתרון. הסר אותם, לנקות את פני השטח של השתל עם פתרון חיטוי iodopovidone, הימנעות זרימתו בתוך קנולות המדריך. הכנס obturators סטרילי, לשים על הכובע ולהחזיר את החיה לחדר המושבה. שים לב החיה מעת לעת כדי לזהות תופעות לוואי אפשריות של התרופה.
- הפעל את המשאבה עם אותם פרמטרים כמו במהלך microinjection ולבדוק זרימה נכונה כדי להבטיח כי patency של המערכת נשמר במהלך ההליך.
- לחץ על הבוכנה כדי לגרש את TTX / הרכב מתוך microinjector עד בועת האוויר מגיע לקצה המחט. הזכר את TTX במיקרו-טיוב שלו. מלא את המזרק במים מזוקקים והשתמש בו כדי לנקות את פנים הצינורות. להשליך את המים לתוך החומר המנטרל ולחזור על תהליך זה לפחות שלוש פעמים. נקה את החלק החיצוני של מזרקים, צינורות ומיקרו-מזרקים עם בד ספוג בחומר המנטרל.
8. המתת חסד ועיבוד רקמות
- ביום של אסטרוס צפוי או מאושר בנרתיק, להזריק את החולדה עם מנת יתר תוך-פריטונאלית של נתרן פנטוברביטל (75 מ"ג/ קילוגרם). בדוק אם יש אובדן הכרה והזרק 200 nL של פתרון כחול מתילן 0.5% באמצעות קנולס המדריך כמתואר בשלבים 7.1 עד 7.9. בדוק אם סימני כאב באמצעות הבוהן או בדיקת צביטת הזנב, ואם אף אחד לא זוהה, לערוף את ראש החולדה באמצעות גיליוטינה מכרסם.
- השתמש במספריים כדי לפתוח את חלל הבטן ולמצוא את השחלות. השתמש במספריים קשתית עדינה כדי לנתח כל שחלה, חיתוך בצומת הרחם-tubal בעזרת זכוכית מגדלת. הימנע מפגיעה oviduct כי זה יגרום לאובדן ביוצים.
- שים את השחלות תחת סטריאומיקרוסקופ והשתמש בסכין גילוח כדי להסיר את כל רקמת השומן מבלי לפגוע באיבר. הסר את oviduct מכל שחלה על ידי חיתוך עם סכין גילוח רחוק ככל האפשר מאזור ampulla. הר כל oviduct על שקופית אחרת לכסות עם טיפת מים. יש לאחסן את השחלות בוויאליה המכילה את הפתרון של בואן.
- יבשו בעדינות את האובידוקט במגבת נייר סופגת וחפשו את האמפולה מתחת לסטריאומיקרוסקופ. עם היד הלא דומיננטית, להחזיק את oviduct במקום על ידי צביטה רחוק מן ampulla עם מחט 23 G, ולאחר מכן להשתמש מחט 23 G נוסף ביד הדומיננטית לעשות 1 מ"מ סינגוך באזור האמצעי של האמפולה. מתחמי הקומולוס-ביוציטים יבלטו מהחתכים כטיפה של נוזלצמיג (איור 2D). השתמש במחט ביד הדומיננטית כדי למשוך בעדינות ולאט לאט את הטיפה רחוק מה- oviduct. לחץ על שריד האמפולה כדי להבטיח שלא יישארו בוציטים בפנים. לחלץ את oocytes מן oviducts מהר ככל האפשר כמו ייבוש של oviduct יהיה ללכוד באופן בלתי הפיך את oocytes בפנים.
- הסר את oviduct מן השקופית ולחכות עד טיפת הנוזל המכיל את oocytes מתייבש. כתים את הדגימה עם המטוקסילין-אאוזין. השתמש בינוני הרכבה כדי כיסוי. שים לב מתחת למיקרוסקופ (10x) כדי לקבוע את מספר הביציות שנ לשפוך על ידי כל שחלה.
הערה: הקרבה על ידי זלוף לב אינה מבוצעת בפרוטוקול זה שכן הביציות יהיו לכודות באובידוקטים ולכן יהיה צורך בשיטות היסתולוגיות כדי להעריך ביוץ. אם המשתמש חייב לעיין כדי לנתח רקמות אחרות, השחלות ניתן להסיר הראשון ואת העורקים היורדים מהודק עם hemostats עבה מתחת לכבד כדי למנוע דליפה של קיבוע. - הסר את העור של הראש ולהטביע את הגולגולת במיכל זכוכית עם פתרון פורמלין 10%. אפשר קיבוע של הראש לפחות עשרה ימים לפני הסרת הצינורית כדי למנוע עיוות של הרקמה. כדי להסיר את הצינורית, להשתמש במספריים כדי לנתק את כל השרירים באזור הגולגולת המקיפה אותו. חותכים בין עצמות האף והחזית עם גוזמי העצם ואז מסירים את העצם העורפית. מכניסים את קצה הגוזמים למגנום פורם ומתחילים לחתוך דרך פסגות הקשת המגיעות לשריר עצם האף.
- האזור המבודד של החלק העליון של הגולגולת חייב להכיל את העצמות הקדמיות והקודקודיות. הסר את הצינורית המושתלת המחוברת לחלק העליון של הגולגולת על ידי משיכה איטית למעלה בניצב לראש. חותכים כל חלק מצורף של קרום המוח עם מספריים קשתית עדינים כדי למנוע עיוות של המוח.
- הפוך חתך הקדמי-אחורי על קרום המוח ולשים אותם בצד כדי להסיר את המוח מבסיס הגולגולת. הכנס פינצטה קהה מתחת לנורות הריח ומשוך בעדינות את המוח עד שעצבי הראייה נראים. חותכים את העצבים עם מספריים קשתית עדינים ולשלוף את המוח. לשמר את המוח בפתרון קבוע.
- להשיג 50 מיקרומטר חלקים בעובי של המוח באמצעות ויברטום, להרכיב אותם שקופיות מצופות פולי-L-ליצין (0.1% במים מזוקקים) וכתם עם טכניקת Nissl. התבונן בשקופיות מתחת למיקרוסקופ (10x) כדי לקבוע את המיקום הסופי של הקנולות (איור 2A-2C) ואת התפשטות הצבע בעזרת אטלס מוח חולדה27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול שתואר לעיל נבדק על ידי הערכת ההשפעות של TTX יחיד או רכב (נוזל השדרתי מלאכותי; ACSF) מיקרו-ג'ק-קציה לאחד משני גרעינים שונים הידועים כמעורבים בוויסות הביוץ בחולדה: הסופרכיאסמטי וגרעין הארקואט. הגרעין הדו-על-פראציאזמטי נבחר מכיוון שהוא מכיל את קוצב הלב הביולוגי המרכזי ביונקים. הוא מעורב ברגולציה של אירועים מחזוריים כהפרשת גונדוטרופינים. גרעין הארקואט נבחר מכיוון שהוא מכיל אוכלוסייה של נוירונים המבטאים קולטני אסטרדיול, אשר מגרה הפרשת GnRH במהלך רוב מחזור אסטרוס. המיקרו-ערך בוצע בשעה 14:00 של שלב הבלוטות, שהוא תקופה המכונה "החלון הקריטי" בשל התרחשותם של רבים מהמנגנונים המרכזיים המסדירים את שחרורם טרום הביוץ של גונדוטרופינים. לאחר הטיפול, מריחות בנרתיק נלקחו כל יום והחולדות הומתו בשעה 09:00 של היום החזוי של estrus, אשר בד בבד עם מריחה בנרתיק האופייני של estrus. כקבוצת ביקורת נוספת, נעשה שימוש בחמישה חולדות שלמות שהומתו בשלב של אסטרוס. החלקיק של בעלי החיים רכיבה על אופניים לאחר הניתוח ואת השבר של חולדות הביוץ של כל קבוצה (חולדות ביוץ / n) חושב ונותח באמצעות בדיקת ההסתברות המדויקת של פישר. מספר השחלות של השחלות נותח על ידי מבחן קרוסקל-ווליס, ואחריו המבחן של דאן. בדיקות סטטיסטיות מתאימות בוצעו כדי להבטיח כי גודל המדגם היה מספיק.
בסך הכל הושתלו 30 חולדות עם קנולות מדריך המכוונות לאחד משני אזורי היעד. כפי שניתן לראות באיור 3, כל בעלי החיים היו מחזוריים לפני הניתוח, אך רק שבעה מהם לא הראו שינויים במחזור האסטרוס לאחר הליך הקנוניציה. עשרים ושלושה בעלי חיים הראו שינויים ארעיים של המחזורים שלהם, המאופיינת בעלייה במספר הימים עם מריחות לויקוציטיות. שינויים כאלה נובעים ככל הנראה מהלחץ שנגרם על ידי הניתוח והצטמצם בהדרגה. עד המחזור החמישי עשרים ושמונה חולדות נחשבו מחזוריות והשניים הנותרים הושלכו מהניסוי. תוצאה זו מראה כי לאחר זמן התאוששות של ארבעה מחזורים אסטרוס (16 ימים), רוב בעלי החיים cannulated מתאימים לניסויים נוספים.
איור 4A ואיור 4B מתאר את אחוז הביוץ ואת מספר סככת הביצות, בהתאמה, על ידי בעלי חיים שלמים ועל ידי הקבוצות שטופלו ב- ACSF או TTX לתוך הגרעין העל-ראשי. כל החולדות השלמות הביוץ וכך היה נכון לגבי קבוצת ACSF. עם זאת, אף אחד מבעלי החיים microinjected עם TTX ביוץ. הזרקת הרכב לא שינה את מספר סככה השחלות. עם זאת, יהיה מעניין להעריך את הכדאיות והאיכות של ביוציטים ששוחררו. תוצאות דומות ניתן לראות באיור 4C ובאיור 4D עבור חולדות המוכנסות לגרעין הארקואט. בשני המקרים, שיטה זו הוכיחה את השתתפותו של אזור מוח נפרד בוויסות הביוץ בחלון הקריטי של שלב הבליטה, אשר הוסק לראשונה ממחקרי נגע אך לא אושר. ההשפעות של מיקרו-אנז'ק TTX נראות חולפות ולא קבועות מאז ניסוי קודם הראה כי חולדות מוזרקות בגרעין suprachiasmatic מחוץ "החלון הקריטי" ביוץ ביום הצפוי של estrus26. עם זאת, הכללת קבוצות בקרה שבהן בעלי החיים מוקרבים עם 24 שעות או עד הכפשה נרתיקית ברורה של estrus מומלץ גם לטפל בבעיה זו.
התוצאות באיור 5A-B מייצגות את התוצאה הביוץ של בעלי חיים שטופלו ב- ACSF או TTX. עם זאת, כפי שנקבע לאחר אישור היסתולוגי, הקנולות שלהם היו ממוקמות מחוץ לאזור המיועד. רוב הקנולות הללו הונחו באזור הסביבה או באזור הרטרוכיאסמטי, שני תחומים שאינם תורמים להסדרת הביוץ. שני המבנים האלה יחד עם הגרעין suprachiasmatic ואת גרעין arcuate קרובים מאוד מן החדר השלישי, בהתחשב בכך, מצור של ביוץ היה צפוי בכל בעלי החיים אם התרופה דלף לתוך החדר. העובדה כי מיקרו-אינפלציה TTX מחוץ ליעדים לא הצליחה לחסום ביוץ מצביעה על כך שהנפח של TTX חדורה בקצב שנבחר לא דלף לחדר, ומכאן חושף את ההשפעות הספציפיות לאזור של TTX. כתמיכה ברעיון זה, ניתוח היסתולוגי של פרוסות המוח הראה רק נוירונים מוכתמים ליד קצה הקנולות של המדריך. עם זאת, יש להבהיר כי לא בוצעה הערכה ישירה של התפשטות התרופה ולכן יש להתייחס למסקנה זו בהמשך.
איור 1: מריחות נרתיקיות מייצגות כל שלב במחזור estrous החולדה. Estrus (A) מאופיין בנוכחות של תאים מקורניים אפיתל ללא גרעין שניתן למצוא לבדו של יצירת מצטבר כתוצאה של desquamation אפיתל. ב metestrus (B) חלק מהתאים מקורניים אלה עדיין יכולים להיות נוכחים, אבל הם בנחיתות מספרית על ידי לויקוציטים, שהם גם סוג התא השולט ב Diestrus (C). דגימות פרוסטרוס(D)מאופיינות בעקביות צמיגה ובדומיננטיות של תאים מנוכרים אפיתל. סרגל קנה המידה בכל חלונית מייצג 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: בדיקה היסתולוגית של דגימות לאחר המתת חסד. מקטעי קורונלי במוח בגרעין הארקואט (ARC) ובאזור ההוד החציוני (EM) של חולדה שלמה (A),חולדה בעלת צינור דו-צדדי(B)וחולדה עם צינורית שאינה במקומה (C). כוכביות נקודה באזור שבו קצה המדריך קנולס היו ממוקמים, ב B את הטיפים שבו בשוליים בזאלי של גרעין ventromedial (VMH) המאפשר מזרקים בולטים להגיע לשוליים העליונים של ARC. ב C צינורית אחת הייתה ממוקמת בתוך החדר השלישי (3V), וכתוצאה מכך מיקרו-הפעלה חדרית לא מקומית. זוהי טעות נפוצה כאשר היעד ממוקם ליד קו האמצע ויש להשליך נתונים מבעלי חיים אלה. כאשר מבוצע כראוי, החילוץ של ביצים צריך לגרום טיפה אחת של נוזל צמיג המכיל את כל ביצים מן oviduct נבדק כפי שניתן לראות בפאנל (D). סרגל קנה המידה בכל חלונית מייצג 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אחוז מצטבר של בעלי חיים ברכיבה על אופניים לפני ואחרי השתלת הצינורית (***p≤0.0001; **p=0.0003 לעומת המחזור לפני הניתוח, בדיקת ההסתברות המדויקת של פישר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אחוז בעלי החיים הביוץ וחציון עם טווח בין-קוויטרי (מוטות שגיאה) של מספר הביצות הנזרקות על ידי בעלי חיים המוזרקים לתוך מבנה המטרה #1 (גרעין על-ראשיאסמטי, A-B) או #2 (גרעין ארקוט, C-D) עם נוזל מוחי מלאכותי (ACSF) או טטרודוטוקסין (TTX) בשעה 14:00 של שלב הפרוסטרו. הקבוצה ללא פגע נוספה לכל גרף למטרות השוואה והמספר בתוך הסורגים מייצג את שבר הנקבות הביוץ (***p≤0.01 לעומת קבוצות שלמות ו- ACSF, מבחן ההסתברות המדויק של פישר ומבחן Kruskal-Wallis, בהתאמה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: אחוז בעלי החיים הביוץ (A) וחציון עם טווח בין-קווי (סרגלי שגיאה) של מספר סככת הביצות (B) על ידי בעלי חיים שהקנולה שלהם נקבעה מחוץ לאזורי היעד. בעלי חיים אלה היו microinjected עם נוזל השדרתי מלאכותי (ACSF) או טטרודוטוקסין (TTX) בשעה 14:00 של בלטו. הקבוצה השלמה נוספה לכל גרף למטרות השוואה והמספר בתוך הסורגים מייצג את שבר הנקבות הביוץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מתאר שיטה לנטרל באופן חולף, בכל זמן נתון, אזור נפרד במוחם של חולדות ערות וחסרות מעצורים. שיטה פשוטה כדי לעקוב אחר מחזור estrous שלהם ולהעריך ביוץ מסופק גם. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח פשוט של תרומתם של אזורי מוח ספציפיים למנגנונים המניעים ביוץ על ידי השוואת התוצאה הביוץ של בעלי חיים שטופלו TTX עם זה של אלה שטופלו ברכב. למעט המכשיר הסטריאוטקסי ומשאבת המיקרו-שיתוף, הנפוצים במעבדות למדעי המוח, שיטה זו אינה דורשת חומרים יקרים. קנולות מסחריות ומיקרו-נג'קטורים הם הבחירה הרגילה לניסוי מסוג זה, אך המערכת הקלה לבנייה המתוארת כאן מורידה את העלויות והתוצאות אינן ניתנות להבערה. על ידי שימוש בפרוטוקול זה ובחומרים המפורטים בטבלה המלווים מאמר זה, ניתן לייצר פי עשרה יותר קנולות על ידי הוצאת אותה כמות כסף שערכה מסחרית לעשרה בעלי חיים תעלה. בניית עשר קנולס דו-צדדיות, ללא קשר להתאמה האישית הנדרשת למחקר, יכולה להתבצע תוך מספר שעות. בנוסף, כל הרכיבים ניתנים שימוש חוזר אשר מגביר את עלות האפקטיביות.
יחד עם יחס התועלת-עלות, פרוטוקול זה מתאים לכל סביבת מעבדה שכן הוא יכול להתבצע על ידי כל כוח אדם, כולל סטודנטים, עם ידע של מניפולציה מכרסמים, ניתוח סטריאוטקסי וטיפול ברעלנים ביולוגיים ופסולת נלווית. בנוסף, ניתן להתאים אותו לשימוש בכל מין של מכרסם ויונקים קטנים אחרים כולל ארנבות, חמוסים, מרמוסטים ואפילו במינים שאינם יונקים כגון ציפורים וזוחלים. מלבד המאפיינים שצוינו לעיל, היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שניתן להתאים אותו בקלות לחקר תהליכים אחרים תחת ויסות המוח כגון פעילות של איברים היקפיים, התגובה ההומיאוסטטית לאתגרים סביבתיים והתנהגויות שונות.
ישנם מספר צעדים קריטיים שיש לבצע לפני תחילת הניסוי על מנת להשיג את התוצאות הרצויות. ראשית, יש לחשב את הקואורדינטות של המבנה הממוקד אמפירית שכן אלה המדווחים באטלס במוח לא בהכרח יתאימו לבעלי החיים המיועדים למחקר כתוצאה מהמתח, המין או הגיל שלהם. מספר מחקרים הראו כי אלקטרודות מושתלות ובדיקות עירוי משנות את תפקוד האזור הפגום לא רק על ידי הרס של גופים עצביים וסיבים אלא גם על ידי הפעלת תאי גליה. התגובה הדלקתית היוזמת מיד לאחר ההשתלה גורמת בדרך כלל אנקפסולציה של הגוף הזר על ידי תאי גליה. תאים אלה יוצרים נדן הדוק המעכב את זרימת הנוירוטרנסמיטורים ומזיז נוירונים, ויזם תהליך של ניוון עצבי31. ההשפעות המזיקות של הליך ההשתלה לא ניתן להימנע ויש לנקוט זהירות כדי להבטיח כי תופעות כאלה להתרחש רחוק ככל האפשר מאזור המוח של עניין. יש לחשב קואורדינטות כדי למקם את המדריך קנולות לתוך אזור היעד רק אם הוא גדול מספיק כדי להבטיח כי לא יותר מ 10% של האזור ייפגע על ידי הצינורית. גישה זו שימושית, למשל, אם אזורים גדולים של קליפת המוח ייחקרו. גם במקרה זה, יש לבצע ניתוח מפורט של קבוצת הביקורת על מנת להסביר את השפעות השתל על תהליך העניין. עבור מבנים קטנים כגון גרעינים היפותלמיים נפרדים, אנו ממליצים לחוקרים לחשב את הקואורדינטות כדי למקם את המדריך קנולות במרחק הנע בין 0.5 ל -2 מ"מ מהגבול העליון של מבנה היעד באזור האמצעי במישורים הקדמיים-אחוריים והמיונליים-לרוחב על פי האטלס במוח (איור 2B). לגישה זו המזרקים חייבים להיות מתוכננים לבלוט מספיק כדי להגיע לגבול של היעד. בדקנו את זה עבור שני הגרעינים המתוארים בפרוטוקול זה ומצאנו כי חולדות אלה התאושש מחזור estrous שלהם ואת היכולת לבייץ מהר יותר מאשר בעלי החיים עם קנולות מושתל בתוך המטרות.
המסיסות של הסוכנים הפרמקולוגיים להיות מוזרק צריך להיחשב כך פתרון הרכב דומה כמו זה של נוזל השדרתי ככל האפשר. TTX ניתן לרכוש כמו אבקה ליופילית, לבד או עם ציטוט. הראשון יש מסיסות נמוכה במים חוצץ חומצי עם pH סביב 5.0 מומלץ לשחזר אותו, אבל זה יכול להציג את האפשרות של פגיעה ברקמה כתוצאה של זריקות של הרכב לבד. מצד שני, TTX-ציטוט יכול להיות מומס במים או 0.9% תמיסת מלח, אשר שניהם משמשים בדרך כלל ככלי רכב. אנו ממליצים נגד השימוש בשני כלי הרכב האלה, ומציעים להשתמש בנוזל השדרתי המלאכותי או בתמיסת הלקטאט של רינגר במקום. מחקר קודם הראה כי תמיסת מלח microinjected לתוך הגרעין העל-פראציאסמטי יש השפעות מזיקות על הביוץ כאשר מבוצע ב estrus או diestrus26. מספר מאמרים דיווחו כי זלוף של רקמת עצבים עם פתרונות שאינם תואמים את המאפיינים הפיזיים והכימיים של נוזל השדרתי משנה את האנטומיה והפיזיולוגיה של נוירונים ומקדם תגובות דלקתיות ומוות תאים32,33,34,35. בהתחשב בתוצאות אלה, השימוש בנוזל השדרתי המלאכותי כמו הרכב מומלץ מאוד בכל הניסויים מעורבים microinjection של תרופות לתוך המוח.
לפני תחילת הניסויים, החוקרים צריכים לקבוע אמפירית את הנפח האופטימלי של הפתרון להיות מוזרק, כמו הן דליפה לתוך מבנים סמוכים כיסוי לא מספיק יכול לבלבל את הפרשנות של התוצאות. זה יכול להתבצע על ידי microinjecting צבע מסיס במים לתוך קוביות אגר או ג'לטין ברור. לאחר מכן ניתן להעריך את פיזור הצבע ולהשוות את גודל היעד הצפוי כפי שדווח באטלס המוחי. ובכל זאת, תכונות של אזור המוח של עניין כגון הצפיפות התאית שלה ואת נוכחותם של סיבי סיבים או גבולות חדרית ישפיעו על הדינמיקה דיפוזיה, ואת התוצאות עשויות להיות שונות מאלה שנמצאו אגר וג'לטין. בהתאם, החוקר חייב אז לבדוק את הפרמטרים שהושגו במבחנה באזור היעד של כמה בעלי חיים. מספר צבעים שימשו בהצלחה עבור microinjections intracerebral בחולדות על מנת לתאר את הדיפוזיה של נפח נתון של פתרון. הדוגמאות הנפוצות ביותר הן סגול קרסיל, כחול טיון, מתילן כחול, דיו כחול, ירוק מהיר והודו של אוון. צבעים אלה מומסים במים מזוקקים בריכוז של 0.5% או נמוך יותר. הכחול של אוון יש את היתרון של להיות ניתן לגילוי במיקרוסקופ פלואורסצנטי (עירור ב 620 ננומטר ופליטה ב 680 ננומטר), המאפשר ניתוח כמותי יותר של התפשטות. חיידקי לטקס יכולים גם הם להתאים לגישה זו. חשוב להזכיר כי כרכים גדולים מ 2.0 μL לא צריך להינתן לתוך המוח עם טכניקה זו מאז נזק מכני עקירת רקמות יתרחש36.
קצב הזרימה של הפתרון הוא גם גורם חשוב לשליטה, שכן microinjection של כמויות גבוהות במהירות גבוהה גורם עקירת רקמות נגעים מכניים40. בנוסף, שיעור גבוה של עירוי גם מגביר את התפשטות התרופה, וכתוצאה מכך חוסר הפעילות של מבנים שכנים. ככל עלייה משולשת באזור מכוסה על ידי פתרון יכול להיגרם על ידי שינוי קצב העירוי מ 100 nL / 5 דקות ל 100 nL / 1 דקה36. תצפיות היסתולוגיות של מוחות חולדה מוזרק עם מתילן כחול עולה כי קצב עירוי של 50 nL / דקה אינו לעקור את הרקמה תוך הזרקת התרופה לאזור היעד (תצפיות אישיות). זה נבדק רק עם נפחים השווים או נמוכים מ 200 nL ולכן החוקרים חייבים להריץ ניסויי פיילוט אם נפחים גדולים יותר ישמשו.
לאחר קביעת נפח העבודה, מומלץ גם להעריך את ההתפשטות על כל בעל חיים. זה יכול להיעשות על ידי הזרקת צבע משותף עם התרופות או על ידי הזרקת אותו כמה דקות לפני המתת חסד, כמתואר בפרוטוקול זה. המודל הקודם מאפשר לצבע להתפשט יחד עם הרעלן, ובכך מספק הערכה מדויקת יותר של האזור המושפע. החיסרון של שיטה זו הוא כי הצבע עלול להפריע לפעילות של התרופה, והוא עשוי להיות גם ציטוטוקסי. לבסוף, אישור מרקמת העצבים עשוי להתרחש אם החיה צריכה לשרוד מספר ימים לאחר הליך ההזרקה, אשר ישפיע על הערכת ההתפשטות. אם גישה זו תשמש, יש לטפל בהשפעות הצבע על התהליך הנחקר על ידי השוואת התוצאה של קבוצת הרכב + צבע לזו של בעלי חיים שלמים. אם הזרקת הצבע תתרחש לפני המתת חסד, עושה זאת בעקבות אותם פרמטרים כמו במהלך microinjection (קצב עירוי ונפח) מומלץ. זה צריך להתבצע לפחות 10 דקות לפני המתת חסד כדי לאפשר את התפשטות הפתרון. בשיטה זו, נמצא כי 200 nL של פתרון כחול TTX / מתילן מכסה כדור של 0.6 מ"מ של קוטר ואת הפיזור אינו משתנה באופן משמעותי אם microinjection מתרחשת 1 שעה לפני הקרבה (תצפית אישית). זה מסכים עם המחקר על ידי פרוינדועמיתיו 37, כמו גם אחד על ידי Zhuravin ו Bures38, אשר שניהם מצאו כי 1 μL של פתרון TTX מתפשט בנפח בצורת כדורית עם קוטר של כ 3 מ"מ. באופן כללי, הוכח כי פיזור התרופה תלוי במשקל המולקולרי שלה ואת הנפח מוזרק,39 ואת התוצאות הנ"ל להתאים את דיפוזיה של צבעים עם משקל מולקולרי דומה לזה של TTX. אם יש צורך בשליטה מדויקת יותר על הפיזור, הזרקת TTX radiolabeled או יישום של אימונוהיסטוכימיה נגד TTX רגיל עם נוגדנים זמינים מסחרית ניתן לבצע37. מלבד תיאור טוב יותר של האזור המכוסה על ידי התרופה, שתי גישות אלה מוגבלות על ידי אישור של TTX מן הרקמה, אשר יש לשקול אם החיה צריכה לשרוד כמה ימים לאחר microinjection, מצד שני, עבודה ולהיפטר של חומר רדיואקטיבי יציג צעדים חדשים ובעיות אבטחה שלא יכול להיות תואם עם כל המעבדות והפרוטוקולים.
הכללה של קבוצת ביקורת המורכבת מבעלי חיים המוזרקים לאזור במוח שאין לו תפקיד בוויסות התהליך הנחקר מומלץ. קבוצה זו תסייע לחוקר לקבוע את הספציפיות של אזור היעד בוויסות תהליך זה ותבטל את האפשרות שהתרופות, המוזרקים בכל מבנה, עלולות לעורר אות חסימה המבוסס על מנגנון נפוץ יותר כגון הפעלת הלחץ או ציר החיסון. מאז אפילו המנתחים סטראוטקסיים הניסויים ביותר אינם מסוגלים להשיג 100% הצלחה כאשר מבנים קטנים ממוקדים, ניסויים אלה מלווים בדרך כלל קנולות להציב מחוץ למבנה הרצוי ולכן קבוצת ביקורת זו מושגת בשוגג. התוצאות מבעלי החיים שבהם הצינורית לא הייתה במקומה הן בעלות ערך ואין להשליך; במקום זאת, יש לבצע ניתוח מקיף בהתחשב באזור המוזרק ופיזור התרופה. עניין מיוחד הן התוצאות המציגות השפעה שונה (או אף אחד) בבעלי חיים מוזרק באזורים קרובים ליעדים.
לפרוטוקול זה יש מגבלות הטמונות במיקום הכרוני של קנולות. לא ניתן למנוע הרס קבוע של סיבי מעבר וגופים עצביים במסלול של הצינורית. השימוש נימים זכוכית עם קוטר קצה של כמה מיקרומטרים היא השיטה של בחירה כדי לספק תרופות לתוך המוח עם נזק מינימלי לרקמה41. מתודולוגיה זו, לעומת זאת, שימשה בעיקר בניסויים שבהם החיה היא מרדים ו / או הראש מחובר למנגנון סטריאוטקסי או התקנים מחזיק אחרים. זאת בעיקר בשל שבריריותו של הנימי עצמו, מה שמקשה על חיבורו לחיה ערה וחסרת מעצורים. מערכת המשתמשת בני נימים מזכוכית המחוברים למשאבות אוסמוטיות, במקום קנולות מדריך, הראתה שיפור ניכר בכמות רקמת המוח שניזוקה ובתגובת הגלישה לפציעה42. במערכת זו, עם זאת, עירוי של התרופות הוא כרוני ולא מתוזמן ולכן לא שימושי בניסויים שבהם זמן ההזרקה חייב להיות נשלט במדויק. מערכת מיקרו-ינון המבוססת על נימי זכוכית שהוכנסו לאזור היעד באמצעות צינורית מדריך שהושתלה בעבר תוארה על ידי אקינורי ועמיתיה43. מערכת זו מאפשרת הזרקה של בעל חיים ער בזמן הרצוי, אבל זה לא חזק מאוד ואת החיה חייבת להיות מוגבלת במהלך ההליך, אשר יכול להוביל להפעלה של תגובת הלחץ. בפרוטוקול זה, ההשפעות של נזק לרקמת עצבים במסלול של צינורית המדריך ניתן לשלוט על ידי השוואת קבוצות שלמות ורכב. כאן הוצגה תוצאה ביוץ דומה עבור שתי הקבוצות, והגיע למסקנה כי הרקמה מושפעת, כמו גם את הזרקת הרכב לא להפריע הביוץ. על החוקרים להריץ מחקרי פיילוט כדי לקבוע אם המבנים הממוקמים על גב לאזור היעד שלהם, אשר ייהרס על ידי הצינורית, מעורבים ברגולציה של התהליך הנחקר. ובכל זאת, כיוון עתידי מבטיח לעבודה זו הוא לעצב מערכת משלוחים שמנצלת את נקודות החוזק של קנולות מדריך ונימים מזכוכית.
שיקול חשוב נוסף עבור החוקרים הוא זמן הפעולה של TTX. Zhuravin ו Bures38 הראו כי TTX לוקח כמה דקות כדי להגיע למצור מקסימלי של שידור עצבי, אשר נמשך כשעה וחצי, ירידה הדרגתית על פני כמה שעות. זה הופך את TTX לסם המועדף כאשר נדרשת אי-אקטיביות לאורך זמן. אם הניסוי דורש אי-פעילות מהירה יותר, ניתן להשתמש בהרדמה מקומית כגון לידוקאין מכיוון שלוקח רק כמה שניות להגיע למצור מקסימלי. ההשפעות של תרופה זו להימשך פחות מ 20 דקות, מתן רזולוציה זמנית עדינה יותר מאשר TTX. המאפיינים המוזכרים לעיל הופכים את TTX לכלי טוב לניסויים גישושים החוקרים את נוכחותם של אותות עצביים הנוצרים בחלונות זמניים פחות מוגדרים היטב. לידוקאין, לעומת זאת, שימושי לתיאור חלון זה44. החיסרון של שתי התרופות הוא שהן חוסמות את העברת פוטנציאל הפעולה בסיבים של מעבר, ומציגות ממצאים בפרשנות הנתונים מכיוון שהאות יכול להגיע ממבנה אחר ששולח תחזיות אקסונליות לאזור המוזרק. במקרה זה, ניתוח זהיר של הזריקות שנקבעו להיות מחוץ לאזור היעד חשובים מאוד. לדוגמה, במאמר זה הוכח כי עירוי TTX לאזור רק קהור לגרעין suprachiasmatic לתוך האזור בינו לבין גרעין arcuate לא לחסום ביוץ. תוצאות כאלה גילו כי הסיבים והתאים באזורים אלה אינם מעורבים בוויסות הביוץ, שהיה בלתי צפוי בשל נוכחות של רשת הדדית של סיבים המקשרים את הגרעין העל-רציאסמטי הן עם גרעין הארקואט והן עם האזורים הזעירים המכילים נוירונים GnRH.
חלופה שאינה חוסמת את השידור לאורך סיבי מעבר באזור המוזרק היא שימוש בציטוטים דיווה כגון קובלט ומגנזיום, אשר שניהם מעכבים את שחרורם של נוירוטרנסמיטורים על ידי מסופים presynaptic. הבעיה עם גישה זו, עם זאת, היא הזמן הקצר מאוד של פעולה לא פעילה ורעילות גבוהה44. אפשרויות אחרות כדי למנוע מצור של סיבים הם גישות אופטוגנטיות וכימוגנטיות, שניהם אסטרטגיות למניפולציה של הפעילות של אוכלוסיות עצביות ספציפיות. סלקטיביות הוא הרוויח על ידי transfecting נוירונים עם וקטורים ויראליים שנועדו להכניס רצפים המקודדים עבור אופסינים מאוגדים ערוצי יונים או קולטנים מותאמים לידי ביטוי תחת מקדמים ספציפיים. המיקרו-ערך של הווקטור מבוצע בבעלי חיים מרדים באמצעות נימים מזכוכית, מה שגורם להפרעה מועטה של הרקמה שמסביב. השתלת סיבים אופטיים או הזרקה מערכתית של תרופות סינתטיות מאפשרת מניפולציה מדויקת מאוד של אוכלוסיית היעד45. טכניקות אלה הוכחו כיעילות במחקר, לבד או בשילוב עם טכניקות כגון מיקרו-ערך TTX המוצג בפרוטוקולזה 46. ובכל זאת, יש לשקול מספר היבטים של שיטות אלה כדי לתכנן ניסויים מוצלחים, כולל אימות הספציפיות של הביטוי, שליטה על מספר התאים שהודבקו, הערכת רעילות והערכה של תופעות הלוואי של גירוי אור וכימי.
מרכיבים קריטיים של פרוטוקול זה כללו קביעה נכונה של שלב מחזור estrous עבור כל בעל חיים. כדי לבצע הליך זה בהצלחה, השגת דגימות איכות של האפיתל הנרתיק ופרשנות נכונה של התוצאות הם מכריעים (אנו ממליצים בעקבות איור 1). בנוסף, החוקרים חייבים למלא בזהירות את מערכת ההזרקה כדי למנוע שילוב של בועות אוויר שעלולות לגרום להזרקה של כמויות לא מדויקות של תרופות. חשוב גם לעקוב אחר בעלי החיים במהלך microinjection כדי למנוע מהם לנשוך את הצינורות או להפריע אחרת למערכת. לבסוף, חוקרים עיוורים לתנאי ניסוי צריכים לנתח את התוצאה של הביוץ, את המיקום הסופי של הצינורית ואת פיזור הפתרון לאזור היעד כדי להבטיח כי הפרשנות של התוצאות אינה משוחדת.
כאן תוארה שיטה אמינה, חסכונית ופשוטה לניתוח תרומתם של אזורים נפרדים במוח בוויסות הביוץ. הליך זה מבוצע בחולדות ערות וחסרות מעצורים, העולות על ההשפעות המזיקות של המצור על עצבית וגם את ההשפעות המעכבות כי הורמוני לחץ כגון קורטיזול וקורטיקוסטרון מפעיל על הפרשת GnRH. שיטה זו ניתנת להתאמה אישית מלאה וניתן להשתמש בה כדי לספק כל תרופה לכל מבנה של המוח. בנוסף, ניתן להתאים אותו בקלות למינים נפוצים של מכרסמים ולא מכרסמים המשמשים במעבדה. לבסוף, פרוטוקול זה יכול לשמש בשילוב עם שיטות לכימות של חומרים כגון הורמונים ומטבוליטים בדם, הערכה של ביטוי גנים בתאים וברקמות, הקלטת פעילות עצבית וגם את הביצועים של בעלי חיים ערים בבדיקות התנהגותיות כדי לקבוע את התפקיד של אזורי מוח ספציפיים בתהליכים התנהגותיים ופיזיולוגיים מגוונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף ביחס למאמר זה.
Acknowledgments
אנו מודים לריימונד סנצ'ז מאוניברסיטת וושינגטון על עזרתו היקרה בעריכת כתבי יד M.Sc ג'ורג'ינה קורטס M.Sc סינציה חוויאר על תמיכתם הטכנית בתקינה של טכניקה זו. אנו מודים גם לחברי שירותי הווטרינר בפקולטה דה אסטודיוס סופריור סרגוסה: MVZ. אדריאנה אלטאמירנו, MVZ. רומן הרננדז ו-MVZ. דולורס-אליזבת גוזמן לתחזוקה וטיפול מצוין בבעלי חיים ניסיוניים. הניסויים המתוארים בפרוטוקול זה נתמכו על ידי מספר מענק DGAPA-PAPIIT: IN216015 ועל ידי מספר מענק CONACyT: 236908 לרוברטו דומינז. קרלוס-קמילו סילבה הוא דוקטורנט מתוכנית דה דוקטורדו en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) ונתמך על ידי הקונז'ו הלאומי דה סינסיה y Tecnología (מספר גרנט: 294555).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL Hamilton syringes | Hamilton | 80314 | |
| 21 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305165 | |
| 23 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle | BD | 305106 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | BASi | MD-2400 | |
| Bone trimer | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Burr for micro drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Clipper | Wahl | ||
| Cut-off disc | Dremel | SM5010 | |
| Cutting tweezers | Truper | 17367 | |
| Cyanocrylate glue | Kola loka | K-1 | |
| Dental cement | Nic Tone | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosin | Sigma | E4009 | |
| Estereoscope | Zeiss | ||
| Extra fine Bonn scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Face mask | Lanceta HG | 60036 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Hematoxilin | Sigma | H3136 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 320331 | |
| Hypromelose artificial tears | Sophia Labs | 8950015 | |
| Isoflurane | Pisa Agropecuaria | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Microinjection pump | KD Scientific | 788380 | |
| Monomer | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Nitrile gloves | Lanceta HG | 69028 | |
| Non-Rupture Ear Bars | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poly-L lysine | Sigma | P4707 | |
| Povidone-iodine | Dermo Dine | ||
| Povidone-iodine with soap | Germisin espuma | ||
| Pressure tweezers | Truper | 17371 | |
| Rat anesthesia mask | David Kopf Instruments | Model 906 | |
| Saline solution | PISA | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sodium pentobarbital | Pisa Agropecuaria | ||
| Standard electrode holder | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Stainless steel wire | American Orthodontic | 856-612 | |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments | Model 900LS | |
| Surgical Sissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Teflon connectors | Basi | MD-1510 | |
| Teflon tubing | Basi | MF-5164 | |
| Tetrodotoxin | Alomone labs | T-500 | |
| Vaporizer | Kent scientific | VetFlo |
References
- Herbison, A. E. Control of puberty onset and fertility by gonadotropin-releasing hormone neurons. Nature Reviews Endocrinology. 12 (8), 452-466 (2016).
- Fink, G. Neuroendocrine Regulation of Pituitary Function. Neuroendocrinology in Physiology and Medicine. Conn, M., Freeman, E. , Springer Science Business Media. New York. 107-133 (2000).
- Herbison, A. E. The Gonadotropin-Releasing Hormone Pulse Generator. Endocrinology. 159 (11), 3723-3736 (2018).
- Morello, H., Taleisnik, S. Changes of the release of luteinizing hormone (LH) on the day of proestrus after lesions or stimulation of the raphe nuclei in rats. Brain Research. 360 (1-2), 311-317 (1985).
- Slusher, M. A., Critchlow, V. Effect of Midbrain Lesions on Ovulation and Adrenal Response to Stress in Female Rats. Experimental Biology and Medicine. 101 (3), 497-499 (1959).
- Sawyer, C. H., Haun, C. K., Hilliard, J., Radford, H. M., Kanematsu, S. Further Evidence for the Identity of Hypothalamic Areas Controlling Ovulation and Lactation in the Rabbit. Endocrinology. 73 (3), 338-344 (1963).
- Schiavi, R., Jutisz, M., Sakiz, E., Guillemin, R. Stimulation of Ovulation by Purified LH-Releasing Factor (LRF) in Animals Rendered Anovulatory by Hypothalamic Lesion. Experimental Biology and Medicine. 114 (2), 426-429 (1963).
- Bagga, N., Chhina, G. S., Mohan Kumar, V., Singh, B. Cholinergic activation of medial preoptic area by amygdala for ovulation in rat. Physiology & Behavior. 32 (1), 45-48 (1984).
- Barraclough, C. A., Yrarrazaval, S., Hatton, R. A Possible Hypothalamic Site of Action of Progesterone in the Facilitation of Ovulation in the Rat. Endocrinology. 75 (6), 838-845 (1964).
- Critchlow, V. Blockade of ovulation in the rat by mesencephalic lesions 1, 2. Endocrinology. 63 (5), 596-610 (1958).
- Terasawa, E., Wiegand, S. J. Effects of Hypothalamic Deafferentation on Ovulation and Estrous Cyclicity in the Female Guinea Pig. Neuroendocrinology. 26 (4), 229-248 (1978).
- Halász, B., Köves, K., Molnár, J. Neural control of ovulation. Human Reproduction. 3 (1), 33-37 (1988).
- Narahashi, T. Pharmacology of tetrodotoxin. Journal of Toxicology: Toxin Reviews. 20 (1), 67-84 (2001).
- Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. Tetrodotoxin blockage of sodium conductance increase in lobster giant axons. The Journal of General Physiology. 47 (5), 965-974 (1964).
- Narahashi, T., Deguchi, T., Urakawa, N., Ohkubo, Y. Stabilization and rectification of muscle fiber membrane by tetrodotoxin. American Journal of Physiology-Legacy Content. 198 (5), 934-938 (1960).
- Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiological Reviews. 54 (4), 813-889 (1974).
- Ritchie, J. M., Rogart, R. B. The binding of saxitoxin and tetrodotoxin to excitable tissue. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 79 (1), 1-50 (1977).
- Bermudez-Rattoni, F., Introini-Collison, I. B., McGaugh, J. L. Reversible inactivation of the insular cortex by tetrodotoxin produces retrograde and anterograde amnesia for inhibitory avoidance and spatial learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5379-5382 (1991).
- Tang, X., Yang, L., Liu, X., Sanford, L. D. Influence of Tetrodotoxin Inactivation of the Central Nucleus of the Amygdala on Sleep and Arousal. Sleep. 28 (8), 923-930 (2005).
- Klement, D., Pašt’alková, E., Fenton, A. A. Tetrodotoxin infusions into the dorsal hippocampus block non-locomotor place recognition. Hippocampus. 15 (4), 460-471 (2005).
- Conejo, N. M., Cimadevilla, J. M., González-Pardo, H., Méndez-Couz, M., Arias, J. L. Hippocampal Inactivation with TTX Impairs Long-Term Spatial Memory Retrieval and Modifies Brain Metabolic Activity. PLoS ONE. 8 (5), 64749 (2013).
- Grimm, J., Ronald, E. Dissociation of Primary and Secondary Reward-Relevant Limbic Nuclei in an Animal Model of Relapse. Neuropsychopharmacology. 22 (5), 473-479 (2000).
- Hasegawa, H., et al. Inhibition of the preoptic area and anterior hypothalamus by tetrodotoxin alters thermoregulatory functions in exercising rats. Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1458-1462 (2005).
- Meyer, F., Louilot, A. Early Prefrontal Functional Blockade in Rats Results in Schizophrenia-Related Anomalies in Behavior and Dopamine. Neuropsychopharmacology. 37 (10), 2233-2243 (2012).
- Rothfeld, J. M., Harlan, R. E., Shivers, B. D. Reversible disruption of lordosis via midbrain infusions of procaine and tetrodotoxin. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 25 (4), 857-863 (1986).
- Silva, C., Cortés, G. D., Javier, C. Y., Flores, A., Domínguez, R. A neural circadian signal essential for ovulation is generated in the suprachiasmatic nucleus during each stage of the estrous cycle. Experimental Physiology. , (2019).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (7th Ed). , Academic Press. California. (2014).
- Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal Cytology of the Laboratory Rat and Mouse. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS ONE. 7 (4), 35538 (2012).
- Wirtshafter, D., Asin, K., Kent, E. W. Simple technique for midline stereotaxic surgery in the rat. Physiology & Behavior. 23 (1), 409-410 (1979).
- Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).
- Kazim, S. F., Enam, S. A., Shamim, M. S. Possible detrimental effects of neurosurgical irrigation fluids on neural tissue: An evidence based analysis of various irrigants used in contemporary neurosurgical practice. International Journal of Surgery. 8 (8), 586-590 (2010).
- Miyajima, M., et al. Role of cerebrospinal fluid as perfusate in neuroendoscopic surgery: A basic investigation. Acta Neurochirurgica. 113, 103-107 (2012).
- Mori, K., et al. Potential risk of artificial cerebrospinal fluid solution without magnesium ion for cerebral irrigation and perfusion in neurosurgical practice. Neurologia Medico-Chirurgica. 53 (9), 596-600 (2013).
- Oka, K., Yamamoto, M., Nonaka, T., Tomonaga, M. The significance of artificial cerebrospinal fluid as perfusate and endoneurosurgery. Neurosurgery. 38 (4), (1996).
- James, T. A., Starr, M. S. Effects of the rate and volume of injection on the pharmacological response elicited by intraingral microapplication of drugs in the rat. Journal of Pharmacological Methods. 1 (3), 197-202 (1978).
- Freund, N., Manns, M., Rose, J. A method for the evaluation of intracranial tetrodotoxin injections. Journal of Neuroscience Methods. 186 (1), 25-28 (2010).
- Zhuravin, I. A., Bures, J. Extent of the tetrodotoxin induced blockade examined by pupillary paralysis elicited by intracerebral injection of the drug. Experimental Brain Research. 83 (3), 687-690 (1991).
- Myers, R. Injection of solutions into cerebral tissue: relation between volume and diffusion. Physiology and Behavior. 1 (2), 171-174 (1966).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal of Visualized Experiments. (46), e2082 (2010).
- McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. J Neuroimmunol. 194 (1-2), 27-33 (2008).
- Cunningham, M. G., O'Connor, R. P., Wong, S. E. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of VisualizedExperiments. (13), e716 (2008).
- Akinori, A., Masamichi, S., Hiroshi, T. A new device for microinjection of drugs into the lower brain stem of conscious rats: Studies on site of action of morphine. Journal of Pharmacological Methods. 2 (4), 371-378 (1979).
- Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- de Sousa, A. F., et al. Optogenetic reactivation of memory ensembles in the retrosplenial cortex induces systems consolidation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences. 116 (17), 8576-8581 (2019).
- Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
