Summary
Este protocolo describe la construcción de un sistema de microinyección de bajo costo, su implantación estereotáxica en estructuras cerebrales profundas y el procedimiento para microinyecciones cronometradas de tetrodotoxina en ratas despiertas y sin restricciones. El objetivo es revelar la participación de las estructuras hipotalámicas en la regulación de la ovulación mediante la inhibición de su actividad neuronal.
Abstract
Se han utilizado muchos enfoques experimentales para estudiar el papel del cerebro en la regulación de la ovulación. Los ejemplos incluyen la lesión y la desaferenciación de grupos neuronales, que son métodos invasivos que perjudican permanentemente la integridad del área objetivo. Estos métodos van acompañados de efectos colaterales que pueden afectar al análisis de los mecanismos reguladores agudos y temporales. La implantación estereotáxica de cánulas guía dirigidas a regiones cerebrales específicas, seguidas de un período de recuperación, permite a los investigadores microinyectar diferentes fármacos tras la desaparición de los efectos no deseados de la cirugía. La tetrodotoxina se ha utilizado para determinar el papel de varias áreas del cerebro en diversos procesos fisiológicos porque inhibe transitoriamente los potenciales de acción dependientes del sodio, bloqueando así toda la actividad neuronal en la región objetivo. Este protocolo combina este método con estrategias para la evaluación del ciclo estral y la ovulación para revelar el papel de las regiones cerebrales discretas en la regulación de la ovulación en momentos particulares de cualquier etapa dada del ciclo estral. Se utilizaron ratas despiertas y desenfrenadas(Rattus norvegicus)para evitar los efectos de bloqueo que los anestésicos y las hormonas del estrés ejercen sobre la ovulación. Este protocolo se puede adaptar fácilmente a otras especies, dianas cerebrales y agentes farmacológicos para estudiar diferentes procesos fisiológicos. Las mejoras futuras a este método incluyen el diseño de un sistema de microinyección utilizando capilares de vidrio de pequeño diámetro en lugar de cánulas guía. Esto reducirá la cantidad de tejido dañado durante la implantación y disminuirá la propagación de los medicamentos infundidos fuera del área objetivo.
Introduction
La ovulación es el proceso por el cual uno o más ovocitos maduros se liberan de los ovarios una vez cada ciclo estral/menstrual. Como todas las especies de mamíferos dependen de la producción de gametos para reproducirse, la comprensión de los mecanismos que regulan la ovulación tiene un gran impacto en áreas que van desde la biomedicina, la industria ganadera y el mantenimiento de especies en peligro de extinción. La ovulación está regulada por el eje hipotalámico-hipofisario-ovárico, que involucra varias áreas hipotalámicas y extra-hipotalámicas, los gonadotropos en la hipófisis anterior y las células de la teca y la granulosa que, junto con los ovocitos, forman los folículos ováricos dentro de los ovarios1.
Los folículos ováricos crecen, se desarrollan y eventualmente ovulan en respuesta a la secreción tónica y fásica de la hormona estimulante del folículo y la hormona luteinizante, las dos gonadotropinas secretadas por los gonadotropos. El patrón de secreción de gonadotropina es fundamental para el desarrollo folicular adecuado y la ovulación y está regulado por la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH)1,2. Este neuropéptido es sintetizado por neuronas dispersas por todo el diencéfalo basal y luego secretadas a la vasculatura portal que une el hipotálamo y la hipófisis anterior. La actividad secretora de las neuronas GnRH es a su vez modulada por la entrada sináptica que surge de diversas estructuras cerebrales. Estas estructuras transmiten información sobre el estado del entorno externo e interno del organismo, incluida la disponibilidad de alimentos, la duración del fotoperíodo y la concentración de hormonas en la sangre. En este sentido, dan forma al patrón reproductivo de cada especie y se deben determinar los roles específicos de tales estructuras para comprender adecuadamente los mecanismos que gobiernan la ovulación. A título de ejemplo, se ha demostrado que la fluctuación en los niveles de estradiol durante el ciclo estral regula la secreción de GnRH; sin embargo, las neuronas GnRH no expresan la isoforma del receptor de estradiol necesaria para detectar tales cambios. Dos poblaciones de neuronas que expresan estos receptores se localizan en la región periventricular rostral del tercer ventrículo y en el núcleo arqueado, respectivamente, y establecen sinapsis con las neuronas GnRH. Existe evidencia que sugiere que estas neuronas interpretan la concentración de estradiol y luego estimulan la actividad de las neuronas GnRH liberando kisspeptina, un potente inductor de la secreción de GnRH3.
Los experimentos que involucran lesiones térmicas o químicas, así como la deaferenciación mecánica, permitieron a los investigadores determinar la participación de varias estructuras cerebrales en la regulación de la ovulación4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Estos experimentos, sin embargo, tienen la desventaja de ser invasivos y traumáticos, requiriendo varios días de recuperación antes de evaluar los efectos del tratamiento, impidiendo el análisis de los efectos agudos del tratamiento. Además, afectan permanentemente las áreas objetivo e interrumpen otros procesos fisiológicos a largo plazo. Debido a estos problemas, los resultados de estos experimentos suelen estar oscurecidos por los mecanismos compensatorios homeostáticos en el cuerpo del animal y extraer información precisa sobre la dinámica reguladora temporal en la que está involucrada el área es bastante difícil.
La microinyección de fármacos que interrumpen transitoriamente la actividad de las neuronas a través de cánulas guía es una alternativa adecuada que supera las desventajas mencionadas anteriormente. Las cánulas se pueden colocar en cualquier región del cerebro mediante una cirugía estereotáxica, lo que permite al investigador comenzar el tratamiento farmacológico después de que desaparezcan los efectos de confusión de la cirugía. La microinyección cronometrada de los medicamentos permite a los investigadores probar hipótesis sobre la contribución de la región a un paso particular del proceso y se puede realizar en animales despiertos restringidos o en movimiento libre. Una variedad de medicamentos que incluyen anestésicos locales, agonistas, antagonistas, agonistas inversos y toxinas biológicas como la tetrodotoxina (TTX) pueden microinyectarse en la región de interés en momentos específicos.
TTX es una toxina biológica sintetizada por bacterias que viven en el cuerpo del pez globo, así como otros vertebrados e invertebrados. TTX silencia la actividad neuronal a través del bloqueo selectivo y transitorio de los canales de sodio, lo que resulta en la inhibición de los potenciales de acción dependientes del sodio. En presencia de TTX, las células experimentan una alteración en la fase de despolarización y, por lo tanto, no son excitables, sino que permanecen vivas. El efecto de bloqueo de TTX se explica por su composición molecular: un grupo guanidinio es capaz de pasar a través del aspecto extracelular del canal de sodio, pero el resto de la molécula no puede pasar debido a su tamaño, por lo que se atasca y bloquea el canal13,14,15,16,17 . El mecanismo de acción del TTX permitió su uso como herramienta para estudiar el sistema nervioso tanto in vitro como in vivo. La inyección intracerebral de esta toxina se ha utilizado para estudiar el papel de las áreas discretas del cerebro en varios procesos como la retención de la memoria18,el sueño y la excitación19,el reconocimiento delugares 20,la navegación espacial21,el abuso de drogas22,la termorregulación23,el desarrollo de la esquizofrenia24,el comportamiento sexual25 y la regulación de la ovulación26 entre otros. En este protocolo describimos los efectos sobre la ovulación de la inactivación transitoria de núcleos hipotalámicos por microinyección TTX en ratas despiertas y desenfrenadas.
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Protocol
Los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de la Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, UNAM. Esta institución opera en estricto cumplimiento con las normas mexicanas para el manejo de animales, Norma Oficial: NOM-062-ZOO-1999, que concueerda con los lineamientos internacionales.
1. Construcción de cánulas bilaterales
- Extraiga el eje de acero inoxidable del cubo de dos agujas hipodérmicas de 23 G con pinzas de presión y luego retire el pegamento restante con una cuchilla de bisturí.
- Dibuje una línea de 15 mm aparte del extremo romo de los ejes con un marcador permanente fino. Use pinzas de corte para quitar los extremos biselados.
- Sujetar los segmentos de 15 mm con hemostáticos finos y presionarlos perpendicularmente con un disco de corte unido a una herramienta rotatoria hasta obtener segmentos de tubo de 14 mm. Este paso se realiza con el fin de eliminar la parte ocluida de los ejes, creando extremos abiertos y romos. Finalmente, inserte una aguja de 30 G a través de los segmentos para eliminar cualquier obstrucción interna.
- Determinar la distancia entre las estructuras de interés en los hemisferios izquierdo y derecho del cerebro con la ayuda de un atlas cerebral27. Utilice arcilla moldeadora para unir los dos segmentos de 14 mm a un portaobjetos de microscopio y asegúrese de que ambos estén al mismo nivel horizontal. Observar a través de un micrómetro ocular (10x) y ajustar los segmentos con pinzas finas hasta obtener la distancia deseada.
- Mezcle la pasta de soldadura con ácido clorhídrico al 10% en una proporción de 2: 1 y agregue una gota de la mezcla 2 mm por debajo del extremo romo de los segmentos. Suda ambos segmentos con un solo punto utilizando un soldador y alambre de soldadura de 0,5 mm de diámetro. Asegúrese de que la soldadura no obstruya la luz de los segmentos.
- Cree un soporte para unir la cánula al soporte estereotáxico cortando un segmento de 10 mm de alambre resistente de acero inoxidable de 0,3 mm. Use arcilla moldeadora para colocar 2 mm del alambre en contacto con el punto de soldadura anterior y el resto colocado sobre el extremo romo de las cánulas. Suerda el alambre a las cánulas.
- Limpiar la superficie de las cánulas con etanol al 70% para eliminar el exceso de la pasta de soldadura. Enjuague el interior de las cánulas con agua estéril para eliminar las partículas metálicas. Repita este proceso hasta que no se puedan detectar partículas bajo el microscopio a un aumento de 10x.
2. Construcción de obturadores y tapas
- Para construir los obturadores corte dos segmentos de 16 mm de alambre blando redondo de acero inoxidable (0,35 mm de diámetro). Sostenga una cánula bilateral con hemostáticos, perpendicular a un banco de laboratorio, e inserte uno de estos segmentos en cada cánula hasta que lleguen al banco. Dobla el remanente en un ángulo de 90°.
- Para las tapas corte dos segmentos de 2 mm de tubo de silicona (diámetro interior = 0,76 mm) y aplique una gota de pegamento de silicio en uno de los extremos de cada segmento. No deje que el pegamento entre en el tubo. Dejar secar durante al menos 24 horas.
3. Construcción de microinyectores
- Repita el paso 1.1, usando agujas hipodérmicas de 30 G en su lugar para crear los ejes.
- Dibuje una línea de 18,5 mm aparte del extremo romo de los ejes y retire el resto de los extremos biselados con pinzas de corte.
- Repita el paso 1.1 con una sola aguja de 23 G para construir adaptadores cortando dos segmentos de 6 mm de largo a partir del extremo romo.
- Eliminar las porciones ocluidas de los segmentos de 6 mm presionándolos perpendicularmente contra el disco de corte hasta obtener dos adaptadores de 4 mm. Eliminar cualquier obstrucción interna.
- Inserte el extremo biselado de los segmentos de 30 G en los adaptadores. Mire a través de un estereomitroscopio para asegurarse de que el extremo de ambos, segmentos y adaptadores, estén al mismo nivel. Aplique pegamento de cianoacrilato en la articulación distal con un hisopo de algodón y deje secar durante 15 minutos.
- Remoje dos conectores de tubos de teflón en etanol al 70% durante 5 minutos y luego conéctelos a los microinyectores a través de los adaptadores. Espere hasta que el diámetro de los conectores se reduzca durante al menos 24 horas y luego esterilice el microinyector con un método de baja temperatura para evitar daños en los conectores (se recomienda la esterilización por óxido de etileno).
4. Mantenimiento animal y frotis vaginales
- Utilice ratas encapuchadas hembras adultas cíclicas(Rattus norvegicus,cepa CIIZ-V) que pesen entre 230 y 260 gramos. Aloja a las ratas en grupos de cuatro en jaulas estándar de polipropileno en una habitación con un fotoperíodo de luz-oscuridad de 14:10. Ajuste la temperatura y la humedad a 22 ± 2 ° C y al 40%, respectivamente. Proporcionar alimentos y agua ad libitum.
- Tome frotis vaginales todos los días entre las 10:00 y las 12:00 h.
- Esterilizar un lazo bacteriológico modificado con un diámetro interior de 1 mm utilizando una lámpara de alcohol y enfriarlo con agua estéril. Sostenga a la rata con un agarre seguro e introduzca 5 mm del asa bacteriológica en la vagina, tocando sus paredes internas. Retire el asa bacteriológica. Si tiene éxito, se verá una caída nublada en la punta. Coloque esta gota en un portaobjetos de microscopio.
- Repita este proceso para cada rata esterilizando y enfriando el bucle entre cada animal.
- Después de que las gotas se sequen, se tiñe con hematoxilina-eosina y observe las muestras bajo un microscopio a 10x.
- Determinar la proporción de leucocitos, células nucleadas epiteliales y células queratinizadas en cada frotis y clasificarlo según los criterios de etapas del ciclo estral reportados en la Figura 1,que concueerda con la literatura previa28,29.
5. Implantación estereotáxica de las cánulas
NOTA: Realizar la implantación de las cánulas después de una cirugía estereotáxica aséptica regular y cumpliendo con las normas institucionales.
- Antes de la cirugía
- Esterilizar instrumentos quirúrgicos, cánulas, tornillos quirúrgicos, obturadores, gasas e hisopos de algodón de madera 24 horas antes de la cirugía utilizando un autoclave de vapor. Esterilizar las puntas de los instrumentos metálicos entre cirugías consecutivas limpiándolas con peróxido de hidrógeno al 10% seguido de agua y luego colocarlas en un esterilizador de cuentas calientes.
- Prepare las áreas de trabajo y el instrumento estereotáxico antes de sacar al animal de la sala de clases. Prepare al animal para la cirugía en un área que se encuentre lo más lejos posible de la mesa de cirugía para evitar la contaminación durante el procedimiento.
- Limpie las áreas de preparación y cirugía con etanol al 70% seguido de una aplicación de una solución de cloruro al 10% durante diez minutos. Limpie la base, el marco y los manipuladores del instrumento estereotáxico con etanol al 70% y esterilice las puntas de las barras para los oídos con un esterilizador de cuentas calientes y enfríe al aire antes de la cirugía.
- Realice la cirugía con una bata de laboratorio dedicada, máscara facial, capó para la cabeza, mangas quirúrgicas, cubiertas de zapatos y guantes quirúrgicos. Pídale al asistente que prepare a los animales para la cirugía y verifique su estado general durante el procedimiento.
- Conecte la cánula al soporte estereotáxico. Pídale al asistente que traiga al primer animal que será operado a la habitación. Seleccione ratas en diestro para la cirugía, ya que las observaciones de nuestro laboratorio indican que estos animales recuperan los ciclos estrales adecuados más rápido que las ratas operadas en otras etapas, probablemente porque la respuesta al estrés cambia junto con el ciclo estral.
- Pesar al animal e inducir anestesia con 4% de isoflurano en oxígeno al 100% dentro de una cámara de inducción para ratas conectada a un vaporizador de isoflurano. Para evitar estresar a los animales, no prellene la cámara. Confirme un plano quirúrgico de anestesia comprobando la dilatación de la pupila y la pérdida de dolor medida por las pruebas de pellizco de la cola y el oído después de observar la pérdida del reflejo de enrechamiento.
- Anestesiar a la rata mediante una inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) si no se dispone de un vaporizador de isoflurano.
- Retire la rata de la cámara de inducción y use un cono nasal en la tabla de preparación para mantener los efectos de la anestesia con isoflurano al 2,5% en oxígeno al 100%. Recorte el cabello del cuero cabelludo con cortapelos y elimine el vello suelto con un rodillo de pelusa. Inyecte una dosis subcutánea preoperatoria de 2 mg/kg de Meloxicam y 5 mg/kg de Enrofloxacina como antiinflamatorio/analgésico no esteroideo y antibiótico, respectivamente.
- Aplique lágrimas artificiales de hipromelosa en cada ojo para evitar la desecación durante la cirugía.
- Monte al animal en el instrumento estereotáxico sobre una almohadilla de calentamiento utilizando barras para los oídos sin ruptura y una máscara de anestesia. Ajuste la abrazadera de la nariz para asegurarse de que la cabeza del animal sea plana. Realice un exfoliante quirúrgico en el área afeitada alternando entre povidona yodada con jabón y etanol al 70% una vez y luego usando povidona yodada y etanol al 70% dos veces. Inserte un termómetro rectal para registrar la temperatura del animal durante el procedimiento y luego cúbralo con un campo quirúrgico estéril.
- Durante la cirugía
- Use un bisturí para hacer una incisión de 2 cm en la piel y el músculo en el medio del área afeitada. Retire el periostio del cráneo usando un hisopo de algodón recubierto con peróxido de hidrógeno al 2% para revelar bregma o lambda, los puntos de referencia que se utilizarán para calcular las coordenadas objetivo. Seque el cráneo con aire para una mejor visualización del punto de referencia.
- Utilice los manipuladores del instrumento estereotáxico para mover la cánula a una posición directamente encima del punto de referencia de su elección. Registre las coordenadas anterior-posterior y medial-lateral del instrumento estereotáxico y utilícelas para calcular las coordenadas del área objetivo de acuerdo con el atlas cerebral27.
- Establezca las coordenadas calculadas en el instrumento estereotáxico y coloque la punta de la cánula en la superficie del cráneo. Registre la coordenada dorsal-ventral y utilí ante ella para calcular la profundidad en el área objetivo.
- Retire el brazo del manipulador desenroscándolo del marco. Use una rebaba dental unida a una herramienta rotatoria a una velocidad de 15,000 rpm para hacer una marca en el lugar donde se realizará la craneotomía. Luego use la rebaba para hacer tres agujeros, formando un triángulo equilátero alrededor de la marca. Estos agujeros no deben perforar el cráneo. Inserte los tornillos quirúrgicos en los orificios, asegurándose de que estén bien colocados.
- Haga que la craneotomía sea lo suficientemente ancha como para acomodar la distancia entre las áreas objetivo en cada hemisferio. Debe ser lo más pequeño posible en diámetro pero lo suficientemente grande como para permitir la bajada de la cánula sin tocar los bordes del cráneo, ya que esto modificará la trayectoria. Realizar la craneotomía de forma gradual, aplicando la menor presión posible. El cráneo del roedor tiene solo unos pocos milímetros de grosor y es fundamental para preservar la integridad de los tejidos de abajo.
- Una vez que la duramadre sea visible, use una aguja estéril de 21 G con la punta curvada en un ángulo de 90 ° para eliminar las astillas de hueso y hacer un corte anterior-posterior en las meninges. Use la técnica Wirtshafter y sus colegas30 para evitar daños en el seno sagital superior si el área objetivo se encuentra cerca de la línea media.
- Coloque el soporte con la cánula en el marco y use el manipulador dorsal-ventral para alcanzar la coordenada ventral. Verifique que la aguja no toque los bordes mientras desciende y aumente el diámetro de la craneotomía si es necesario.
NOTA: Es importante que la punta de las cánulas guía se dirija a una región que va de 0,5 a 2,0 mm por encima de la región de interés. Esto se debe a la reacción inflamatoria del cerebro en respuesta a la introducción de cuerpos extraños y a la destrucción del tejido. Esto es especialmente crítico si la región de interés es pequeña y la distancia de trabajo debe calcularse empíricamente de antemano.
- Coloque el soporte con la cánula en el marco y use el manipulador dorsal-ventral para alcanzar la coordenada ventral. Verifique que la aguja no toque los bordes mientras desciende y aumente el diámetro de la craneotomía si es necesario.
- Aplique cemento dental para unir la cánula al cráneo y déjela secar. Asegúrese de que el cemento dental no cubra el extremo romo de la cánula, ya que esto la obstruirá irreversiblemente. Espere hasta que el cemento se solidifique por completo.
- Inserte los obturadores para evitar obstrucciones adicionales y para garantizar la permeabilidad durante el estudio. Póngase la tapa de silicona para evitar la contaminación.
- Después de la cirugía
- Reemplace los líquidos perdidos mediante una inyección intraperitoneal de 1.0 ml de solución salina estéril a temperatura fisiológica. Coloque al animal en una jaula de recuperación con soporte térmico hasta que se recupere de la anestesia. Verifique la temperatura y la frecuencia cardíaca / respiratoria del animal periódicamente. Los efectos del isoflurano duran unos minutos después de la interrupción del flujo de gases, mientras que los efectos de ketamina/xilazina duran de 40 a 50 minutos.
- Proporcionar inyecciones postoperatorias de los medicamentos antibióticos, analgésicos y antiinflamatorios (a las mismas dosis y rutas indicadas anteriormente) durante 48-72 h e inspeccionar de cerca a los animales diariamente durante el resto del experimento. Informe cualquier signo de dolor, estrés o pérdida de peso a los servicios veterinarios o a un miembro capacitado del laboratorio. No realice ninguna otra manipulación a las ratas durante este período.
- Comience a tomar frotis vaginales después del tratamiento postoperatorio y continúe haciéndolo hasta que el animal muestre tres ciclos estrales consecutivos de cuatro días.
NOTA: Los catéteres yugulares crónicos se pueden implantar quirúrgicamente, lo que permite al investigador tomar muestras de sangre en serie para analizar la secreción de hormonas como estradiol, progesterona, testosterona, hormona luteinizante, hormona estimulante del folículo y corticosterona. Recomendamos colocar un catéter de este tipo una vez que el animal se recupera de la cirugía cerebral, ya que esto mejorará la tasa de supervivencia al tiempo que evita la obstrucción del catéter que puede resultar de un tiempo de recuperación prolongado.
6. Manejo de tetrodotoxinas y preparación de soluciones
PRECAUCIÓN: TTX es una de las sustancias más tóxicas conocidas. Actúa sobre los músculos esqueléticos y el tejido nervioso. La intoxicación por contacto es poco probable, pero cualquier herida abierta es una vía potencial para la inoculación en el cuerpo. Las principales preocupaciones a la hora de trabajar con TTX son la punción de la piel con instrumentos afilados que han estado en contacto con la toxina y la generación de aerosoles que pueden llegar a la boca, ojos y mucosas. Dependiendo de la dosis, TTX puede ser letal si es inhalado, ingerido o inoculado por la piel. Causará una fuerte irritación de los ojos. La DL50 ha sido probada en ratones mediante administración oral e intravenosa y es de 334 μg/kg y 7,3 μg/kg, respectivamente. No hay antitoxina disponible en este momento.
NOTA: La sustancia inactivante es un NaOCl al 1,0% con o sin 0,25 N NaOH, o una solución de lejía al 10%. La inactivación completa ocurre después de 30 minutos de exposición. TTX no puede ser completamente inactivado por ningún derivado de cloruro a una concentración inferior al 10%, por autoclave ni por esterilización por calor seco a una temperatura inferior a 500 ° F. Todos los procedimientos que involucran TTX deben ser realizados por dos personas bien informadas que usan pares internos y externos de guantes de nitrilo, bata de laboratorio dedicada, gafas de seguridad, máscara facial desechable, zapatos cerrados y pantalones de cuerpo entero.
- Preparación de la solución de stock
- Coloque una almohadilla que esté empapada con la sustancia inactivante en la campana de humos para evitar la contaminación en caso de derrame. Asegúrese de que la campana extractora de humos funciona correctamente antes de comenzar. Prepare un receptáculo con la solución inactivante para desechar las puntas de pipeta.
- Resuspend polvo liofilizado estéril de citrato TTX de acuerdo con las instrucciones del fabricante mediante una titulación extremadamente cuidadosa y lenta con líquido cefalorraquídeo artificial estéril, enjuagando las paredes del vial en el proceso. Evite la formación de espuma y aerosol. Siga una técnica aséptica para evitar la contaminación de la solución TTX, ya que se inyectará en el cerebro de animales vivos. Use una jeringa con una aguja en lugar de una micropipeta si sus viales de TTX tienen una membrana externa para evitar la formación de aerosoles.
- Alicuar la solución de caldo en microtubos estériles. Haga que las alícuotas sean lo más pequeñas posible, ya que los ciclos de congelación / descongelación pueden alterar la estabilidad de las moléculas. No llene más de la mitad de los tubos porque el agua aumenta de volumen cuando se congela, lo que puede provocar la apertura de la tapa y la contaminación del tubo y otras muestras almacenadas en el recipiente.
- Descontaminar el exterior de los tubos y las superficies donde se utilizó TTX con la sustancia inactivante. Guarde los tubos a -20 °C en una caja de viales dentro de un recipiente secundario.
- Diluir la solución de caldo a una concentración de trabajo
- Prepare soluciones recién diluidas el día en que se utilizarán, ya que las soluciones diluidas son menos estables. Coloque una almohadilla que esté empapada con la sustancia inactivante en la campana de humos y un micro tubo-rack encima de ella. Prepare un receptáculo con la solución inactivante para desechar las puntas de pipeta.
- Pipetear la solución de caldo en la parte inferior de un microtubo estéril y luego agregar la cantidad calculada de líquido cefalorraquídeo artificial para lograr una concentración de 10 ng / μL. Como se describe para la re-suspensión del polvo TTX, realice una titulación extremadamente cuidadosa y lenta, enjuagando las paredes del vial y evitando la formación de espuma y aerosol.
- Si las muestras que han estado en el congelador se utilizarán para la microinyección, se les debe permitir equilibrar a temperatura ambiente durante al menos una hora antes del experimento.
7. Microinyección de TTX o soluciones de vehículos en ratas que se mueven libremente
- Configure la bomba de microinyección con la velocidad de infusión y el tiempo total de inyección según el experimento. Calcule estos parámetros de antemano teniendo en cuenta el volumen ocupado por la estructura objetivo y la cantidad de solución a inyectar. Para este experimento, inyecte 200 nL de solución a una velocidad de 50 nL por minuto durante un tiempo total de perfusión de 4 minutos.
- Llene dos jeringas Hamilton de 10 μL con agua destilada estéril, inserte un trozo de tubo de teflón estéril en el conector del tubo de cada microinyector, asegurándose de que la longitud del tubo no limite el movimiento de la rata (el tubo se puede esterilizar con óxido de etileno).
- Coloque una almohadilla que esté empapada con la sustancia inactivante y un cuadrado de 2 cm x 2 cm de película de parafina sobre ella. Pipetear una cantidad suficiente de TTX para llenar la aguja del inyector y 1 cm del tubo por encima de la película. Absorba la gota TTX retrayendo suavemente el émbolo. Monte las jeringas en la bomba de microinyección y use sus controles para manipular el émbolo hasta que se pueda ver una gota de TTX en la punta de cada microinyector. Deseche las gotas en la almohadilla empapadas con sustancia inactivante.
- Seleccione las ratas que serán microinyectadas. Use solo ratas que mostraron al menos tres ciclos consecutivos después de la cirugía. Considere su etapa del ciclo y la hora del día. Tanto el tiempo como la etapa dependen de la hipótesis específica que va a probar, para este experimento se producen 14:00 horas de proestro seleccionadas ya que las señales preovulatorias nerviosas que gobiernan la secreción fástica de GnRH se producen en este momento. Transportarlos a la habitación donde se llevará a cabo la inyección dentro de sus propias jaulas de vivienda para evitar angustia.
- Sostenga a la rata con un agarre firme, retire la tapa y los obturadores de las cánulas, inserte los microinyectores en las cánulas guía y devuelva al animal a la jaula.
- Encienda la bomba y espere hasta que finalice la microinyección. Observar al animal durante este período para detectar un posible desprendimiento de los microinyectores y evitar la torsión de los tubos de teflón.
- Deje los microinyectores en su lugar durante dos minutos adicionales para evitar el reflujo de la solución. Retíralos, limpia la superficie del implante con solución antiséptica de yodopovidona, evitando su flujo dentro de las cánulas guía. Inserte obturadores estériles, póngase la tapa y devuelva al animal a la sala de la colonia. Observe al animal periódicamente para detectar cualquier posible efecto secundario de la droga.
- Encienda la bomba con los mismos parámetros que durante la microinyección y compruebe si hay un flujo correcto para asegurarse de que la permeabilidad del sistema se haya conservado durante el procedimiento.
- Presione el émbolo para expulsar el TTX/vehículo fuera del microinyector hasta que la burbuja de aire llegue a la punta de la aguja. Recuerda el TTX en su microtubo. Llene la jeringa con agua destilada y utilícesla para limpiar el interior de los tubos. Deseche el agua en la sustancia inactivante y repita este proceso al menos tres veces. Limpie el exterior de jeringas, tubos y microinyectores con un paño empapado en la sustancia inactivante.
8. Eutanasia y procesamiento de tejidos
- El día del estro predicho o confirmado vaginalmente, inyecte a la rata una sobredosis intraperitoneal de pentobarbital de sodio (75 mg / kg). Verifique si hay pérdida de conciencia e inyecte 200 nL de una solución de azul de metileno al 0.5% a través de las cánulas guía como se describe en los pasos 7.1 a 7.9. Verifique si hay signos de dolor usando la prueba de pellizco de dedo del dedo deldo del día o la cola y, si no se detecta ninguno, decapitar a la rata con una guillotina de roedores.
- Use tijeras para abrir la cavidad abdominal y encontrar los ovarios. Use tijeras finas de iris para diseccionar cada ovario, cortando en la unión útero-trompa con la ayuda de una lupa. Evite dañar el oviducto porque esto resultará en la pérdida de ovocitos.
- Coloque los ovarios debajo de un estereomitroscopio y use una cuchilla de afeitar para eliminar todo el tejido graso sin dañar el órgano. Retire el oviducto de cada ovario cortando con la cuchilla de afeitar lo más lejos posible de la región de la ampolla. Monte cada oviducto en un tobogán diferente y cúbralo con una gota de agua. Guarde los ovarios en un vial que contenga la solución de Bouin.
- Seque suavemente los oviductos con una toalla de papel absorbente y busque la ampolla debajo del estereomitroscopio. Con la mano no dominante, sostenga el oviducto en su lugar pellizcando lejos de la ampolla con una aguja de 23 G, luego use otra aguja de 23 G en la mano dominante para hacer una incisión de 1 mm en la región media de la ampolla. Los complejos cúmulo-ovocito sobresaldrán de la incisión como una gota de líquido viscoso (Figura 2D). Use la aguja en la mano dominante para tirar suave y lentamente de la gota lejos del oviducto. Presione el remanente de la ampolla para asegurarse de que no queden ovocitos en el interior. Extraiga los ovocitos de los oviductos lo más rápido posible, ya que la desecación del oviducto atrapará irreversiblemente los ovocitos en su interior.
- Retire el oviducto del portaobjetos y espere hasta que la gota de líquido que contiene los ovocitos se seque. Mante la muestra con hematoxilina-eosina. Utilice el medio de montaje para cubrir el deslizamiento. Observar bajo el microscopio (10x) para determinar el número de ovocitos desprendidos por cada ovario.
NOTA: El sacrificio por perfusión cardíaca no se realiza en este protocolo ya que los ovocitos quedarían atrapados en los oviductos y por lo tanto serían necesarios métodos histológicos para valorar la ovulación. Si el usuario debe perfundirse para analizar otros tejidos, primero se pueden extirpar los ovarios y sujetar las arterias descendentes con hemostáticos gruesos debajo del hígado para evitar fugas de fijador. - Retire la piel de la cabeza y sumerja el cráneo en un recipiente de vidrio con una solución de formalina al 10%. Permita la fijación de la cabeza durante al menos diez días antes de retirar la cánula para evitar la distorsión del tejido. Para eliminar la cánula, use tijeras para separar todos los músculos de la región del cráneo que la rodea. Corte entre los huesos nasales y frontales con recortadores de hueso y luego retire el hueso occipital. Inserte la punta de los recortadores en el foramen magnum y comience a cortar a través de las crestas sagitales que llegan al remanente del hueso nasal.
- La región aislada de la parte superior del cráneo debe contener los huesos frontales y parietales. Retire la cánula implantada unida a la parte superior del cráneo tirando lentamente hacia arriba perpendicularmente a la cabeza. Corte cualquier porción adjunta de las meninges con tijeras finas de iris para evitar la deformación del cerebro.
- Haga un corte anterior-posterior en las meninges y póngalas a un lado para eliminar el cerebro de la base del cráneo. Inserte pinzas romas debajo de los bulbos olfativos y tire suavemente del cerebro hasta que los nervios ópticos sean visibles. Corta los nervios con tijeras finas de iris y saca el cerebro. Preservar el cerebro en solución fijadora.
- Obtener secciones de 50 μm de espesor del cerebro utilizando un vibratomo, montarlas en portaobjetos recubiertos de poli-L-lisina (0,1% en agua destilada) y teñir con la técnica Nissl. Observe las diapositivas bajo el microscopio (10x) para determinar la posición final de las cánulas(Figura 2A-2C)y la propagación del tinte con la ayuda de un atlas cerebral derata 27.
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Representative Results
El protocolo descrito anteriormente se probó mediante la evaluación de los efectos de un solo TTX o vehículo (líquido cefalorraquídeo artificial; ACSF) microinyección en uno de los dos núcleos diferentes que se sabe que están involucrados en la regulación de la ovulación en la rata: el supraquiasmático y el núcleo arqueado. Se eligió el núcleo supraquiasmático ya que contiene el marcapasos circadiano central en mamíferos. Está implicado en la regulación de eventos cíclicos como la secreción de gonadotropinas. El núcleo arqueado fue elegido porque contiene una población de neuronas que expresan receptores de estradiol, lo que estimula la secreción de GnRH durante la mayor parte del ciclo estral. La microinyección se realizó a las 14:00 horas de la etapa de proestro, que es un período conocido como la "ventana crítica" debido a la aparición de muchos de los mecanismos centrales que regulan la liberación preovulatoria de gonadotropinas. Después del tratamiento, se tomaron frotis vaginales todos los días y las ratas fueron sacrificadas a las 09:00 horas del día previsto del estro, que coincidió con un frotis vaginal característico del estro. Como grupo de control adicional, se utilizaron cinco ratas intactas sacrificadas en la etapa de celo. La fracción de animales ciclistas después de la cirugía y la fracción de ratas ovulantes de cada grupo (ratas ovulantes/n) se calculó y analizó utilizando la prueba de probabilidad exacta de Fisher. El número de óvulos desprendidos por ambos ovarios fue analizado por la prueba de Kruskal-Wallis, seguida de la prueba de Dunn. Se realizaron pruebas estadísticas apropiadas para asegurar que el tamaño de la muestra era adecuado.
Un total de 30 ratas hembra fueron implantadas con cánulas guía dirigidas a una de las dos áreas objetivo. Como se muestra en la Figura 3,todos los animales eran cíclicos antes de la cirugía, pero solo siete de ellos no mostraron alteraciones del ciclo estral después del procedimiento de canulación. Veintitrés animales mostraron alteraciones transitorias de sus ciclos, caracterizadas por un aumento en el número de días con frotis leucocíticos. Tales alteraciones se deben probablemente al estrés inducido por la cirugía y disminuyeron gradualmente. En el quinto ciclo, veintiocho ratas se consideraron cíclicas y las dos restantes fueron descartadas del experimento. Este resultado muestra que, después de un tiempo de recuperación de cuatro ciclos estrales (16 días), la mayoría de los animales canulados son adecuados para una mayor experimentación.
La Figura 4A y la Figura 4B representan el porcentaje de animales ovulantes y el número de óvulos arrojados, respectivamente, por animales intactos y por los grupos tratados con ACSF o TTX en el núcleo supraquiasmático. Todas las ratas intactas ovularon y lo mismo fue cierto para el grupo ACSF. Sin embargo, ninguno de los animales microinyectados con TTX ovuló. La inyección del vehículo no modificó el número de óvulos arrojados. Sin embargo, sería interesante valorar la viabilidad y calidad de los ovocitos liberados. Se pueden observar resultados similares en la Figura 4C y la Figura 4D para ratas microinyectadas en el núcleo arqueado. En ambos casos, este método demostró la participación de una región cerebral discreta en la regulación de la ovulación en la ventana crítica de la etapa de proestro, que se infirió por primera vez de los estudios de lesiones pero no se confirmó. Los efectos de la microinyección TTX parecen ser transitorios en lugar de permanentes, ya que un experimento previo mostró que las ratas inyectadas en el núcleo supraquiasmático fuera de la "ventana crítica" ovularon en el día esperado del estro26. Sin embargo, también se recomienda la inclusión de grupos de control en los que los animales se sacrifican con 24 horas o hasta que se logre un claro frotis vaginal de estro para abordar este problema.
Los resultados de la Figura 5A-B representan el resultado ovulatorio de los animales que fueron tratados con ACSF o TTX. Sin embargo, según lo determinado después de la confirmación histológica, sus cánulas se ubicaron fuera de la región prevista. La mayoría de estas cánulas se colocaron en la comisura anterior o en la zona retroquiasmática, dos zonas que no contribuyen a la regulación de la ovulación. Ambas estructuras junto con el núcleo supraquiasmático y arqueado están muy cerca del tercer ventrículo, teniendo en cuenta esto, se esperaría un bloqueo de la ovulación en todos los animales si el medicamento se filtrara en el ventrículo. El hecho de que la microinyección de TTX fuera de los objetivos no logró bloquear la ovulación sugiere que el volumen de TTX infundido a la velocidad seleccionada no se filtró en el ventrículo, revelando así los efectos específicos de la región de TTX. En apoyo de esta idea, el análisis histológico de las rebanadas cerebrales solo mostró neuronas teñidas cerca de la punta de las cánulas guía. Sin embargo, debemos aclarar que no se realizó una evaluación directa de la propagación del fármaco y, por lo tanto, esta conclusión debe abordarse más a fondo.
Figura 1: Frotis vaginales representativos de cada etapa del ciclo estral de la rata. El estro(A)se caracteriza por la presencia de células cornificadas epiteliales sin núcleo que se puede encontrar ya sea solo de formación cumulosa como resultado de la descamación epitelial. En metestro (B) algunas de estas células cornificadas todavía pueden estar presentes, pero son superadas en número por los leucocitos, que también son el tipo de célula predominante en Diestrus (C). Las muestras de proestro (D) se caracterizan por su consistencia viscosa y el predominio de células nucleadas epiteliales. La barra de escala en cada panel representa 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Examen histológico de muestras después de la eutanasia. Secciones coronales cerebrales en el núcleo arqueado (ARC) y la región de eminencia mediana (EM) de una rata intacta(A),una rata canulada bilateralmente(B)y una rata con una cánula fuera de lugar(C). Los asteriscos apuntan a la zona donde se ubicaba la punta de las cánulas guía, en B las puntas se encontraban en el margen basal del núcleo ventromedial (VMH) permitiendo que los inyectores protuberantes llegaran al margen superior del ARC. En C se localizó una cánula dentro del tercer ventrículo (3V), dando lugar a una microinyección ventricular no localizada. Este es un error común cuando el objetivo se encuentra cerca de la línea media y los datos de estos animales deben descartarse. Cuando se realiza correctamente, la extracción de ovocitos debe dar como resultado una sola gota de líquido viscoso que contenga todos los ovocitos del oviducto examinado como se ve en el panel (D). La barra de escala en cada panel representa 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Porcentaje acumulado de animales ciclistas antes y después de la implantación de la cánula (***p≤0.0001; **p=0.0003 vs. el ciclo antes de la cirugía, prueba de probabilidad exacta de Fisher). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Porcentaje de animales ovulantes y mediana con rango intercuartílico (barras de error) del número de óvulos desprendidos por animales microinyectados en la estructura diana #1 (núcleo supraquiasmático, A-B) o #2 (núcleo arqueado, C-D) con líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) o tetrodotoxina (TTX) a las 14:00 de la etapa de proestro. El grupo intacto se agregó a cada gráfico para fines de comparación y el número dentro de las barras representa la fracción de hembras ovulantes (***p≤0.01 vs. grupos Intact y ACSF, la prueba de probabilidad exacta de Fisher y la prueba de Kruskal-Wallis, respectivamente). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Porcentaje de animales ovulantes (A) y mediana con rango intercuartílico (barras de error) del número de óvulos arrojados (B) por animales cuyas cánulas se determinaron fuera de las áreas objetivo. Estos animales fueron microinyectados con líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) o tetrodotoxina (TTX) a las 14:00 del proestro. El grupo intacto se agregó a cada gráfico para fines de comparación y el número dentro de las barras representa la fracción de hembras ovulantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este artículo describe un método para inactivar transitoriamente, en un momento dado, una región discreta en el cerebro de ratas despiertas y sin restricciones. También se proporciona un método simple para rastrear su ciclo estral y evaluar la ovulación. Este protocolo permite un análisis directo de la contribución de regiones cerebrales específicas a los mecanismos que impulsan la ovulación al comparar el resultado ovulatorio de los animales tratados con TTX con el de los tratados con vehículos. Con la excepción del instrumento estereotáxico y la bomba de microinyección, que son comunes en los laboratorios de neurociencia, este método no requiere materiales costosos. Las cánulas comerciales y los microinyectores son la opción habitual para este tipo de experimento, pero el sistema fácil de construir descrito aquí reduce los costos y los resultados son indistinguibles. Al utilizar este protocolo y los materiales enumerados en la tabla que acompañan a este artículo, se pueden fabricar diez veces más cánulas gastando la misma cantidad de dinero que costaría un kit comercial para diez animales. La construcción de diez cánulas bilaterales, sin importar la personalización requerida para el estudio, se puede realizar en pocas horas. Además, todos los componentes son reutilizables, lo que aumenta la rentabilidad.
Junto con la relación costo-beneficio, este protocolo es adecuado para cualquier entorno de laboratorio, ya que puede ser realizado por cualquier personal, incluidos los estudiantes, con conocimientos de manipulación de roedores, cirugía estereotáxica y manejo de toxinas biológicas y desechos relacionados. Además, se puede adaptar para ser utilizado en cualquier especie de roedor y otros pequeños mamíferos, incluidos conejos, hurones, titíes e incluso en especies no mamíferas como aves y reptiles. Además de las características señaladas anteriormente, la principal ventaja de este protocolo es que se puede adaptar fácilmente para el estudio de otros procesos bajo la regulación del cerebro como la actividad de los órganos periféricos, la respuesta homeostática a los desafíos ambientales y diversos comportamientos.
Hay varios pasos críticos que deben realizarse antes de comenzar el experimento para lograr los resultados deseados. En primer lugar, las coordenadas de la estructura objetivo deben calcularse empíricamente, ya que las reportadas en los atlas cerebrales no necesariamente coincidirán con los animales designados para el estudio como resultado de su cepa, sexo o edad. Varios estudios han demostrado que los electrodos implantados y las sondas de infusión alteran la función de la zona lesionada no solo por la destrucción de cuerpos y fibras neuronales, sino también por la activación de las células gliales. La reacción inflamatoria que se inicia inmediatamente después de la implantación generalmente causa la encapsulación del cuerpo extraño por las células gliales. Estas células forman una hela apretada que impide el flujo de neurotransmisores y desplaza a las neuronas, iniciando un proceso de neurodegeneración31. Los efectos nocivos del procedimiento de implantación no se pueden evitar y se debe tener cuidado para garantizar que dichos efectos se produzcan lo más lejos posible de la región cerebral de interés. Las coordenadas deben calcularse para colocar las cánulas guía en el área objetivo solo si es lo suficientemente grande como para garantizar que no más del 10% del área se dañe por la cánula. Este enfoque es útil, por ejemplo, si se estudiarán grandes áreas de la corteza. Incluso en este caso, se debe realizar un análisis detallado del grupo de control para tener en cuenta los efectos del implante en el proceso de interés. Para estructuras pequeñas como núcleos hipotalámicos discretos, aconsejamos a los investigadores que calculen las coordenadas para colocar las cánulas guía a una distancia que oscila entre 0,5 y 2 mm desde el borde superior de la estructura objetivo en la región media en los planos anterior-posterior y medial-lateral de acuerdo con el atlas cerebral(Figura 2B). Para este enfoque, los inyectores deben estar diseñados para sobresalir lo suficiente como para alcanzar el borde del objetivo. Hemos probado esto para los dos núcleos descritos en este protocolo y encontramos que estas ratas recuperaron su ciclo estral y la capacidad de ovular más rápido que los animales con cánulas implantadas dentro de los objetivos.
Se debe considerar la solubilidad de los agentes farmacológicos a inyectar para que la solución del vehículo sea lo más similar posible a la del líquido cefalorraquídeo. TTX se puede comprar como un polvo liofilizado, ya sea solo o con citrato. El primero tiene baja solubilidad en agua y se recomienda un tampón ácido con un pH alrededor de 5.0 para reconstituirlo, pero esto puede introducir la posibilidad de dañar el tejido como resultado de las inyecciones del vehículo solo. Por otro lado, el citrato TTX se puede disolver en agua o solución salina al 0,9%, que se utilizan comúnmente como vehículos. Recomendamos no usar ambos vehículos, y sugerimos usar líquido cefalorraquídeo artificial o solución de lactato de Ringer en su lugar. Un estudio previo mostró que la solución salina microinyectada en el núcleo supraquiasmático tiene efectos nocivos sobre la ovulación cuando se realiza en celo o diestro26. Varios artículos han reportado que la perfusión de tejido nervioso con soluciones que no coinciden con las características físicas y químicas del líquido cefalorraquídeo altera la anatomía y fisiología de las neuronas y promueve las respuestas inflamatorias y la muerte celular32,33,34,35. Teniendo en cuenta estos resultados, se recomienda encarecidamente el uso de líquido cefalorraquídeo artificial como vehículo en todos los experimentos que involucran microinyección de medicamentos en el cerebro.
Antes de comenzar los experimentos, los investigadores deben determinar empíricamente el volumen óptimo de solución a inyectar, ya que tanto la fuga en las estructuras adyacentes como la cobertura insuficiente podrían confundir la interpretación de los resultados. Esto se puede lograr mediante la microinyección de un tinte soluble en agua en cubos de agar transparente o gelatina. La dispersión del tinte se puede estimar y comparar con el tamaño esperado del objetivo como se informa en el atlas cerebral. Aún así, las propiedades de la región cerebral de interés, como su densidad celular y la presencia de tractos de fibra o bordes ventriculares, afectarán la dinámica de difusión, y los resultados pueden diferir de los que se encuentran en el agar y la gelatina. En consecuencia, el investigador debe probar los parámetros obtenidos in vitro en el área objetivo de unos pocos animales. Varios colorantes se han utilizado con éxito para microinyecciones intracerebrales en ratas con el fin de delinear la difusión de un volumen dado de solución. Los ejemplos más comunes son el violeta cresil, el azul de tionina, el azul de metileno, el azul de Evan, el verde rápido y la tinta de la India. Estos colorantes se disuelven en agua destilada a una concentración del 0,5% o inferior. El azul de Evan tiene la ventaja de ser detectable en un microscopio de fluorescencia (excitación a 620 nm y emisión a 680 nm), lo que permite un análisis más cuantitativo de la propagación. Las microperlas de látex también pueden ser adecuadas para este enfoque. Es importante mencionar que los volúmenes superiores a 2.0 μL no deben administrarse en el cerebro con esta técnica ya que se producirá daño mecánico y desplazamiento de tejidos36.
El caudal de la solución también es un factor importante a controlar, ya que la microinyección de altos volúmenes a alta velocidad provoca desplazamiento tisular y lesiones mecánicas40. Además, una alta tasa de infusión también aumenta la propagación del medicamento, lo que resulta en la inactivación de las estructuras vecinas. Tanto como un aumento de tres veces en el área cubierta por una solución puede ser causado por el cambio de la velocidad de perfusión de 100 nL / 5 minutos a 100 nL / 1 minuto36. Las observaciones histológicas de cerebros de ratas inyectados con azul de metileno indican que una velocidad de infusión de 50 nL / minuto no desplaza el tejido mientras confina el medicamento en el área objetivo (observaciones personales). Esto solo se probó con volúmenes iguales o inferiores a 200 nL y, por lo tanto, los investigadores deben realizar experimentos piloto si se utilizarán volúmenes más grandes.
Una vez que se ha determinado el volumen de trabajo, también se recomienda evaluar la propagación en cada animal. Esto se puede hacer ya sea co-inyectando un tinte con los medicamentos o inyectándolo unos minutos antes de la eutanasia, como se describe en este protocolo. El modelo anterior permite que el tinte se propague junto con la toxina, proporcionando así una evaluación más precisa del área afectada. Una desventaja de este método es que el tinte puede interferir con la actividad del medicamento y también puede ser citotóxico. Finalmente, el aclaramiento del tejido nervioso puede ocurrir si el animal necesita sobrevivir durante varios días después del procedimiento de inyección, lo que afectaría la estimación de la propagación. Si se va a utilizar este enfoque, los efectos del colorante en el proceso en estudio deben abordarse comparando el resultado del grupo vehículo+colorante con el de los animales intactos. Si la inyección del colorante se produce antes de la eutanasia, se recomienda hacerlo siguiendo los mismos parámetros que durante la microinyección (velocidad de perfusión y volumen). Esto debe realizarse al menos 10 minutos antes de la eutanasia para permitir la propagación de la solución. Con este método, se encontró que 200 nL de una solución de TTX/azul de metileno cubre una esfera de 0,6 mm de diámetro y la dispersión no cambia significativamente si la microinyección ocurre 1 hora antes del sacrificio (observación personal). Esto concueerda con el estudio de Freund y sus colegas37,así como con el de Zhuravin y Bures38,que encontraron que 1 μL de solución de TTX se extiende en un volumen de forma esférica con un diámetro de aproximadamente 3 mm. En general, se ha demostrado que la dispersión del fármaco depende de su peso molecular y del volumen inyectado,39 y los resultados indicados anteriormente coinciden con la difusión de colorantes con un peso molecular similar al del TTX. Si se necesita un control más preciso de la dispersión, se puede realizar la inyección de TTX radiomarcado o la implementación de inmunohistoquímica contra TTX regular con anticuerpos disponibles comercialmente37. Además de una mejor delimitación del área cubierta por el fármaco, estos dos enfoques están limitados por la eliminación del TTX del tejido, que debe considerarse si el animal debe sobrevivir varios días después de la microinyección, por otro lado, trabajar y eliminar el material radiactivo introducirá nuevos pasos y problemas de seguridad que no podrían ser compatibles con todos los laboratorios y protocolos.
Se recomienda la inclusión de un grupo control que consista en animales inyectados en un área del cerebro que no tiene un papel en la regulación del proceso estudiado. Este grupo ayudará al investigador a determinar la especificidad del área objetivo en la regulación de ese proceso y descartará la posibilidad de que los fármacos, inyectados en cualquier estructura, puedan desencadenar una señal de bloqueo basada en un mecanismo más extendido como es la activación del estrés o eje inmune. Dado que incluso los cirujanos estereotáxicos más experimentados no pueden obtener una tasa de éxito del 100% cuando se dirigen a estructuras pequeñas, estos experimentos generalmente se acompañan de cánulas colocadas fuera de la estructura deseada y, por lo tanto, este grupo de control se logra involuntariamente. Los resultados de los animales en los que se extravió la cánula son valiosos y no deben descartarse; en su lugar, se debe realizar un análisis exhaustivo teniendo en cuenta el área inyectada y la dispersión de la droga. De especial interés son los resultados que muestran un efecto diferente (o ninguno) en animales inyectados en regiones cercanas a los objetivos.
Este protocolo tiene limitaciones inherentes a la colocación crónica de cánulas. No es posible evitar la destrucción permanente de fibras de paso y cuerpos neuronales en la trayectoria de la cánula. El uso de capilares de vidrio con un diámetro de punta de unos pocos micrómetros es el método de elección para administrar medicamentos en el cerebro con un daño mínimo al tejido41. Esta metodología, sin embargo, se ha utilizado principalmente en experimentos en los que el animal es anestesiado y / o la cabeza está unida al aparato estereotáxico u otros dispositivos de soporte. Esto se debe principalmente a la fragilidad del capilar en sí, lo que dificulta su fijación a un animal despierto y desenfrenado. Un sistema que utiliza capilares de vidrio conectados a bombas osmóticas, en lugar de cánulas guía, ha mostrado una mejora considerable en la cantidad de tejido cerebral dañado y en la respuesta glial a lalesión 42. En este sistema, sin embargo, la infusión de los medicamentos es crónica en lugar de cronometrada y, por lo tanto, no es útil en experimentos en los que el tiempo de inyección debe controlarse con precisión. Un sistema de microinyección basado en un capilar de vidrio insertado en el área objetivo a través de una cánula guía previamente implantada fue descrito por Akinori y sus colegas43. Este sistema permite la inyección de un animal despierto en el momento deseado, pero no es muy robusto y el animal debe estar restringido durante el procedimiento, lo que puede conducir a la activación de la respuesta al estrés. En este protocolo, los efectos del daño al tejido nervioso en la trayectoria de la cánula guía se pueden controlar comparando los grupos intacto y vehicular. Aquí se mostró un resultado ovulatorio similar para ambos grupos, y se concluyó que el tejido afectado, así como la inyección del vehículo no interfirieron con la ovulación. Los investigadores deben realizar estudios piloto para determinar si las estructuras dorsales ubicadas en su área objetivo, que serían destruidas por la cánula, están involucradas en la regulación del proceso estudiado. Aún así, una dirección futura prometedora para este trabajo es diseñar un sistema de entrega que capitalice las fortalezas tanto de las cánulas guía como de los capilares de vidrio.
Otra consideración importante para los investigadores es el tiempo de acción de TTX. Zhuravin y Bures38 han demostrado que TTX tarda unos minutos en alcanzar un bloqueo máximo de la transmisión neuronal, que dura alrededor de una hora y media, disminuyendo gradualmente durante varias horas. Esto hace que TTX sea el fármaco de elección cuando se requiere una inactivación duradera. Si el experimento requiere una inactivación más rápida, se pueden usar anestésicos locales como la lidocaína, ya que solo se necesitan unos segundos para alcanzar un bloqueo máximo. Los efectos de este medicamento duran menos de 20 minutos, proporcionando una resolución temporal más fina que TTX. Las características expuestas anteriormente hacen de TTX una buena herramienta para experimentos exploratorios que estudian la presencia de señales neuronales que se generan en ventanas temporales menos definidas. La lidocaína, por otro lado, es útil para delinear esta ventana44. Una desventaja de ambos fármacos es que bloquean la transmisión de potenciales de acción en fibras de paso, introduciendo artefactos en la interpretación de los datos ya que la señal podría provenir potencialmente de una estructura diferente que envía proyecciones axonales a la zona inyectada. En este caso, el análisis cuidadoso de las inyecciones que se determina que están fuera del área objetivo es muy importante. Por ejemplo, en este artículo se demostró que la infusión de TTX en el área justo anterior al núcleo supraquiasmático y en la región entre él y el núcleo arqueado no bloqueó la ovulación. Tales resultados revelaron que las fibras y las células en esas regiones no están involucradas en la regulación de la ovulación, lo que fue inesperado debido a la presencia de una red recíproca de fibras que unen el núcleo supraquiasmático tanto con el núcleo arqueado como con las regiones anteriores que contienen las neuronas GnRH.
Una alternativa que no bloquea la transmisión a lo largo de las fibras de paso en el área inyectada es el uso de cationes divalentes como el cobalto y el magnesio, que inhiben la liberación de neurotransmisores por terminales presinápticos. El problema con este enfoque, sin embargo, es el tiempo muy corto de acción inactivadora y la alta toxicidad44. Otras opciones para evitar el bloqueo de fibras son los enfoques optogenético y quimiogenético, ambos estrategias para la manipulación de la actividad de poblaciones neuronales específicas. La selectividad se obtiene mediante la transfección de neuronas con vectores virales diseñados para insertar secuencias que codifican para opsinas unidas a canales iónicos o receptores modificados expresados bajo promotores específicos. La microinyección del vector se realiza en animales anestesiados utilizando capilares de vidrio, causando poca interrupción del tejido circundante. La implantación de fibras ópticas o la inyección sistémica de drogas sintéticas permite una manipulación muy precisa de la población objetivo45. Estas técnicas demostraron ser útiles en un estudio, ya sea solo o en conjunto con técnicas como la microinyección TTX presentada en este protocolo46. Aún así, se deben considerar varios aspectos de estos métodos para diseñar experimentos exitosos, incluida la validación de la especificidad de la expresión, el control del número de células transfectadas, la evaluación de la toxicidad y la evaluación de los efectos secundarios de la luz y la estimulación química.
Los componentes críticos de este protocolo incluyeron la determinación adecuada de la etapa del ciclo estral para cada animal. Para realizar este procedimiento con éxito, la obtención de muestras de calidad del epitelio vaginal y la correcta interpretación de los resultados son fundamentales (aconsejamos seguir la Figura 1). Además, los investigadores deben llenar cuidadosamente el sistema de inyección para evitar la incorporación de burbujas de aire que podrían resultar en la inyección de volúmenes inexactos de medicamentos. También es importante monitorear a los animales durante la microinyección para evitar que muerda el tubo o interfiera con el sistema. Finalmente, los investigadores ciegos a las condiciones experimentales deben analizar el resultado de la ovulación, la posición final de la cánula y la dispersión de la solución en el área objetivo para garantizar que la interpretación de los resultados sea imparcial.
Aquí se describió un método confiable, rentable y directo para analizar la contribución de áreas discretas del cerebro en la regulación de la ovulación. Este procedimiento se realiza en ratas despiertas y desenfrenadas, superando los efectos nocivos del bloqueo de la neurotransmisión y también los efectos inhibitorios que las hormonas del estrés como el cortisol y la corticosterona ejercen sobre la secreción de GnRH. Este método es totalmente personalizable y se puede utilizar para administrar cualquier medicamento en cualquier estructura del cerebro. Además, se puede adaptar fácilmente para especies comunes de roedores y no roedores utilizadas en el laboratorio. Finalmente, este protocolo se puede utilizar junto con métodos para la cuantificación de sustancias como hormonas y metabolitos en la sangre, la evaluación de la expresión génica en células y tejidos, el registro de la actividad neuronal y también el rendimiento de animales despiertos en pruebas de comportamiento para determinar el papel de áreas cerebrales específicas en diversos procesos conductuales y fisiológicos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar en relación con este artículo.
Acknowledgments
Agradecemos a Raymond Sánchez de la Universidad de Washington por su valiosa ayuda en la edición de manuscritos y a M.Sc. Georgina Cortés y M.Sc. Cintia Javier por su apoyo técnico en la estandarización de esta técnica. También agradecemos a los miembros de los servicios veterinarios de la Facultad de Estudios Superiores Zaragoza: MVZ. Adriana Altamirano, MVZ. Román Hernández y MVZ. Dolores-Elizabeth Guzmán por el excelente mantenimiento y cuidado de animales de experimentación. Los experimentos descritos en este protocolo fueron apoyados por el número de subvención DGAPA-PAPIIT: IN216015 y por el número de subvención CONACyT: 236908 a Roberto Domínguez. Carlos-Camilo Silva es estudiante de doctorado del Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) y cuenta con el apoyo del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (número de beca: 294555).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL Hamilton syringes | Hamilton | 80314 | |
| 21 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305165 | |
| 23 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle | BD | 305106 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | BASi | MD-2400 | |
| Bone trimer | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Burr for micro drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Clipper | Wahl | ||
| Cut-off disc | Dremel | SM5010 | |
| Cutting tweezers | Truper | 17367 | |
| Cyanocrylate glue | Kola loka | K-1 | |
| Dental cement | Nic Tone | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosin | Sigma | E4009 | |
| Estereoscope | Zeiss | ||
| Extra fine Bonn scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Face mask | Lanceta HG | 60036 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Hematoxilin | Sigma | H3136 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 320331 | |
| Hypromelose artificial tears | Sophia Labs | 8950015 | |
| Isoflurane | Pisa Agropecuaria | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Microinjection pump | KD Scientific | 788380 | |
| Monomer | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Nitrile gloves | Lanceta HG | 69028 | |
| Non-Rupture Ear Bars | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poly-L lysine | Sigma | P4707 | |
| Povidone-iodine | Dermo Dine | ||
| Povidone-iodine with soap | Germisin espuma | ||
| Pressure tweezers | Truper | 17371 | |
| Rat anesthesia mask | David Kopf Instruments | Model 906 | |
| Saline solution | PISA | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sodium pentobarbital | Pisa Agropecuaria | ||
| Standard electrode holder | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Stainless steel wire | American Orthodontic | 856-612 | |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments | Model 900LS | |
| Surgical Sissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Teflon connectors | Basi | MD-1510 | |
| Teflon tubing | Basi | MF-5164 | |
| Tetrodotoxin | Alomone labs | T-500 | |
| Vaporizer | Kent scientific | VetFlo |
References
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