Summary
Denne protokol beskriver opførelsen af et billigt mikroinjektionssystem, dets stereotaxiske implantation i dybhjernestrukturer og proceduren for tidsurige mikroinjektioner af tetrodotoksin hos vågne og hæmningsløse rotter. Målet er at afsløre deltagelsen af hypothalamus strukturer i reguleringen af ægløsning ved at hæmme deres neurale aktivitet.
Abstract
Mange eksperimentelle tilgange er blevet brugt til at studere hjernens rolle i reguleringen af ægløsning. Eksempler omfatter læsion og deafferentation af neuronale grupper, som begge er invasive metoder, der permanent forringe integriteten af målområdet. Disse metoder ledsages af følgevirkninger, der kan påvirke analysen af akutte og tidsmæssige reguleringsmekanismer. Den stereotaxiske implantation af guide kanyler rettet mod specifikke hjerneområder, efterfulgt af en restitutionsperiode, gør det muligt for forskere at mikroinject forskellige lægemidler efter forsvinden af uønskede virkninger af operationen. Tetrodotoxin er blevet brugt til at bestemme rollerne i flere hjerneområder i forskellige fysiologiske processer, fordi det forbigående hæmmer natriumafhængige handlingspotentialer og dermed blokerer al neural aktivitet i målregionen. Denne protokol kombinerer denne metode med strategier for vurdering af den estrøse cyklus og ægløsning for at afsløre den rolle, diskrete hjerneområder i reguleringen af ægløsning på bestemte tidspunkter af et givet stadium af den estrøse cyklus. Vågne og hæmningsløse rotter (Rattus norvegicus) blev brugt til at undgå de blokerende virkninger, som bedøvelses- og stresshormoner udøver på ægløsning. Denne protokol kan let tilpasses andre arter, hjernemål og farmakologiske midler for at studere forskellige fysiologiske processer. Fremtidige forbedringer af denne metode omfatter design af et mikroinjektionssystem ved hjælp af glaskapillærer med lille diameter i stedet for guide kanyler. Dette vil reducere mængden af væv beskadiget under implantationen og mindske spredningen af de infunderede lægemidler uden for målområdet.
Introduction
Ægløsning er den proces, hvorved en eller flere modne oocytter frigives fra æggestokkene, når hver estral / menstruationscyklus. Da alle pattedyrarter er afhængige af produktionen af gameter til at opdrætte, har forståelsen af de mekanismer, der regulerer ægløsning, en enorm indvirkning i områder lige fra biomedicin, husdyrindustrien og vedligeholdelse af truede arter. Ægløsning er reguleret af hypothalamus-hypofyse-æggestokkene akse, som involverer flere hypothalamus og ekstra-hypothalamus områder, gonadotropes i den forreste hypofyse og theca og granulosa celler, der sammen med oocytter, danner æggestokkene follikler inde i æggestokkene1.
Ovarie follikler vokse, udvikle og i sidste ende ægløsning som reaktion på tonic og phasic sekretion af follikel-stimulerende hormon og luteiniserende hormon, de to gonadotropins udskilles af gonadotropes. Mønsteret af gonadotropin sekretion er afgørende for korrekt follikulær udvikling og ægløsning, og det er reguleret af gonadotropin-frigive hormon (GnRH)1,2. Denne neuropeptid syntetiseres af neuroner spredt over hele basal diencephalon og udskilles derefter til portalen vaskulatur, der forbinder hypothalamus og den forreste hypofyse. GnRH-neuronernes sekretoriske aktivitet moduleres igen af synaptisk input, der opstår fra forskellige hjernestrukturer. Disse strukturer formidler oplysninger om tilstanden af organismens ydre og indre miljø, herunder tilgængeligheden af mad, længden af fotoperioden og koncentrationen af hormoner i blodet. I denne forstand former de hver arts reproduktive mønster, og de specifikke roller af sådanne strukturer skal bestemmes for korrekt at forstå de mekanismer, der styrer ægløsning. Som et eksempel har det vist sig, at udsvingene i estradiol niveauer i løbet af estrous cyklus regulerer udskillelsen af GnRH; GnRH-neuroner udtrykker dog ikke den estradiol receptorisoform, der er nødvendig for at opdage sådanne ændringer. To populationer af neuroner, der udtrykker disse receptorer, er placeret i rostralperiventrikulære region i den tredje ventrikel og i arcuatekernen og stablish synapser med GnRH-neuroner. Der er tegn på, at disse neuroner fortolker koncentrationen af estradiol og derefter stimulere aktiviteten af GnRH-neuroner ved at frigive kisspeptin, en potent induktor af GnRH sekretion3.
Eksperimenter med termiske eller kemiske læsioner samt mekanisk deafferentation tillod forskere at bestemme inddragelsen af flere hjernestrukturer i reguleringen af ægløsning4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Disse eksperimenter har imidlertid den ulempe at være invasive og traumatiske, der kræver flere dages genopretning, før de evaluerer virkningerne af behandlingen, hvilket hæmmer analysen af de akutte virkninger af behandlingen. Derudover påvirker de permanent de målrettede områder og forstyrrer andre fysiologiske processer på lang sigt. På grund af disse problemer er resultaterne af disse eksperimenter normalt tilsløret af de homøostatiske kompenserende mekanismer i dyrets krop, og det er ret vanskeligt at udtrække nøjagtige oplysninger om den tidsmæssige lovgivningsmæssige dynamik, som området er involveret i.
Mikroinjektionen af lægemidler, der forbigående forstyrrer neuronernes aktivitet gennem guide kanyler, er et passende alternativ, der overgår de ulemper, der er nævnt ovenfor. Kanylerne kan placeres i enhver hjerneregion ved en stereotaxisk kirurgi, så forskeren kan starte lægemiddelbehandlingen efter de forvirrende virkninger af operationen forsvinder. Den tidsmæssige mikroinjektion af lægemidlerne gør det muligt for forskere at teste hypoteser om regionens bidrag til et bestemt trin i processen og kan udføres hos vågen beherskede eller frit bevægende dyr. En række lægemidler, herunder lokalbedøvelse, agonister, antagonister, inverse agonister og biologiske toksiner såsom tetrodotoxin (TTX) kan mikroin injiceres i regionen af interesse på bestemte tidspunkter.
TTX er et biologisk toksin syntetiseret af bakterier, der lever i lunderfiskens krop samt andre hvirveldyr og hvirvelløse dyr. TTX gør neural aktivitet lydløs gennem selektiv og forbigående blokade af natriumkanaler, hvilket resulterer i hæmning af natriumafhængige handlingspotentialer. I nærværelse af TTX oplever cellerne en ændring i depolariseringsfasen og er derfor ikke spændende, men forbliver i live. Den blokerende virkning af TTX forklares ved dens molekylære sammensætning: en guanidiniumgruppe er i stand til at passere gennem natriumkanalens ekstracellulære aspekt, men resten af molekylet kan ikke passere på grund af dets størrelse, så det sidder fast og blokerer kanalen13,14,15,16,17 . TTX's virkningsmekanisme gjorde det muligt at bruge den som et værktøj til at studere nervesystemet både in vitro og in vivo. Intracerebral injektion af dette toksin er blevet brugt til at studere den rolle diskrete hjerneområder i flere processer som hukommelse opbevaring18,søvn og ophidselse19, sted anerkendelse20,rumlig navigation21,stofmisbrug22, termoregulering23, udvikling af skizofreni24,seksuel adfærd25 og regulering af ægløsning26 blandt andet. I denne protokol beskriver vi virkningerne på ægløsning af den forbigående inaktivering af hypothalamus kerner ved TTX mikroinjektion hos vågen og uhæmmet rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurer, der involverer dyr, blev godkendt af Den Etiske Komité for Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, UNAM. Denne institution opererer i nøje overensstemmelse med de mexicanske regler for håndtering af dyr, Official Norm: NOM-062-ZOO-1999, som er i overensstemmelse med internationale retningslinjer.
1. Opførelse af bilaterale kanyler
- Uddrag rustfrit stål akslen fra navet af to 23 G hypodermiske nåle ved hjælp af tryk pincet og derefter fjerne eventuelle resterende lim ved hjælp af en skalpel klinge.
- Tegn en linje 15 mm fra den stumpe ende af akslerne med en fin permanent markør. Brug skære pincet til at fjerne de skrå ender.
- Hold 15 mm segmenter med fine hæmostats og tryk dem vinkelret med en cut-off disk fastgjort til et rotatory værktøj, indtil 14 mm segmenter af slanger er opnået. Dette trin er gjort for at fjerne den okkluderede del af akslerne, hvilket skaber åbne og stumpe ender. Endelig skal du indsætte en 30 G nål gennem segmenterne for at fjerne enhver intern obstruktion.
- Bestem afstanden mellem strukturerne af interesse i venstre og højre halvkugle i hjernen ved hjælp af en hjerne atlas27. Brug moldering ler til at fastgøre de to 14 mm segmenter til et mikroskop dias og sikre, at begge er på samme vandrette niveau. Overhold gennem et okulært mikrometer (10x) og juster segmenterne med fine pincet, indtil den ønskede afstand er opnået.
- Bland loddepasta med 10% saltsyre i en 2:1 proportion og tilsæt et fald i blandingen 2 mm under den stumpe ende af segmenterne. Lodde begge segmenter med et enkelt punkt ved hjælp af et loddejern og loddetråd med en diameter på 0,5 mm. Sørg for, at lodden ikke hindrer lumen af segmenterne.
- Opret en støtte til fastgørelse af kanylen til stereotaxisk holder ved at skære et 10 mm segment af elastisk 0,3 mm rustfri ståltråd. Brug moldering ler til at placere 2 mm af ledningen i kontakt med det tidligere loddepunkt og resten, der ligger over kanylernes stumpe ende. Lodde ledningen til kanylerne.
- Rengør overfladen af kanylerne med 70% ethanol for at fjerne overskuddet af loddepastaen. Skyl det indre af kanylerne med sterilt vand for at fjerne metalpartikler. Gentag denne proces, indtil der ikke kan detekteres partikler under mikroskopet ved en 10x forstørrelse.
2. Konstruktion af obturatorer og hætter
- For at opbygge obturatorerne skæres to 16 mm segmenter af rund blød tråd i rustfrit stål (0,35 mm diameter). Hold en bilateral kanyle med hæmostats, vinkelret på en laboratoriebænk, og indsæt et af disse segmenter i hver kanyle, indtil de når bænken. Bøj resten i en 90° vinkel.
- For hætterne skæres to 2 mm segmenter af silikonerør (indre diameter = 0,76 mm) og anvende en dråbe silicium lim i en af enderne af hvert segment. Lad ikke limen komme ind i slangen. Lad tørre i mindst 24 timer.
3. Opførelse af mikroinjektorer
- Gentag trin 1.1, ved hjælp af 30 G hypodermiske nåle i stedet for at skabe akslerne.
- Træk en linje 18,5 mm bortset fra den stumpe ende af akslerne og fjern resten af de skrå ender med skære pincet.
- Gentag trin 1.1 med en enkelt 23 G nål til at bygge adaptere ved at skære to 6 mm lange segmenter startende fra den stumpe ende.
- Fjern de okkluderede dele af 6 mm-segmenterne ved at trykke dem vinkelret mod afskæringsskiven, indtil der opnås to 4 mm adaptere. Eliminer enhver intern obstruktion.
- Sæt den skrå ende af 30 G-segmenterne i adapterne. Kig gennem et stereomikroskop for at sikre, at enden af både segmenter og adaptere er på samme niveau. Påfør cyanoacrylatlim på distalleddet ved hjælp af en vatpind og lad tørre i 15 minutter.
- Soak to Teflon slange stik i 70% ethanol i 5 minutter og derefter fastgør dem til mikroinjektorer gennem adaptere. Vent, indtil diameteren af stikkene krymper i mindst 24 timer og steriliserer derefter mikroinjektoren med en lavtemperaturmetode for at undgå beskadigelse af stikkene (ethylenoxidsterilisering anbefales).
4. Dyrevedligeholdelse og vaginal udstrygninger
- Brug cykliske voksne kvindelige hætteklædte rotter (Rattus norvegicus, CIIZ-V stamme) vejer mellem 230 og 260 gram. Hus rotterne i grupper på fire i standard polypropylenbure i et rum med en 14:10 lys-mørk fotoperiode. Indstil temperaturen og fugtigheden til henholdsvis 22 ± 2 °C og til henholdsvis 40 %. Giv mad og vand ad libitum.
- Tag vaginal udstrygninger hver dag mellem 10:00 og 12:00 h.
- Steriliser en modificeret bakteriologisk sløjfe med en indvendig diameter på 1 mm ved hjælp af en alkohollampe og afkøles med sterilt vand. Hold rotten med et sikkert greb og indfør 5 mm af den bakteriologiske sløjfe i skeden og rør ved dens indre vægge. Fjern den bakteriologiske sløjfe. Hvis det lykkes, vil et overskyet fald blive set på spidsen. Placer denne dråbe på et mikroskop dias.
- Gentag denne proces for hver rotte sterilisering og afkøling af løkken mellem hvert dyr.
- Når dråberne tørrer af, pletter med hæmatoxylin-eosin og observere prøverne under et mikroskop ved 10x.
- Bestem andelen af leukocytter, epitelnukleated celler og keratiniserede celler på hver smear og klassificere det i henhold til kriterierne for estrous cyklus faser rapporteret i figur 1, som er i overensstemmelse med tidligere litteratur28,29.
5. Stereotaxisk implantation af kanylerne
BEMÆRK: Udfør implantationen af kanylerne efter en regelmæssig aseptisk stereotaxisk kirurgi og overholdelse af institutionelle normer.
- Før operationen
- Sterilisere kirurgiske instrumenter, kanyler, kirurgiske skruer, obturatorer, gaze og træ vatpinde 24 timer før operationen ved hjælp af en damp autoklave. Steriliser spidsen af metalliske instrumenter mellem på hinanden følgende operationer ved at rense dem med 10% hydrogenperoxid efterfulgt af vand og derefter placere dem i en varm perle sterilisator.
- Forbered arbejdsområderne og stereotaxicinstrumentet, før dyret fjernes fra hjemmerummet. Forbered dyret til operation i et område, der er placeret så vidt muligt fra operationsbordet for at undgå forurening under proceduren.
- Rengør præparat og kirurgi områder med 70% ethanol efterfulgt af en anvendelse af en 10% chloridopløsning i ti minutter. Rengør bunden, rammen og manipulatorerne på det stereotaxiske instrument med 70% ethanol og steriliser ørestængernes spidser ved hjælp af en varm perlesterilser og luftkøl dem før operationen.
- Udfør operationen iført en dedikeret kittel, ansigtsmaske, hovedhjelm, kirurgiske ærmer, skodæksler og kirurgiske handsker. Bed assistenten om at forberede dyrene til operation og kontrollere deres generelle tilstand under proceduren.
- Fastgør kanylen til stereotaxisk holder. Bed assistenten om at bringe det første dyr, der skal betjenes ind i rummet. Vælg rotter i diestrus til operation, da observationer fra vores laboratorium indikerer, at disse dyr genvinder ordentlige estrøse cyklusser hurtigere end rotter, der drives i andre faser, sandsynligvis fordi reaktionen på stress ændres sammen med den estrøse cyklus.
- Afveje dyret, og fremkalde anæstesi med 4% isoflurane i 100% ilt inde i en induktion kammer for rotter forbundet med en isoflurane fordamper. For at undgå at stresse dyrene, må du ikke prefill kammeret. Bekræft et kirurgisk anæstesiplan ved at kontrollere pupiludvidelse og tab af smerte målt ved hale- og øreknibningsprøver, når du har observeret tabet af retterefleksen.
- Anæstesi rotten ved en intraperitoneal injektion af en blanding af ketamin (100 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg), hvis der ikke er en isoflurane vaporizer til rådighed.
- Fjern rotten fra induktionskammeret og brug en næsekegle i forberedelsestabellen for at opretholde virkningerne af anæstesi med 2,5% isoflurane i 100% ilt. Trim håret i hovedbunden med klippere og fjern løst hår med en fnugrulle. Indsprøjt en præoperativ subkutan dosis på henholdsvis 2 mg/kg Meloxicam og 5 mg/kg Enrofloxacin som en ikke-steroid antiinflammatorisk/smertestillende og antibiotisk.
- Påfør hypromellose kunstige tårer på hvert øje for at undgå udtørring under operationen.
- Monter dyret i stereotaxic instrumentet over en opvarmning pad ved hjælp af ikke-brud øre barer og en anæstesi maske. Juster næseklemmen for at sikre, at dyrets hoved er fladt. Udfør en kirurgisk krat i det barberede område skiftevis mellem povidone-jod med sæbe og 70% ethanol én gang og derefter ved hjælp af povidone-jod og 70% ethanol to gange. Indsæt et rektaltermometer for at registrere dyrets temperatur under proceduren og derefter dække det med et sterilt kirurgisk felt.
- Under operationen
- Brug en skalpel til at lave et 2 cm snit i hud og muskler midt i det barberede område. Fjern periosteum fra kraniet ved hjælp af en vatpind belagt med 2% hydrogenperoxid til at afsløre bregma eller lambda, de vartegn, der vil blive brugt til at beregne målet koordinater. Tør kraniet med luft for en bedre visualisering af landemærket.
- Brug manipulatorerne af det stereotaxiske instrument til at flytte kanylen til en position direkte over det foretrukne vartegn. Registrer de forreste posterior og de mediale-laterale koordinater fra det stereotaxiske instrument og brug dem til at beregne målområdets koordinater i henhold til hjerneatlaset27.
- Indstil de beregnede koordinater i det stereotaxiske instrument og læg spidsen af kanylen på overfladen af kraniet. Registrer ryg-ventral koordinat og bruge den til at beregne dybden til målområdet.
- Fjern manipulatorens arm ved at skrue den af rammen. Brug en dental burr fastgjort til et rotatory værktøj med en hastighed på 15.000 rpm at gøre et mærke på det sted, hvor kraniotomi vil blive udført. Brug derefter burren til at lave tre huller, der danner en ligesidet trekant omkring mærket. Disse huller må ikke gennembore kraniet. Sæt de kirurgiske skruer ind i hullerne, så de er tæt placeret.
- Gør kraniotomi bred nok til at rumme afstanden mellem målområderne på hver halvkugle. Det skal være så lille i diameter som muligt, men stort nok til at tillade sænkning af kanylen uden at røre kraniets grænser, da dette vil ændre bane. Udfør kraniotomien gradvist og påføring af det lavest mulige tryk. Gnaverekraniet er kun et par millimeter tykt, og det er afgørende at bevare vævenes integritet nedenfor.
- Når dura mater er synlig, skal du bruge en steril 21 G nål med spidsen buet i en 90 ° vinkel for at fjerne splinter af knoglen og gøre en forreste-posterior skåret i meninges. Brug Wirtshafter og kolleger30 teknik til at undgå skader på den overlegne sagittal sinus, hvis målområdet er placeret tæt på midterlinjen.
- Placer holderen med kanylen i rammen og brug rygventilral manipulator til at nå ventral koordinaten. Kontroller, at nålen ikke rører ved kanterne, mens den falder ned, og øg kraniotomiens diameter, hvis det er nødvendigt.
BEMÆRK: Det er vigtigt, at spidsen af guide kanylerne er rettet mod en region fra 0,5 til 2,0 mm over regionen af interesse. Dette skyldes hjernens inflammatoriske reaktion som reaktion på indførelsen af fremmedlegemer og ødelæggelsen af vævet. Dette er især kritisk, hvis interesseområdet er lille, og arbejdsafstanden skal beregnes empirisk på forhånd.
- Placer holderen med kanylen i rammen og brug rygventilral manipulator til at nå ventral koordinaten. Kontroller, at nålen ikke rører ved kanterne, mens den falder ned, og øg kraniotomiens diameter, hvis det er nødvendigt.
- Påfør dental cement til at fastgøre kanylen til kraniet og lad det tørre. Sørg for, at tandcementet ikke dækker den stumpe ende af kanylen, da dette uigenkaldeligt vil hindre den. Vent, indtil cementen størkner helt.
- Sæt obturatorerne i for at undgå yderligere forhindringer og for at sikre patency under undersøgelsen. Tag silikonehætten på for at undgå forurening.
- Efter operationen
- Udskift tabte væsker med en intraperitoneal injektion på 1,0 mL steril saltvandsopløsning ved en fysiologisk temperatur. Placer dyret i et genopretningsbur med termisk støtte, indtil det kommer sig efter anæstesi. Kontroller dyrets temperatur og puls/åndedrætsfrekvens med jævne mellemrum. Isoflurane effekter vare i et par minutter efter afbrydelse af gas flux mens ketamin / xylazin effekter varer i 40-50 min.
- Giv postoperative injektioner af antibiotika, smertestillende og antiinflammatoriske lægemidler (i de samme doser og ruter, der er angivet før) i 48-72 timer og nøje inspicere dyrene dagligt for resten af eksperimentet. Anmeld ethvert tegn på smerte, stress eller vægttab til dyrlægetjenester eller til et uddannet medlem af laboratoriet. Udfør ikke nogen anden manipulation til rotterne i denne periode.
- Begynd at tage vaginal udstrygninger efter den postoperative behandling og fortsætte med at gøre det, indtil dyret viser tre på hinanden følgende estrøse cyklusser på fire dage.
BEMÆRK: Kronisk halspulsåre kan implanteres kirurgisk, så forskeren kan tage serielle blodprøver for at analysere udskillelsen af hormoner som estradiol, progesteron, testosteron, luteiniserende hormon, follikelstimulerende hormon og kortikosteron. Vi anbefaler at placere et sådant kateter, når dyret kommer sig efter hjerneoperationen, da dette vil forbedre overlevelsesraten og samtidig undgå tilstopning af kateteret, der kan skyldes en forlænget restitutionstid.
6. Tetrodotoxin håndtering og udarbejdelse af løsninger
FORSIGTIG: TTX er et af de mest giftige stoffer, der er kendt. Det virker på skeletmuskulatur og nervevæv. Forgiftning ved kontakt er usandsynligt, men ethvert åbent sår er en potentiel vej til podning i kroppen. De største bekymringer, når man arbejder med TTX, er punktering af huden med skarpe instrumenter, der har været i kontakt med toksinet og generering af aerosoler, der kan nå mund, øjne og slimhinder. Afhængigt af dosis kan TTX være dødelig, hvis den indåndes, sluges eller podes af huden. Det vil forårsage stærk irritation af øjnene. LD50 er blevet testet hos mus ved oral og intravenøs administration, og den er henholdsvis 334 μg/kg og 7,3 μg/kg. Der er ingen antitoksin til rådighed på nuværende tidspunkt.
BEMÆRK: Inaktiverende stof er en 1,0% NaOCl med eller uden 0,25 N NaOH, eller en 10% blegemiddelopløsning. Fuldstændig inaktivering sker efter 30 min eksponering. TTX kan ikke helt inaktiveres af kloridderivat i en koncentration under 10 %, ved autoklavering eller ved tørvarmesterilisering ved en temperatur på under 500 °F. Alle procedurer, der involverer TTX, skal udføres af to kyndige personer, der bærer indvendige og ydre par nitrilehandsker, dedikeret kittel, sikkerhedsbriller, engangsmundbind, lukkede sko og bukser i fuld længde.
- Udarbejdelse af lagerløsningen
- Anbring en pude, der er gennemblødt med det inaktiverende stof, i røghætten for at forhindre forurening i tilfælde af spild. Sørg for, at røghætten fungerer korrekt, før du starter. Forbered en beholder med den inaktiverende opløsning til at bortskaffe pipettespidser.
- Resuspend steril TTX citrat lyophilized pulver i henhold til producentens anvisninger ved en yderst omhyggelig og langsom titrering med steril kunstig cerebrospinalvæske, skylning ned væggene i hætteglasset i processen. Undgå dannelsen af skum og aerosol. Følg en aseptisk teknik for at undgå forurening af TTX-opløsningen, da den vil blive injiceret i levende dyrs hjerne. Brug en sprøjte med en nål i stedet for en mikropipette, hvis dine TTX-hætteglas har en ydre membran for at forhindre aerosoldannelse.
- Aliquot lageropløsningen i sterile mikrorør. Gør aliquots så små som muligt, da frysning / optøning cykler kan ændre stabiliteten af molekylerne. Fyld ikke mere end halvdelen af rørene, fordi vandet stiger i volumen, når det fryses, hvilket kan føre til åbning af låget og forurening af røret og andre prøver, der opbevares i beholderen.
- Dekontaminere ydersiden af rørene og overfladerne, hvor TTX blev brugt med det inaktiverende stof. Rørbeholderne opbevares ved -20 °C i en hætteglaskasse i en sekundær beholder.
- Udvanding af lageropløsningen til en arbejdskoncentration
- Forbered frisk fortyndede opløsninger den dag, de vil blive brugt, da fortyndede opløsninger er mindre stabile. Placer en pude, der er gennemblødt med det inaktiverende stof i røghætten og et mikrorørsstativ oven på den. Forbered en beholder med den inaktiverende opløsning til at bortskaffe pipettespidser.
- Pipette lageropløsningen i bunden af et sterilt mikrorør og tilsæt derefter den beregnede mængde kunstig cerebrospinalvæske for at opnå en koncentration på 10 ng/μL. Som beskrevet for re-suspension af TTX pulver, udføre en yderst omhyggelig og langsom titrering, skylning ned væggene i hætteglasset og undgå dannelsen af skum og aerosol.
- Hvis prøver, der har været på fryseren, anvendes til mikroinjektion, skal de have lov til at ekvilibrere ved stuetemperatur i mindst en time før forsøget.
7. Microinjektion af TTX eller køretøjsløsninger til frit bevægende rotter
- Konfigurer mikroinjektionspumpen med infusionshastigheden og den samlede injektionstid i henhold til eksperimentet. Beregn disse parametre på forhånd i betragtning af den mængde, der er optaget af målstrukturen, og mængden af opløsning, der skal injiceres. Til dette forsøg injiceres 200 nL opløsning med en hastighed på 50 nL i minuttet i en samlet infusionstid på 4 minutter.
- Fyld to 10 μL Hamilton sprøjter med sterilt destilleret vand, indsæt et stykke steril Teflon slanger i slangestikket på hver mikroinjektor, hvilket sikrer, at slangens længde ikke begrænser rottens bevægelse (slange kan steriliseres ved hjælp af ethylenoxid).
- Placer en pude, der er gennemblødt med det inaktiverende stof og en 2 cm x 2 cm kvadrat af paraffinfilm over den. Pipette en tilstrækkelig mængde TTX til at fylde injektorens kanyle og 1 cm af slangen over filmen. Absorber TTX-dråben ved forsigtigt at trække stemplet tilbage. Monter sprøjterne i mikroinjektionspumpen, og brug dens styringer til at manipulere stemplet, indtil en dråbe TTX kan ses på spidsen af hver mikroinjektor. Kassér dråberne i puden gennemblødt med inaktiverende stof.
- Vælg de rotter, der skal mikroin injiceres. Brug kun rotter, der viste mindst tre på hinanden følgende cyklusser efter operationen. Overvej deres fase af cyklussen og tidspunktet på dagen. Både tid og stadium afhænger af den specifikke hypotese, som du vil teste, for dette eksperiment 14:00 timers proestrus valgt siden nervøse præovulatoriske signaler, der styrer phasic GnRH sekretion forekomme i dette øjeblik. Transport dem til det rum, hvor injektionen vil finde sted inde i deres egne staldbure for at undgå nød.
- Hold rotten med et fast greb, fjern hætten og obturatorerne fra kanylerne, indsæt mikroinjektorerne i guide kanylerne og returner dyret til buret.
- Tænd for pumpen og vent, indtil mikroinjektionen er færdig. Overhold dyret i denne periode for at opdage en mulig løsrivelse af mikroinjektorerne og for at undgå vridning af Teflon-rørene.
- Lad mikroinjektorerne være på plads i yderligere to minutter for at undgå opstød af opløsningen. Fjern dem, rengør overfladen af implantatet med iodopovidon antiseptisk opløsning, undgå dets flow inde i guide kanylerne. Indsæt sterile obturatorer, læg på hætten og returner dyret til kolonirummet. Overhold dyret med jævne mellemrum for at opdage eventuelle bivirkninger af lægemidlet.
- Tænd pumpen med de samme parametre som under mikroinjektion og kontroller, om der er et korrekt flow for at sikre, at systemets patency blev bevaret under proceduren.
- Tryk stemplet for at udstøde TTX/køretøjet ud af mikroinjektoren, indtil luftboblen når spidsen af nålen. Husk TTX i sin microtube. Fyld sprøjten med destilleret vand og brug den til at rense det indre af rørene. Kassér vandet i det inaktiverende stof, og gentag denne proces mindst tre gange. Rengør ydersiden af sprøjter, rør og mikroinjektorer med en klud gennemblødt i det inaktiverende stof.
8. Aktiv dødshjælp og vævsbehandling
- På dagen for den forudsagte eller vaginalt bekræftede østrus injiceres rotten med en intraperitoneal overdosis natriumpentobarbital (75 mg/kg). Kontroller, om der er bevidstløshed, og 200 nL af en 0,5 % methylenblå opløsning gennem fører kanylerne som beskrevet i trin 7.1 til 7.9. Kontroller for smerte tegn ved hjælp af tå eller hale knivspids test, og hvis ingen er opdaget, halshugge rotten ved hjælp af en gnaver guillotinen.
- Brug en saks til at åbne bughulen og finde æggestokkene. Brug fin iris saks til at dissekere hver æggestok, skære på livmoderen-tubal krydset ved hjælp af et forstørrelsesglas. Undgå at beskadige ovidukt, fordi dette vil resultere i tab af oocytter.
- Sæt æggestokkene under et stereomikroskop og brug et barberblad til at fjerne alt fedtvævet uden at beskadige organet. Fjern ovidukt fra hver æggestok ved at skære med barberbladet så vidt muligt fra ampulla-regionen. Monter hver ovidukt på en anden rutsjebane og dæk med en dråbe vand. Opbevar æggestokkene i et hætteglas, der indeholder Bouins opløsning.
- Tør forsigtigt ovidukter med et absorberende papirhåndklæde og søg efter ampulla under stereomikroskopet. Med den ikke-dominerende hånd skal du holde oviduktet på plads ved at klemme langt fra ampulla med en 23 G nål, og brug derefter en anden 23 G nål i den dominerende hånd for at lave et 1 mm snit i den midterste del af ampulla. Cumulus-oocytkomplekserne stikker ud fra snittet som en dråbe tyktflydende væske (figur 2D). Brug nålen i den dominerende hånd til forsigtigt og langsomt at trække dråben langt fra oviduktet. Tryk på resten af ampullaen for at sikre, at der ikke efterlades oocytter indeni. Uddrag oocytterne fra ovidukterne så hurtigt som muligt, da udtørring af oviduktet uigenkaldeligt vil fange oocytterne indeni.
- Fjern oviduktet fra rutsjebanen, og vent, indtil dråben væske, der indeholder oocytterne, tørrer. Plette prøven med hæmatoxylin-eosin. Brug monteringsmedium til coverlip. Overhold under mikroskopet (10x) for at bestemme antallet af oocytter, der kastes af hver æggestok.
BEMÆRK: Offer ved hjerteperfusion udføres ikke i denne protokol, da oocytterne ville blive fanget i ovidukterne, og derfor vil histologiske metoder være nødvendige for at vurdere ægløsning. Hvis brugeren skal gennemgå for at analysere andre væv, æggestokkene kan fjernes først og de faldende arterier fastspændt med tykke hæmostats under leveren for at undgå utætte fiksativ. - Fjern hovedets hud og neddyb kraniet i en glasbeholder med en 10% formalinopløsning. Tillad fiksering af hovedet i mindst ti dage, før du fjerner kanylen for at undgå forvrængning af vævet. For at fjerne kanylen skal du bruge en saks til at løsne alle musklerne i det område af kraniet, der omgiver den. Skær mellem næse- og frontalbenene med knogletrimmere og fjern derefter occipital knoglen. Indsæt spidsen af trimmerne i foramen magnum og begynde at skære gennem sagittal kamme nå resten af næsebenet.
- Det isolerede område af toppen af kraniet skal indeholde frontale og parietale knogler. Fjern den implanterede kanyle fastgjort til toppen af kraniet ved langsomt at trække den op vinkelret på hovedet. Skær enhver vedhæftet del af meninges med fin iris saks for at undgå deformation af hjernen.
- Lav en forreste-posterior skåret på meninges og læg dem til side for at fjerne hjernen fra bunden af kraniet. Indsæt stump pincet under de olfaktoriske pærer og træk forsigtigt hjernen op, indtil synsnervene er synlige. Skær nerverne med fin iris saks og trække hjernen ud. Bevar hjernen i fiksativ opløsning.
- Opnå 50 μm tykke dele af hjernen ved hjælp af en vibratom, montere dem i poly-L-lysin belagt dias (0,1% i destilleret vand) og plet med Nissl teknik. Overhold diasene under mikroskopet (10x) for at bestemme kanylernes endelige position (Figur 2A-2C) og spredningen af farvestoffet ved hjælp af et rottehjerneatlas27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den ovenfor beskrevne protokol blev afprøvet ved at vurdere virkningerne af et enkelt TTX eller køretøj (kunstig cerebrospinalvæske; ACSF) mikroinjektion i en af to forskellige kerner, der vides at være involveret i reguleringen af ægløsning i rotten: suprachiasmatic og arcuatekernen. Den suprachiasmatiske kerne blev valgt, da den indeholder den centrale døgnrytmemager hos pattedyr. Det er involveret i reguleringen af cykliske begivenheder som udskillelse af gonadotropiner. Den arcuate kerne blev valgt, fordi den indeholder en population af neuroner, der udtrykker estradiol receptorer, som stimulerer GnRH sekretion i det meste af den estrous cyklus. Mikroinjektionen blev udført kl. 14:00 timers proestrusstadiet, hvilket er en periode kendt som det "kritiske vindue" på grund af forekomsten af mange af de centrale mekanismer, der regulerer præovulatorisk frigivelse af gonadotropiner. Efter behandling blev vaginale udstrygninger taget hver dag, og rotterne blev aflivet kl. 09:00 timer af den forudsagte dag af østrus, som faldt sammen med en vaginal smear karakteristisk for østrus. Som en yderligere kontrolgruppe blev fem intakte rotter aflivet på østrusstadiet anvendt. Fraktionen af cykeldyr efter operationen og andelen af ægløsning rotter i hver gruppe (ægløsning rotter / n) blev beregnet og analyseret ved hjælp af Fishers nøjagtige sandsynlighedstest. Antallet af æg skur af begge æggestokke blev analyseret af Kruskal-Wallis test, efterfulgt af Dunn's test. Der blev udført passende statistiske test for at sikre, at stikprøvestørrelsen var tilstrækkelig.
I alt 30 hunrotter blev implanteret med guide kanyler rettet mod et af de to målområder. Som vist i figur 3var alle dyrene cykliske før operationen, men kun syv af dem viste ikke ændringer af den estrøse cyklus efter cannulationsproceduren. Treogtyve dyr viste forbigående ændringer af deres cyklusser, karakteriseret ved en stigning i antallet af dage med leukocytiske udstrygninger. Sådanne ændringer skyldes sandsynligvis stress forårsaget af operationen og gradvist faldet. Ved femte cyklus blev 28 rotter betragtet som cykliske, og de resterende to blev kasseret fra eksperimentet. Dette resultat viser, at de fleste af de cannulated dyr efter en restitutionstid på fire estrøse cyklusser (16 dage) er egnede til yderligere forsøg.
Figur 4A og figur 4B viser procentdelen af ægløsning af dyr og antallet af ægskur af henholdsvis intakte dyr og af de grupper, der behandles med enten ACSF eller TTX, i den suprachiasmatiske kerne. Alle de intakte rotter ægløsning og det samme var tilfældet for ACSF-gruppen. Ingen af dyrene mikroin injiceres dog med TTX-ægløsning. Injektionen af køretøjet ændrede ikke antallet af ægskur. Det ville dog være interessant at vurdere levedygtigheden og kvaliteten af de frigivne oocytter. Lignende resultater kan observeres i figur 4C og figur 4D for rotter mikroinjectederede i arcuatekernen. I begge tilfælde beviste denne metode deltagelsen af en diskret hjerneregion i reguleringen af ægløsning i proestrusstadiets kritiske vindue, som først blev udledt af læsionsundersøgelser, men ikke bekræftet. Virkningerne af TTX mikroinjektion synes at være forbigående snarere end permanent, da et tidligere eksperiment viste, at rotter injiceres i suprachiasmatic kernen uden for "kritisk vindue" ægløsning på den forventede dag af østrus26. Det anbefales imidlertid også at behandle dette problem, hvis der medtages kontrolgrupper, hvor dyrene ofres med en 24-timers eller indtil der opnås en klar vaginal udtværing af østrus.
Resultaterne i figur 5A-B repræsenterer ægløsningsresultatet af dyr, der blev behandlet med ACSF eller TTX. Men som fastslået efter histologisk bekræftelse var deres kanyler placeret uden for den tilsigtede region. De fleste af disse kanyler blev placeret i den forreste commissure eller retrochiasmatic område, to områder, der ikke bidrager til reguleringen af ægløsning. Begge disse strukturer sammen med suprachiasmatic og arcuate kernen er meget tæt fra den tredje ventrikel, i betragtning af dette, en blokade af ægløsning ville forventes i alle dyr, hvis stoffet lækket ind i ventrikel. Det faktum, at TTX mikroinjection uden for målene undladt at blokere ægløsning tyder på, at mængden af TTX infunderes med den valgte hastighed ikke lække ind i ventrikel, dermed afslører regionen-specifikke virkninger af TTX. Til støtte for denne idé viste histologisk analyse af hjerneskiverne kun farvede neuroner nær spidsen af guide kanylerne. Vi må dog præcisere, at der ikke blev foretaget nogen direkte vurdering af spredningen af lægemidlet, og derfor bør denne konklusion behandles yderligere.
Figur 1: Vaginal udstrygninger repræsentative for hvert trin i den estrøse cyklus. Estrus (A) er karakteriseret for tilstedeværelsen af epitel cornified celler uden en kerne, der kan findes enten alene for at danne cumulous som følge af epitel desquamation. I metestrus (B) kan nogle af disse cornified celler stadig være til stede, men er i undertal af leukocytter, som også er den fremherskende celletype i Diestrus (C). Proestrus prøver (D) er karakteriseret ved de tyktflydende konsistens og overvægt af epitelkernede celler. Skalalinjen i hvert panel repræsenterer 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Histologisk undersøgelse af prøver efter aktiv dødshjælp. Hjerne koronar sektioner på arcuate kerne (ARC) og median eminence (EM) region af en intakt rotte (A), en bilateralt-cannulated rotte(B) og en rotte med en malplaceret kanyle (C). Stjernerne peger på det område, hvor spidsen af de styrende kanyler var placeret, i B de spidser, hvor på basal margenen af ventromedial kerne (VMH), så de fremspringede injektorer til at nå den øvre margen af ARC. I C en kanyle var placeret inde i den tredje ventrikel (3V), hvilket resulterer i en ikke-lokaliseret ventrikulær mikroinjection. Dette er en almindelig fejl, når målet er placeret tæt på midterlinjen, og data fra disse dyr skal kasseres. Når udvindingen af oocytter udføres korrekt, skal det resultere i en enkelt dråbe tyktflydende væske, der indeholder alle oocytterne fra det undersøgte ovidukt, som det ses i panelet (D). Skalalinjen i hvert panel repræsenterer 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Kumulativ procentdel af cykeldyr før og efter implantationen af kanylen (***p≤0.0001; **p=0,0003 vs. cyklussen før operationen, Fishers nøjagtige sandsynlighedstest). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Procentdel af ægløsning af dyr og medianen med mellemkvilområde (fejlstænger) af antallet af æg, der kastes af dyr, der mikroin injiceres i målstrukturen #1 (suprachiasmatic nucleus, A-B) eller #2 (arcuate nucleus, C-D) med kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) eller tetrodotoxin (TTX) kl. Den intakte gruppe blev tilføjet til hver graf til sammenligningsformål, og antallet inde i søjlerne repræsenterer den brøkdel af ægløsningshunner (***p≤0.01 vs. Intakte og ACSF-grupper, Fishers nøjagtige sandsynlighedstest og Kruskal-Wallis-test). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Procentdel af ægløsning af dyr (A) og median med interkvilområde (fejlstænger) af antallet af ægskur (B) af dyr, hvis kanyler blev bestemt til at være uden for målområderne. Disse dyr blev mikroinsinbered med kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) eller tetrodotoxin (TTX) kl. Den intakte gruppe blev tilføjet til hver graf til sammenligningsformål, og tallet inde i søjlerne repræsenterer den brøkdel af ægløsningshunner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel beskriver en metode til at forbigående inaktivere, på et givet tidspunkt, en diskret region i hjernen af vågen og uhæmmet rotter. Der findes også en enkel metode til at spore deres estrøse cyklus og vurdere ægløsning. Denne protokol giver mulighed for en simpel analyse af specifikke hjerneområders bidrag til de mekanismer, der driver ægløsning ved at sammenligne ægløsningsresultatet af TTX-behandlede dyr med det køretøjsbehandlede dyr. Med undtagelse af det stereotaxiske instrument og mikroinjektionspumpen, som er almindelige i neurovidenskabslaboratorier, kræver denne metode ikke dyre materialer. Kommercielle kanyler og mikroinjektorer er det sædvanlige valg for denne form for eksperiment, men det let at bygge system, der er beskrevet her, sænker omkostningerne, og resultaterne kan ikke skelnes. Ved at bruge denne protokol og de materialer, der er anført i tabellen, der ledsager denne artikel, kan ti gange flere kanyler fremstilles ved at bruge det samme beløb, som et kommercielt kit til ti dyr ville koste. Opførelsen af ti bilaterale kanyler, uanset hvilken tilpasning der kræves til undersøgelsen, kan udføres på få timer. Derudover kan alle komponenter genanvendes, hvilket øger omkostningseffektiviteten.
Sammen med forholdet mellem fordele og omkostninger er denne protokol velegnet til ethvert laboratoriemiljø, da det kan udføres af ethvert personale, herunder studerende, med kendskab til gnavermanipulation, stereotaxisk kirurgi og håndtering af biologiske toksiner og relateret affald. Derudover kan det tilpasses til at blive brugt i enhver art af gnavere og andre små pattedyr, herunder kaniner, fritter, marmosets og endda i ikke-pattedyrarter som fugle og krybdyr. Udover de egenskaber, der er nævnt ovenfor, er den største fordel ved denne protokol, at den let kan tilpasses til undersøgelse af andre processer under regulering af hjernen, såsom aktiviteten af perifere organer, den homøostatiske reaktion på miljømæssige udfordringer og forskellige adfærdsmønstre.
Der er flere kritiske trin, der skal udføres, før eksperimentet startes for at opnå de ønskede resultater. For det første skal koordinaterne for den målrettede struktur beregnes empirisk, da de, der er rapporteret i hjerneatlaser, ikke nødvendigvis vil stemme overens med de dyr, der er udpeget til undersøgelsen som følge af deres belastning, køn eller alder. Flere undersøgelser har vist, at implanterede elektroder og infusion sonder ændre funktionen af den skadede zone ikke kun ved ødelæggelse af neurale organer og fibre, men også ved aktivering af gliaceller. Den inflammatoriske reaktion, der indledes umiddelbart efter implantationen, forårsager typisk indkapsling af fremmedlegemet ved gliaceller. Disse celler danner en stram kappe, der hæmmer strømmen af neurotransmittere og fortrænger neuroner, indleder en proces med neurodegeneration31. De skadelige virkninger af implantationsproceduren kan ikke undgås, og man bør sørge for, at sådanne virkninger opstår så langt fra hjerneregionen af interesse som muligt. Koordinater bør kun beregnes for at placere guidede kanylerne i målområdet, hvis de er store nok til at sikre, at højst 10% af området vil blive beskadiget af kanylen. Denne tilgang er nyttig, for eksempel hvis store områder af cortex vil blive undersøgt. Selv i dette tilfælde skal der foretages en detaljeret analyse af kontrolgruppen for at tage højde for implantatets indvirkning på renteprocessen. For små strukturer som diskrete hypothalamus kerner anbefaler vi forskere at beregne koordinaterne for at placere guide kanylerne i en afstand fra 0,5 til 2 mm fra den øvre kant af målstrukturen i den midterste region i de forreste posterior og mediale-laterale planer i henhold til hjerneatlaset (Figur 2B). I den forbindelse skal injektorerne udformes således, at de stikker tilstrækkeligt ud til at nå målets grænse. Vi har testet dette for de to kerner, der er beskrevet i denne protokol og konstateret, at disse rotter genvundet deres esterous cyklus og evnen til at ægløsning hurtigere end dyrene med kanyler implanteret inde i målene.
Det bør overvejes, om de farmakologiske agenser, der skal injiceres, er opløselige, således at køretøjsopløsningen svarer så meget til cerebrospinalvæsken som muligt. TTX kan købes som et lyophilized pulver, enten alene eller med citrat. Den første har lav opløselighed i vand og en sur buffer med en pH omkring 5.0 anbefales at rekonstruere det, men dette kan introducere muligheden for at beskadige vævet som følge af injektioner af køretøjet alene. På den anden side kan TTX-citrat opløses i vand eller 0,9% saltvandsopløsning, som begge almindeligvis anvendes som køretøjer. Vi anbefaler mod brug af begge disse køretøjer, og foreslår at bruge kunstig cerebrospinalvæske eller Ringers laktatopløsning i stedet. En tidligere undersøgelse viste, at saltvandsopløsning mikroinjectederet i suprachiasmatic kernen har skadelige virkninger på ægløsning, når de udføres på østrus eller diestrus26. Flere artikler har rapporteret, at perfusion af nervevæv med løsninger, der ikke matcher de fysiske og kemiske egenskaber af cerebrospinalvæske ændrer anatomien og fysiologien af neuroner og fremmer inflammatoriske reaktioner og celledød32,33,34,35. I betragtning af disse resultater anbefales brugen af kunstig cerebrospinalvæske, da køretøjet stærkt anbefales i alle eksperimenter, der involverer mikroinjektion af stoffer i hjernen.
Før man begynder forsøg, bør forskerne empirisk bestemme den optimale mængde opløsning, der skal injiceres, da både lækker i tilstødende strukturer og utilstrækkelig dækning kunne forvirre fortolkningen af resultaterne. Dette kan opnås ved microinjecting en vandopløselig farvestof i klar agar eller gelatine terninger. Spredningen af farvestoffet kan derefter estimeres og sammenlignes med den forventede størrelse af målet som rapporteret i hjernen atlas. Stadig, egenskaber af hjernen region af interesse såsom dens cellulære tæthed og tilstedeværelsen af fiberkanaler eller ventrikulære grænser vil påvirke diffusion dynamik, og resultaterne kan afvige fra dem, der findes i agar og gelatine. Derfor skal forskeren derefter teste de parametre, der er opnået in vitro i målområdet for nogle få dyr. Flere farvestoffer er med succes blevet anvendt til intracerebral mikroinjections hos rotter for at afgrænse diffusionen af en given mængde opløsning. De mest almindelige eksempler er cresyl violet, thionine blå, methylenblå, Evans blå, hurtiggrøn og indisk blæk. Disse farvestoffer opløses i destilleret vand ved en koncentration på 0,5% eller lavere. Evans blå har den fordel, at den kan påvises i et fluorescensmikroskop (excitation ved 620 nm og emission ved 680 nm), hvilket giver mulighed for en mere kvantitativ analyse af spredningen. Latex mikroperler kan også være egnet til denne tilgang. Det er vigtigt at nævne, at mængder på over 2,0 μL ikke bør administreres i hjernen med denne teknik, da mekanisk skade og vævsforskydning vil forekomme36.
Opløsningens strømningshastighed er også en vigtig faktor at kontrollere, da mikroinjektionen af høje mængder ved høj hastighed forårsager vævsforskydning og mekaniske læsioner40. Derudover øger en høj infusionshastighed også spredningen af lægemidlet, hvilket resulterer i inaktivering af tilstødende strukturer. Så meget som en tredobling af det område, der er omfattet af en opløsning, kan skyldes, at infusionshastigheden ændres fra 100 nL/5 minutter til 100 nL/1 minut36. Histologiske observationer af rottehjerner injiceret med methylenblåt indikerer, at en infusionshastighed på 50 nL/minut ikke fortrænger vævet, mens lægemidlet begrænsers til målområdet (personlige observationer). Dette blev kun testet med mængder svarende til eller lavere end 200 nL, og derfor skal forskerne køre pilotforsøg, hvis der vil blive anvendt større mængder.
Når arbejdsmængden er bestemt, anbefales det også at vurdere spredningen på hvert dyr. Dette kan gøres ved enten at co-injicere et farvestof med narkotika eller ved at injicere det et par minutter før aktiv dødshjælp, som beskrevet i denne protokol. Den tidligere model gør det muligt for farvestoffet at sprede sig sammen med toksinet, hvilket giver en mere præcis vurdering af det berørte område. En ulempe ved denne metode er, at farvestoffet kan forstyrre aktiviteten af lægemidlet, og kan også være cytotoksisk. Endelig kan der forekomme clearance fra nervevævet, hvis dyret skal overleve i flere dage efter injektionsproceduren, hvilket ville påvirke estimatet af spredningen. Hvis denne fremgangsmåde vil blive anvendt, skal farvestoffets indvirkning på den undersøgte proces behandles ved at sammenligne resultatet af køretøj+farvegruppen med resultaterne af intakte dyr. Hvis injektionen af farvestoffet vil forekomme før aktiv dødshjælp, anbefales det at gøre det efter de samme parametre som under mikroinjektion (infusionshastighed og volumen). Dette skal udføres mindst 10 minutter før aktiv dødshjælp for at tillade spredning af opløsningen. Med denne metode blev det konstateret, at 200 nL af en TTX /methylenblå opløsning dækker en kugle på 0,6 mm diameter, og spredningen ændrer sig ikke væsentligt, hvis mikroinjektion forekommer 1 time før offer (personlig observation). Dette er i overensstemmelse med undersøgelsen af Freund og kolleger37, samt den ene af Zhuravin og Bures38, som begge fandt, at 1 μL TTX opløsning spredes i et sfærisk-formet volumen med en diameter på ca. 3 mm. Generelt har det vist sig, at spredningen af lægemidlet afhænger af dets molekylvægt og det injicerede volumen,39 og de ovenfor anførte resultater matcher diffusionen af farvestoffer med en molekylvægt svarende til TTX. Hvis der er behov for en mere præcis kontrol af spredning, kan injektion af radiolabel TTX eller implementering af immunohistochemistry mod regelmæssig TTX med kommercielt tilgængelige antistoffer udføres37. Ud over en bedre afgrænsning af det område, der er omfattet af lægemidlet, er disse to tilgange begrænset af clearance af TTX fra vævet, hvilket skal overvejes, hvis dyret skulle overleve flere dage efter mikroinjektionen, på den anden side vil arbejde og bortskaffelse af radioaktivt materiale introducere nye trin og sikkerhedsproblemer, der ikke kunne være kompatible med alle laboratorier og protokoller.
Det anbefales at medtage en kontrolgruppe, der består af dyr, der injiceres i et hjerneområde, der ikke har en rolle i reguleringen af den undersøgte proces. Denne gruppe vil hjælpe forskeren til at bestemme specificiteten af målområdet i reguleringen af denne proces og vil kassere muligheden for, at narkotika, injiceres i enhver struktur, kunne udløse en blokering signal baseret på en mere udbredt mekanisme såsom aktivering af stress eller immun akse. Da selv de mest eksperimenterede stereotaxiske kirurger ikke er i stand til at opnå en 100% succesrate, når små strukturer er målrettet, er disse eksperimenter normalt ledsaget af kanyler placeret uden for den ønskede struktur, og dermed denne kontrolgruppe er utilsigtet opnået. Resultaterne fra de dyr, hvor kanylen var malplaceret, er værdifulde og bør ikke kasseres. I stedet skal der foretages en omfattende analyse i betragtning af det injicerede område og spredningen af lægemidlet. Af særlig interesse er de resultater, der viser en anden effekt (eller ingen) hos dyr injiceret i regioner tæt på målene.
Denne protokol har begrænsninger iboende for kronisk placering af kanyler. Det er ikke muligt at undgå permanent ødelæggelse af fibre af passage og neuronale organer i kanylens bane. Brugen af glas kapillærer med en spids diameter på et par mikrometer er den valgte metode til at levere lægemidler ind i hjernen med minimal skade på vævet41. Denne metode er imidlertid hovedsagelig blevet anvendt i forsøg, hvor dyret bedøves, og/eller hovedet er fastgjort til det stereotaxiske apparat eller andre holderanordninger. Dette skyldes hovedsagelig kapillærens skrøbelighed, hvilket gør det vanskeligt at fastgøre den til et vågent og uhæmmet dyr. Et system, der bruger glas kapillærer forbundet til osmotiske pumper, i stedet for guide kanyler, har vist en betydelig forbedring i mængden af hjernevæv beskadiget og i glial reaktion på skaden42. I dette system er infusionen af stofferne imidlertid kronisk snarere end tids og derfor ikke nyttig i eksperimenter, hvor injektionstiden skal kontrolleres præcist. Et mikroinjektionssystem baseret på en glas kapillær indsat i målområdet gennem en tidligere implanteret guide kanyle blev beskrevet af Akinori og kolleger43. Dette system tillader injektion af et vågent dyr på det ønskede tidspunkt, men det er ikke meget robust, og dyret skal begrænses under proceduren, hvilket kan føre til aktivering af stressresponset. I denne protokol kan virkningerne af skader på nervevæv i styre kanylens bane kontrolleres ved at sammenligne de intakte grupper og køretøjsgrupperne. Her blev det vist et lignende ægløsningsresultat for begge grupper, og det blev konkluderet, at det berørte væv samt injektion af køretøjet ikke forstyrrede ægløsningen. Forskere skal køre pilotundersøgelser for at afgøre, om de strukturer, der er placeret dorsale til deres målområde, som ville blive ødelagt af kanylen, er involveret i reguleringen af den undersøgte proces. Alligevel er en lovende fremtidig retning for dette arbejde at designe et leveringssystem, der udnytter styrkerne i både guide kanyler og glas kapillærer.
En anden vigtig overvejelse for forskere er tidspunktet for virkningen af TTX. Zhuravin og Bures38 har vist, at TTX tager et par minutter at nå en maksimal blokade af neural transmission, som varer i omkring en og en halv time, faldende gradvist over flere timer. Dette gør TTX det foretrukne stof, når langvarig inaktivering er påkrævet. Hvis eksperimentet kræver hurtigere inaktivering, kan lokale bedøvelsesmidler som lidokain bruges, da det kun tager et par sekunder at nå en maksimal blokade. Virkningerne af dette stof varer i mindre end 20 minutter, hvilket giver en finere tidsmæssig opløsning end TTX. De egenskaber, der er angivet ovenfor, gør TTX til et godt værktøj til sonderende eksperimenter, der studerer tilstedeværelsen af neurale signaler, der genereres i mindre veldefinerede tidsmæssige vinduer. Lidokain, på den anden side, er nyttig til afgrænsning af dette vindue44. En ulempe ved begge lægemidler er, at de blokerer transmissionen af handlingspotentialer i fibre af passage, indføre artefakter i fortolkningen af data, da signalet potentielt kunne komme fra en anden struktur, der sender axonal fremskrivninger til det injicerede område. I dette tilfælde er omhyggelig analyse af injektionerne, der er bestemt til at være uden for målområdet, meget vigtige. For eksempel blev det i denne artikel vist, at TTX infusion i området bare forreste til den suprachiasmatiske kerne og ind i regionen mellem den og arcuatekernen ikke blokerede ægløsning. Sådanne resultater viste, at fibrene og cellerne i disse regioner ikke er involveret i reguleringen af ægløsning, hvilket var uventet på grund af tilstedeværelsen af et gensidigt net af fibre, der forbinder den suprachiasmatiske kerne med både arcuatekernen og de forreste regioner, der indeholder GnRH-neuroner.
Et alternativ, der ikke blokerer transmissionen langs vejefibre i det injicerede område, er brugen af divalente kationer som kobolt og magnesium, som begge hæmmer frigivelsen af neurotransmittere ved præsynaptiske terminaler. Problemet med denne tilgang er imidlertid den meget korte tid med inaktiverende handling og højtoksicitet 44. Andre muligheder for at undgå blokade af fibre er de optogenetiske og kemiske tilgange, som begge er strategier for manipulation af aktiviteten af specifikke neuronale populationer. Selektivitet opnås ved at transfektere neuroner med virale vektorer designet til at indsætte sekvenser, der kodificerer for enten opsiner bundet til ionkanaler eller modificerede receptorer udtrykt under specifikke initiativtagere. Vektorens mikroinjektion udføres hos bedøvede dyr ved hjælp af glaskapillærer, hvilket forårsager lidt forstyrrelse af det omgivende væv. Implantationen af optiske fibre eller den systemiske injektion af syntetiske stoffer giver mulighed for en meget præcis manipulation af målpopulationen45. Disse teknikker viste sig nyttige i en undersøgelse, enten alene eller i forbindelse med teknikker som TTX mikroinjektion præsenteret i denne protokol46. Alligevel skal flere aspekter af disse metoder overvejes at designe vellykkede eksperimenter, herunder validering af udtryks specificiteten, kontrol for antallet af celler, der overføres, vurdering af toksicitet og evaluering af bivirkningerne af lys og kemisk stimulering.
Kritiske komponenter i denne protokol omfattede korrekt bestemmelse af stadiet af den estrøse cyklus for hvert dyr. For at udføre denne procedure med succes er opnåelse af kvalitetsprøver af vaginal epitel og korrekt fortolkning af resultaterne afgørende (vi anbefaler følgende figur 1). Derudover skal forskerne omhyggeligt udfylde injektionssystemet for at forhindre inkorporering af luftbobler, der kan resultere i injektion af unøjagtige mængder af lægemidler. Det er også vigtigt at overvåge dyrene under mikroinjektionen for at forhindre dem i at bide slangen eller på anden måde forstyrre systemet. Endelig bør forskere, der er blinde for eksperimentelle forhold, analysere resultatet af ægløsningen, kanylens endelige position og spredningen af opløsningen i målområdet for at sikre, at fortolkningen af resultaterne er upartisk.
Her blev en pålidelig, omkostningseffektiv og ligetil metode til at analysere bidraget fra diskrete områder af hjernen i reguleringen af ægløsning beskrevet. Denne procedure udføres i vågen og uhæmmet rotter, overgår de skadelige virkninger af blokaden af neurotransmission og også de hæmmende virkninger, stresshormoner som kortisol og kortikosteron udøver på GnRH sekretion. Denne metode er fuldt tilpasselig og kan bruges til at levere ethvert lægemiddel i enhver struktur i hjernen. Derudover kan det let tilpasses til almindelige gnaver- og ikke-gnaverarter, der anvendes i laboratoriet. Endelig kan denne protokol bruges sammen med metoder til kvantificering af stoffer som hormoner og metabolitter i blodet, vurdering af genekspression i celler og væv, registrering af neuronal aktivitet og også udførelsen af vågne dyr i adfærdsmæssige tests for at bestemme specifikke hjerneområders rolle i forskellige adfærdsmæssige og fysiologiske processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre i forhold til denne artikel.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Raymond Sanchez på University of Washington for hans værdifulde hjælp i manuskriptredigering og for at M.Sc Georgina Cortés og M.Sc. Cintia Javier for deres tekniske støtte i standardiseringen af denne teknik. Vi er også taknemmelige for medlemmerne af dyrlægen tjenester på Facultad de Estudios Superiores Zaragoza: MVZ. Adriana Altamirano, MVZ. Roman Hernández og MVZ. Dolores-Elizabeth Guzmán for fremragende vedligeholdelse og pleje af forsøgsdyr. De eksperimenter, der er beskrevet i denne protokol, blev støttet af DGAPA-PAPIIT-bevillingsnummer: IN216015 og af CONACyT-tilskudsnummer: 236908 til Roberto Domínguez. Carlos-Camilo Silva er ph.d.-studerende fra Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) og støttes af Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Grant nummer: 294555).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL Hamilton syringes | Hamilton | 80314 | |
| 21 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305165 | |
| 23 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle | BD | 305106 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | BASi | MD-2400 | |
| Bone trimer | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Burr for micro drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Clipper | Wahl | ||
| Cut-off disc | Dremel | SM5010 | |
| Cutting tweezers | Truper | 17367 | |
| Cyanocrylate glue | Kola loka | K-1 | |
| Dental cement | Nic Tone | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosin | Sigma | E4009 | |
| Estereoscope | Zeiss | ||
| Extra fine Bonn scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Face mask | Lanceta HG | 60036 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Hematoxilin | Sigma | H3136 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 320331 | |
| Hypromelose artificial tears | Sophia Labs | 8950015 | |
| Isoflurane | Pisa Agropecuaria | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Microinjection pump | KD Scientific | 788380 | |
| Monomer | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Nitrile gloves | Lanceta HG | 69028 | |
| Non-Rupture Ear Bars | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poly-L lysine | Sigma | P4707 | |
| Povidone-iodine | Dermo Dine | ||
| Povidone-iodine with soap | Germisin espuma | ||
| Pressure tweezers | Truper | 17371 | |
| Rat anesthesia mask | David Kopf Instruments | Model 906 | |
| Saline solution | PISA | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sodium pentobarbital | Pisa Agropecuaria | ||
| Standard electrode holder | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Stainless steel wire | American Orthodontic | 856-612 | |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments | Model 900LS | |
| Surgical Sissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Teflon connectors | Basi | MD-1510 | |
| Teflon tubing | Basi | MF-5164 | |
| Tetrodotoxin | Alomone labs | T-500 | |
| Vaporizer | Kent scientific | VetFlo |
References
- Herbison, A. E. Control of puberty onset and fertility by gonadotropin-releasing hormone neurons. Nature Reviews Endocrinology. 12 (8), 452-466 (2016).
- Fink, G. Neuroendocrine Regulation of Pituitary Function. Neuroendocrinology in Physiology and Medicine. Conn, M., Freeman, E. , Springer Science Business Media. New York. 107-133 (2000).
- Herbison, A. E. The Gonadotropin-Releasing Hormone Pulse Generator. Endocrinology. 159 (11), 3723-3736 (2018).
- Morello, H., Taleisnik, S. Changes of the release of luteinizing hormone (LH) on the day of proestrus after lesions or stimulation of the raphe nuclei in rats. Brain Research. 360 (1-2), 311-317 (1985).
- Slusher, M. A., Critchlow, V. Effect of Midbrain Lesions on Ovulation and Adrenal Response to Stress in Female Rats. Experimental Biology and Medicine. 101 (3), 497-499 (1959).
- Sawyer, C. H., Haun, C. K., Hilliard, J., Radford, H. M., Kanematsu, S. Further Evidence for the Identity of Hypothalamic Areas Controlling Ovulation and Lactation in the Rabbit. Endocrinology. 73 (3), 338-344 (1963).
- Schiavi, R., Jutisz, M., Sakiz, E., Guillemin, R. Stimulation of Ovulation by Purified LH-Releasing Factor (LRF) in Animals Rendered Anovulatory by Hypothalamic Lesion. Experimental Biology and Medicine. 114 (2), 426-429 (1963).
- Bagga, N., Chhina, G. S., Mohan Kumar, V., Singh, B. Cholinergic activation of medial preoptic area by amygdala for ovulation in rat. Physiology & Behavior. 32 (1), 45-48 (1984).
- Barraclough, C. A., Yrarrazaval, S., Hatton, R. A Possible Hypothalamic Site of Action of Progesterone in the Facilitation of Ovulation in the Rat. Endocrinology. 75 (6), 838-845 (1964).
- Critchlow, V. Blockade of ovulation in the rat by mesencephalic lesions 1, 2. Endocrinology. 63 (5), 596-610 (1958).
- Terasawa, E., Wiegand, S. J. Effects of Hypothalamic Deafferentation on Ovulation and Estrous Cyclicity in the Female Guinea Pig. Neuroendocrinology. 26 (4), 229-248 (1978).
- Halász, B., Köves, K., Molnár, J. Neural control of ovulation. Human Reproduction. 3 (1), 33-37 (1988).
- Narahashi, T. Pharmacology of tetrodotoxin. Journal of Toxicology: Toxin Reviews. 20 (1), 67-84 (2001).
- Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. Tetrodotoxin blockage of sodium conductance increase in lobster giant axons. The Journal of General Physiology. 47 (5), 965-974 (1964).
- Narahashi, T., Deguchi, T., Urakawa, N., Ohkubo, Y. Stabilization and rectification of muscle fiber membrane by tetrodotoxin. American Journal of Physiology-Legacy Content. 198 (5), 934-938 (1960).
- Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiological Reviews. 54 (4), 813-889 (1974).
- Ritchie, J. M., Rogart, R. B. The binding of saxitoxin and tetrodotoxin to excitable tissue. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 79 (1), 1-50 (1977).
- Bermudez-Rattoni, F., Introini-Collison, I. B., McGaugh, J. L. Reversible inactivation of the insular cortex by tetrodotoxin produces retrograde and anterograde amnesia for inhibitory avoidance and spatial learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5379-5382 (1991).
- Tang, X., Yang, L., Liu, X., Sanford, L. D. Influence of Tetrodotoxin Inactivation of the Central Nucleus of the Amygdala on Sleep and Arousal. Sleep. 28 (8), 923-930 (2005).
- Klement, D., Pašt’alková, E., Fenton, A. A. Tetrodotoxin infusions into the dorsal hippocampus block non-locomotor place recognition. Hippocampus. 15 (4), 460-471 (2005).
- Conejo, N. M., Cimadevilla, J. M., González-Pardo, H., Méndez-Couz, M., Arias, J. L. Hippocampal Inactivation with TTX Impairs Long-Term Spatial Memory Retrieval and Modifies Brain Metabolic Activity. PLoS ONE. 8 (5), 64749 (2013).
- Grimm, J., Ronald, E. Dissociation of Primary and Secondary Reward-Relevant Limbic Nuclei in an Animal Model of Relapse. Neuropsychopharmacology. 22 (5), 473-479 (2000).
- Hasegawa, H., et al. Inhibition of the preoptic area and anterior hypothalamus by tetrodotoxin alters thermoregulatory functions in exercising rats. Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1458-1462 (2005).
- Meyer, F., Louilot, A. Early Prefrontal Functional Blockade in Rats Results in Schizophrenia-Related Anomalies in Behavior and Dopamine. Neuropsychopharmacology. 37 (10), 2233-2243 (2012).
- Rothfeld, J. M., Harlan, R. E., Shivers, B. D. Reversible disruption of lordosis via midbrain infusions of procaine and tetrodotoxin. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 25 (4), 857-863 (1986).
- Silva, C., Cortés, G. D., Javier, C. Y., Flores, A., Domínguez, R. A neural circadian signal essential for ovulation is generated in the suprachiasmatic nucleus during each stage of the estrous cycle. Experimental Physiology. , (2019).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (7th Ed). , Academic Press. California. (2014).
- Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal Cytology of the Laboratory Rat and Mouse. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS ONE. 7 (4), 35538 (2012).
- Wirtshafter, D., Asin, K., Kent, E. W. Simple technique for midline stereotaxic surgery in the rat. Physiology & Behavior. 23 (1), 409-410 (1979).
- Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).
- Kazim, S. F., Enam, S. A., Shamim, M. S. Possible detrimental effects of neurosurgical irrigation fluids on neural tissue: An evidence based analysis of various irrigants used in contemporary neurosurgical practice. International Journal of Surgery. 8 (8), 586-590 (2010).
- Miyajima, M., et al. Role of cerebrospinal fluid as perfusate in neuroendoscopic surgery: A basic investigation. Acta Neurochirurgica. 113, 103-107 (2012).
- Mori, K., et al. Potential risk of artificial cerebrospinal fluid solution without magnesium ion for cerebral irrigation and perfusion in neurosurgical practice. Neurologia Medico-Chirurgica. 53 (9), 596-600 (2013).
- Oka, K., Yamamoto, M., Nonaka, T., Tomonaga, M. The significance of artificial cerebrospinal fluid as perfusate and endoneurosurgery. Neurosurgery. 38 (4), (1996).
- James, T. A., Starr, M. S. Effects of the rate and volume of injection on the pharmacological response elicited by intraingral microapplication of drugs in the rat. Journal of Pharmacological Methods. 1 (3), 197-202 (1978).
- Freund, N., Manns, M., Rose, J. A method for the evaluation of intracranial tetrodotoxin injections. Journal of Neuroscience Methods. 186 (1), 25-28 (2010).
- Zhuravin, I. A., Bures, J. Extent of the tetrodotoxin induced blockade examined by pupillary paralysis elicited by intracerebral injection of the drug. Experimental Brain Research. 83 (3), 687-690 (1991).
- Myers, R. Injection of solutions into cerebral tissue: relation between volume and diffusion. Physiology and Behavior. 1 (2), 171-174 (1966).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal of Visualized Experiments. (46), e2082 (2010).
- McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. J Neuroimmunol. 194 (1-2), 27-33 (2008).
- Cunningham, M. G., O'Connor, R. P., Wong, S. E. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of VisualizedExperiments. (13), e716 (2008).
- Akinori, A., Masamichi, S., Hiroshi, T. A new device for microinjection of drugs into the lower brain stem of conscious rats: Studies on site of action of morphine. Journal of Pharmacological Methods. 2 (4), 371-378 (1979).
- Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- de Sousa, A. F., et al. Optogenetic reactivation of memory ensembles in the retrosplenial cortex induces systems consolidation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences. 116 (17), 8576-8581 (2019).
- Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
