Summary

Optrævling af de diskrete områder af rottehjernen i reguleringen af ægløsning gennem reversibel inaktivering af Tetrodotoxin Microinjections

Published: September 03, 2020
doi:

Summary

Denne protokol beskriver opførelsen af et billigt mikroinjektionssystem, dets stereotaxiske implantation i dybhjernestrukturer og proceduren for tidsurige mikroinjektioner af tetrodotoksin hos vågne og hæmningsløse rotter. Målet er at afsløre deltagelsen af hypothalamus strukturer i reguleringen af ægløsning ved at hæmme deres neurale aktivitet.

Abstract

Mange eksperimentelle tilgange er blevet brugt til at studere hjernens rolle i reguleringen af ægløsning. Eksempler omfatter læsion og deafferentation af neuronale grupper, som begge er invasive metoder, der permanent forringe integriteten af målområdet. Disse metoder ledsages af følgevirkninger, der kan påvirke analysen af akutte og tidsmæssige reguleringsmekanismer. Den stereotaxiske implantation af guide kanyler rettet mod specifikke hjerneområder, efterfulgt af en restitutionsperiode, gør det muligt for forskere at mikroinject forskellige lægemidler efter forsvinden af uønskede virkninger af operationen. Tetrodotoxin er blevet brugt til at bestemme rollerne i flere hjerneområder i forskellige fysiologiske processer, fordi det forbigående hæmmer natriumafhængige handlingspotentialer og dermed blokerer al neural aktivitet i målregionen. Denne protokol kombinerer denne metode med strategier for vurdering af den estrøse cyklus og ægløsning for at afsløre den rolle, diskrete hjerneområder i reguleringen af ægløsning på bestemte tidspunkter af et givet stadium af den estrøse cyklus. Vågne og hæmningsløse rotter (Rattus norvegicus) blev brugt til at undgå de blokerende virkninger, som bedøvelses- og stresshormoner udøver på ægløsning. Denne protokol kan let tilpasses andre arter, hjernemål og farmakologiske midler for at studere forskellige fysiologiske processer. Fremtidige forbedringer af denne metode omfatter design af et mikroinjektionssystem ved hjælp af glaskapillærer med lille diameter i stedet for guide kanyler. Dette vil reducere mængden af væv beskadiget under implantationen og mindske spredningen af de infunderede lægemidler uden for målområdet.

Introduction

Ægløsning er den proces, hvorved en eller flere modne oocytter frigives fra æggestokkene, når hver estral / menstruationscyklus. Da alle pattedyrarter er afhængige af produktionen af gameter til at opdrætte, har forståelsen af de mekanismer, der regulerer ægløsning, en enorm indvirkning i områder lige fra biomedicin, husdyrindustrien og vedligeholdelse af truede arter. Ægløsning er reguleret af hypothalamus-hypofyse-æggestokkene akse, som involverer flere hypothalamus og ekstra-hypothalamus områder, gonadotropes i den forreste hypofyse og theca og granulosa celler, der sammen med oocytter, danner æggestokkene follikler inde i æggestokkene1.

Ovarie follikler vokse, udvikle og i sidste ende ægløsning som reaktion på tonic og phasic sekretion af follikel-stimulerende hormon og luteiniserende hormon, de to gonadotropins udskilles af gonadotropes. Mønsteret af gonadotropin sekretion er afgørende for korrekt follikulær udvikling og ægløsning, og det er reguleret af gonadotropin-frigive hormon (GnRH)1,2. Denne neuropeptid syntetiseres af neuroner spredt over hele basal diencephalon og udskilles derefter til portalen vaskulatur, der forbinder hypothalamus og den forreste hypofyse. GnRH-neuronernes sekretoriske aktivitet moduleres igen af synaptisk input, der opstår fra forskellige hjernestrukturer. Disse strukturer formidler oplysninger om tilstanden af organismens ydre og indre miljø, herunder tilgængeligheden af mad, længden af fotoperioden og koncentrationen af hormoner i blodet. I denne forstand former de hver arts reproduktive mønster, og de specifikke roller af sådanne strukturer skal bestemmes for korrekt at forstå de mekanismer, der styrer ægløsning. Som et eksempel har det vist sig, at udsvingene i estradiol niveauer i løbet af estrous cyklus regulerer udskillelsen af GnRH; GnRH-neuroner udtrykker dog ikke den estradiol receptorisoform, der er nødvendig for at opdage sådanne ændringer. To populationer af neuroner, der udtrykker disse receptorer, er placeret i rostralperiventrikulære region i den tredje ventrikel og i arcuatekernen og stablish synapser med GnRH-neuroner. Der er tegn på, at disse neuroner fortolker koncentrationen af estradiol og derefter stimulere aktiviteten af GnRH-neuroner ved at frigive kisspeptin, en potent induktor af GnRH sekretion3.

Eksperimenter med termiske eller kemiske læsioner samt mekanisk deafferentation tillod forskere at bestemme inddragelsen af flere hjernestrukturer i reguleringen af ægløsning4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Disse eksperimenter har imidlertid den ulempe at være invasive og traumatiske, der kræver flere dages genopretning, før de evaluerer virkningerne af behandlingen, hvilket hæmmer analysen af de akutte virkninger af behandlingen. Derudover påvirker de permanent de målrettede områder og forstyrrer andre fysiologiske processer på lang sigt. På grund af disse problemer er resultaterne af disse eksperimenter normalt tilsløret af de homøostatiske kompenserende mekanismer i dyrets krop, og det er ret vanskeligt at udtrække nøjagtige oplysninger om den tidsmæssige lovgivningsmæssige dynamik, som området er involveret i.

Mikroinjektionen af lægemidler, der forbigående forstyrrer neuronernes aktivitet gennem guide kanyler, er et passende alternativ, der overgår de ulemper, der er nævnt ovenfor. Kanylerne kan placeres i enhver hjerneregion ved en stereotaxisk kirurgi, så forskeren kan starte lægemiddelbehandlingen efter de forvirrende virkninger af operationen forsvinder. Den tidsmæssige mikroinjektion af lægemidlerne gør det muligt for forskere at teste hypoteser om regionens bidrag til et bestemt trin i processen og kan udføres hos vågen beherskede eller frit bevægende dyr. En række lægemidler, herunder lokalbedøvelse, agonister, antagonister, inverse agonister og biologiske toksiner såsom tetrodotoxin (TTX) kan mikroin injiceres i regionen af interesse på bestemte tidspunkter.

TTX er et biologisk toksin syntetiseret af bakterier, der lever i lunderfiskens krop samt andre hvirveldyr og hvirvelløse dyr. TTX gør neural aktivitet lydløs gennem selektiv og forbigående blokade af natriumkanaler, hvilket resulterer i hæmning af natriumafhængige handlingspotentialer. I nærværelse af TTX oplever cellerne en ændring i depolariseringsfasen og er derfor ikke spændende, men forbliver i live. Den blokerende virkning af TTX forklares ved dens molekylære sammensætning: en guanidiniumgruppe er i stand til at passere gennem natriumkanalens ekstracellulære aspekt, men resten af molekylet kan ikke passere på grund af dets størrelse, så det sidder fast og blokerer kanalen13,14,15,16,17 . TTX’s virkningsmekanisme gjorde det muligt at bruge den som et værktøj til at studere nervesystemet både in vitro og in vivo. Intracerebral injektion af dette toksin er blevet brugt til at studere den rolle diskrete hjerneområder i flere processer som hukommelse opbevaring18,søvn og ophidselse19, sted anerkendelse20,rumlig navigation21,stofmisbrug22, termoregulering23, udvikling af skizofreni24,seksuel adfærd25 og regulering af ægløsning26 blandt andet. I denne protokol beskriver vi virkningerne på ægløsning af den forbigående inaktivering af hypothalamus kerner ved TTX mikroinjektion hos vågen og uhæmmet rotter.

Protocol

Procedurer, der involverer dyr, blev godkendt af Den Etiske Komité for Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, UNAM. Denne institution opererer i nøje overensstemmelse med de mexicanske regler for håndtering af dyr, Official Norm: NOM-062-ZOO-1999, som er i overensstemmelse med internationale retningslinjer. 1. Opførelse af bilaterale kanyler Uddrag rustfrit stål akslen fra navet af to 23 G hypodermiske nåle ved hjælp af tryk pincet og derefter fjerne eventuelle resterende l…

Representative Results

Den ovenfor beskrevne protokol blev afprøvet ved at vurdere virkningerne af et enkelt TTX eller køretøj (kunstig cerebrospinalvæske; ACSF) mikroinjektion i en af to forskellige kerner, der vides at være involveret i reguleringen af ægløsning i rotten: suprachiasmatic og arcuatekernen. Den suprachiasmatiske kerne blev valgt, da den indeholder den centrale døgnrytmemager hos pattedyr. Det er involveret i reguleringen af cykliske begivenheder som udskillelse af gonadotropiner. Den arcuate kerne blev valgt, fordi den…

Discussion

Denne artikel beskriver en metode til at forbigående inaktivere, på et givet tidspunkt, en diskret region i hjernen af vågen og uhæmmet rotter. Der findes også en enkel metode til at spore deres estrøse cyklus og vurdere ægløsning. Denne protokol giver mulighed for en simpel analyse af specifikke hjerneområders bidrag til de mekanismer, der driver ægløsning ved at sammenligne ægløsningsresultatet af TTX-behandlede dyr med det køretøjsbehandlede dyr. Med undtagelse af det stereotaxiske instrument og mikroin…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi er taknemmelige for Raymond Sanchez på University of Washington for hans værdifulde hjælp i manuskriptredigering og for at M.Sc Georgina Cortés og M.Sc. Cintia Javier for deres tekniske støtte i standardiseringen af denne teknik. Vi er også taknemmelige for medlemmerne af dyrlægen tjenester på Facultad de Estudios Superiores Zaragoza: MVZ. Adriana Altamirano, MVZ. Roman Hernández og MVZ. Dolores-Elizabeth Guzmán for fremragende vedligeholdelse og pleje af forsøgsdyr. De eksperimenter, der er beskrevet i denne protokol, blev støttet af DGAPA-PAPIIT-bevillingsnummer: IN216015 og af CONACyT-tilskudsnummer: 236908 til Roberto Domínguez. Carlos-Camilo Silva er ph.d.-studerende fra Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) og støttes af Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Grant nummer: 294555).

Materials

10 μL Hamilton syringes Hamilton 80314
21 G x 1" stainless steel hypdermic needle BD 305165
23 G x 1" stainless steel hypdermic needle BD 305145
30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle BD 305106
Artificial cerebrospinal fluid BASi MD-2400
Bone trimer Fine Science Tools 16152-12
Burr for micro drill Fine Science Tools 19007-05
Clipper Wahl
Cut-off disc Dremel SM5010
Cutting tweezers Truper 17367
Cyanocrylate glue Kola loka K-1
Dental cement Nic Tone
Enrofloxasin Senosiain
Eosin Sigma E4009
Estereoscope Zeiss
Extra fine Bonn scissors Fine Science Tools 14084-08
Face mask Lanceta HG 60036
Graefe Forceps Fine Science Tools 11050-10
Hematoxilin Sigma H3136
Hemostats Fine Science Tools 13008-12
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Hydrochloric acid Sigma 320331
Hypromelose artificial tears Sophia Labs 8950015
Isoflurane Pisa Agropecuaria
Meloxicam Aranda 1183
Microinjection pump KD Scientific 788380
Monomer Nic Tone
Mototool Dremel 3000
Nitrile gloves Lanceta HG 69028
Non-Rupture Ear Bars David Kopf Instruments 855
Poly-L lysine Sigma P4707
Povidone-iodine Dermo Dine
Povidone-iodine with soap Germisin espuma
Pressure tweezers Truper 17371
Rat anesthesia mask David Kopf Instruments Model 906
Saline solution PISA
Scalpel Fine Science Tools 10004-13
Scalpel blade Fine Science Tools 10015-00
Sodium pentobarbital Pisa Agropecuaria
Standard electrode holder David Kopf Instruments 1770
Stainless steel wire American Orthodontic 856-612
Stereotaxic apparatus David Kopf Instruments Model 900LS
Surgical Sissors Fine Science Tools 14001-12
Teflon connectors Basi MD-1510
Teflon tubing Basi MF-5164
Tetrodotoxin Alomone labs T-500
Vaporizer Kent scientific VetFlo

References

  1. Herbison, A. E. Control of puberty onset and fertility by gonadotropin-releasing hormone neurons. Nature Reviews Endocrinology. 12 (8), 452-466 (2016).
  2. Fink, G., Conn, M., Freeman, E. Neuroendocrine Regulation of Pituitary Function. Neuroendocrinology in Physiology and Medicine. , 107-133 (2000).
  3. Herbison, A. E. The Gonadotropin-Releasing Hormone Pulse Generator. Endocrinology. 159 (11), 3723-3736 (2018).
  4. Morello, H., Taleisnik, S. Changes of the release of luteinizing hormone (LH) on the day of proestrus after lesions or stimulation of the raphe nuclei in rats. Brain Research. 360 (1-2), 311-317 (1985).
  5. Slusher, M. A., Critchlow, V. Effect of Midbrain Lesions on Ovulation and Adrenal Response to Stress in Female Rats. Experimental Biology and Medicine. 101 (3), 497-499 (1959).
  6. Sawyer, C. H., Haun, C. K., Hilliard, J., Radford, H. M., Kanematsu, S. Further Evidence for the Identity of Hypothalamic Areas Controlling Ovulation and Lactation in the Rabbit. Endocrinology. 73 (3), 338-344 (1963).
  7. Schiavi, R., Jutisz, M., Sakiz, E., Guillemin, R. Stimulation of Ovulation by Purified LH-Releasing Factor (LRF) in Animals Rendered Anovulatory by Hypothalamic Lesion. Experimental Biology and Medicine. 114 (2), 426-429 (1963).
  8. Bagga, N., Chhina, G. S., Mohan Kumar, V., Singh, B. Cholinergic activation of medial preoptic area by amygdala for ovulation in rat. Physiology & Behavior. 32 (1), 45-48 (1984).
  9. Barraclough, C. A., Yrarrazaval, S., Hatton, R. A Possible Hypothalamic Site of Action of Progesterone in the Facilitation of Ovulation in the Rat. Endocrinology. 75 (6), 838-845 (1964).
  10. Critchlow, V. Blockade of ovulation in the rat by mesencephalic lesions 1, 2. Endocrinology. 63 (5), 596-610 (1958).
  11. Terasawa, E., Wiegand, S. J. Effects of Hypothalamic Deafferentation on Ovulation and Estrous Cyclicity in the Female Guinea Pig. Neuroendocrinology. 26 (4), 229-248 (1978).
  12. Halász, B., Köves, K., Molnár, J. Neural control of ovulation. Human Reproduction. 3 (1), 33-37 (1988).
  13. Narahashi, T. Pharmacology of tetrodotoxin. Journal of Toxicology: Toxin Reviews. 20 (1), 67-84 (2001).
  14. Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. Tetrodotoxin blockage of sodium conductance increase in lobster giant axons. The Journal of General Physiology. 47 (5), 965-974 (1964).
  15. Narahashi, T., Deguchi, T., Urakawa, N., Ohkubo, Y. Stabilization and rectification of muscle fiber membrane by tetrodotoxin. American Journal of Physiology-Legacy Content. 198 (5), 934-938 (1960).
  16. Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiological Reviews. 54 (4), 813-889 (1974).
  17. Ritchie, J. M., Rogart, R. B. The binding of saxitoxin and tetrodotoxin to excitable tissue. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 79 (1), 1-50 (1977).
  18. Bermudez-Rattoni, F., Introini-Collison, I. B., McGaugh, J. L. Reversible inactivation of the insular cortex by tetrodotoxin produces retrograde and anterograde amnesia for inhibitory avoidance and spatial learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5379-5382 (1991).
  19. Tang, X., Yang, L., Liu, X., Sanford, L. D. Influence of Tetrodotoxin Inactivation of the Central Nucleus of the Amygdala on Sleep and Arousal. Sleep. 28 (8), 923-930 (2005).
  20. Klement, D., Pašt’alková, E., Fenton, A. A. Tetrodotoxin infusions into the dorsal hippocampus block non-locomotor place recognition. Hippocampus. 15 (4), 460-471 (2005).
  21. Conejo, N. M., Cimadevilla, J. M., González-Pardo, H., Méndez-Couz, M., Arias, J. L. Hippocampal Inactivation with TTX Impairs Long-Term Spatial Memory Retrieval and Modifies Brain Metabolic Activity. PLoS ONE. 8 (5), 64749 (2013).
  22. Grimm, J., Ronald, E. Dissociation of Primary and Secondary Reward-Relevant Limbic Nuclei in an Animal Model of Relapse. Neuropsychopharmacology. 22 (5), 473-479 (2000).
  23. Hasegawa, H., et al. Inhibition of the preoptic area and anterior hypothalamus by tetrodotoxin alters thermoregulatory functions in exercising rats. Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1458-1462 (2005).
  24. Meyer, F., Louilot, A. Early Prefrontal Functional Blockade in Rats Results in Schizophrenia-Related Anomalies in Behavior and Dopamine. Neuropsychopharmacology. 37 (10), 2233-2243 (2012).
  25. Rothfeld, J. M., Harlan, R. E., Shivers, B. D. Reversible disruption of lordosis via midbrain infusions of procaine and tetrodotoxin. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 25 (4), 857-863 (1986).
  26. Silva, C., Cortés, G. D., Javier, C. Y., Flores, A., Domínguez, R. A neural circadian signal essential for ovulation is generated in the suprachiasmatic nucleus during each stage of the estrous cycle. Experimental Physiology. , (2019).
  27. Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (7th Ed). , (2014).
  28. Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal Cytology of the Laboratory Rat and Mouse. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
  29. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS ONE. 7 (4), 35538 (2012).
  30. Wirtshafter, D., Asin, K., Kent, E. W. Simple technique for midline stereotaxic surgery in the rat. Physiology & Behavior. 23 (1), 409-410 (1979).
  31. Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).
  32. Kazim, S. F., Enam, S. A., Shamim, M. S. Possible detrimental effects of neurosurgical irrigation fluids on neural tissue: An evidence based analysis of various irrigants used in contemporary neurosurgical practice. International Journal of Surgery. 8 (8), 586-590 (2010).
  33. Miyajima, M., et al. Role of cerebrospinal fluid as perfusate in neuroendoscopic surgery: A basic investigation. Acta Neurochirurgica. 113, 103-107 (2012).
  34. Mori, K., et al. Potential risk of artificial cerebrospinal fluid solution without magnesium ion for cerebral irrigation and perfusion in neurosurgical practice. Neurologia Medico-Chirurgica. 53 (9), 596-600 (2013).
  35. Oka, K., Yamamoto, M., Nonaka, T., Tomonaga, M. The significance of artificial cerebrospinal fluid as perfusate and endoneurosurgery. Neurosurgery. 38 (4), (1996).
  36. James, T. A., Starr, M. S. Effects of the rate and volume of injection on the pharmacological response elicited by intraingral microapplication of drugs in the rat. Journal of Pharmacological Methods. 1 (3), 197-202 (1978).
  37. Freund, N., Manns, M., Rose, J. A method for the evaluation of intracranial tetrodotoxin injections. Journal of Neuroscience Methods. 186 (1), 25-28 (2010).
  38. Zhuravin, I. A., Bures, J. Extent of the tetrodotoxin induced blockade examined by pupillary paralysis elicited by intracerebral injection of the drug. Experimental Brain Research. 83 (3), 687-690 (1991).
  39. Myers, R. Injection of solutions into cerebral tissue: relation between volume and diffusion. Physiology and Behavior. 1 (2), 171-174 (1966).
  40. Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal of Visualized Experiments. (46), e2082 (2010).
  41. McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. J Neuroimmunol. 194 (1-2), 27-33 (2008).
  42. Cunningham, M. G., O’Connor, R. P., Wong, S. E. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of VisualizedExperiments. (13), e716 (2008).
  43. Akinori, A., Masamichi, S., Hiroshi, T. A new device for microinjection of drugs into the lower brain stem of conscious rats: Studies on site of action of morphine. Journal of Pharmacological Methods. 2 (4), 371-378 (1979).
  44. Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
  45. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  46. de Sousa, A. F., et al. Optogenetic reactivation of memory ensembles in the retrosplenial cortex induces systems consolidation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences. 116 (17), 8576-8581 (2019).
  47. Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).

Play Video

Cite This Article
Silva, C., Bolaños-Hurtado, M., Juárez-Tapia, C., Flores, A., Arrieta-Cruz, I., Cruz, M., Domínguez, R. Unraveling the Role of Discrete Areas of the Rat Brain in the Regulation of Ovulation through Reversible Inactivation by Tetrodotoxin Microinjections. J. Vis. Exp. (163), e61493, doi:10.3791/61493 (2020).

View Video