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Neuroscience

टेट्रोडोटॉक्सिन माइक्रोइंजेक्शन द्वारा रिवर्सिबल निष्क्रियता के माध्यम से ओव्यूलेशन के नियमन में चूहे मस्तिष्क के असतत क्षेत्रों की भूमिका को सुलझाना

Published: September 3, 2020 doi: 10.3791/61493
Automatic Translation
*1,2, *1, 4, 1,2, 3,5, 3, 1,2,3
1Chronobiology of Reproduction Research Lab, Biology of Reproduction Research Unit, Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Developmental Biology Lab, Biology of Reproduction Research Unit, Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, Universidad Nacional Autónoma de México, 3Neuroendocrinology Lab, Biology of Reproduction Research Unit, Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, Universidad Nacional Autónoma de México, 4Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Autónoma de México, 5Department of Basic Research, Instituto Nacional de Geriatria, Ministry of Health
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल कम लागत वाली माइक्रोइंजेक्शन प्रणाली के निर्माण, गहरे मस्तिष्क संरचनाओं में इसके स्टीरियोटैक्सिक प्रत्यारोपण और जाग और अनर्गल चूहों में टेट्रोडोटॉक्सिन के समय पर माइक्रोइंजेक्शन की प्रक्रिया का वर्णन करता है। लक्ष्य उनकी तंत्रिका गतिविधि को बाधित करके ओव्यूलेशन के नियमन में हाइपोथैलेमिक संरचनाओं की भागीदारी को प्रकट करना है।

Abstract

ओव्यूलेशन के नियमन में मस्तिष्क की भूमिका का अध्ययन करने के लिए कई प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों का उपयोग किया गया है। उदाहरणों में न्यूरोनल समूहों का घाव और बहरापन शामिल है, जो दोनों आक्रामक तरीके हैं जो स्थायी रूप से लक्ष्य क्षेत्र की अखंडता को ख़राब करते हैं। इन तरीकों के साथ संपाश्र्वक प्रभाव होते हैं जो तीव्र और लौकिक नियामक तंत्र के विश्लेषण को प्रभावित कर सकते हैं। विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों के उद्देश्य से गाइड कैनुलास का स्टीरियोटैक्सिक प्रत्यारोपण, एक वसूली अवधि के बाद, शोधकर्ताओं को सर्जरी के अवांछित प्रभावों के गायब होने के बाद विभिन्न दवाओं को माइक्रोजेक्ट करने की अनुमति देता है। टेट्रोडोटॉक्सिन का उपयोग विविध शारीरिक प्रक्रियाओं में कई मस्तिष्क क्षेत्रों की भूमिकाओं को निर्धारित करने के लिए किया गया है क्योंकि यह क्षणिक रूप से सोडियम-निर्भर कार्रवाई क्षमता को रोकता है, इस प्रकार लक्षित क्षेत्र में सभी तंत्रिका गतिविधि को अवरुद्ध करता है। यह प्रोटोकॉल इस विधि को एस्ट्रोस चक्र और ओव्यूलेशन के आकलन के लिए रणनीतियों के साथ जोड़ता है ताकि एस्ट्रोस चक्र के किसी भी चरण के विशेष समय में ओव्यूलेशन के नियमन में असतत मस्तिष्क क्षेत्रों की भूमिका को प्रकट किया जा सके। जाग और अनर्गल चूहों(Rattus norvegicus)अवरुद्ध प्रभाव है कि एनेस्थेटिक्स और तनाव हार्मोन अंडाशय पर लागू से बचने के लिए इस्तेमाल किया गया । इस प्रोटोकॉल को विभिन्न शारीरिक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए अन्य प्रजातियों, मस्तिष्क लक्ष्यों और औषधीय एजेंटों के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। इस विधि में भविष्य में सुधार में गाइड कैनुलास के बजाय छोटे व्यास के ग्लास केशिकाओं का उपयोग करके माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम का डिजाइन शामिल है। इससे प्रत्यारोपण के दौरान क्षतिग्रस्त ऊतकों की मात्रा कम हो जाएगी और लक्ष्य क्षेत्र के बाहर संचार दवाओं का प्रसार कम हो जाएगा।

Introduction

ओव्यूलेशन वह प्रक्रिया है जिसके द्वारा हर एस्ट्रोल/मासिक धर्म चक्र में एक बार अंडाशय से एक या अधिक परिपक्व ओसाइट्स जारी किए जाते हैं । चूंकि सभी स्तनधारी प्रजातियां नस्ल के लिए गेम्टे के उत्पादन पर निर्भर करती हैं, इसलिए ओव्यूलेशन को विनियमित करने वाले तंत्रों की समझ जैव चिकित्सा, पशुधन उद्योग और लुप्तप्राय प्रजातियों के रखरखाव से लेकर क्षेत्रों में बहुत बड़ा प्रभाव डालती है। ओव्यूलेशन को हाइपोथैलेमिक-पिट्यूटरी-ओवेरियन एक्सिस द्वारा विनियमित किया जाता है, जिसमें कई हाइपोथैलेमिक और अतिरिक्त हाइपोथैलेमिक क्षेत्र शामिल हैं, पूर्वकाल पीयूष और थेका और ग्रैनुलोसा कोशिकाओं में गोंडोट्रोप्स जो ओसाइट्स के साथ, अंडाशय के अंदर अंडाशय के रोम बनाते हैं1।

ओवेरियन रोम बढ़ने, विकसित और अंततः कूप उत्तेजक हार्मोन और ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन के टॉनिक और चरणबद्ध स्राव के जवाब में अंडाशय, दो गोंडोडोपिंस गोंडोट्रॉप द्वारा स्रावित। गोंडोट्रोपिन स्राव का पैटर्न उचित कूप विकास और ओव्यूलेशन के लिए निर्णायक है और इसे गोंडोट्रोपिन-रिलीजिंग हार्मोन (जीएनआरएच)1, 2द्वारा विनियमित कियाजाताहै। इस न्यूरोपेप्टाइड को बेसल डाइएनसेफेलॉन में बिखरे हुए न्यूरॉन्स द्वारा संश्लेषित किया जाता है और फिर पोर्टल वेक्यूलेचर में स्रावित किया जाता है जो हाइपोथैलेमस और पूर्वकाल पिट्यूटरी को जोड़ता है। जीएनआरएच-न्यूरॉन्स की गुप्त गतिविधि बदले में विविध मस्तिष्क संरचनाओं से उत्पन्न होने वाले सिनैप्टिक इनपुट द्वारा संग्राहक होती है। ये संरचनाएं भोजन की उपलब्धता, फोटोपीरियोड की लंबाई और रक्त में हार्मोन की एकाग्रता सहित जीव के बाहरी और आंतरिक वातावरण की स्थिति के बारे में जानकारी व्यक्त करती हैं। इस अर्थ में, वे प्रत्येक प्रजाति के प्रजनन पैटर्न को आकार देते हैं और ओव्यूलेशन को नियंत्रित करने वाले तंत्रों को ठीक से समझने के लिए ऐसी संरचनाओं की विशिष्ट भूमिकाओं का निर्धारण किया जाना चाहिए। एक उदाहरण के रूप में, यह दिखाया गया है कि एस्ट्रोस चक्र के दौरान एस्ट्रोडियोल के स्तर में उतार-चढ़ाव जीएनआरएच के स्राव को नियंत्रित करता है; हालांकि, जीएनआरएच-न्यूरॉन्स ऐसे बदलावों का पता लगाने के लिए आवश्यक एस्ट्रडिओल रिसेप्टर आइसोफॉर्म को व्यक्त नहीं करता है। इन रिसेप्टर्स को व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स की दो आबादी तीसरे वेंट्रिकल के रोस्ट्रल पेरिवेनेट्रिकर क्षेत्र में और क्रमशः आर्क्यूएट न्यूक्लियस में स्थित हैं, और जीएनआरएच-न्यूरॉन्स के साथ स्टैबलिश सिनेप्स हैं। यह सुझाव देने के लिए सबूत हैं कि ये न्यूरॉन्स एस्ट्राडिओल की एकाग्रता की व्याख्या करते हैं और फिर जीएनआरएच स्राव3के एक शक्तिशाली प्रेरक किस्पेप्टिन को रिहा करके जीएनआरएच-न्यूरॉन्स की गतिविधि को उत्तेजित करते हैं।

तार्मिक या रासायनिक घावों के साथ-साथ यांत्रिक बहराधवहार से जुड़े प्रयोगों ने शोधकर्ताओं को ओव्यूलेशन4, 5,6,7,8,9,10, 11,12 के नियमन में कई मस्तिष्क संरचनाओं की भागीदारी निर्धारित करने की अनुमतिदी। . हालांकि, इन प्रयोगों में आक्रामक और दर्दनाक होने का नुकसान होता है, उपचार के प्रभावों का मूल्यांकन करने से पहले कई दिनों की वसूली की आवश्यकता होती है, उपचार के तीव्र प्रभावों के विश्लेषण में बाधा डालते हैं। इसके अलावा, वे स्थायी रूप से लक्षित क्षेत्रों को प्रभावित करते हैं और लंबी अवधि में अन्य शारीरिक प्रक्रियाओं को बाधित करते हैं। इन समस्याओं के कारण, इन प्रयोगों के परिणाम आमतौर पर जानवर के शरीर में होमोस्टेटिक प्रतिपूरक तंत्र से अस्पष्ट होते हैं और लौकिक नियामक गतिशीलता के बारे में सटीक जानकारी निकालते हैं जिसमें क्षेत्र शामिल है बल्कि मुश्किल है।

गाइड कैनुलास के माध्यम से न्यूरॉन्स की गतिविधि को बाधित करने वाली दवाओं का माइक्रोइंजेक्शन एक उपयुक्त विकल्प है जो ऊपर उल्लिखित नुकसान से बढ़कर है। कैनुलास को स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी द्वारा किसी भी मस्तिष्क क्षेत्र में रखा जा सकता है, जिससे शोधकर्ता को सर्जरी के जटिल प्रभाव गायब होने के बाद दवा उपचार शुरू करने की अनुमति मिल सकती है। दवाओं का समय पर माइक्रोइंजेक्शन शोधकर्ताओं को प्रक्रिया के एक विशेष कदम के लिए क्षेत्र के योगदान के बारे में परिकल्पनाओं का परीक्षण करने की अनुमति देता है और जाग संयमित या मुक्त चलती जानवरों में किया जा सकता है । स्थानीय एनेस्थेटिक्स, एगोनिस्ट, विरोधी, विलोम एगोनिस्ट और टेट्रोडोटॉक्सिन (टीटीएक्स) जैसे जैविक विषाक्त पदार्थों सहित विभिन्न प्रकार की दवाओं को विशिष्ट समय पर ब्याज के क्षेत्र में माइक्रोइंजेक्टेड किया जा सकता है।

टीटीएक्स एक जैविक विष है जो पफरफिश के शरीर में रहने वाले बैक्टीरिया के साथ-साथ अन्य कशेरुकी और अकशेरुकी से संश्लेषित होता है। टीटीएक्स सोडियम चैनलों की चयनात्मक और क्षणिक नाकाबंदी के माध्यम से तंत्रिका गतिविधि को मौन करता है, जिसके परिणामस्वरूप सोडियम-निर्भर कार्रवाई क्षमता का अवरोध होता है। टीटीएक्स की उपस्थिति में, कोशिकाएं डीपोलराइजेशन चरण में परिवर्तन का अनुभव करती हैं और इस प्रकार उत्तेजनीय नहीं होती हैं लेकिन जीवित रहती हैं। टीटीएक्स के अवरुद्ध प्रभाव को इसकी आणविक संरचना द्वारा समझाया गया है: एक ग्वानिडिनियम समूह सोडियम चैनल के बाह्रात्म पहलू से गुजरने में सक्षम है, लेकिन बाकी अणु इसके आकार के कारण पारित नहीं हो सकते हैं, इसलिए यह अटक गया है और चैनल13,14,15,16, 17 को ब्लॉक करता है . टीटीएक्स की कार्रवाई के तंत्र ने विट्रो और वीवो दोनों में तंत्रिका तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में इसके उपयोग की अनुमति दी। इस विष के इंट्रासेरेब्रल इंजेक्शन का उपयोग स्मृति प्रतिधारण 18, नींद और उत्तेजना 19, स्थान मान्यता 20, स्थानिकनेविगेशन21,नशीली दवाओं के दुरुपयोग22,थर्मोरेगुलेशन23,सिजोफ्रेनिया के विकास24,यौन व्यवहार25 और ओव्यूलेशन26 के विनियमन जैसी कई प्रक्रियाओं में असतत मस्तिष्क क्षेत्रों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए किया गया है। दूसरों के बीच। इस प्रोटोकॉल में हम जाग और अनर्गल चूहों में टीटीएक्स माइक्रोइंजेक्शन द्वारा हाइपोथैलेमिक नाभिक के क्षणिक निष्क्रियता के अंडाशय पर प्रभाव का वर्णन करते हैं।

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Protocol

जानवरों से जुड़ी प्रक्रियाओं को मुखाल्टाड डी एस्टुडियोस सुपीरियर्स जरगोज़ा, यूएनएएम की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था । इस संस्था पशु हैंडलिंग के लिए मैक्सिकन नियमों के साथ सख्त अनुसार संचालित, सरकारी आदर्श: NOM-062-ZOO-१९९९, जो अंतरराष्ट्रीय दिशा निर्देशों के साथ सहमत हैं ।

1. द्विपक्षीय कैनुलास का निर्माण

  1. दबाव चिमटी का उपयोग कर दो 23 जी हाइपोडर्मिक सुइयों के हब से स्टेनलेस स्टील शाफ्ट निकालें और फिर एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर किसी भी शेष गोंद को हटा दें।
  2. एक ठीक स्थायी मार्कर के साथ शाफ्ट के कुंद अंत के अलावा एक लाइन 15 मिमी ड्रा। beveled सिरों को हटाने के लिए चिमटी काटने का उपयोग करें।
  3. 15 मिमी खंडों को ठीक हीमोस्टैट्स के साथ रखें और उन्हें एक रोटेसरी टूल से जुड़ी कट-ऑफ डिस्क के साथ लंबवत दबाएं जब तक कि ट्यूबिंग के 14 मिमी खंड प्राप्त न हो जाएं। यह कदम शाफ्ट के ऑक्सक्यूड हिस्से को खत्म करने के लिए किया जाता है, जिससे खुले और कुंद सिरों का निर्माण होता है। अंत में, किसी भी आंतरिक बाधा को खत्म करने के लिए खंडों के माध्यम से एक 30 जी सुई डालें।
  4. मस्तिष्क के एटलस27की सहायता से मस्तिष्क के बाएं और दाएं गोलार्धों में रुचि की संरचनाओं के बीच की दूरी निर्धारित करें । माइक्रोस्कोप स्लाइड करने के लिए दो 14 मिमी खंडों को संलग्न करने के लिए मोल्डिंग मिट्टी का उपयोग करें और यह सुनिश्चित करें कि दोनों एक ही क्षैतिज स्तर पर हैं। एक नेत्र माइक्रोमीटर (10x) के माध्यम से निरीक्षण करें और वांछित दूरी प्राप्त होने तक ठीक चिमटी के साथ खंडों को समायोजित करें।
  5. 2:1 अनुपात में 10% हाइड्रोक्लोरिक एसिड के साथ मिलाएं मिलाएं सोल्डर पेस्ट करें और खंडों के कुंद अंत के नीचे मिश्रण 2 मिमी की एक बूंद जोड़ें। मिलाप दोनों खंडों में सोल्डरिंग आयरन और 0.5 मिमी व्यास के सोल्डर तार का उपयोग करके एक ही बिंदु के साथ। सुनिश्चित करें कि मिलाप खंडों के ल्यूमेन में बाधा न डालता है।
  6. लचीला 0.3 मिमी स्टेनलेस स्टील तार के 10 मिमी खंड को काटकर स्टीरियोटैक्सिक धारक को कैनुला संलग्न करने के लिए एक समर्थन बनाएं। पिछले मिलाप बिंदु के संपर्क में तार के 2 मिमी जगह और कैनुलास के कुंद अंत के ऊपर बिछाने बाकी के लिए मोल्डिंग मिट्टी का उपयोग करें। कन्नूला को तार मिलाप।
  7. मिलाप पेस्ट की अधिकता को दूर करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ कैनुलास की सतह को साफ करें। धातु के कणों को हटाने के लिए बाँझ पानी के साथ कैनुलास के इंटीरियर फ्लश। इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि 10x आवर्धन पर माइक्रोस्कोप के नीचे कोई कण नहीं पाया जा सकता है।

2. ऑब्स्टरेटर और कैप का निर्माण

  1. ऑबर्टेटर बनाने के लिए गोल स्टेनलेस-स्टील सॉफ्ट वायर (0.35 मिमी व्यास) के दो 16 मिमी खंडों को काटा। हीमोस्टैट्स के साथ एक द्विपक्षीय कैनुला पकड़ें, एक प्रयोगशाला पीठ के लंबवत, और इनमें से एक खंड को प्रत्येक कैनुला में तब तक डालें जब तक कि वे बेंच तक न पहुंच जाएं। अवशेष को 90 डिग्री कोण पर मोड़ें।
  2. कैप्स के लिए सिलिकॉन ट्यूबिंग (आंतरिक व्यास = 0.76 मिमी) के दो 2 मिमी खंडों को काट दें और प्रत्येक खंड के सिरों में से एक पर सिलिकॉन गोंद की एक बूंद लागू करें। गोंद को टयूबिंग में प्रवेश न करने दें। कम से कम 24 घंटे तक सूखने दें।

3. माइक्रोइंजेक्टर का निर्माण

  1. शाफ्ट बनाने के बजाय 30 ग्राम हाइपोडर्मिक सुइयों का उपयोग करके चरण 1.1 दोहराएं।
  2. शाफ्ट के कुंद अंत के अलावा एक लाइन 18.5 मिमी ड्रा करें और चिमटी काटने के साथ बेवेल्ड सिरों के अवशेष को हटा दें।
  3. कुंद अंत से शुरू होने वाले दो 6 मिमी लंबे खंडों को काटकर एडाप्टर बनाने के लिए एक एकल 23 जी सुई के साथ चरण 1.1 दोहराएं।
  4. 6 मिमी खंडों के ओसीलेड भागों को कट-ऑफ डिस्क के खिलाफ लंबवत दबाकर तब तक समाप्त करें जब तक कि दो 4 मिमी एडाप्टर प्राप्त न हो जाएं। किसी भी आंतरिक बाधा को खत्म करें।
  5. एडाप्टर्स में 30 जी सेगमेंट के बेवल्ड एंड डालें। यह सुनिश्चित करने के लिए एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के माध्यम से देखें कि दोनों, खंडों और एडाप्टर का अंत एक ही स्तर पर है। कपास के झाड़ू का उपयोग करके डिस्टल संयुक्त पर साइनोएक्रिलेट गोंद लगाएं और 15 मिनट तक सूखने दें।
  6. 5 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में दो टेफ्लॉन ट्यूबिंग कनेक्टर सोख लें और फिर उन्हें एडाप्टर के माध्यम से माइक्रोइंजेक्टर से जोड़ें। जब तक कनेक्टर का व्यास कम से कम 24 घंटे तक सिकुड़ न जाए और फिर कनेक्टर्स के नुकसान से बचने के लिए कम तापमान विधि के साथ माइक्रोइंजेक्टर को स्टरलाइज न करें (एथिलीन ऑक्साइड नसबंदी की सिफारिश की जाती है)।

4. पशु रखरखाव और योनि स्मीयर

  1. 230 और 260 ग्राम के बीच वजनी चक्रीय वयस्क मादा हुड चूहों(रैटस नॉर्वेजिकस,सीआईआईजेड-वी तनाव) का उपयोग करें। 14:10 प्रकाश-अंधेरे फोटोपीरियोड के साथ एक कमरे में मानक पॉलीप्रोपाइलीन पिंजरों में चार के समूहों में चूहों को घर दें। तापमान और आर्द्रता क्रमशः 2 डिग्री सेल्सियस ± 2 डिग्री सेल्सियस और 40% पर निर्धारित करें। भोजन और पानी विज्ञापन लिबिटमप्रदान करें ।
  2. हर दिन 10:00 और 12:00 घंटे के बीच योनि स्मीयर लें।
    1. एक अल्कोहल लैंप का उपयोग करके 1 मिमी के आंतरिक व्यास के साथ एक संशोधित जीवाणु पाश को बाँझ करें और इसे बाँझ पानी से ठंडा करें। चूहे को एक सुरक्षित पकड़ के साथ पकड़ें और इसकी आंतरिक दीवारों को छूते हुए योनि में 5 मिमी जीवाणु पाश पेश करें। जीवाणु पाश निकालें। यदि सफल, एक बादल ड्रॉप टिप पर देखा जाएगा । इस बूंद को माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखें।
    2. प्रत्येक चूहे की नसबंदी और प्रत्येक जानवर के बीच पाश ठंडा करने के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
    3. बूंदों के सूखने के बाद, हेमटॉक्सीलिन-इओसिन के साथ दाग और 10x पर एक माइक्रोस्कोप के तहत नमूनों का निरीक्षण करें।
    4. प्रत्येक धब्बा पर ल्यूकोसाइट्स, एपिथेलियल न्यूक्लियेटेड कोशिकाओं और केराटिनाइज्ड कोशिकाओं के अनुपात का निर्धारण करें और इसे चित्र 1में सूचित एस्ट्रोस चक्र चरणों के मानदंडों के अनुसार वर्गीकृत करें, जो पिछले साहित्य28,29से सहमत हैं ।

5. कैनुलास का स्टीरियोटैक्सिक प्रत्यारोपण

नोट: एक नियमित रूप से एसेप्टिक स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी के बाद कैनुलास के प्रत्यारोपण और संस्थागत मानदंडों का पालन करें।

  1. सर्जरी से पहले
    1. एक भाप ऑटोक्लेव का उपयोग कर सर्जरी से पहले सर्जिकल उपकरणों, कैनुला, सर्जिकल शिकंजा, ऑब्यूटरेटर, धुंध और लकड़ी के कपास झाड़ू 24 घंटे को निष्फल करें। लगातार सर्जरी के बीच धातु उपकरणों के सुझावों को 10% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ साफ करके पानी के बाद और फिर उन्हें एक गर्म मनका स्टरलाइजर में रखें।
    2. होमरूम से जानवर को हटाने से पहले काम करने वाले क्षेत्रों और स्टीरियोटैक्सिक इंस्ट्रूमेंट तैयार करें। प्रक्रिया के दौरान संदूषण से बचने के लिए सर्जरी टेबल से जहां तक संभव हो, उस क्षेत्र में सर्जरी के लिए जानवर तैयार करें।
    3. तैयारी और सर्जरी क्षेत्रों को 70% इथेनॉल के साथ साफ करें और इसके बाद दस मिनट के लिए 10% क्लोराइड समाधान का आवेदन करें। 70% इथेनॉल के साथ स्टीरियोटैक्सिक इंस्ट्रूमेंट के बेस, फ्रेम और जोड़तोड़ को साफ करें और सर्जरी से पहले गर्म मनका स्टरलाइजर का उपयोग करके कान की सलाखों के सुझावों को स्टरलाइज करें और उन्हें हवा में ठंडा करें।
    4. एक समर्पित प्रयोगशाला कोट, फेस मास्क, हेड बोनट, सर्जिकल आस्तीन, जूता कवर और सर्जिकल दस्ताने पहने हुए सर्जरी करें। सहायक को सर्जरी के लिए जानवरों को तैयार करने और प्रक्रिया के दौरान उनकी सामान्य स्थिति की जांच करने के लिए कहें।
    5. स्टीरियोटैक्सिक धारक को कैनुला संलग्न करें। सहायक को कमरे में संचालित करने के लिए पहले जानवर लाने के लिए कहें। सर्जरी के लिए डाइस्ट्रस में चूहों का चयन करें, क्योंकि हमारी प्रयोगशाला से टिप्पणियों से संकेत मिलता है कि ये जानवर अन्य चरणों में संचालित चूहों की तुलना में उचित एस्ट्रोस चक्र जल्दी ठीक हो जाते हैं, शायद इसलिए कि तनाव की प्रतिक्रिया एस्ट्रोस चक्र के साथ बदलती है।
    6. जानवर का वजन करें, और एक आइसोफ्लोरैन वाष्पीकरण से जुड़े चूहों के लिए एक इंडक्शन चैंबर के अंदर 100% ऑक्सीजन में 4% आइसोफ्लोरैन के साथ संज्ञाहरण को प्रेरित करें। जानवरों पर जोर देने से बचने के लिए, कक्ष को प्रीफिल न करें। छात्र फैलाव और दर्द के नुकसान की जांच करके संज्ञाहरण के एक सर्जिकल विमान की पुष्टि करें, जैसा कि पूंछ और कान चुटकी परीक्षणों द्वारा मापा जाता है, जिसके बाद आप सही पलटा के नुकसान का निरीक्षण करते हैं।
      1. यदि आइसोफ्लुन वाष्पीकरण उपलब्ध नहीं है तो केटामाइन (100 मिलीग्राम/किलो) और जाइलाज़ीन (10 मिलीग्राम/किलो) के मिश्रण के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा चूहे को एनेस्थेटाइज करें।
    7. प्रेरण कक्ष से चूहे को हटा दें और 100% ऑक्सीजन में 2.5% आइसोफ्लुन के साथ संज्ञाहरण के प्रभाव को बनाए रखने के लिए तैयारी तालिका में नाक शंकु का उपयोग करें। क्लिपर के साथ खोपड़ी के बालों को ट्रिम करें और एक लिंट रोलर के साथ ढीले बालों को हटा दें। क्रमशः एक गैर स्टेरॉयड विरोधी भड़काऊ/एनाल्जेसिक और एंटीबायोटिक के रूप में 2 मिलीग्राम/किलो मेलोक्सिकम और 5 मिलीग्राम/किलो एन्रोफ्लोक्सेसिन की एक प्रीऑपरेटिव चमड़े के नीचे की खुराक इंजेक्ट करें ।
      1. सर्जरी के दौरान विचेशन से बचने के लिए प्रत्येक आंख में हाइड्रोमेलोज कृत्रिम आंसू लगाएं।
    8. गैर-टूटना कान सलाखों और एक संज्ञाहरण मुखौटा का उपयोग कर एक वार्मिंग पैड के ऊपर स्टीरियोटैक्सिक उपकरण में जानवर माउंट। यह सुनिश्चित करने के लिए नाक क्लैंप को समायोजित करें कि जानवर का सिर सपाट है। एक बार पोविडोन-आयोडीन और 70% इथेनॉल के साथ पोविडोन-आयोडीन के बीच बारी-बारी से मुंडा क्षेत्र में एक सर्जिकल स्क्रब करें और फिर दो बार पोविडोन-आयोडीन और 70% इथेनॉल का उपयोग करें। प्रक्रिया के दौरान जानवर के तापमान को रिकॉर्ड करने के लिए एक गुदा थर्मामीटर डालें और फिर इसे बाँझ शल्य क्षेत्र के साथ कवर करें।
  2. सर्जरी के दौरान
    1. मुंडा क्षेत्र के बीच में त्वचा और मांसपेशियों में 2 सेमी चीरा बनाने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें। ब्रेग्मा या लैम्ब्डा को प्रकट करने के लिए 2% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ लेपित कपास झाड़ू का उपयोग करके खोपड़ी से पेरिओस्टियम निकालें, लक्ष्य निर्देशांक की गणना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले स्थलों का उपयोग किया जाएगा। लैंडमार्क के बेहतर दृश्य के लिए खोपड़ी को हवा से सुखाएं।
    2. कैनुला को सीधे पसंद के लैंडमार्क से ऊपर की स्थिति में ले जाने के लिए स्टीरियोटैक्सिक इंस्ट्रूमेंट के जोड़तोड़ का उपयोग करें। पूर्वकाल-पीछे और मध्य-पार्श्व निर्देशांक को स्टीरियोटैक्सिक उपकरण से पंजीकृत करें और मस्तिष्क एटलस27के अनुसार लक्ष्य क्षेत्र के निर्देशांक की गणना करने के लिए उनका उपयोग करें।
    3. गणना निर्देशांक को स्टीरियोटैक्सिक उपकरण में सेट करें और खोपड़ी की सतह पर कैनुला की नोक रखें। पृष्ठीय-वेंट्रल समन्वय को पंजीकृत करें और इसका उपयोग लक्ष्य क्षेत्र में गहराई की गणना करने के लिए करें।
    4. इसे फ्रेम से अनस्क्रूव करके मैनिपुलेटर की बांह निकालें। 15,000 आरपीएम की गति से एक रोटेटरी उपकरण से जुड़े एक दंत बर्र का उपयोग करें ताकि उस जगह पर निशान बनाया जा सके जहां क्रैनिओटॉमी किया जाएगा। फिर तीन छेद बनाने के लिए बर्र का उपयोग करें, निशान के चारों ओर एक समभुज त्रिकोण बनाते हैं। इन छेदों खोपड़ी छेद नहीं होना चाहिए। शल्य चिकित्सा शिकंजा को छेद में डालें, यह सुनिश्चित करते हुए कि वे कसकर रखे गए हैं।
    5. प्रत्येक गोलार्द्ध में लक्षित क्षेत्रों के बीच की दूरी को समायोजित करने के लिए क्रैनियोटॉमी को पर्याप्त रूप से चौड़ा बनाएं। यह संभव के रूप में व्यास में के रूप में छोटा होना चाहिए, लेकिन काफी बड़ा खोपड़ी की सीमाओं को छूने के बिना कैनुला को कम करने की अनुमति है, क्योंकि यह प्रक्षेपवक्र को संशोधित करेगा । क्रैनिओटॉमी को धीरे-धीरे करें, सबसे कम दबाव को लागू करें। कृंतक खोपड़ी सिर्फ कुछ मिलीमीटर मोटी है और यह नीचे ऊतकों की अखंडता को बनाए रखने के लिए निर्णायक है।
    6. एक बार ड्यूरा मेटर दिखाई देने के बाद, हड्डी के किरचों को हटाने और मेनिंग्स में एक पूर्वकाल-पीछे कटौती करने के लिए 90 डिग्री कोण पर घुमावदार टिप के साथ एक बाँझ 21 जी सुई का उपयोग करें। यदि लक्ष्य क्षेत्र मिडलाइन के करीब स्थित है तो बेहतर सैजिटल साइनस को नुकसान से बचने के लिए Wirtshafter और सहयोगियों30 तकनीक का उपयोग करें।
      1. धारक को फ्रेम में कैनुला के साथ रखें और वेंट्रल समन्वय तक पहुंचने के लिए पृष्ठीय-वेंट्रल मैनिपुलेटर का उपयोग करें। चेक करें कि उतरते समय सुई सीमाओं को न छुए और जरूरत पड़ने पर क्रेनियोटॉमी का व्यास बढ़ाएं।
        नोट: यह महत्वपूर्ण है कि गाइड कैनुलास की नोक ब्याज के क्षेत्र से ऊपर 0.5 से 2.0 मिमी तक के क्षेत्र को लक्षित करता है। यह विदेशी निकायों की शुरूआत और ऊतक के विनाश के जवाब में मस्तिष्क की भड़काऊ प्रतिक्रिया के कारण है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है यदि ब्याज का क्षेत्र छोटा है और काम की दूरी की गणना पहले से अनुभवजन्य रूप से की जानी चाहिए ।
    7. खोपड़ी को कैनुला संलग्न करने के लिए दंत सीमेंट लागू करें और इसे सूखने दें। सुनिश्चित करें कि दंत सीमेंट कैनुला के कुंद अंत को कवर नहीं करता है क्योंकि यह अपरिवर्तनीय रूप से इसे बाधित करेगा। तब तक इंतजार करें जब तक सीमेंट पूरी तरह से जम न जाया न जाया न हो।
    8. आगे की बाधाओं से बचने के लिए और अध्ययन के दौरान पितृसत्ती सुनिश्चित करने के लिए ऑब्स्टरेटर डालें। संदूषण से बचने के लिए सिलिकॉन कैप पर रखो।
  3. सर्जरी के बाद
    1. एक शारीरिक तापमान पर बाँझ नमकीन समाधान के 1.0 एमएल के एक इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा खोए हुए तरल पदार्थ को बदलें। जानवर को थर्मल सपोर्ट के साथ रिकवरी पिंजरे में रखें जब तक कि यह संज्ञाहरण से ठीक न हो जाए। समय-समय पर जानवर के तापमान और चूल्हा/श्वसन दर की जांच करें। आइसोफ्लुन प्रभाव गैस प्रवाह के व्यवधान के बाद कुछ मिनटों के लिए रहता है जबकि केटामाइन/जाइलाज़ीन प्रभाव 40-50 मिनट तक रहता है ।
    2. 48-72 घंटे के लिए एंटीबायोटिक, एनाल्जेसिक और एंटी-भड़काऊ दवाओं (पहले बताए गए एक ही खुराक और मार्गों पर) के पोस्ट-ऑपरेटिव इंजेक्शन प्रदान करें और बाकी प्रयोग के लिए दैनिक आधार पर जानवरों का बारीकी से निरीक्षण करें। पशु चिकित्सक सेवाओं या प्रयोगशाला के एक प्रशिक्षित सदस्य को दर्द, तनाव या वजन के नुकसान के किसी भी संकेत की रिपोर्ट करें । इस अवधि के दौरान चूहों के लिए कोई अन्य हेरफेर न करें।
    3. पोस्ट-ऑपरेटिव उपचार के बाद योनि स्मीयर लेना शुरू करें और इसे तब तक जारी रखें जब तक कि जानवर चार दिनों के लगातार तीन एस्ट्रोस चक्रों को न दिखा सके।
      नोट: क्रोनिक जुगुलर कैथेटर शल्य चिकित्सा प्रत्यारोपित किया जा सकता है, शोधकर्ता धारावाहिक रक्त के नमूने लेने के लिए इस तरह के एस्ट्रोडिओल, प्रोजेस्टेरोन, टेस्टोस्टेरोन, ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन, कूप उत्तेजक हार्मोन और कोर्टिकोस्टेरोन के रूप में हार्मोन के स्राव का विश्लेषण करने की अनुमति । हम इस तरह के एक कैथेटर रखने की सलाह देते हैं एक बार जानवर मस्तिष्क सर्जरी से ठीक हो जाता है, क्योंकि यह जीवित रहने की दर में सुधार होगा, जबकि कैथेटर के क्लोजिंग से भी परहेज करता है जो एक विस्तारित वसूली समय से परिणाम दे सकता है।

6. टेट्रोडोटॉक्सिन हैंडलिंग और समाधान की तैयारी

सावधानी: टीटीएक्स सबसे जहरीले पदार्थों में से एक है जिसे जाना जाता है। यह कंकाल की मांसपेशियों और तंत्रिका ऊतक पर कार्य करता है। संपर्क से नशा की संभावना नहीं है लेकिन किसी भी खुले घाव शरीर में टीका लगाने के लिए एक संभावित मार्ग है। टीटीएक्स के साथ काम करते समय मुख्य चिंताएं तेज उपकरणों के साथ त्वचा का पंचर होती हैं जो विष और एयरोसोल की पीढ़ी के संपर्क में रही हैं जो मुंह, आंखों और म्यूकस झिल्ली तक पहुंच सकती हैं। खुराक के आधार पर, TTX घातक हो सकता है अगर सांस, निगल लिया या त्वचा द्वारा टीका लगाया । इससे आंखों में तेज जलन होगी। एलडी50 का मौखिक और नसों में प्रशासन द्वारा चूहों में परीक्षण किया गया है और यह क्रमश 334 माइक्रोग्राम/किलोग्राम और 73 माइक्रोग्राम/किलोग्राम है। इस समय कोई एंटीटॉक्सिन उपलब्ध नहीं है।

नोट: निष्क्रिय पदार्थ 0.25 एन नाओएच, या 10% ब्लीच समाधान के साथ या बिना 1.0% नाओसीएल है। पूर्ण निष्क्रियता 30 मिनट के संपर्क के बाद होती है। टीटीएक्स को 10% से कम एकाग्रता पर, ऑटोक्लेविंग द्वारा और न ही 500 डिग्री एफ से कम तापमान पर शुष्क गर्मी नसबंदी द्वारा पूरी तरह से निष्क्रिय नहीं किया जा सकता है। टीटीएक्स से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को दो जानकार व्यक्तियों द्वारा किया जाना चाहिए जो नाइट्रिल दस्ताने, समर्पित प्रयोगशाला कोट, सुरक्षा चश्मा, डिस्पोजेबल फेस मास्क, बंद जूते और पूर्ण लंबाई पैंट के आंतरिक और बाहरी जोड़े पहने हुए हैं।

  1. स्टॉक समाधान की तैयारी
    1. एक पैड रखें जो फैल के मामले में प्रदूषण को रोकने के लिए धुएं के हुड में निष्क्रिय पदार्थ से लथपथ हो। सुनिश्चित करें कि धूम हुड शुरू करने से पहले ठीक से काम कर रहा है। पिपेट टिप्स के निपटान के लिए निष्क्रिय समाधान के साथ एक गोदाम तैयार करें।
    2. इस प्रक्रिया में शीशी की दीवारों को नीचे धोने वाले कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ के साथ बेहद सावधान और धीमी गति से टिटरेशन द्वारा निर्माता निर्देशों के अनुसार रेशपेंड बाँझ टीटीएक्स साइट्रेट ल्योफिलाइज्ड पाउडर। फोम और एयरोसोल के बनने से बचें। टीटीएक्स समाधान के प्रदूषण से बचने के लिए एक एसेप्टिक तकनीक का पालन करें क्योंकि इसे जीवित जानवरों के मस्तिष्क में इंजेक्ट किया जाएगा। यदि आपके टीटीएक्स शीशियों में एयरोसोल गठन को रोकने के लिए बाहरी झिल्ली है तो माइक्रोपिपेट के बजाय सुई के साथ सिरिंज का उपयोग करें।
    3. स्टॉक समाधान को बाँझ माइक्रो ट्यूबों में अलीकोट करें। एलिकोट्स को यथासंभव छोटा बनाएं क्योंकि ठंड/विगलन चक्र अणुओं की स्थिरता को बदल सकते हैं । आधे से अधिक ट्यूबों को न भरें क्योंकि जमे हुए होने पर पानी की मात्रा बढ़ जाती है, जिससे ढक्कन खुल सकता है और ट्यूब और कंटेनर में संग्रहित अन्य नमूनों का संदूषण हो सकता है।
    4. ट्यूबों और सतहों के बाहरी हिस्से को दूषित करें जहां सक्रिय पदार्थ के साथ टीटीएक्स का उपयोग किया जाता था। एक माध्यमिक कंटेनर के अंदर एक शीशी बॉक्स में -20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को स्टोर करें।
  2. एक काम एकाग्रता के लिए शेयर समाधान को कमजोर करना
    1. जिस दिन पतला समाधान कम स्थिर होते हैं, उस दिन उनका उपयोग किया जाएगा, हौसले से पतला समाधान तैयार करें। एक पैड रखें जो धुएं के हुड में निष्क्रिय पदार्थ से लथपथ हो और उसके ऊपर एक माइक्रो ट्यूब-रैक हो। पिपेट टिप्स के निपटान के लिए निष्क्रिय समाधान के साथ एक गोदाम तैयार करें।
    2. एक बाँझ माइक्रोट्यूब के तल पर स्टॉक समाधान को पिपेट करें और फिर 10 एनजी/माइक्रोन की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ की गणना की गई मात्रा जोड़ें। जैसा कि टीटीएक्स पाउडर को फिर से निलंबित करने के लिए वर्णित है, एक बेहद सावधान और धीमी गति से टिटरेशन करें, शीशी की दीवारों को नीचे धोना और फोम और एयरोसोल के गठन से बचना।
    3. यदि फ्रीजर पर किए गए नमूनों का उपयोग माइक्रोइंजेक्शन के लिए किया जाएगा, तो उन्हें प्रयोग से कम से एक घंटे पहले कमरे के तापमान पर संतुलन बनाने की अनुमति दी जानी चाहिए ।

7. स्वतंत्र रूप से चलती चूहों में टीटीएक्स या वाहन समाधान का माइक्रोइंजेक्शन

  1. प्रयोग के अनुसार इंजेक्शन की जलसेक दर और कुल समय के साथ माइक्रोइंजेक्शन पंप को कॉन्फ़िगर करें। लक्ष्य संरचना द्वारा कब्जे वाली मात्रा और इंजेक्शन दिए जाने वाले समाधान की मात्रा को ध्यान में रखते हुए इन मापदंडों की पहले से गणना करें। इस प्रयोग के लिए 4 मिनट के कुल जलसेक समय के लिए प्रति मिनट 50 एनएल की दर से समाधान के 200 एनएल इंजेक्ट करें।
  2. बाँझ आसुत पानी के साथ दो 10 μL हैमिल्टन सिरिंज भरें, प्रत्येक माइक्रोइंजेक्टर के ट्यूबिंग कनेक्टर में बाँझ टेफ्लॉन ट्यूबिंग का एक टुकड़ा डालें, यह सुनिश्चित करना है कि ट्यूबिंग की लंबाई चूहे के आंदोलन को बाधित नहीं करती है (टयूबिंग को एथिलीन ऑक्साइड का उपयोग करके निष्फल किया जा सकता है)।
  3. एक पैड रखें जो निष्क्रिय पदार्थ से लथपथ हो और इसके ऊपर पैराफिन फिल्म का 2 सेमी x 2 सेमी वर्ग हो। पिपेट फिल्म के ऊपर इंजेक्टर की सुई और ट्यूबिंग के 1 सेमी भरने के लिए टीटीएक्स की पर्याप्त मात्रा। प्लंजर को धीरे-धीरे वापस लेकर टीटीएक्स ड्रॉप को अवशोषित करें। माइक्रोइंजेक्शन पंप में सीरिंज माउंट करें और अपने नियंत्रण का उपयोग प्लंजर में हेरफेर करने के लिए करें जब तक कि टीटीएक्स की एक बूंद प्रत्येक माइक्रोइंजेक्टर की नोक पर देखी जा सकती है। निष्क्रिय पदार्थ से लथपथ पैड में बूंदों को त्यागें।
  4. उन चूहों का चयन करें जो माइक्रोजेक्टेड होंगे। सर्जरी के बाद कम से कम लगातार तीन चक्र दिखाने वाले केवल चूहों का उपयोग करें। उनके चरण चक्र और दिन के समय पर विचार करें। समय और चरण दोनों विशिष्ट परिकल्पना पर निर्भर करता है जिसे आप परीक्षण करेंगे, इस प्रयोग के लिए चयनित प्रोस्ट्रस के 14:00 घंटे के बाद से इस समय चरणबद्ध GnRH स्राव को नियंत्रित करने वाले तंत्रिका प्रीव्युलेटरी संकेत होते हैं। उन्हें उस कमरे में ले जाएं जहां इंजेक्शन संकट से बचने के लिए अपने स्वयं के आवास पिंजरों के अंदर होगा।
  5. चूहे को एक फर्म पकड़ के साथ पकड़ें, कैनुलास से टोपी और ऑब्यूटर को हटा दें, गाइड कैनुला में माइक्रोइंजेक्टर डालें और जानवर को पिंजरे में वापस करें।
  6. पंप चालू करें और माइक्रोइंजेक्शन खत्म होने तक इंतजार करें। माइक्रोइंजेक्टर की संभावित टुकड़ी का पता लगाने और टेफ्लॉन ट्यूबों को घुमाने से बचने के लिए इस अवधि के दौरान जानवर का निरीक्षण करें।
  7. समाधान के भाटा से बचने के लिए दो अतिरिक्त मिनट के लिए माइक्रोइंजेक्टर को छोड़ दें। उन्हें निकालें, इओडोपोविडोन एंटीसेप्टिक समाधान के साथ प्रत्यारोपण की सतह को साफ करें, गाइड कैनुलास के अंदर इसके प्रवाह से बचें। बाँझ ऑप्टरेटर डालें, टोपी पर रखें और जानवर को कॉलोनी के कमरे में वापस करें। दवा के किसी भी संभावित दुष्प्रभाव का पता लगाने के लिए समय-समय पर जानवर का निरीक्षण करें।
  8. माइक्रोइंजेक्शन के दौरान समान मापदंडों के साथ पंप चालू करें और यह सुनिश्चित करने के लिए सही प्रवाह की जांच करें कि प्रक्रिया के दौरान सिस्टम की स्थिति को बनाए रखा गया था।
  9. जब तक हवा का बुलबुला सुई की नोक तक नहीं पहुंच जाता तब तक टीटीएक्स/वाहन को माइक्रोइंजेक्टर से निष्कासित करने के लिए प्लंजर दबाएं। अपने माइक्रोट्यूब में टीटीएक्स को याद करें। सिरिंज को आसुत पानी से भरें और ट्यूबों के इंटीरियर को साफ करने के लिए इसका इस्तेमाल करें। पानी को निष्क्रिय पदार्थ में फेंकें और इस प्रक्रिया को कम से कम तीन बार दोहराएं। निष्क्रिय पदार्थ में भिगोए गए कपड़े से सीरिंज, ट्यूब और माइक्रोइंजेक्टर के बाहर साफ करें।

8. इच्छामृत्यु और ऊतक प्रसंस्करण

  1. भविष्यवाणी या योनि की पुष्टि की एस्ट्रोस के दिन, सोडियम पेंटोबार्बिटल (75 मिलीग्राम/किलो) के इंट्रापेरिटोनियल ओवरडोज के साथ चूहे को इंजेक्ट करें। चेतना के नुकसान के लिए जांच करें और गाइड कैनुलास के माध्यम से 0.5% मेथिलीन नीले समाधान के 200 एनएमएल इंजेक्ट करें जैसा कि चरण 7.1 से 7.9 में वर्णित है। पंजे या पूंछ चुटकी परीक्षण का उपयोग करके दर्द के संकेतों की जांच करें और, यदि किसी का पता नहीं चल रहा है, तो कृंतक गिलोटिन का उपयोग करके चूहे को काटना।
  2. पेट की गुहा को खोलने और अंडाशय को खोजने के लिए कैंची का प्रयोग करें। प्रत्येक अंडाशय को विच्छेदन करने के लिए ठीक आईरिस कैंची का उपयोग करें, एक आवर्धक ग्लास की सहायता से गर्भाशय-ट्यूबल जंक्शन पर काटें। ओविडक्ट को नुकसान पहुंचाने से बचें क्योंकि इससे ओसाइट्स का नुकसान होगा।
  3. अंडाशय को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे रखें और अंग को नुकसान पहुंचाए बिना सभी वसा ऊतकों को हटाने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करें। एम्पुला क्षेत्र से जहां तक संभव हो, रेजरब्लेड से काटकर प्रत्येक अंडाशय से अंडाशय निकालें। एक अलग स्लाइड पर प्रत्येक अंडाशय माउंट और पानी की एक बूंद के साथ कवर। अंडाशय को एक शीशी में स्टोर करें जिसमें बोइन का समाधान हो।
  4. धीरे-धीरे एक शोषक कागज तौलिया के साथ अंडाशय सूखी और स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत एम्पुला की खोज करें। गैर-प्रमुख हाथ के साथ, एम्पुला से 23 जी सुई के साथ दूर से पिंचिंग करके ओविडक्ट को पकड़ें, फिर एम्पुला के मध्य क्षेत्र में 1 मिमी चीरा बनाने के लिए प्रमुख हाथ में एक और 23 जी सुई का उपयोग करें। क्यूमुलस-ओसाइट परिसर चिपचिपा तरल पदार्थ(चित्रा 2डी)की एक बूंद के रूप में चीरा से फैल जाएगा। धीरे-धीरे और धीरे-धीरे ड्रॉप को अंडाशय से दूर खींचने के लिए प्रमुख हाथ में सुई का उपयोग करें। एम्पुला के अवशेष को दबाएं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि अंदर कोई ओसाइट्स नहीं बचा है। ओविडक्ट के जितनी तेजी से संभव हो ओविडक्ट्स से ओसाइट्स निकालें, क्योंकि ओविडक्ट का ऊसाइट्स अंदर अपरिवर्तनीय रूप से जाल करेगा।
  5. स्लाइड से अंडाशय निकालें और oocytes सूख जाता है युक्त तरल पदार्थ की बूंद तक इंतजार करें। हेमैटोक्सीलिन-इओसिन के साथ नमूने को दाग दें। कवरलिप करने के लिए बढ़ते माध्यम का उपयोग करें। प्रत्येक अंडाशय द्वारा शेड की संख्या निर्धारित करने के लिए माइक्रोस्कोप (10x) के तहत निरीक्षण करें।
    नोट: हृदय परफ्यूजन द्वारा बलिदान इस प्रोटोकॉल में नहीं किया जाता है क्योंकि ओसाइट्स ओविडक्ट्स में फंस जाएंगे और इसलिए ओव्यूलेशन का आकलन करने के लिए हिस्टोलॉजिकल तरीके आवश्यक होंगे। यदि उपयोगकर्ता को अन्य ऊतकों का विश्लेषण करने के लिए प्रेरित करना चाहिए, तो अंडाशय को पहले हटाया जा सकता है और अवस्थक के लीक होने से बचने के लिए जिगर के नीचे मोटी हेमोस्टैट्स के साथ उतरती धमनियों को हटाया जा सकता है।
  6. सिर की त्वचा को हटा दें और खोपड़ी को 10% फॉर्मेलिन समाधान के साथ एक ग्लास कंटेनर में जलमग्न करें। ऊतक की विकृति से बचने के लिए कैनुला को हटाने से पहले कम से कम दस दिनों के लिए सिर के निर्धारण की अनुमति दें। कैनुला को हटाने के लिए, खोपड़ी के क्षेत्र में सभी मांसपेशियों को अलग करने के लिए कैंची का उपयोग करें जो इसे घेरे हुए हैं। नाक और ललाट हड्डियों के बीच बोन ट्रिमर्स के साथ काटें और फिर ऑक्सीपिटल बोन को हटा दें। फॉरमेन मैग्नम में ट्रिमर्स की नोक डालें और नाक की हड्डी के अवशेष तक पहुंचने वाले सगित्तल क्रेस्ट के माध्यम से काटना शुरू करें।
  7. खोपड़ी के शीर्ष के अलग-अलग क्षेत्र में ललाट और पार्श्व हड्डियां होनी चाहिए। धीरे-धीरे इसे सिर पर लंबवत खींचकर खोपड़ी के शीर्ष से जुड़े प्रत्यारोपित कैनुला को हटा दें। मस्तिष्क के विरूपण से बचने के लिए मेनिंग्स के किसी भी संलग्न हिस्से को ठीक आईरिस कैंची से काटें।
  8. मेनिंग्स पर एक पूर्वकाल-पीछे का कट बनाएं और खोपड़ी के आधार से मस्तिष्क को हटाने के लिए उन्हें अलग रखें। घ्राण बल्ब के नीचे कुंद चिमटी डालें और धीरे से मस्तिष्क को खींच जब तक ऑप्टिक नसों दिखाई दे रहे हैं । नसों को बारीक आइरिस कैंची से काटकर दिमाग को बाहर निकाल लें। सुधारात्मक समाधान में मस्तिष्क को संरक्षित करें।
  9. वाइब्रेटम का उपयोग करके मस्तिष्क के 50 माइक्रोन मोटी खंड प्राप्त करें, उन्हें पॉली-एल-लिसिन कोटेड स्लाइड (आसुत पानी में 0.1%) और निएसएल तकनीक के साथ दाग में माउंट करें। कन्नूला(चित्रा 2ए-2सी)की अंतिम स्थिति और चूहे के मस्तिष्क एटलस 27 की सहायता से डाई के प्रसार का निर्धारण करने के लिए माइक्रोस्कोप (10x) केनीचेस्लाइड्स देखें ।

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Representative Results

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का परीक्षण एकल टीटीएक्स या वाहन (कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ) के प्रभावों का मूल्यांकन करके किया गया था; ACSF) चूहे में ओव्यूलेशन के नियमन में शामिल होने के लिए जाने जाने वाले दो अलग-अलग नाभिक में से एक में माइक्रोइंजेक्शन: सुपररैचियास्मैटिक और आर्क्यूएट न्यूक्लियस। सुप्राचियास्मेटिक नाभिक को चुना गया था क्योंकि इसमें स्तनधारियों में केंद्रीय सर्कैडियन पेसमेकर होता है। यह गोंडोट्रोपिन के स्राव के रूप में चक्रीय घटनाओं के नियमन में शामिल है। आर्क्यूएट न्यूक्लियस को इसलिए चुना गया क्योंकि इसमें न्यूरॉन्स की आबादी होती है जो एस्ट्रोडिओल रिसेप्टर्स को व्यक्त करती है, जो अधिकांश एस्ट्रोस चक्र के दौरान जीएनआरएच स्राव को उत्तेजित करती है। माइक्रोइंजेक्शन प्रोस्ट्रस चरण के 14:00 घंटे पर किया गया था, जो गोंडोट्रोपिन के पूर्व-अंडाशय रिलीज को विनियमित करने वाले कई केंद्रीय तंत्रों की घटना के कारण "महत्वपूर्ण खिड़की" के रूप में जाना जाता है। उपचार के बाद, योनि स्मीयरों को हर दिन लिया जाता था और चूहों को एस्ट्रस के अनुमानित दिन के 09:00 घंटे पर इच्छामृत्यु दी जाती थी, जो एस्ट्रस की योनि धब्बा विशेषता के साथ हुई थी। एक अतिरिक्त नियंत्रण समूह के रूप में, एस्ट्रस के चरण में इच्छामृत्यु वाले पांच अक्षुण्ण चूहों का उपयोग किया गया था। सर्जरी के बाद साइकिल चलाने वाले जानवरों के अंश और प्रत्येक समूह (ovulating चूहों/n) के ovulating चूहों के अंश की गणना की गई थी और फिशर के सटीक संभावना परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था । दोनों अंडाशय द्वारा ओवा शेड की संख्या का विश्लेषण क्रुस्कल-वालिस टेस्ट द्वारा किया गया था, जिसके बाद डन का परीक्षण किया गया था । नमूना आकार पर्याप्त था यह सुनिश्चित करने के लिए उचित सांख्यिकीय परीक्षण किए गए थे।

कुल 30 महिला चूहों को दो लक्ष्य क्षेत्रों में से एक पर निशाना साधते हुए गाइड कैनुलास के साथ प्रत्यारोपित किया गया । जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है, सर्जरी से पहले सभी जानवर चक्रीय थे लेकिन उनमें से केवल सात ने कैनुलेशन प्रक्रिया के बाद एस्ट्रोस चक्र में परिवर्तन नहीं दिखाया। तेईस जानवरों ने अपने चक्रों के क्षणिक परिवर्तन दिखाए, जो ल्यूकोसिटिक स्मीयरों के साथ दिनों की संख्या में वृद्धि की विशेषता है। इस तरह के परिवर्तन शायद सर्जरी द्वारा प्रेरित तनाव के कारण होते हैं और धीरे-धीरे कम हो जाते हैं। पांचवें चक्र तक अट्ठाईस चूहों को चक्रीय माना जाता था और शेष दो को प्रयोग से छोड़ दिया जाता था। इस परिणाम से पता चलता है कि, चार एस्ट्रोस चक्र (16 दिनों) के वसूली समय के बाद, अधिकांश कैनन्युलेटेड जानवर आगे के प्रयोग के लिए उपयुक्त हैं।

चित्रा 4A और चित्रा 4B अंडाशय जानवरों के प्रतिशत और ओवा शेड की संख्या क्रमशः, अक्षुण्ण जानवरों द्वारा और या तो ACSF या TTX के साथ सुप्राचियास्मैटिक नाभिक में इलाज समूहों द्वारा दर्शाया गया है । सभी अक्षुण्ण चूहों ovulated और एक ही ACSF समूह के लिए सच था । हालांकि, टीटीएक्स के साथ माइक्रोइंजेक्टेड जानवरों में से कोई भी नहीं। वाहन के इंजेक्शन से ओवा शेड का नंबर संशोधित नहीं किया गया। हालांकि, जारी किए गए ओसाइट्स की व्यवहार्यता और गुणवत्ता का आकलन करना दिलचस्प होगा। इसी तरह के परिणाम अंक 4 सी और चित्रा 4D में चूहों के लिए आर्क्यूएट नाभिक में माइक्रोइंजेक्टेड देखे जा सकते हैं। दोनों ही मामलों में, इस विधि ने प्रोस्ट्रस चरण की महत्वपूर्ण खिड़की पर ओव्यूलेशन के नियमन में एक असतत मस्तिष्क क्षेत्र की भागीदारी साबित की, जिसे पहले घाव के अध्ययन से अनुमानित किया गया था लेकिन पुष्टि नहीं हुई। टीटीएक्स माइक्रोइंजेक्शन का प्रभाव स्थायी होने के बजाय क्षणभंगुर प्रतीत होता है क्योंकि पिछले प्रयोग से पता चला है कि चूहों ने एस्ट्रस26के अपेक्षित दिन में "क्रिटिकल विंडो" के बाहर सुपररेचियामैटिक नाभिक में इंजेक्शन लगाया था। हालांकि, नियंत्रण समूहों के शामिल किए जाने जिसमें जानवरों को 24 घंटे के साथ या जब तक एस्ट्रोस का एक स्पष्ट योनि धब्बा प्राप्त नहीं हो जाता है, इस मुद्दे को हल करने की सिफारिश की जाती है।

चित्रा 5ए-बी में परिणाम उन जानवरों के अंडाशय परिणाम का प्रतिनिधित्व करते हैं जिनका एसीएसएफ या टीटीएक्स के साथ इलाज किया गया था। हालांकि, हिस्टोलॉजिकल पुष्टि के बाद निर्धारित के रूप में, उनके cannulas इच्छित क्षेत्र के बाहर स्थित थे । इनमें से अधिकांश कैनुलास को पूर्वकाल संयोजिका या रेट्रोचियामेटिक क्षेत्र में रखा गया था, दो क्षेत्र जो ओव्यूलेशन के नियमन में योगदान नहीं करते हैं। सुप्राचियास्मेटिक और आर्कुएट न्यूक्लियस के साथ इन दोनों संरचनाओं को तीसरे वेंट्रिकल से बहुत करीब हैं, इस पर विचार करते हुए, यदि दवा वेंट्रिकल में लीक हो जाती है तो सभी जानवरों में ओव्यूलेशन की नाकाबंदी की उम्मीद की जाएगी। तथ्य यह है कि लक्ष्यों के बाहर TTX माइक्रोइंजेक्शन ओव्यूलेशन को ब्लॉक करने में विफल रहा है, पता चलता है कि चयनित दर पर संचार टीटीएक्स की मात्रा वेंट्रिकल में लीक नहीं हुई, इसलिए टीटीएक्स के क्षेत्र-विशिष्ट प्रभावों का खुलासा किया गया। इस विचार के समर्थन में, मस्तिष्क के स्लाइस के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण ने केवल गाइड कैनुलास की नोक के पास दाग न्यूरॉन्स दिखाए। हालांकि, हमें स्पष्ट करना चाहिए कि दवा के प्रसार का कोई सीधा आकलन नहीं किया गया था और इसलिए इस निष्कर्ष को और अधिक संबोधित किया जाना चाहिए ।

Figure 1
चित्र 1: योनि स्मीयर चूहे के एस्ट्रोस चक्र के प्रत्येक चरण के प्रतिनिधि। एस्ट्रस(ए)को एक नाभिक के बिना एपिथेलियल कॉर्निफाइड कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए विशेषता है जो एपिथेलियल डेस्क्व्यूमेशन के परिणामस्वरूप संचयी बनाने के लिए अकेले पाया जा सकता है। मेटेस्ट्रस(बी)में इनमें से कुछ कॉर्निफाइड कोशिकाएं अभी भी मौजूद हो सकती हैं, लेकिन ल्यूकोसाइट्स द्वारा अधिक संख्या में हैं, जो डिस्ट्रस(सी)में प्रमुख कोशिका प्रकार भी हैं। प्रोस्ट्रस नमूने(डी)की विशेषता है कि वे चिपचिपा से मिलकर और एपिथेलियल नाभिक कोशिकाओं की प्रधानता करते हैं। प्रत्येक पैनल में स्केल बार 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: इच्छामृत्यु के बाद नमूनों की हिस्टोलॉजिकल जांच। एक अक्षुण्ण चूहा(एआरसी),एक द्विपक्षीय-कैनुलेटेड चूहा(बी)और एक गलत कैनुला(सी)के साथ एक चूहा के आर्क्यूएट न्यूक्लियस (एआरसी) और औसत उत्सर्जन (EM) क्षेत्र में मस्तिष्क कोरोनल सेक्शन। इस क्षेत्र में एस्टरिक्स बिंदु जहां गाइड कैनुलास की नोक स्थित थी, बी में सुझाव जहां वेंट्रोमेडियल न्यूक्लियस (वीएमएच) के बेसल मार्जिन पर प्रोट्रूडेड इंजेक्टर्स को एआरसी के ऊपरी मार्जिन तक पहुंचने की अनुमति देता है। सी में एक कैनुला तीसरे वेंट्रिकल (3V) के अंदर स्थित था, जिसके परिणामस्वरूप एक गैर-स्थानीयकृत वेंट्रिकुलर माइक्रोइंजेक्शन हुआ। यह एक आम गलती है जब लक्ष्य मिडलाइन के पास स्थित है और इन जानवरों से डेटा को छोड़ दिया जाना चाहिए । जब ठीक से प्रदर्शन किया जाता है, तो ओसाइट्स की निकासी के परिणामस्वरूप चिपचिपा तरल पदार्थ की एक बूंद होनी चाहिए जिसमें पैनल(डी)में देखे गए सभी ओविडक्ट से सभी ओसाइट्स होते हैं। प्रत्येक पैनल में स्केल बार 500 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: कैनुला के प्रत्यारोपण से पहले और बाद में साइकिल चलाने वाले जानवरों का संचयी प्रतिशत (***p≤0.0001; * * पी = 0.0003 बनाम सर्जरी से पहले चक्र, फिशर की सटीक संभावना परीक्षण)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: लक्ष्य संरचना #1 (सुपराचियामैटिक न्यूक्लियस, ए-बी) या #2 (आर्कुएट न्यूक्लियस, सी-डी) कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल द्रव (ACSF) या टेट्रोडोटॉक्सिन (टीटीएक्स) के साथ प्रोस्ट्रस चरण के 14:00 पर । तुलना उद्देश्यों के लिए प्रत्येक ग्राफ में बरकरार समूह जोड़ा गया था और सलाखों के अंदर की संख्या क्रमशः अंडाशय महिलाओं (***p≤0.01 बनाम बरकरार और ACSF समूहों, फिशर की सटीक संभावना परीक्षण और Kruskal-Wallis परीक्षण, क्रमशः) के अंश का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: अंडाशय जानवरों का प्रतिशत (ए) और अंतरवर्गीय रेंज (त्रुटि सलाखों) के साथ औसत जानवरों द्वारा ओवा शेड (बी) की संख्या का जिसका cannulas लक्ष्य क्षेत्रों के बाहर होना निर्धारित किया गया । इन जानवरों को प्रोस्ट्रस के 14:00 पर कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल द्रव (ACSF) या टेट्रोडोडोटॉक्सिन (टीटीएक्स) के साथ माइक्रोइंजेक्टेड किया गया था। तुलना उद्देश्यों के लिए प्रत्येक ग्राफ में बरकरार समूह जोड़ा गया था और सलाखों के अंदर की संख्या महिलाओं को अंडाशय के अंश का प्रतिनिधित्व करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यह लेख किसी भी समय, जाग और अनर्गल चूहों के मस्तिष्क में एक असतत क्षेत्र, क्षणिक रूप से निष्क्रिय करने की विधि का वर्णन करता है। उनके एस्ट्रोस चक्र को ट्रैक करने और ओव्यूलेशन का आकलन करने के लिए एक सरल विधि भी प्रदान की गई है। यह प्रोटोकॉल उन तंत्रों के लिए विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों के योगदान का सीधा विश्लेषण करने की अनुमति देता है जो वाहन-उपचारित जानवरों के साथ टीटीएक्स-इलाज जानवरों के अंडाशय परिणाम की तुलना करके ओव्यूलेशन ड्राइव करते हैं। स्टीरियोटैक्सिक उपकरण और माइक्रोइंजेक्शन पंप के अपवाद के साथ, जो तंत्रिका विज्ञान प्रयोगशालाओं में आम हैं, इस विधि को महंगी सामग्रियों की आवश्यकता नहीं होती है। वाणिज्यिक कैनुलास और माइक्रोइंजेक्टर इस तरह के प्रयोग के लिए सामान्य विकल्प हैं, लेकिन यहां वर्णित आसान-से-निर्माण प्रणाली लागत कम है और परिणाम अविवेच्य हैं। इस प्रोटोकॉल और तालिका में सूचीबद्ध सामग्री का उपयोग करके कि इस लेख के साथ, दस गुना अधिक cannulas पैसे की एक ही राशि है कि दस जानवरों के लिए एक वाणिज्यिक किट खर्च होगा खर्च करके निर्मित किया जा सकता है । दस द्विपक्षीय कैनुलास का निर्माण, चाहे अध्ययन के लिए आवश्यक अनुकूलन कुछ ही घंटों में किया जा सके। इसके अलावा, सभी घटक फिर से उपयोग करने योग्य हैं जो लागत प्रभावशीलता को बढ़ाते हैं।

लाभ-लागत अनुपात के साथ, यह प्रोटोकॉल किसी भी प्रयोगशाला वातावरण के लिए उपयुक्त है क्योंकि यह कृंतक हेरफेर, स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी और जैविक विषाक्त पदार्थों और संबंधित कचरे की हैंडलिंग के ज्ञान के साथ छात्रों सहित किसी भी कर्मियों द्वारा किया जा सकता है। इसके अलावा, इसे खरगोशों, फेरेट्स, मार्मोसेट और यहां तक कि गैर-स्तनधारी प्रजातियों जैसे पक्षियों और सरीसृपों सहित कृंतक और अन्य छोटे स्तनधारियों की किसी भी प्रजाति में उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। ऊपर उल्लेख ति विशेषताओं के अलावा, इस प्रोटोकॉल का मुख्य लाभ यह है कि इसे मस्तिष्क के नियमन के तहत अन्य प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है जैसे परिधीय अंगों की गतिविधि, पर्यावरणीय चुनौतियों और विभिन्न व्यवहारों के लिए होम्योस्टिटिक प्रतिक्रिया।

वांछित परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रयोग शुरू करने से पहले कई महत्वपूर्ण कदम उठाए जाने चाहिए। सबसे पहले, लक्षित संरचना के निर्देशांक की गणना अनुभवजन्य रूप से की जानी चाहिए क्योंकि मस्तिष्क एटलस में रिपोर्ट किए गए लोग जरूरी नहीं कि उनके तनाव, लिंग या उम्र के परिणामस्वरूप अध्ययन के लिए नामित जानवरों के साथ मेल खाएंगे। कई अध्ययनों से पता चला है कि प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड और जलसेक जांच न केवल तंत्रिका शरीर और फाइबर के विनाश से बल्कि ग्लियल कोशिकाओं की सक्रियता से घायल क्षेत्र के कार्य को बदल देती है। प्रत्यारोपण के तुरंत बाद शुरू होने वाली भड़काऊ प्रतिक्रिया आमतौर पर ग्लियल कोशिकाओं द्वारा विदेशी शरीर के एनकैप्सुलेशन का कारण बनती है। ये कोशिकाएं एक तंग म्यान बनाती हैं जो न्यूरोट्रांसमीटर के प्रवाह को बाधित करती हैं और न्यूरोडिजेनरेशन31की प्रक्रिया शुरू करती हैं। प्रत्यारोपण प्रक्रिया के हानिकारक प्रभावों से बचा नहीं जा सकता है और यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि इस तरह के प्रभाव यथासंभव ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र से दूर होते हैं। गाइड कैनुला को लक्ष्य क्षेत्र में रखने के लिए निर्देशांक की गणना की जानी चाहिए, तभी यह सुनिश्चित करने के लिए कि कैनुला द्वारा 10% से अधिक क्षेत्र क्षतिग्रस्त नहीं होगा। यह दृष्टिकोण उपयोगी है, उदाहरण के लिए, यदि कॉर्टेक्स के बड़े क्षेत्रों का अध्ययन किया जाएगा। यहां तक कि इस मामले में, नियंत्रण समूह का एक विस्तृत विश्लेषण किया जाना चाहिए ताकि ब्याज की प्रक्रिया पर प्रत्यारोपण के प्रभाव के लिए खाते में । असतत हाइपोथैलेमिक नाभिक जैसी छोटी संरचनाओं के लिए, हम शोधकर्ताओं को सलाह देते हैं कि वे मस्तिष्क एटलस(चित्रा 2B)के अनुसार पूर्वकाल-पीछे और मध्य-पार्श्व विमानों में मध्य क्षेत्र में लक्ष्य संरचना की ऊपरी सीमा से ०.५ से 2 मिमी तक की दूरी पर गाइड कैनुलास को रखने के लिए निर्देशांक की गणना करें । इस दृष्टिकोण के लिए इंजेक्टरों को लक्ष्य की सीमा तक पहुंचने के लिए पर्याप्त फैलाना डिजाइन किया जाना चाहिए। हमने इस प्रोटोकॉल में वर्णित दो नाभिक के लिए इसका परीक्षण किया है और पाया कि इन चूहों ने अपने एस्ट्रस चक्र और लक्ष्यों के अंदर प्रत्यारोपित कैनुलास के साथ जानवरों की तुलना में जल्दी अंडाशय की क्षमता बरामद की है ।

इंजेक्शन दिए जाने वाले औषधीय एजेंटों की घुलनशीलता पर विचार किया जाना चाहिए ताकि वाहन समाधान यथासंभव सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ के समान हो। टीटीएक्स को अकेले या साइट्रेट के साथ एक लियोफिलिज्ड पाउडर के रूप में खरीदा जा सकता है। पहले एक पानी में कम घुलनशीलता है और 5.0 के आसपास एक पीएच के साथ एक अम्लीय बफर इसे पुनर्गठित करने की सिफारिश की है, लेकिन यह अकेले वाहन के इंजेक्शन के परिणामस्वरूप ऊतक को नुकसान पहुंचाने की संभावना शुरू कर सकते हैं। दूसरी ओर, टीटीएक्स-साइट्रेट को पानी या 0.9% खारा समाधान में भंग किया जा सकता है, जो आमतौर पर वाहनों के रूप में उपयोग किए जाते हैं। हम इन दोनों वाहनों के उपयोग के खिलाफ सलाह देते हैं, और इसके बजाय कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ या रिंगर के लैक्टेट समाधान का उपयोग करने का सुझाव देते हैं। पिछले अध्ययन से पता चला है कि सुपरैचियामैटिक न्यूक्लियस में किए गए खारे समाधान का ओव्यूलेशन पर हानिकारक प्रभाव पड़ता है जब26को एस्ट्रोस या डाइस्ट्रस पर किया जाता है । कई लेखों में बताया गया है कि तंत्रिका ऊतकों का परफ्यूजन ऐसे समाधानों से मेल नहीं खाते जो सेरेब्रोस्पाइनल द्रव की भौतिक और रासायनिक विशेषताओं से मेल नहीं खाते हैं , न्यूरॉन्स की शारीरिक और शरीर विज्ञान को बदल देते हैं और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं और कोशिका मृत्यु को बढ़ावा देते हैं32,33,34,35. इन परिणामों को ध्यान में रखते हुए, कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ के उपयोग के रूप में वाहन मस्तिष्क में दवाओं के माइक्रोइंजेक्शन से जुड़े सभी प्रयोगों में दृढ़ता से सिफारिश की जाती है।

प्रयोगों की शुरुआत से पहले, शोधकर्ताओं को अनुभवजन्य रूप से इंजेक्शन के लिए समाधान की इष्टतम मात्रा निर्धारित करनी चाहिए, क्योंकि आसन्न संरचनाओं और अपर्याप्त कवरेज दोनों में लीक होने से परिणामों की व्याख्या को चकित किया जा सकता है । यह स्पष्ट आगर या जिलेटिन क्यूब्स में पानी में घुलनशील डाई को माइक्रोइंजेक्ट करके पूरा किया जा सकता है। डाई के फैलाव का अनुमान लगाया जा सकता है और मस्तिष्क एटलस में रिपोर्ट के रूप में लक्ष्य के अपेक्षित आकार के साथ तुलना की जा सकती है। फिर भी, इसकी सेलुलर घनत्व और फाइबर ट्रैक्ट या वेंट्रिकुलर सीमाओं की उपस्थिति जैसे ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र के गुण प्रसार गतिशीलता को प्रभावित करेंगे, और परिणाम आगर और जिलेटिन में पाए जाने वाले लोगों से भिन्न हो सकते हैं। तदनुसार, शोधकर्ता तो कुछ जानवरों के लक्ष्य क्षेत्र में विट्रो में प्राप्त मापदंडों का परीक्षण करना चाहिए । समाधान की दी गई मात्रा के प्रसार को चित्रित करने के लिए चूहों में इंट्रासर्ज्रल माइक्रोइंजेक्शन के लिए कई रंगों का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। सबसे आम उदाहरण क्रेसिल वायलेट, थियोनाइन ब्लू, मेथिलीन ब्लू, इवान का नीला, तेज हरा और भारत स्याही हैं। इन रंगों को आसुत पानी में 0.5% या कम एकाग्रता पर भंग कर दिया जाता है। इवान के नीले रंग में फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप (620 एनएम पर उत्तेजन और 680 एनएम पर उत्सर्जन) में पता लगाने योग्य होने का लाभ है, जिससे प्रसार का अधिक मात्रात्मक विश्लेषण होता है। लेटेक्स माइक्रोमोतियों को भी इस दृष्टिकोण के लिए उपयुक्त हो सकता है। यह बताना महत्वपूर्ण है कि 2.0 माइक्रोन से अधिक मात्रा को इस तकनीक से मस्तिष्क में प्रशासित नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि यांत्रिक क्षति और ऊतक विस्थापन36हो जाएगा ।

समाधान की प्रवाह दर भी नियंत्रित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है, क्योंकि उच्च गति पर उच्च मात्रा के माइक्रोइंजेक्शन ऊतक विस्थापन और यांत्रिक घावों40का कारण बनता है। इसके अलावा, जलसेक की एक उच्च दर दवा के प्रसार को भी बढ़ाती है, जिसके परिणामस्वरूप पड़ोसी संरचनाओं की निष्क्रियता होती है। समाधान के दायरे में आने वाले क्षेत्र में तीन गुना वृद्धि जलसेक दर को 100 एनएल/5 मिनट से बदलकर 100 एन एल/1 मिनट36तक हो सकती है । मेथिलीन नीले रंग के साथ इंजेक्शन चूहे दिमाग की हिस्टोलॉजिकल टिप्पणियों से संकेत मिलता है कि ५० nL/मिनट की जलसेक दर ऊतक को विस्थापित नहीं करती है, जबकि दवा को लक्ष्य क्षेत्र (व्यक्तिगत टिप्पणियों) में सीमित करती है । यह केवल 200 एनएल के बराबर या उससे कम मात्रा के साथ परीक्षण किया गया था और इसलिए शोधकर्ताओं को पायलट प्रयोगों को चलाना चाहिए यदि बड़ी मात्रा का उपयोग किया जाएगा।

एक बार काम करने की मात्रा निर्धारित हो जाने के बाद, प्रत्येक जानवर पर प्रसार का आकलन करने की भी सिफारिश की जाती है। यह या तो दवाओं के साथ एक डाई इंजेक्शन या इच्छामृत्यु से कुछ मिनट पहले इंजेक्शन द्वारा किया जा सकता है, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है । पूर्व मॉडल डाई विष के साथ फैलने की अनुमति देता है, इस प्रकार प्रभावित क्षेत्र का अधिक सटीक आकलन प्रदान करता है। इस विधि का एक नकारात्मक पक्ष यह है कि डाई दवा की गतिविधि में हस्तक्षेप कर सकती है, और साइटोटॉक्सिक भी हो सकती है। अंत में, तंत्रिका ऊतक से निकासी हो सकती है यदि इंजेक्शन प्रक्रिया के बाद जानवर को कई दिनों तक जीवित रहने की आवश्यकता होती है, जो प्रसार के अनुमान को प्रभावित करेगी। यदि इस दृष्टिकोण का उपयोग किया जाएगा, तो अध्ययन के तहत प्रक्रिया पर डाई के प्रभाव को अक्षुण्ण जानवरों के साथ वाहन + डाई समूह के परिणाम की तुलना करके संबोधित किया जाना चाहिए । यदि डाई का इंजेक्शन इच्छामृत्यु से पहले हो जाएगा, तो माइक्रोइंजेक्शन (जलसेक दर और मात्रा) के दौरान समान मापदंडों का पालन करने की सिफारिश की जाती है। यह समाधान के प्रसार की अनुमति देने के लिए इच्छामृत्यु से कम से 10 मिनट पहले किया जाना चाहिए । इस विधि के साथ, यह पाया गया कि एक TTX/मेथिलीन नीले समाधान के २०० nL व्यास के ०.६ मिमी के एक क्षेत्र को शामिल किया गया है और फैलाव काफी नहीं बदलता है अगर माइक्रोइंजेक्शन बलिदान (व्यक्तिगत अवलोकन) से 1 घंटे पहले होता है । यह फ्रायंड और सहयोगियों द्वारा अध्ययन से सहमत है37,साथ ही ज़हुराविन और ब्यूरो38द्वारा एक, जिसमें दोनों ने पाया कि टीटीएक्स समाधान का 1 माइक्रोन लगभग 3 मिमी व्यास के साथ गोलाकार आकार की मात्रा में फैलता है। सामान्य तौर पर, यह दिखाया गया है कि दवा का फैलाव इसके आणविक वजन और इंजेक्शन की मात्रा पर निर्भर करता है,39 और ऊपर बताए गए परिणाम टीटीएक्स के समान आणविक वजन के साथ रंगों के प्रसार से मेल खाते हैं। यदि फैलाव के अधिक सटीक नियंत्रण की आवश्यकता है, तो रेडियोलेबल टीटीएक्स का इंजेक्शन या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी के साथ नियमित टीटीएक्स के खिलाफ इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का कार्यान्वयन37किया जा सकता है। दवा द्वारा कवर किए गए क्षेत्र के बेहतर चित्रण के अलावा, ये दोनों दृष्टिकोण ऊतक से टीटीएक्स की मंजूरी से सीमित हैं, जिस पर विचार किया जाना चाहिए कि जानवर को माइक्रोइंजेक्शन के कई दिनों बाद जीवित रहना चाहिए, दूसरी ओर, रेडियोधर्मी सामग्री के काम करने और निपटान से नए कदम और सुरक्षा मुद्दे पेश होंगे जो सभी प्रयोगशालाओं और प्रोटोकॉल के साथ संगत नहीं हो सकते हैं।

एक नियंत्रण समूह है कि एक मस्तिष्क क्षेत्र है कि अध्ययन प्रक्रिया के विनियमन में एक भूमिका नहीं है में इंजेक्शन जानवरों से मिलकर के शामिल किए जाने की सिफारिश की है । यह समूह शोधकर्ता को उस प्रक्रिया के नियमन में लक्ष्य क्षेत्र की विशिष्टता निर्धारित करने में मदद करेगा और इस संभावना को त्याग देगा कि किसी भी संरचना में इंजेक्ट की गई दवाएं, तनाव या प्रतिरक्षा धुरी की सक्रियता जैसे अधिक व्यापक तंत्र में आधारित अवरुद्ध संकेत को ट्रिगर कर सकती हैं। चूंकि यहां तक कि सबसे अधिक प्रयोग किए जाने वाले स्टीरियोटैक्सिक सर्जन भी 100% सफलता दर प्राप्त करने में सक्षम नहीं होते हैं जब छोटी संरचनाओं को लक्षित किया जाता है, तो ये प्रयोग आमतौर पर वांछित संरचना के बाहर रखे गए कैनुलास के साथ होते हैं और इसलिए यह नियंत्रण समूह अनजाने में प्राप्त होता है। जिन जानवरों में कैनुला गलत था, उनके परिणाम मूल्यवान हैं और उन्हें त्याग नहीं दिया जाना चाहिए; इसके बजाय, इंजेक्शन क्षेत्र और दवा के फैलाव पर विचार करने पर एक व्यापक विश्लेषण किया जाना चाहिए। विशेष रुचि के परिणाम है कि लक्ष्य के पास क्षेत्रों में इंजेक्शन जानवरों में एक अलग प्रभाव (या कोई नहीं) से पता चलता है ।

इस प्रोटोकॉल में कैनुलास के पुराने प्लेसमेंट के लिए निहित सीमाएं हैं। कैनुला के प्रक्षेपवक्र में मार्ग और न्यूरोनल निकायों के फाइबर के स्थायी विनाश से बचना संभव नहीं है। कुछ माइक्रोमीटर के टिप व्यास वाले कांच केशिकाओं का उपयोग ऊतक41को न्यूनतम क्षति के साथ मस्तिष्क में दवाओं को वितरित करने के लिए पसंद की विधि है। हालांकि, इस पद्धति का उपयोग ज्यादातर उन प्रयोगों में किया गया है जिनमें पशु को एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है और/या सिर स्टीरियोटैक्सिक उपकरण या अन्य धारक उपकरणों से जुड़ा होता है । यह मुख्य रूप से केशिका की कमजोरी के कारण होता है, जिससे इसे जागते और अनर्गल जानवर से जोड़ना मुश्किल हो जाता है। गाइड कैनुलास के बजाय ऑस्मोटिक पंपों से जुड़े ग्लास केशिकाओं का उपयोग करने वाली एक प्रणाली ने क्षतिग्रस्त मस्तिष्क ऊतक की मात्रा में और चोट42के लिए ग्लियल प्रतिक्रिया में काफी सुधार दिखाया है। इस प्रणाली में, हालांकि, दवाओं का अर्क समय के बजाय पुरानी है और इसलिए उन प्रयोगों में उपयोगी नहीं है जिनमें इंजेक्शन समय को ठीक से नियंत्रित किया जाना चाहिए। पहले से प्रत्यारोपित गाइड कैनुला के माध्यम से लक्ष्य क्षेत्र में डाले गए कांच के केशिका पर आधारित एक माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम का वर्णन अकिनोरी और उनके सहयोगियों नेकियाथा । यह प्रणाली वांछित समय पर एक जाग जानवर के इंजेक्शन की अनुमति देती है, लेकिन यह बहुत मजबूत नहीं है और प्रक्रिया के दौरान जानवर को प्रतिबंधित किया जाना चाहिए, जिससे तनाव प्रतिक्रिया की सक्रियता हो सकती है। इस प्रोटोकॉल में, गाइड कैनुला के प्रक्षेपवक्र में तंत्रिका ऊतक को नुकसान के प्रभाव को बरकरार और वाहन समूहों की तुलना करके नियंत्रित किया जा सकता है। यहां यह दोनों समूहों के लिए एक समान अंडाकार परिणाम दिखाया गया था, और यह निष्कर्ष निकाला गया था कि ऊतक प्रभावित है, साथ ही वाहन के इंजेक्शन अंडाशय के साथ हस्तक्षेप नहीं किया । शोधकर्ताओं को यह निर्धारित करने के लिए प्रायोगिक अध्ययन चलाना चाहिए कि क्या उनके लक्ष्य क्षेत्र के लिए पृष्ठीय स्थित संरचनाएं, जो कैनुला द्वारा नष्ट हो जाएंगी, अध्ययन प्रक्रिया के नियमन में शामिल हैं । फिर भी, इस काम के लिए एक आशाजनक भविष्य की दिशा एक डिलीवरी सिस्टम डिजाइन करना है जो गाइड कैनुलास और ग्लास केशिकाओं दोनों की ताकत को भुनाती है।

शोधकर्ताओं के लिए एक और महत्वपूर्ण विचार टीटीएक्स की कार्रवाई का समय है। Zhuravin और Bures३८ से पता चला है कि TTX तंत्रिका संचरण है, जो लगभग डेढ़ घंटे के लिए रहता है की एक अधिकतम नाकाबंदी तक पहुंचने के लिए कुछ मिनट लगते हैं, कई घंटे से अधिक धीरे से कम । यह TTX पसंद की दवा बनाता है जब लंबे समय तक चलने वाली निष्क्रियता की आवश्यकता होती है। यदि प्रयोग में तेजी से निष्क्रियता की आवश्यकता होती है, तो लिडोकेन जैसे स्थानीय एनेस्थेटिक्स का उपयोग किया जा सकता है क्योंकि अधिकतम नाकाबंदी तक पहुंचने में केवल कुछ सेकंड लगते हैं। इस दवा का प्रभाव 20 मिनट से भी कम समय तक चलता है, जो टीटीएक्स की तुलना में एक महीन लौकिक संकल्प प्रदान करता है। ऊपर बताई गई विशेषताएं टीटीएक्स को अन्वेषणात्मक प्रयोगों के लिए एक अच्छा उपकरण बनाती हैं जो कम अच्छी तरह से परिभाषित अस्थायी खिड़कियों में उत्पन्न तंत्रिका संकेतों की उपस्थिति का अध्ययन करती हैं। दूसरी ओर, लिडोकेन, इस विंडो44को चित्रित करने के लिए उपयोगी है। दोनों दवाओं का एक नुकसान यह है कि वे पारित होने के तंतुओं में कार्रवाई क्षमता के संचरण को अवरुद्ध करते हैं, डेटा की व्याख्या में कलाकृतियों को पेश करते हैं क्योंकि संकेत संभवतः एक अलग संरचना से आ सकता है जो इंजेक्शन क्षेत्र में अक्षीय अनुमानों को भेजता है। इस मामले में, लक्ष्य क्षेत्र के बाहर होने के लिए निर्धारित इंजेक्शन का सावधानीपूर्वक विश्लेषण बहुत महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, इस लेख में यह दिखाया गया था कि क्षेत्र में टीटीएक्स जलसेक सुपररैचियासमैटिक नाभिक के पूर्वकाल में और इसके बीच के क्षेत्र में और आर्क्यूएट नाभिक ने ओव्यूलेशन को अवरुद्ध नहीं किया। इस तरह के परिणामों से पता चला है कि उन क्षेत्रों में फाइबर और कोशिकाएं ओव्यूलेशन के नियमन में शामिल नहीं हैं, जो फाइबर के पारस्परिक जाल की उपस्थिति के कारण अप्रत्याशित थी, जो कि आर्क्यूएट न्यूक्लियस और जीएनआरएच न्यूरॉन्स युक्त पूर्वकाल क्षेत्रों दोनों के साथ सुपररेकेटिक नाभिक को जोड़ती है।

एक विकल्प जो इंजेक्शन क्षेत्र में पारित होने के फाइबर के साथ संचरण को अवरुद्ध नहीं करता है, वह कोबाल्ट और मैग्नीशियम जैसे डिवेलेंट cations का उपयोग है, जो दोनों प्रेसिनैप्टिक टर्मिनलों द्वारा न्यूरोट्रांसमीटर की रिहाई को रोकते हैं। हालांकि, इस दृष्टिकोण के साथ समस्या निष्क्रिय कार्रवाई और उच्च विषाक्तता44का बहुत कम समय है। फाइबर की नाकाबंदी से बचने के लिए अन्य विकल्प ऑप्टोजेनेटिक और केमोजेनेटिक दृष्टिकोण हैं, जिनमें से दोनों विशिष्ट न्यूरोनल आबादी की गतिविधि में हेरफेर के लिए रणनीतियां हैं। चयनशीलता वायरल वैक्टर के साथ न्यूरॉन्स को ट्रांसफेक्टिंग करके प्राप्त की जाती है जो उन दृश्यों को डालने के लिए डिज़ाइन की जाती हैं जो या तो ऑप्सिन के लिए कोडिफाई करते हैं जो आयन चैनलों या विशिष्ट प्रमोटरों के तहत व्यक्त किए गए संशोधित रिसेप्टर्स से बंधे होते हैं। वेक्टर का माइक्रोइंजेक्शन कांच के केशिकाओं का उपयोग करके एनेस्थेटाइज्ड जानवरों में किया जाता है, जिससे आसपास के ऊतकों में थोड़ा व्यवधान होता है। ऑप्टिक फाइबर का प्रत्यारोपण या सिंथेटिक दवाओं का प्रणालीगत इंजेक्शन लक्षितजनसंख्या मेंबहुत सटीक हेरफेर करने की अनुमति देता है । ये तकनीकें एक अध्ययन में उपयोगी साबित हुईं, या तो अकेले या इस प्रोटोकॉल46में प्रस्तुत टीटीएक्स माइक्रोइंजेक्शन जैसी तकनीकों के साथ संयोजन के रूप में। फिर भी, इन तरीकों के कई पहलुओं को सफल प्रयोगों को डिजाइन करने के लिए विचार किया जाना चाहिए, जिसमें अभिव्यक्ति की विशिष्टता का सत्यापन, संक्रमित कोशिकाओं की संख्या के लिए नियंत्रण, विषाक्तता का आकलन और प्रकाश और रासायनिक उत्तेजना के दुष्प्रभावों का मूल्यांकन शामिल है।

इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण घटकों में प्रत्येक जानवर के लिए एस्ट्रोस चक्र के चरण का उचित निर्धारण शामिल था। इस प्रक्रिया को सफलतापूर्वक करने के लिए, योनि एपिथेलियम के गुणवत्ता के नमूने प्राप्त करने और परिणामों की सही व्याख्या करना निर्णायक है (हम चित्रा 1के बाद सलाह देते हैं)। इसके अतिरिक्त, शोधकर्ताओं को ध्यान से इंजेक्शन प्रणाली को भरने के लिए हवा बुलबुले है कि दवाओं की गलत मात्रा के इंजेक्शन में परिणाम सकता है के समावेश को रोकने चाहिए । माइक्रोइंजेक्शन के दौरान जानवरों की निगरानी करना भी जरूरी है ताकि उन्हें ट्यूबिंग काटने से रोका जा सके या अन्यथा सिस्टम में दखल दिया जा सके । अंत में, प्रायोगिक स्थितियों के लिए अंधा शोधकर्ताओं ओव्यूलेशन के परिणाम का विश्लेषण करना चाहिए, कैनुला की अंतिम स्थिति और लक्ष्य क्षेत्र में समाधान के फैलाव को सुनिश्चित करने के लिए कि परिणामों की व्याख्या निष्पक्ष है ।

यहां ओव्यूलेशन के नियमन में मस्तिष्क के असतत क्षेत्रों के योगदान का विश्लेषण करने के लिए एक विश्वसनीय, लागत कुशल और सीधी विधि का वर्णन किया गया था। यह प्रक्रिया जाग और अनर्गल चूहों में की जाती है, न्यूरोट्रांसमिशन की नाकाबंदी के हानिकारक प्रभावों को पार करती है और यह भी निरोधात्मक प्रभाव है कि तनाव हार्मोन जैसे कोर्टिसोल और कोर्टिकोस्टेरोन जीएनआरएच स्राव पर डालती है। यह विधि पूरी तरह से अनुकूलन योग्य है और मस्तिष्क की किसी भी संरचना में किसी भी दवा को वितरित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, इसे प्रयोगशाला में उपयोग की जाने वाली सामान्य कृंतक और गैर-कृंतक प्रजातियों के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। अंत में, इस प्रोटोकॉल का उपयोग रक्त में हार्मोन और मेटाबोलाइट्स जैसे पदार्थों के मात्राकरण के तरीकों के साथ किया जा सकता है, कोशिकाओं और ऊतकों में जीन अभिव्यक्ति का आकलन, न्यूरोनल गतिविधि की रिकॉर्डिंग और विविध व्यवहार और शारीरिक प्रक्रियाओं में विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों की भूमिका निर्धारित करने के लिए व्यवहार परीक्षणों में जागते जानवरों का प्रदर्शन भी किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों को इस लेख के सापेक्ष खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है ।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि संपादन में उनकी बहुमूल्य मदद के लिए वाशिंगटन विश्वविद्यालय में रेमंड सांचेज के आभारी हैं और इस तकनीक के मानकीकरण में उनकी तकनीकी सहायता के लिए जॉर्जीना कोर्टेस और M.Sc सिंटिया जेवियर को M.Sc हैं । हम संकाय डी एस्टुडियोस सुपीरियर जरगोज़ा: एमवीजेड में पशु चिकित्सक सेवाओं के सदस्यों के आभारी भी हैं। एड्रियाना अल्तामिरानो, एमवीजेड। रोमन हर्नांडेज़ और एमवीजेड। प्रयोगात्मक जानवरों के उत्कृष्ट रखरखाव और देखभाल के लिए डोलोरेस-एलिजाबेथ गुज़मान। इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोगों को डीजीएपीए-PAPIIT अनुदान संख्या: IN216015 और CONACyT अनुदान संख्या द्वारा समर्थित किया गया था: रॉबर्टो डोमिनगुएज के 236908। कार्लोस-कैमिलो सिल्वा प्रोग्रामा डी डॉक्टराडो एन सिएंसियास बायोमेडिस, यूनीवर्सिड नैसिनल ऑटोनोमा डी मेक्सिको (यूएनएएम) से डॉक्टरेट छात्र हैं और इसे कॉन्सेजो नैसिनल डी सिनेसिया वाई टेक्नोलोगिया (ग्रांट नंबर: 294555) द्वारा समर्थित किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 μL Hamilton syringes Hamilton 80314
21 G x 1" stainless steel hypdermic needle BD 305165
23 G x 1" stainless steel hypdermic needle BD 305145
30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle BD 305106
Artificial cerebrospinal fluid BASi MD-2400
Bone trimer Fine Science Tools 16152-12
Burr for micro drill Fine Science Tools 19007-05
Clipper Wahl
Cut-off disc Dremel SM5010
Cutting tweezers Truper 17367
Cyanocrylate glue Kola loka K-1
Dental cement Nic Tone
Enrofloxasin Senosiain
Eosin Sigma E4009
Estereoscope Zeiss
Extra fine Bonn scissors Fine Science Tools 14084-08
Face mask Lanceta HG 60036
Graefe Forceps Fine Science Tools 11050-10
Hematoxilin Sigma H3136
Hemostats Fine Science Tools 13008-12
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Hydrochloric acid Sigma 320331
Hypromelose artificial tears Sophia Labs 8950015
Isoflurane Pisa Agropecuaria
Meloxicam Aranda 1183
Microinjection pump KD Scientific 788380
Monomer Nic Tone
Mototool Dremel 3000
Nitrile gloves Lanceta HG 69028
Non-Rupture Ear Bars David Kopf Instruments 855
Poly-L lysine Sigma P4707
Povidone-iodine Dermo Dine
Povidone-iodine with soap Germisin espuma
Pressure tweezers Truper 17371
Rat anesthesia mask David Kopf Instruments Model 906
Saline solution PISA
Scalpel Fine Science Tools 10004-13
Scalpel blade Fine Science Tools 10015-00
Sodium pentobarbital Pisa Agropecuaria
Standard electrode holder David Kopf Instruments 1770
Stainless steel wire American Orthodontic 856-612
Stereotaxic apparatus David Kopf Instruments Model 900LS
Surgical Sissors Fine Science Tools 14001-12
Teflon connectors Basi MD-1510
Teflon tubing Basi MF-5164
Tetrodotoxin Alomone labs T-500
Vaporizer Kent scientific VetFlo

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References

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टेट्रोडोटॉक्सिन माइक्रोइंजेक्शन द्वारा रिवर्सिबल निष्क्रियता के माध्यम से ओव्यूलेशन के नियमन में चूहे मस्तिष्क के असतत क्षेत्रों की भूमिका को सुलझाना
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