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Developmental Biology

वेनस कुरूपता के लिए एक रोगी-व्युत्पन्न Xenograft मॉडल

Published: June 15, 2020 doi: 10.3791/61501
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

हम शिरायस कुरूपता का एक मुरीन ज़ेनोबेड़ा मॉडल उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह मॉडल रोगी-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं के चमड़े के नीचे इंजेक्शन पर आधारित है जिसमें हाइपर-एक्टिवेट टाई2 और/या PIK3CA जीन म्यूटेशन होते हैं । Xenograft घावों बारीकी से वीएम रोगी ऊतक की हिस्टोपैथोलॉजिकल सुविधाओं को पुनः काटना।

Abstract

वेनस कुरूपता (वीएम) एक संवहनी विसंगति है जो शिरीन नेटवर्क के बिगड़ा विकास से उत्पन्न होती है जिसके परिणामस्वरूप फैली हुई और अक्सर बेकार नसों। इस लेख का उद्देश्य ध्यान से एक मुरीन ज़ेनोबेड़ा मॉडल की स्थापना का वर्णन करना है जो मानव वीएम की नकल करता है और रोगी विषमता को प्रतिबिंबित करने में सक्षम है। एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसी) में हाइपर-एक्टिवेटिंग गैर-विरासत (दैहिक) टेक (TIE2) और PIK3CA म्यूटेशन को वीएम में पैथोलॉजिकल पोत वृद्धि के मुख्य ड्राइवरों के रूप में पहचाना गया है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल उत्परिवर्ती TIE2 और/या PIK3CA व्यक्त रोगी व्युत्पन्न चुनाव आयोग के अलगाव, शुद्धि और विस्तार का वर्णन करता है । इन ईसी को एक्टाटिक वैस्कुलर चैनल उत्पन्न करने के लिए इम्यूनोडिफिशल एथेमिक चूहों के पीछे चमड़े के इंजेक्शन दिए जाते हैं। TIE2 या PIK3CA-उत्परिवर्ती चुनाव आयोग के साथ उत्पन्न घावों इंजेक्शन के 7 \ u20129 दिनों के भीतर संवहनी दिख रहे है और वीएम रोगी ऊतक की हिस्टोपैथोलॉजिकल सुविधाओं का पुनर्पूंजीकरण । यह वीएम ज़ेनोबेड़ा मॉडल वीएम गठन और विस्तार को चलाने वाले सेलुलर और आणविक तंत्र की जांच करने के लिए एक विश्वसनीय मंच प्रदान करता है। इसके अलावा, यह मॉडल मानव वीएम में देखे गए असामान्य पोत वृद्धि को रोकने में उपन्यास दवा उम्मीदवारों की प्रभावकारिता का परीक्षण करने वाले अनुवादात्मक अध्ययनों के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाता होगा।

Introduction

वैक्यूलेचर के विकास में दोष शिराय कुरूपता (वीएम) सहित कई बीमारियों का अंतर्निहित कारण हैं। वीएम एक जन्मजात रोग है जो असामान्य रूपोजेने की बीमारी है और नसों का विस्तार होता है1. वीएम ऊतक और एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसी) पर महत्वपूर्ण अध्ययनों ने दो,जीनों में लाभ-कार्य उत्परिवर्तनों की पहचान की है: टेक,जो टायरोसिन किनेज़ रिसेप्टर TIE2, और PIK3CAको एन्कोड करता है, जो पी110α (उत्प्रेरक उपइका) को एन्कोड करता है PI3-kinase (PI3K)2,3,4,5।,, इन दैहिक उत्परिवर्तनों के परिणामस्वरूप PI3K/AKT सहित प्रमुख एंजियोजेनिक/विकास सिग्नलिंग रास्तों के लिगांड-स्वतंत्र हाइपर-एक्टिवेशन होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप फैली हुई एक्टेटिक नसें3होती हैं । इन महत्वपूर्ण आनुवंशिक खोजों के बावजूद, असामान्य एंजियोजेनेसिस को ट्रिगर करने वाले बाद के सेलुलर और आणविक तंत्र और बढ़े हुए संवहनी चैनलों के गठन को अभी भी पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहा है।

सामान्य और पैथोलॉजिकल एंजियोजेनेसिस के दौरान, नए जहाजों को पहले से मौजूद संवहनी नेटवर्क से अंकुरित किया जाता है और ईसी प्रसार, प्रवासन, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) रिमॉडलिंग और ल्यूमेनगठन 6सहित महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं के अनुक्रम से गुजरता है। ईसी की विट्रो संस्कृतियों में दो और त्रि-आयामी (2D/3D) व्यक्तिगत रूप से इन सेलुलर गुणों में से प्रत्येक की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं। फिर भी, अनुवाद अनुसंधान के लिए लक्षित दवाओं के पूर्व-नैदानिक मूल्यांकन के लिए एक कुशल मंच प्रदान करते हुए मेजबान माइक्रोएनवायरमेंट के भीतर पैथोलॉजिकल पोत वृद्धि को पुनः प्राप्त करने वाले माउस मॉडल की स्पष्ट मांग है।

आज तक, TIE2 गेन-ऑफ-फंक्शन म्यूटेशन से जुड़े वीएम के ट्रांसजेनिक मुरीन मॉडल की रिपोर्ट नहीं की गई है। वर्तमान ट्रांसजेनिक वीएम माउस मॉडल सक्रिय उत्परिवर्तन PIK3CA p.H1047R3,,5की सर्वव्यापी या ऊतक-प्रतिबंधित अभिव्यक्ति पर भरोसा करते हैं। ये ट्रांसजेनिक जानवर इस हॉटस्पॉट PIK3CA उत्परिवर्तन के पूरे शरीर या ऊतक-विशिष्ट प्रभावों में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। इन मॉडलों की सीमा एक अत्यधिक रोग संवहनी नेटवर्क का गठन है जिसके परिणामस्वरूप प्रारंभिक घातकता होती है। इस प्रकार, ये माउस मॉडल वीएम पैथोलॉजी की उत्परिवर्तनीय घटनाओं और स्थानीयकृत प्रकृति की छिटपुट घटनाओं को पूरी तरह से प्रतिबिंबित नहीं करते हैं।

इसके विपरीत, रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोबेड़ा मॉडल रोग रोग ऊतक या रोगियों से प्राप्त कोशिकाओं के प्रत्यारोपण या इंजेक्शन पर आधारित हैं इम्यूनोडिडेंट चूहों में7। Xenograft मॉडल रोग के विकास और उपन्यास चिकित्सकीय एजेंटों की खोज के बारे में ज्ञान को व्यापक बनाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं8. इसके अलावा, रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं का उपयोग करने से वैज्ञानिकों को रोगी फेनोटाइप के स्पेक्ट्रम का अध्ययन करने के लिए उत्परिवर्तन विषमता को पुनः प्राप्त करने की अनुमति देता है ।

यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जहां रोगी-व्युत्पन्न वीएम ईसी जो TIE2 के एक उत्परिवर्ती संविलियन-सक्रिय रूप को व्यक्त करता है और/या PIK3CA को एथिमामिक नग्न चूहों के पीछे चमड़े के इंजेक्शन दिए जाते हैं । इंजेक्शन संवहनी कोशिकाओं को ईसीएम ढांचे में निलंबित किया जाता है ताकि एंजियोजेनेसिस को बढ़ावा दिया जा सके जैसा कि पिछले संवहनी ज़ेनोबेड़ा मॉडल 9 ,10,,11में वर्णित है ।10 ये वीएम ईसी महत्वपूर्ण रूपोजेने की मात्रा से गुजरते हैं और सहायक कोशिकाओं के अभाव में बढ़े हुए, छिद्रित रोग वाहिकाओं उत्पन्न करते हैं। वीएम का वर्णित ज़ेनोबेड़ा मॉडल अनियंत्रित ल्यूमेन विस्तार को बाधित करने की क्षमता के लिए लक्षित दवाओं के पूर्व नैदानिक मूल्यांकन के लिए एक कुशल मंच प्रदान करता है।

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Protocol

सिनसिनाटी चिल्ड्रन हॉस्पिटल मेडिकल सेंटर (सीसीएचएमसी), कैंसर और ब्लड डिजीज इंस्टीट्यूट में एक अनुमोदित संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) प्रति संस्थागत नीतियों के तहत ऊतक के नमूनों और ट्यूमर और वैस्कुलर विसंगतियों के साथ रोगियों से सूचित सहमति और नैदानिक जांच पर समिति के अनुमोदन के साथ रोगी ऊतक नमूनों को प्रतिभागियों से प्राप्त किया गया था । नीचे वर्णित सभी पशु प्रक्रियाओं की समीक्षा की गई है और सीसीएचएमसी संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. सामग्री और स्टॉक समाधान की तैयारी

  1. पूर्ण एंडोथेलियल सेल ग्रोथ मीडियम (ईजीएम) की तैयारी
    1. किट में मौजूद निम्नलिखित विकास कारकों के साथ एंडोथेलियल बेसल माध्यम (ईबीएम) का पूरक (सामग्री की तालिकादेखें): मानव फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर-बीटा (एचएफजीएफ-ए), वैस्कुलर एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (VEGF), लांग Arg3 इंसुलिन की तरह विकास कारक- I (R 3-IGF-I), एस्कोर्बिक एसिड, एस्कॉर्बिक एसिड, एस्कोर्बिक एसिड, एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ), जेनटामाइसिन सल्फेट और एम्फोटेरिसिन-बी और हेपरिन।3 इसमें 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन/एल-ग्लूटामाइन (पीएसजी) सॉल्यूशन और 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) जोड़ें ।
      नोट: हम हाइड्रोकॉर्टिसोन जोड़ने की सलाह नहीं देते हैं।
    2. बाँझ एक 0.2 माइक्रोन बोतल शीर्ष फिल्टर के माध्यम से एक लैमिनार प्रवाह हुड के तहत समाधान को एक ऑटोक्लेवेड ग्लास बोतल में और एलिकोट मीडिया को 50 एमएल शंकु ट्यूबों में फ़िल्टर करें और एक सप्ताह तक या एक वर्ष तक -20 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. कोलेजनेज़ एक स्टॉक समाधान तैयार करें
    1. 50 मिलीग्राम/एमएल कोलेजनेस 1x फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) में एक स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें।
    2. बाँझ 0.2 माइक्रोन फिल्टर और सिरिंज के साथ एक लेमिनार प्रवाह हुड के तहत समाधान फ़िल्टर करें, और -20 डिग्री सेल्सियस पर 100 माइक्रोल एलिककोट स्टोर करें।
  3. ऊतक संग्रह माध्यम तैयार करें (बफर ए)
    1. 0.927ग्राम कैल्शियम क्लोराइड डिहाइड्रेट (सीएसीएल2 .2H 2O)और 1 ग्राम मैग्नीशियम सल्फेट हेप्टाहाइड्रेट (MgSO4.7H 2O) को 500 मिली लीटर आसुत पानी में जोड़कर सीए2+ /एमजी 2+ स्टॉक समाधान तैयार करें। बाँझ एक ऑटोक्लेव ग्लास की बोतल में एक 0.2 माइक्रोन बोतल शीर्ष फिल्टर के माध्यम से समाधान फिल्टर और कमरे के तापमान (आर टी) पर स्टोर।
    2. 10% सीए2 + /एमजी 2 +समाधान और 2% एफबीएस के साथ दुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) को पूरक करें।
    3. बाँझ 0.2 माइक्रोन फिल्टर और सिरिंज के साथ एक लैमिनार प्रवाह हुड के तहत समाधान फ़िल्टर और -20 डिग्री सेल्सियस पर 5 एमएल के aliquots स्टोर।
  4. ऊतक संस्कृति प्लेटों की फाइब्रोनेक्टिन कोटिंग
    1. 500 एमएल डिओनाइज्ड वाटर में 5.3 ग्राम सोडियम कार्बोनेट(एनए 2सीओ3;0.1 एम) को घोलकर कोटिंग बफर (बफर बी) तैयार करें। 1 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) का उपयोग करके बफर के पीएच को 9.4 तक समायोजित करें। एक ऑटोक्लेव ग्लास की बोतल में एक 0.2 माइक्रोन बोतल शीर्ष फिल्टर के माध्यम से एक लैमिनार प्रवाह हुड के नीचे फ़िल्टर करें और आरटी में स्टोर करें।
    2. कोटिंग के लिए, पिपेट 2 एमएल/5 एमएल/10 एमएल बफर बी प्रति 60 मिमी/100 मिमी/145 मिमी ऊतक संस्कृति प्लेट, क्रमशः । मानव प्लाज्मा फाइब्रोनेक्टिन शुद्ध प्रोटीन समाधान के 1 μg/सेमी2 जोड़ें और धीरे से थाली पर तरल वितरित ।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट प्लेट,20 मिनट के लिए 5% सीओ 2।
    4. बफर बी को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को बनाने से पहले पीबीएस के साथ प्लेट धोएं।

2. वीएम रोगी ऊतक से एंडोथेलियल कोशिकाओं का अलगाव

  1. ठोस वीएम ऊतक से चुनाव आयोग का अलगाव
    नोट: वीएम ऊतक एक आईआरबी अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत सर्जरी12,,13 debulking द्वारा पुनः प्राप्त है ।
    1. पीबीएस में 5% पीएसजी में वीएम ऊतक (ऊतक नमूना वजन आमतौर पर 0.5 ग्राम और 1.5 ग्राम के बीच होता है) धोएं।
    2. एक 100 मिमी सेल संस्कृति पकवान के लिए ऊतक हस्तांतरण, बाँझ शल्य विच्छेदन उपकरण का उपयोग कर छोटे टुकड़ों में कीमा ऊतक नमूना, और एक 50 मिलीएल शंकु ट्यूब में स्थानांतरित।
    3. कोलेजनासे के 100 माइक्रोन जोड़ें 1 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए बफर ए के 5 एमएल में स्टॉक समाधान, फिर इसे ऊतक में जोड़ें और हर 5 मिनट में सामग्री मिलाते हुए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कीमा बनाया हुआ ऊतक पचा लें।
    4. 50 एमएल शंकु नली के भीतर 6 मिमी, चिकनी सतह मूसल ग्राइंडर का उपयोग करके आरटी में पचाए गए ऊतकों को ध्यान से पीसें।
    5. 0.5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) और 2% पीएसजी के साथ पूरक ठंडे पीबीएस के 5 एमएल जोड़ते समय एक मूसल का उपयोग करके पचाने वाले ऊतकों को ध्यान से पीसने के लिए जारी रखें। इस स्टेप को चार बार दोहराएं।
    6. ऊतक के टुकड़ों को हटाने के लिए 50 एमएल शंकु नली में 100 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से समाधान को फ़िल्टर करें।
    7. आरटी में 400 एक्स जी पर 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज सेल सस्पेंशन। 2.3 कदम के लिए आगे बढ़ें।
  2. रोगी स्क्लेरोथेरेपी से प्राप्त घाव रक्त से वीएम ईसी का अलगाव
    1. आईआरबी अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत स्क्लेरोथेरेपी से मानव वीएम घाव रक्त प्राप्त करें।
    2. पीबीएस में पतला घाव रक्त (नमूना मात्रा आमतौर पर 0.5 एमएल और 5 एमएल के बीच होती है) 40 एमएल की अंतिम मात्रा तक।
    3. आरटी में 200 एक्स जी पर 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज सेल सस्पेंशन।
  3. प्रारंभिक सेल चढ़ाना
    1. सुपरनेट को त्यागें और ईजीएम के 1 एमसीएल में सिंगल-सेल पेलेट को फिर से रीसस्ट करें।
    2. फाइब्रोनेक्टिन-लेपित (1 μg/cm²) 100 मिमी प्लेटें और सेल निलंबन के बीज 1 मिलीएल पर पूर्ण ईजीएम के 9 मिलीएल जोड़ें।
    3. एक आर्द्र 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट कोशिकाओं।
    4. हर दूसरे दिन मीडिया के 2 एमएल निकालें और बाँझ फ़िल्टर एफबीएस के 2 एमएल जोड़ें।
    5. एक बार सेल संस्कृतियों 40 \u201250% की एक उदारता तक पहुंचने के माध्यम को पूरा करने के लिए ईजीएम को पूरा करने के लिए बदल जाते हैं । यह आम तौर पर कोशिकाओं के लिए इस मांग तक पहुंचने के लिए 2 \ u20123 सप्ताह के बीच लेता है ।
    6. ईसी कॉलोनियों की उपस्थिति के लिए दैनिक निरीक्षण करें। उन्हें उनके विशिष्ट "कोबलस्टोन-जैसे" आकृति विज्ञान(चित्रा 1A)द्वारा पहचाना जा सकता है। 3 \u20125 के बीच ईसी-कालोनियों प्रत्येक नमूने में दिखाई देते हैं ।
    7. एक और 5 \ u20127 दिनों के लिए हर दूसरे दिन माध्यम बदलें जब तक व्यक्तिगत चुनाव आयोग कालोनियों एक दूसरे को छूने के लिए शुरू करते हैं ।
  4. व्यक्तिगत ईसी कॉलोनियों का मैनुअल अलगाव
    1. ईसी कालोनियों को फसल करने के लिए, पीबीएस के 5 एमएल के साथ प्लेट धोएं और मैन्युअल रूप से एक सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ एस्पिरेट करें।
    2. प्लेट को माइक्रोस्कोप में ले जाएं और इसे लैमिनार फ्लो हुड में लौटने से पहले ढक्कन और नीचे दोनों पर एक अंकन पेन का उपयोग करके कई ईसी कॉलोनियों के स्थानों को सर्कल करें।
    3. चिह्नित क्षेत्रों पर 0.05% ट्राइप्सिन-ईडीटीए समाधान के 50 माइक्रोन को पाइप करके ईसी कॉलोनियों को अलग करें।
    4. एक छोटे सेल स्क्रैपर या एक पिपेट टिप का उपयोग करना, धीरे प्लेट से कोशिकाओं को परिमार्जन।
    5. प्लेट को निकटतम किनारे पर झुकाएं, और प्रति चिह्नित क्षेत्र ईजीएम के 1 एमएल के साथ कुल्ला करें और कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
    6. हीमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की संख्या गिनें।
    7. ताजा ईजीएम युक्त फाइब्रोनेक्टिन-लेपित (1 μg/cm²) सेल संस्कृति व्यंजनों पर 1 x 104 कोशिकाओं/सेमी2 के घनत्व पर एकत्र ईसी कालोनियों को प्लेट करें । अगले दिन, ईजीएम को पूरा करने के लिए माध्यम बदलें।
    8. 2\u20123 सप्ताह के लिए हर दूसरे दिन ईजीएम को पूरा करने के लिए माध्यम बदलें जब तक कि कोशिकाएं 80% पूर्णता तक न पहुंच जाए।
    9. 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्री-गर्म 0.05% ट्राइपसिन-ईडीटीए प्रति 100 मिमी डिश के 2 मिलील के साथ ईसी को ट्राइपसिनाइज करें और ईजीएम के 4 मिलियन जोड़कर ट्राइपसिन को बेअसर करें।
    10. सेल निलंबन को 5 मिनट के लिए आरटी में 400 x ग्राम पर एक 15 एमएल शंकु नली और अपकेंद्रित्र में ले लीजिए। ईजीएम के 2 एमएल में सुपरनेट और रिसिपेंड कोशिकाओं को एस्पिरेट करें।
    11. हीमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की संख्या गिनें। विशिष्ट सेल संख्या प्राप्त 1 x 106 कोशिकाओं प्रति 60 मिमी सेल संस्कृति प्लेट या 2 x 106 कोशिकाओं प्रति 100 मिमी ऊतक संस्कृति प्लेट हैं।
    12. 5 मिनट के लिए आरटी में 400 x g पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को गोली और सुपरनेट को एस्पिरेट करें। 3.2.1 कदम पर आगे बढ़ें।

3. एंडोथेलियल सेल चयन और विस्तार

  1. एंटी-सीडी 31-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों की तैयारी
    1. भंवर 30 एस के लिए विरोधी CD31-conjugated चुंबकीय मोती युक्त शीशी । आवश्यक मोतियों की संख्या 8 x 106 मोती/2 x 106 कोशिकाएं हैं।
    2. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में पीबीएस में 0.1% बीएसए युक्त वॉश सॉल्यूशन के 1 मिलील के साथ एंटी-सीडी 31-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों की वांछित मात्रा धोएं।
    3. माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को 1 मिनट के लिए सेल आइसोलेशन चुंबक में रखें।
    4. सुपरनेट को एस्पिरेट करें और वाशिंग स्टेप दोहराएं।
  2. एंडोथेलियल सेल शुद्धिकरण और चढ़ाना
    1. रिसिपेंड सेल गोली पीबीएस में 0.1% बीएसए युक्त वॉश सॉल्यूशन के 500 माइक्रोन में 2.4.12 में प्राप्त की गई।
    2. चुंबकीय मोतियों वाली माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में सेल समाधान जोड़ें और अच्छी तरह से पुनर्निर्भर करें।
    3. कोमल झुकाव के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    4. पीबीएस में 0.1% बीएसए के 500 माइक्रोन जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं।
    5. ट्यूब को 1 मिनट के लिए सेल आइसोलेशन चुंबक पर रखें।
    6. धीरे-धीरे सभी तरल को एस्पिरेट करें, जिसमें मोतियों को छूने के बिना कोशिकाओं का सीडी 31-नकारात्मक अंश शामिल है।
    7. पीबीएस में 0.1% बीएसए के 1 मिलील के साथ सीडी 31-पॉजिटिव सेल अंश वाले मनका गोली को धोएं और चुंबकीय पृथक्करण दोहराएं।
    8. CD31-सकारात्मक कोशिका अंश को शुद्ध करने के लिए न्यूनतम 3 बार के लिए धोने और चुंबकीय पृथक्करण चरण दोहराएं।
    9. 15 एमएल शंकु नली में शुद्ध एंडोथेलियल कोशिकाओं को फिर से 15 रीसपेंड करें और आरटी में 400 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए नीचे स्पिन करें।
    10. ईजीएम के 1 एमएल में सुपरनेट और रिसिपेंड सेल पेलेट निकालें।
    11. फाइब्रोनेक्टिन-लेपित (1 μg/cm²) 100 मिमी प्लेटें और सेल निलंबन के बीज 1 मिलीएल पर पूर्ण ईजीएम के 9 मिलीएल जोड़ें। ध्यान दें कि कुछ चुंबकीय मोती अभी भी इस प्रारंभिक सीडिंग चरण में कोशिकाओं से जुड़े हुए हैं। अधिकांश मोती कोशिका विस्तार के दौरान धोते हैं, लेकिन मोतियों की छोटी संख्या प्रारंभिक मार्ग में बनी रह सकती है।
    12. एक आर्द्र 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट कोशिकाओं।
    13. जब तक कोशिकाएं 80% योग्यता(चित्रा 1B)तक नहीं पहुंच जातीं, तब तक हर दूसरे दिन माध्यम बदलें।
  3. एंडोथेलियल सेल विस्तार
    1. एक बार कोशिकाओं को 80% संकुचन तक पहुंचने, 0.05% ट्रिपपिन-EDTA प्रति 100 मिमी पकवान के 2 ml के साथ अलग 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए।
    2. ईजीएम के 4 एमएल जोड़कर ट्राइप्सिन को बेअसर करें और कोशिकाओं को एक 15 एमएल शंकु नली में इकट्ठा करें।
    3. 5 मिनट के लिए आरटी में 400 x g पर सेंट्रलाइज।
    4. ईजीएम के 2 एमसीएल में सुपरनैंट, रिसिपेंड कोशिकाओं को एएसपाइरेट करें, और हीमोसाइटोमीटर के साथ या स्वचालित सेल काउंटिंग द्वारा कोशिकाओं की संख्या गिनें।
    5. 1 x 104 कोशिकाओं/सेमी² के घनत्व पर बीज कोशिकाएं 145 मिमी फाइब्रोनेक्टिन-लेपित (1 μg/cm²) ऊतक संस्कृति प्लेटों में।
    6. वांछित कोशिका संख्या मिलने तक कोशिकाओं को पारित करना जारी रखें। विचार करें कि एक कॉन्फ्ल्यूंट 145 मिमी ऊतक संस्कृति प्लेट में लगभग 8\u20129 x 106 कोशिकाएं होती हैं और आवश्यक कोशिकाओं की संख्या प्रति इंजेक्शन 2.5 x10 6 कोशिकाएं होती हैं। केवल 3 और 8 मार्ग के बीच कोशिकाओं को ज़ेनोबेड़ा के लिए माना जाना चाहिए।

4. वीएम रोगी-व्युत्पन्न xenograft प्रोटोकॉल

नोट: इस प्रोटोकॉल में हम 5\u20126 सप्ताह पुराने, पुरुष इम्यूनोडिफिशिएंसी, एथिमिक न्यूड फॉक्सएन1 एनयू चूहों का उपयोगकरते हैं।

सभी पशु प्रक्रियाओं को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए ।

  1. इंजेक्शन से पहले दिन सामग्री की तैयारी
    1. रात भर -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में प्री-चिल सीरिंज, सुई और पाइप युक्तियां।
    2. जेल की बढ़ी हुई चिपचिपाहट से बचने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखी गई बर्फ बाल्टी पर रात भर बेसमेंट झिल्ली एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स (बीएमईएम) को धीरे-धीरे पिघलाएं।
  2. इंजेक्शन के लिए सेल निलंबन की तैयारी
    1. 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 145 मिमी डिश के 5 मिलीलन के साथ ईसी को ट्रिपसिनाइज करें।
    2. ईजीएम के 5 एमएल जोड़कर ट्राइप्सिन को बेअसर करें और कोशिकाओं को एक 15 एमएल शंकु नली में एकत्र करें।
    3. 5 मिनट के लिए आरटी में 400 x g पर सेंट्रलाइज।
    4. ईजीएम के 3 एमएल में सुपरनैंट, रिसिपेंड कोशिकाओं को एएसपाइरेट करें, और हीमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
    5. सभी नियोजित इंजेक्शन के लिए आवश्यक कोशिकाओं की कुल संख्या निर्धारित करें।
      नोट: कोशिकाओं की अनुशंसित संख्या प्रति इंजेक्शन 2.5 x 106 कोशिकाएं हैं। तकनीकी डुप्लिकेट के लिए प्रत्येक माउस में कुल 2 इंजेक्शन आमतौर पर किए जाते हैं। सिरिंज में स्थानांतरण के दौरान नुकसान के लिए खाते में सेल नंबर की 10% अधिक गणना करना आवश्यक है।
    6. गणना की गई कोशिका संख्या वाले वॉल्यूम को 5 मिनट के लिए आरटी में 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा एक नए 50 एमएल शंकु नली और पैलेट कोशिकाओं में स्थानांतरित करें।
    7. पैलेट को एस्पिरेट करें, पैलेट को ढीला करने के लिए एक छोटी मात्रा (लगभग 50\u201270 μL) छोड़ दें।
  3. सिरिंज की तैयारी
    1. सिरिंज में स्थानांतरण के दौरान नुकसान के लिए खाते में 20 माइक्रोन/इंजेक्शन की अतिरिक्त मात्रा की गणना करें । बर्फ पर प्रति इंजेक्शन बीएमईएम के 220 माइक्रोल के साथ सेल पेलेट को फिर से रीसस्ट करें। कोशिका निलंबन की इंजेक्शन मात्रा 200 माइक्रोल प्रति घाव होगी।
    2. एक समरूप सेल निलंबन प्राप्त करने और बुलबुले बनाने से बचने के लिए बर्फ पर सेल निलंबन को अच्छी तरह से मिलाएं।
    3. 1 एमएल पिपेट और 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके, सिरिंज के प्लंजर को खींचते समय सक्शन बल द्वारा सिरिंज खोलने में एक साथ बीएमईएम-सेल मिश्रण पिपेट करें।
    4. Luer सिरिंज के लिए एक 26G x 5/8 इंच बाँझ सुई ताला और इंजेक्शन से पहले बर्फ पर तैयार सिरिंज फ्लैट रखो ।
  4. माउस में चमड़े के नीचे इंजेक्शन
    1. एक आइसोफ्लुन वाष्पीकरण का उपयोग कर 1 एल/मिन की प्रवाह दर पर 5% आइसोफ्लुनाणे/ऑक्सीजन मिश्रण के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें । जानवरों की उचित बेहोशी सुनिश्चित करें (उदाहरण के लिए, उंगलियों के लिए अनुत्तरदायी चुटकी)। नाक शंकु के माध्यम से वितरित 1.5% आइसोफ्लाणेन/ऑक्सीजन के निरंतर प्रशासन के माध्यम से संज्ञाहरण बनाए रखें।
    2. चूहों को उनके पेट पर रखें, पीछे के क्षेत्र को उजागर करें जहां ग्राफ्टिंग होगी और इंजेक्शन क्षेत्र को 70% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित करें।
    3. किसी भी बसे कोशिकाओं को फिर से खर्च करने के लिए तैयार सिरिंज को धीरे से रोल करें। सिरिंज के सुई अंत में बुलबुले झटका और सभी बुलबुले को हटाने सुनिश्चित करने के लिए सेल निलंबन की एक छोटी मात्रा निष्कासित।
      नोट: प्रत्येक माउस के लिए दो इंजेक्शन किए जा सकते हैं - बाईं ओर और माउस के दाईं ओर वापस।
    4. चुटकी और अपने अंगूठे और तर्जनी का उपयोग कर एक 'तम्बू की तरह' संरचना बनाने के लिए और त्वचा के नीचे सही सुई डालने। सुनिश्चित करें कि सुई मांसपेशियों के ऊतकों में इंजेक्शन को रोकने के लिए चुटकी त्वचा जारी करके केवल त्वचा गहरी है।
    5. 45 डिग्री कोण पर सुई पकड़े ध्यान से एक छोटे गोलाकार द्रव्यमान(चित्रा 1C)बनाने के लिए सेल-निलंबन के 200 माइक्रोन इंजेक्ट।
    6. एक पैमाने के साथ माउस वजन रिकॉर्ड, कान माउस टैग, और पिंजरे में लौटने के लिए।
    7. यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे सामान्य गतिविधि पर लौटें, स्पनेशन के बाद चूहों की निगरानी करें।
  5. घाव विकास निगरानी
    1. एक कैलिपर का उपयोग करके, प्रत्येक प्लग(चित्रा 1D)की लंबाई और चौड़ाई को मापें।
    2. दस्तावेज़ माप हर दूसरे दिन घाव संग्रह तक ऊपर ।

5. ऊतक संग्रह और प्रसंस्करण

  1. चूहों को 9 दिन बाद एक सीओ2 कक्ष में प्रत्यारोपण और मौत की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण संकेतों की जांच करें । माउस को इच्छामृत्यु के लिए एक माध्यमिक विधि के रूप में चूहों पर गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था करें।
  2. सर्जिकल संदंश और कैंची का उपयोग करके विच्छेदन द्वारा माउस के पार्श्व से xenograft घाव/प्लग फसल।
    नोट: प्लग के भीतर रक्त से भरे जहाजों को टूटने से रोकने के लिए, विच्छेदन उपकरणों के साथ घाव प्लग को छूने से बचना और प्लग से जुड़ी त्वचा जैसे अत्यधिक आसपास के ऊतकों को छोड़ना महत्वपूर्ण है।
  3. धोने के लिए पीबीएस में पुनः प्राप्त घाव विसर्जित करें।
  4. कैमरे के साथ एक कैमरा स्टेज सेट करें। एक शासक के साथ एक काटने बोर्ड पर प्लग संरेखित करें। घावों की सकल संवहनी रिकॉर्ड करने के लिए सभी प्लग की एक छवि लें(चित्रा 1E)।
  5. आरटी में रात भर 10% फॉर्मल में डूबने से प्लग फिक्स करें।
  6. अगले दिन पीबीएस में प्लग धोएं और उन्हें 70% इथेनॉल में ले जाएं।
  7. पैराफिन एम्बेडिंग (पैथोलॉजी कोर) के लिए प्रक्रिया घाव प्लग।

6. घाव अनुभागिंग

  1. सकारात्मक आवेशित स्लाइडों पर एकत्र मुरीन घावों से 5 माइक्रोन अनुभागों को काटने के लिए एक माइक्रोटॉम का उपयोग करें।
    नोट: बाद के विश्लेषण के लिए, प्लग के केंद्र में वर्गों (ऊतक में लगभग 50 \u201270 μm) महत्व के हैं ।
  2. धुंधला होने से पहले 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर पैराफिन पिघलाएं।
  3. एक रासायनिक धुएं प्रवाह हुड के तहत क्रमिक रूप से ऊतक को डी-पैराफिनाइज और फिर से हाइड्रेट करें। इसलिए, 10 मिनट के लिए जाइलीन में इनक्यूबेट स्लाइड, 5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल (एटोह), 3 मिनट के लिए 90% एटोह, और 3 मिनट के लिए 80% एटोह।
  4. 5 मिनट के लिए डिवोनाइज्ड पानी में स्लाइड कुल्ला।

7. हेमटॉक्सीलिन और ईओसिन (एच एंड ई)

  1. हेमटॉक्सीलिन में 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट सेक्शन।
  2. एक धुंधला जार में स्लाइड रखें और पानी साफ होने तक नल के पानी की एक सतत धारा से एक सिंक में कुल्ला ।
  3. 1 मिनट के लिए 70% एटोह में ऊतक क्रमिक रूप से इनक्यूबेटिंग करके डी-हाइड्रेट स्लाइड, 1 मिनट के लिए 80% एटोह, 1 मिनट के लिए 90% एटोह, 1 मिनट के लिए 100% एटोह, और 1 मिनट के लिए ताजा 100% एटोह।
  4. 30 एस के लिए Eosin Y में दाग वर्गों।
  5. समाधान स्पष्ट होने तक ताजा 100% एटोह में कुल्ला करें।
  6. 2 मिनट के लिए जाइलीन में इनक्यूबेट स्लाइड। स्लाइड धूम हुड के तहत 5\u201210 मिनट के लिए सूखी चलो ।
  7. ज़ेनोग्राफ्ट सेक्शन और शीर्ष पर कवरस्लिप स्थान पर स्थायी, गैर-जलीय बढ़ते माध्यम की एक बूंद वितरित करें।
  8. इमेजिंग से पहले स्लाइड को रात भर सूखने दें।

8. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

  1. 0.6 ग्राम त्रिस-बेस और 0.5 एम ईडीटीए के 1 एमएल से 500 मिलियन मिलियन डियोनाइज्ड पानी का वजन करके एंटीजन रिट्रीवल बफर (ट्रिस-ईडीटीए) तैयार करें। पीएच को 1 एम एचसीएल का उपयोग करके 9.0 में समायोजित करें। ट्वीन-20 के 250 माइक्रोन जोड़ें।
  2. एंटीजन रिट्रीवल बफर के साथ एक बीकर में, 95 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए, एंटीजन रिट्रीवल बफर के साथ एक बीकर में 6.2\u20126.3 चरण में प्राप्त किए गए 2010 ऊतक स्लाइड (जैसा कि चरण 6.2\u20126.3 में प्राप्त किया गया है) ।
  3. हीटिंग ब्लॉक से बीकर निकालें, समाधान को 35 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने की अनुमति दें फिर 3 मिनट के लिए पीबीएस में धो लें।
  4. आर टी में 30 मिनट के लिए पीबीएस में 5% सामान्य घोड़े सीरम में ऊतक वर्गों ब्लॉक।
  5. पीबीएस में 5% सामान्य घोड़े सीरम में बायोटिनाइलेटेड यूईए-1 के 20 माइक्रोग्राम/एमएल को कमजोर करके एक बायोटिनिलेटेड उलेक्स यूरोपियस एग्लुटिनिन-I (यूईए-आई) वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करें ।
  6. पिपेट 50\u2012100 μL के UEA-I काम समाधान प्रति अनुभाग और एक ह्यूमिडिफिकिंग चैंबर में आरटी में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट ।
  7. 3 मिनट के लिए पीबीएस में दो बार स्लाइड धोएं।
  8. आरटी में 5 मिनट के लिए 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड में स्लाइड सेक्शन को बुझाएं।
  9. 3 मिनट के लिए पीबीएस में दो बार स्लाइड धोएं।
  10. PBS में 5% सामान्य हॉर्स सीरम में स्ट्रेप्टाविडिन सहिजन स्वॉक्सिडास-कंजूसी के 5 μg/ml तैयार करें ।
  11. प्रत्येक ऊतक स्लाइड पर पिपेट 50\u2012100 μL और एक ह्यूमिडिफाइंग चैंबर में आरटी में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
  12. 3 मिनट के लिए पीबीएस में दो बार स्लाइड धोएं।
  13. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 3,3'3'डियामिनोबेन्ज़िडीन (डीएबी) समाधान तैयार करें और प्रति अनुभाग 50\u2012100 μL जोड़ें।
  14. 10\u201215 मिनट के लिए इनक्यूबेट सेक्शन, हर 2\u20125 मिनट दाग के विकास के लिए जांच और निगरानी।
  15. 3 मिनट के लिए पीबीएस में तीन बार स्लाइड धोएं।
  16. हेमटॉक्सीलिन की एक बूंद जोड़ें और 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  17. एक धुंधला जार में स्लाइड रखें और पानी साफ होने तक नल के पानी की एक सतत धारा से एक सिंक में कुल्ला ।
  18. 1 मिनट के लिए 80% एटोह में क्रमिक रूप से इनक्यूबेट स्लाइड, 1 मिनट के लिए 90% एटोह, 1 मिनट के लिए 100% एटोह, और 2 मिनट के लिए जाइलीन।
  19. स्लाइड धूम हुड के तहत 5\u201210 मिनट के लिए सूखी चलो ।
  20. ज़ेनोग्राफ्ट सेक्शन और शीर्ष पर कवरस्लिप स्थान पर स्थायी, गैर-जलीय बढ़ते माध्यम की एक बूंद वितरित करें।
  21. इमेजिंग से पहले स्लाइड को रात भर सूखने दें।

9. मानव-व्युत्पन्न संवहनी चैनलों का विश्लेषण

नोट: संवहनी क्षेत्र और संवहनी घनत्व को मापने के द्वारा वीएम घावों की संवहनीता की मात्रा निर्धारित की जाती है। केवल यूईए-1 सकारात्मक, मानव-व्युत्पन्न संवहनी चैनलों को परिमाणीकरण के लिए माना जाता है।

  1. 20x आवर्धन (उच्च शक्ति क्षेत्र [एचपीएफ] पर एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ घाव अनुभाग प्रति चार से पांच छवियां लें। ओवरलैप(चित्रा 1F-H)से बचने के लिए घाव अनुभाग के भीतर एक एक्स-प्लेन पैटर्न में एचपीएफ छवियों को लें। ली गई छवियों पर एक स्केल बार शामिल करें।
  2. इमेज जे(फाइल एंड जीटी; ओपन) में एचपीएफ इमेजेज खोलें। स्केल बार के पिक्सल को इस प्रकार ही कैलिब्रेट करें। सीधी रेखा उपकरण का उपयोग करें और स्केल बार पर जाएं। मापा पिक्सल को विश्लेषण और जीटी सेट स्केलपर मिमी क्लिक में परिवर्तित करने के लिए ।
  3. विश्लेषण और जीटी पर क्लिक करें; माप सेट करें और क्षेत्र का चयन करें और ओवरले में जोड़ें।
  4. विश्लेषण और उपाय का उपयोग करके एचपीएफ में कुल क्षेत्र क्षेत्र को मापें। चरण 9.8 में मात्राकरण के लिए इस माप को सहेजें।
  5. फ्रीहैंड चयन उपकरण का उपयोग करके, मैन्युअल रूप से यूईए-आई+ वैस्कुलर चैनलों को रेखांकित करें।
    नोट: एक संवहनी चैनल को किसी भी क्षेत्र के रूप में परिभाषित किया गया है जो यूईए-I+ के साथ लाइन में खड़ा है - ईसी जिसमें रक्त कोशिकाएं हो सकती हैं।
  6. उल्लिखित यूईए-1 + वैस्कुलर क्षेत्र(एमएम 2/एचपीएफ)की मात्रा निर्धारित करने के लिए विश्लेषण और जीटी पर क्लिक करें ।+
  7. एक प्लग के भीतर लिए गए सभी पांच एचपीएफ के लिए इस माप को दोहराएं।
  8. सभी पांच एचपीएफ के कुल संवहनी क्षेत्र का औसत। एचपीएफ प्रति प्राप्त संवहनी क्षेत्र को बाद में एचपीएफ क्षेत्र(एमएम 2, चरण 9.5में) द्वारा विभाजित किया जाता है और एक प्रतिशत (%) के रूप में व्यक्त किया जाता है।
  9. संवहनी घनत्व की मात्रा के लिए, प्रत्येक एचपीएफ के यूईए-1+ संवहनी चैनलों की संख्या की गणना करें। संवहनी घनत्व एचपीएफ क्षेत्र (जहाजों/मिमी2)के अनुसार गिना जाने वाले यूईए-1+ संवहनी चैनलों की औसत संख्या है ।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल इम्यूनोडिडेंट न्यूड चूहों के पीछे रोगी-व्युत्पन्न ईसी के चमड़े के नीचे इंजेक्शन के आधार पर वीएम के एक मुरीन ज़ेनोबेड़ा मॉडल उत्पन्न करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है। एंडोथेलियल सेल कालोनियों को वीएम ऊतक या घाव रक्त(चित्रा 1A, बी)से प्रारंभिक सेल अलगाव के बाद 4 सप्ताह के भीतर काटा जा सकता है। इंजेक्शन के बाद दिन, ज़ेनोबेड़ा घाव प्लग लगभग 80\u2012100 मिमी2के सतह क्षेत्र को कवर करता है। हमारे हाथों में, TIE2/PIK3CA-उत्परिवर्ती चुनाव आयोग के साथ घाव प्लग इंजेक्शन 14,,15 (चित्रा1-ई) से 7 \ u20129 दिनों के भीतर ढरंगे और perfused दिख रहे हैं ।C-E हालांकि, घाव वृद्धि की सीमा चर है और रोगी और नमूना विषमता पर दर्शाता है।

घाव प्लग मानव वीएम ऊतक की हिस्टोपैथोलॉजिकल विशेषताओं को बारीकी से पुन: रीकैपिटल करते हैं: एंडोथेलियल कोशिकाओं की एक पतली परत(चित्रा 1एफ\u2012H)द्वारा रेखांकित बढ़े हुए संवहनी चैनल। इन संवहनी संरचनाओं में आम तौर पर एरिथ्रोसाइट्स होते हैं, जो मेजबान माउस वेक्यूलेचर(चित्रा 1एफ\u2012H)के साथ कार्यात्मक एनास्टोमोस की पुष्टि करते हैं। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल मानव विशिष्ट लेक्टिन यूईए-आई का उपयोग करके धुंधला इस बात की पुष्टि कर सकता हूं कि संवहनी घावों को अस्तर करने वाली कोशिकाएं माउस वेक्यूलेचर(चित्रा 1H)के बजाय मानव प्रत्यारोपित कोशिकाओं से प्राप्त होती हैं। वीएम-ईसी अलगाव से घाव प्लग के विच्छेदन के लिए कदम ों का सारांश एक योजना चित्रा 2में प्रस्तुत की गई है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रतिनिधि परिणाम।
(A)ईसी चयन से पहले वीएम टिश्यू से अलगाव के तीन हफ्ते बाद प्राइमरी मिक्स्ड सेल कल्चर की प्रतिनिधि छवि। विशिष्ट एंडोथेलियल सेल कॉलोनी (ईसी) और दूषित फाइब्रोब्लास्ट (एफबी)। (ख)वीएम रोगी-व्युत्पन्न ऊतकों से शुद्ध (सीडी 31 मनका-चयन) एंडोथेलियल सेल संस्कृति की छवि। स्केल बार = 200 माइक्रोन (ग)घाव एक गोलाकार संरचना बनेगी। नग्न चूहों की त्वचा के माध्यम से नीले रंग के कारण संवहनी दिखाई देता है। (घ)धराशायी रेखाएं दिखाती हैं कि कैलिपर का उपयोग करके लंबाई (एल) और चौड़ाई (डब्ल्यू) को मापकर घाव का आकार कैसे फिर से कोडित किया जाता है । (ई)9 दिन में दिख संवहनी, xenograft घाव explant की तस्वीर । स्केल बार = 1 सेमी(एफ)घाव प्लग अनुभाग की प्रतिनिधि छवि। एक्स-प्लेन पैटर्न जिसमें पांच हाई पावर फील्ड इमेज क्वांटिफिकेशन के लिए लिए ली जाती हैं, उन्हें सफेद धराशायी बक्से से संकेत मिलता है । स्केल बार = 1000 माइक्रोन( जी\u2012H) वीएम घाव प्लग वर्गों के प्रतिनिधि छवियां। (जी)हेमेटॉक्सीलिन और इओसिन स्टेनिंग और(एच)ह्यूमन स्पेसिफिक लेक्टिन यूईए-1 की इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री । स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: वीएम के रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोबेड़ा उत्पन्न करने के लिए कार्यप्रवाह का योजनाबद्ध।
(क)रोगी वीएम घाव ठोस ऊतक या घाव रक्त से अलग एंडोथेलियल कोशिकाओं को चढ़ाया जाता है और जब 80% आंतरायिकता तक पहुंच जाती है, तो एंटी सीडी 31-कंजूस इम्यूनोमैग्नेटिक मोतियों द्वारा चुना जाता है और विस्तारित किया जाता है। (ख)चुनाव आयोग के चमड़े के नीचे इंजेक्शन के लिए, 0 दिन पर, माउस की पीठ पर त्वचा तर्जनी और अंगूठे का उपयोग कर एक तंबू की तरह संरचना बनाने के लिए चुटकी है । घावों को 1 दिन में मापा जाता है और फिर हर दूसरे दिन (लाल तीर) प्रायोगिक दिन 9 के माध्यम से एक कैलिपर का उपयोग करके। घावों को हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए विच्छेदित और संसाधित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां, हम वीएम के रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोबेड़ा मॉडल उत्पन्न करने की विधि का वर्णन करते हैं। यह मुरीन मॉडल एक उत्कृष्ट प्रणाली प्रस्तुत करता है जो शोधकर्ताओं को पैथोलॉजिकल ल्यूमेन इज़ाफ़ा की गहरी समझ हासिल करने की अनुमति देता है और वीएम के उपचार के लिए अधिक प्रभावी और लक्षित उपचार विकसित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता होगा। इसे अन्य प्रकार की संवहनी विसंगतियों जैसे केशिका लिम्फेटिक शिराय कुरूपता16की जांच करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है । प्रजनन योग्य संवहनी घावों की सफल पीढ़ी के लिए कई कदम महत्वपूर्ण हैं। सबसे पहले, रोगी-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाएं शुद्ध (अन्य कोशिका प्रकारों की उपस्थिति के बिना) होनी चाहिए और इंजेक्शन के समय तेजी से बढ़ रही हैं। फाइब्रोब्लास्ट या अन्य मेसेंचिमल गैर-ईसी को दूषित करने से लम्बी आकृति विज्ञान द्वारा आसानी से पहचाना जा सकता है। दुर्लभ अवसर पर, यह संभव है कि विरोधी CD31 एंटीबॉडी संयुग्मित चुंबकीय मोतियों का उपयोग कर शुद्धि के बाद भी, गैर-ईसी की एक छोटी संख्या संस्कृति में रहती है। इन संस्कृतियों को एंडोथेलियल विशिष्ट सेल सतह मार्कर के साथ और अधिक शुद्धि की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में, एंडोथेलियल कोशिकाओं का एकल कोशिका क्लोनल विस्तार संभव है। यह उत्परिवर्ती-ईसी की एकरूपता को फिर से शुरू करेगा क्योंकि एक संस्कृति के भीतर सभी कोशिकाएं एक ही कोशिका से प्राप्त होंगी। हालांकि, वीएम-व्युत्पन्न ईसी के लिए इस दृष्टिकोण की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि कोशिकाएं अपनी प्रसार क्षमताओं को शीर्ष पर करती हैं और 9 \u201210 मार्ग के बाद एक सेंसेंट फेनोटाइप में परिवर्तित होती हैं। यह xenograft प्रयोगों के लिए मार्ग 3 \ u20128 के बीच कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है और इंजेक्शन से पहले दिन कोशिकाओं मार्ग नहीं है ।

विभिन्न सक्रिय उत्परिवर्तनों को ले जाने वाली अन्य संवहनी विसंगतियों की जांच करने के लिए ज़ेनोबेड़ा मॉडल को संशोधित किया जा सकता है। इसके अलावा, जैसा कि रोगी ऊतक के नमूनों को कुछ प्रयोगशालाओं के लिए उपयोग करना मुश्किल होता है, ज़ेनोबेड़ा मॉडल को ईसी का उपयोग करके अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि मानव गर्भनाल रक्त एंडोथेलियल कोशिकाएं (HUVEC), आनुवंशिक रूप से उत्परिवर्तन व्यक्त करने के लिए इंजीनियर/बेकार संवहनी विकास15,,17का कारण ज्ञात ।

क्सीनोबेड़ा में इंजेक्शन के लिए अनुशंसित कोशिकाओं की संख्या बीएमईएम की 2.5 x10 6 कोशिकाएं/200 माइक्रोन है। हालांकि, यदि सेल संख्या अपर्याप्त है तो या तो प्रति जानवर इंजेक्शन की संख्या को एक से कम करना या इंजेक्शन की मात्रा को कम से कम 100 माइक्रोन तक कम करना संभव है। उत्तरार्द्ध के लिए, हालांकि सेल घनत्व अनुपात को बनाए रखना महत्वपूर्ण है जैसे, 1.25 x10 6 कोशिकाएं/ बीएमईएम के साथ काम करते समय, इंजेक्शन से पहले सेल निलंबन के जमना से बचने के लिए सभी चरणों को बर्फ पर किया जाना चाहिए। इंजेक्शन के दौरान, यह महत्वपूर्ण है और सुई को त्वचा के नीचे सीधे 45 डिग्री के कोण पर और मांसपेशियों के ऊतकों से दूर डाला जाता है, क्योंकि मांसपेशियों में इंजेक्शन लगाने से घाव प्रजनन क्षमता बाधित होती है और घाव विच्छेदन मुश्किल हो जाता है। प्रत्येक माउस पर कुल दो इंजेक्शन किए जा सकते हैं- एक दाईं ओर और एक प्रत्येक जानवर के बाईं ओर। एक ही माउस में दूसरा इंजेक्शन एक तकनीकी दोहराने के रूप में काम कर सकते हैं। पीठ पर अधिक इंजेक्शन की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि घाव समय के साथ बढ़ते हैं और एक दूसरे के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। पूर्व नैदानिक अध्ययनों में सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इलाज बनाम अनुपचारित (केवल वाहन) चूहों के xenograft प्लग की तुलना, हम अध्ययन समूह प्रति न्यूनतम 5 जानवरों (10 ज़ेनोबेड़ा प्लग) के उपयोग की सलाह देते हैं। यदि उपलब्ध है, तो दूसरा इंजेक्शन वैकल्पिक रूप से गैर-उत्परिवर्ती ईसी का उपयोग करके 'आंतरिक नियंत्रण' के रूप में उपयोग किया जा सकता है। हमने एचयूवीईसी जैसे प्राथमिक गैर-उत्परिवर्ती ईसी का नियंत्रण के रूप में उपयोग किया है और यह दर्शाया है कि इन कोशिकाओं ने छोटे चैनलों की एक नगण्य संख्या14,,15का गठन किया है । इसके अलावा, इन HUVEC नियंत्रण घाव प्लग में, हम 9 दिन के बाद प्लग में murine व्युत्पन्न संवहनी चैनलों की घुसपैठ देखा है । यदि प्रायोगिक डिजाइन को इनक्यूबेशन बार लंबे समय की आवश्यकता होती है, तो इन घुसपैठ चैनलों को मानव-विशिष्ट सीडी 31 एंटीबॉडी या उलेक्स यूरोपियस एग्लुटिनिन I (यूईए-आई) जैसे मानव-विशिष्ट मार्कर के लिए धुंधला करके विश्लेषण से आसानी से बाहर रखा जा सकता है जो माउस के साथ प्रतिक्रिया को पार नहीं करता है।

यह सुनिश्चित करने के लिए कि घाव पशु स्वास्थ्य और भलाई के लिए बोझ नहीं बन जाता है, घाव के आकार का निरीक्षण करना, माउस के वजन को दैनिक रिकॉर्ड करना, और रक्तस्राव और चोट जैसी किसी भी पक्ष की जटिलताओं पर ध्यान देना महत्वपूर्ण है। यदि घाव की मात्रा 500मिमी 3से अधिक है, तो प्रयोग को समाप्त किया जाना चाहिए।

जब संवहनी घावों को बढ़ाया और प्रेरित किया जाता है, तो घाव को टूटने से बचने के लिए विच्छेदन के दौरान अत्यधिक ध्यान दिया जाना चाहिए। विच्छेदन उपकरणों के साथ घाव प्लग को छूने से बचना महत्वपूर्ण है और प्लग से जुड़े अत्यधिक आसपास के ऊतकों (जैसे त्वचा) को छोड़ दें। यह ज़ेनोबेड़ा प्लग के भीतर संवहनी संरचनाओं के पतन को रोकता है जो सटीक विश्लेषण में हस्तक्षेप करेगा।

अंत में, स्थिरता बनाए रखने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि प्रारंभिक हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण प्लग के केंद्र में शुरू होता है (ऊतक में लगभग 50\u201270μm) के बजाय सीमावर्ती क्षेत्रों जहां एनास्टोमोसिंग माउस वैक्यूलेचर मौजूद हो सकता है। यूईए-आई या एक वैकल्पिक मानव-विशिष्ट एंटीबॉडी जैसे मानव-विशिष्ट ईसी मार्कर के साथ ऊतक वर्गों को दाग देने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है, जो माउस के साथ क्रॉस-प्रतिक्रिया नहीं करेगा, ताकि यह पुष्टि की जा सके कि माउस ईसी पर हमला करने के बजाय संवहनी संरचनाएं मानव-व्युत्पन्न ईसी द्वारा बनाई जाती हैं।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कोई संघर्ष-हितों की है ।

Acknowledgments

लेखक प्रूफरीडिंग के लिए नोरा झीलों का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । इस पांडुलिपि में रिपोर्ट किए गए शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के हिस्से पुरस्कार संख्या R01 HL117952 (ई.बी. के तहत राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males Envigo 069(nu)/070(nu/+) Subcutaneous injection
Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) Vector Laboratories B-1065 Histological anlaysis
Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) Thermo Fisher 974106 Cell culture
Bovine Serum Albumin (BSA) BSA A7906-50MG Cell culture; Histological analysis
Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) Sigma C7902-500G Cell culture
Caliper Electron Microscopy Sciences 50996491 Lesion plug measurment
CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) Life Technologies 11155D EC separation
Cell strainer (100 μM) Greiner 542000 Cell culture
Collagenase A Roche 10103578001 Cell culture
Conical Tube; polypropylene (15 mL) Greiner 07 000 241 Cell culture
Conical Tube; polypropylene (50 mL) Greiner 07 000 239 Cell culture
Coplin staining jar Ted Pella 21029 Histological anlaysis
Coverglass (50 X 22 mm) Fisher Scientific 12545E Histological anlaysis
DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) Vector Laboratories SK-4105 Histological anlaysis
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) Corning 10-027-CV Cell culture
DynaMag-2 Life Technologies 12321D EC separation
Ear punch VWR 10806-286 Subcutaneous injection
EDTA (0.5M, pH 8.0) Life Technologies 15575-020 Histological anlaysis
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) Lonza CC-3162 Cell culture
Eosin Y (alcohol-based) Thermo Scientific 71211 Histological anlaysis
Ethanol Decon Labs 2716 Histological anlaysis
Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone GE Healthcare SH30910.03 Cell culture
Filter tip 1,250 μL MidSci AV1250-H Multiple steps
Filter tip 20 μL VWR 10017-064 Multiple steps
Filter tip 200 μL VWR 10017-068 Multiple steps
Formalin buffered solution (10%) Sigma F04586 Lesion plug dissection
Hemacytometer (INCYTO; Disposable) SKC FILMS DHCN015 Cell culture
Hematoxylin Vector Hematoxylin H-3401 Histological anlaysis
Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) Sigma FC010-10MG Cell culture
Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) Sigma H1009 Histological anlaysis
ImageJ Software Analysis
Isoflurane, USP Akorn Animal Health 59399-106-01 Subcutaneous injection
magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) Sigma M1880-500G Cell culture
Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) Corning 356237 Subcutaneous injection
Microcentrifuge tube (1.5 mL) VWR 87003-294 EC separation
Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) Fisher Scientific 1255015-CS Histological anlaysis
Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles Becton Dickinson (BD) BD305115 Subcutaneous injection
Normal horse serum Vector Laboratories S-2000 Histological anlaysis
Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) Corning 30-009-CI Cell culture
Permanent mounting medium (VectaMount) Vector Laboratories H-5000 Histological anlaysis
Pestle Size C, Plain Thomas Scientific 3431F55 EC isolation
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP3994 Cell culture
Scale VWR 65500-202 Subcutaneous injection
Serological pipettes (10 ml) VWR 89130-898 Cell culture
Serological pipettes (5ml) VWR 89130-896 Cell culture
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma 223530 Cell culture
Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC Vector Laboratories SA-5004 Cell culture
Syringe (60ml) BD Biosciences 309653 Cel culture
SYRINGE FILTER (0.2 µM) Corning 431219 Cell culture
Syringes (1 mL with Luer Lock) Becton Dickinson (BD) BD-309628 Subcutaneous injection
Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) Greiner 664160 Cell culture
Tissue culture-treated plate (145X20 mm) Greiner 639160 Cell culture
Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm Eppendorf 30701119 Cell culture
Tris-base (Trizma base) Sigma T6066 Histological anlaysis
Trypan Blue Solution (0.4 %) Life Technologies 15250061 Cell culture
Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) Corning 25-052-Cl Cell culture
Tween-20 Biorad 170-6531 Histological anlaysis
Wheaton bottle VWR 16159-798 Cell culture
Xylenes Fisher Scientific X3P-1GAL Histological anlaysis

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 160 वेनस कुरूपता ज़ेनोबेड़ा एंडोथेलियल कोशिकाएं TIE2 PIK3CA संवहनी घाव
वेनस कुरूपता के लिए एक रोगी-व्युत्पन्न Xenograft मॉडल
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Schrenk, S., Goines, J., Boscolo, E. … More

Schrenk, S., Goines, J., Boscolo, E. A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation. J. Vis. Exp. (160), e61501, doi:10.3791/61501 (2020).

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