Summary
Этот протокол описывает вскрытие кальварии мышей dmp1-topaz у новорожденных и выделение остеоцитов, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок, посредством клеточного переваривания и фракционирования, в дополнение к подготовке остеоцитов для сортировки клеток, активированной флуоресценцией (FACS).
Abstract
Остеоцит, который когда-то считался пассивным резидентом кости, учитывая закулисную функцию восприятия механической нагрузки, теперь оказался в центре внимания и, как было показано, выполняет несколько основных функций, таких как активная модификация внеклеточного матрикса и формирование эндокринного органа с лакуноканаликулярной системой, которая окружает его, отправляя сообщения в отдаленные участки. Благодаря методам, позволившим протестировать остеоциты in vitro от выделения первичных остеоцитов до остеоцитоподобных клеточных линий, остеоциты в настоящее время испытывают огромный интерес и всплеск знаний о структуре и функциях. Многие аспекты биологии остеоцитов и взаимодействия с другими молекулярными компонентами еще предстоит открыть. В этом протоколе мы подробно описываем эффективное выделение первичных остеоцитов из кальварии новорожденных мышей dmp1-topaz, которые экспрессируют зеленый флуоресцентный белок в остеоцитах, путем фракционирования клеток и последующего получения культур первичных остеоцитов с помощью FACS.
Introduction
Остеоциты представляют собой терминально дифференцированные клетки из остеобластических предшественников, которые были встроены в их секретируемый матрикс1. Они являются наиболее распространенными и долгоживущими клетками среди популяций костных клеток. Они обитают в лакунах и имеют характерную звездчатую морфологию с дендритами, которые простираются через каналы, называемые канальцами, образуя обширную сеть связи и метаболического обмена с окружающей средой и поверхностью кости2. Остеоциты играют роль остеобластов и остеокластов в ремоделировании кости, они являются первичными механосенсорными клетками, придающими адаптацию к механической нагрузке3, участвуют в фосфатном гомеостазе4 и минерализации костного матрикса5, а вместе с лакуноканаликулярной системой действуют как эндокринный орган, сигнализирующий о дальних тканях6.
Остеоциты расположены в минерализованной матрице, что ограничивает доступность и затрудняет их изоляцию, тем самым затрудняя исследование in vitro. Один из первых методов выделения описал изолированные остеоциты из кальварии цыплят с использованием остеоцит-специфического моноклонального антитела (OB7.3)7, которое, как позже стало известно, является птичьим вариантом PHEX (PHosphate-регулирующий ген с гомологией эндопептидазам на Х-хромосоме)8. Другие исследователи использовали последовательное переваривание длинных костей крысы 9 илимыши 10 для получения богатых остеоцитами фракций, в которых, как сообщалось, чистота остеоцитов составляла около 70%9. Ограничения этой процедуры включают неоптимальную чистоту культур, загрязненных другими типами клеток, помимо остеоцитов, и то, что остеоциты могут быть потенциально перерасти другими клетками в культуре, поскольку остеоциты утратили способность делиться. Эти проблемы ограничивают удобство использования долгосрочных культур.
Чтобы преодолеть эти ограничения, были разработаны различные клеточные линии остеоцитов. Клеточная линия11 MLO-Y4 и клеточная линия12 MLO-A5 являются наиболее широко изученными клеточными линиями, которые полезны для изучения остеоцитов на ранней стадии; однако они менее полезны для изучения передачи сигналов зрелых остеоцитов, поскольку они экспрессируют низкие уровни склеростина и FGF2313, оба из которых являются маркерами зрелых остеоцитов. Другие клеточные линии, включая IDG-SW3 14 и Ocy45415, экспрессируют высокие уровни склеростина и FGF23 и полезны при изучении поздней стадии остеоцитов. Клеточные линии оказываются полезными инструментами исследования; Тем не менее, они не лишены ограничений, поскольку не полностью отражают биологию первичной клетки. Различные клеточные линии представляют разные стадии развития спектра зрелости остеоцитов, и клеточные линии не отражают гетерогенность первичных остеоцитов16,17.
Чтобы получить чистые культуры первичных остеоцитов, исследователи воспользовались моделью мыши cre, в которой промотор dmp1 размером 8 кб используется для стимулирования экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP) в остеоцитах18,19. Для получения популяций остеоцитов использовались двойные трансгенные мыши (pOB-Col 2.3-GFP-cyan и DMP1-GFP-топаз) Paic et al.19 и трансгенные мыши dmp1-topaz Nakashima et al.20. в котором они использовали последовательное переваривание и FACS остеоцитов, экспрессирующих GFP, для получения культур первичных остеоцитов19,20. Было показано, что направление cre в 10-kb dmp1 репортерной мыши Ai9, которое активирует белок tdTomato, присутствует в остеоцитах, остеобластах, мышцах и клетках костного мозга. Промотор dmp1 8-kb имел тот же паттерн экспрессии, но только часть остеобластов и клеток костного мозга экспрессировала белок, что указывает на то, что промотор dmp1 8-kb является более специфическим21. Несмотря на это, результаты, полученные с использованием промотора dmp1 8-kb, следует интерпретировать с осторожностью, а профили экспрессии генов следует регулярно проводить с использованием маркеров, специфичных для остеоцитов и остеобластов, чтобы гарантировать, что полученная популяция имеет достаточно высокую чистоту.
Маркеры остеокластов OSCAR и Dcstamp были обнаружены в гемопоэтических необедненных и обедненных популяциях остеоцитов, что привело авторов к выводу, что пищеварительные дискреты, полученные в результате фракционирования 8-kb dmp1-topaz неонатальной кальварии и сортировки GFP, загрязнены гемопоэтическими клетками. Загрязнение гемопоэтическими клетками можно было бы смягчить, ужесточив ворота сортировки GFP, поскольку GFP-положительные гемопоэтические клетки имели достаточно меньшую интенсивность GFP, чем GFP-положительные мезенхимальные клетки (остеоциты)22.
Методы изучения остеоцитов in vitro внесли свой вклад в недавнее богатство информации о биологии остеоцитов. Однако выделение остеоцитов остается трудоемкой и длительной процедурой с низким выходом клеток. Описанный способ переваривания костей с использованием коллагеназы и ЭДТА, часто до фракции 823, занимает несколько часов, в течение которых облагается налогом жизнеспособность остеоцитов. Исследователи сообщили об использовании фракций (2\u20125) для сортировки клеток 20 и показали, что профиль экспрессии генов, связанных с остеоцитами, по сравнению с генами остеобластов подтверждает успех выделения чистых популяций остеоцитов20. В этой статье мы опишем процесс получения фракций (2\u20125) и сравним выход остеоцитов из каждой фракции, начиная с фракции с 1 по 8, чтобы определить отдачу остеоцитов в каждой фракции. Мы также описываем вскрытие кальварии мышей dmp1-topaz у новорожденных и кальвариальное пищеварение с использованием коллагеназы и этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), а также подготовку клеток к FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры и уход за животными выполнялись в соответствии с правилами и положениями Университета Тохоку.
1. Вскрытие кальварии мышей dmp1-topaz новорожденных
- Для этого протокола используйте 6-дневных детенышей мышей C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J. Усыпьте мышей 5% ингаляцией изофлурана, а затем переведите щенков в 70% этанол.
- Перенесите усыпленного щенка в необработанную культуральную посуду.
- С помощью ножниц и пинцета захватите кожу у основания черепа и сделайте надрез.
- Используя первый разрез в качестве отправной точки, разрежьте обе боковые стороны черепа перед ушами, удалите кожу и обнажите кальварию.
- Отведите головку от переносицы и разрежьте кальварию по лямбдоидному шву. Разрежьте по боковым краям теменной кости и растяните ее, включив в лобную часть.
- Отделите кальварию от подлежащей ткани мозга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить чистоту костной кальварии с минимальным прикреплением мягких тканей, не врезайтесь глубоко в кость; Для справки, нужно уметь видеть тень ножниц под костью. - Переведите кальварию в фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS, pH 7,4 по всему протоколу). Убедитесь, что вогнутая часть обращена вверх.
2. Фракционирование кальварии новорожденных мышей
- Перенесите до 5 кальварий в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 5 мл раствора коллагеназы 2 мг/мл. Используйте свежий раствор коллагеназы, приготовленный непосредственно перед использованием.
- Чтобы приготовить свежий раствор коллагеназы, добавьте порошок коллагеназы в изоляционный буфер (70 мМ NaCl, 10 мМ NaHCO 3, 60 мМ сорбита,3 мМ K 2 HPO4, 1 мМ CaCl 2, 1 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (BSA), 5 мг / мл глюкозы и 25 мМ HEPES) в дозе2мг / мл. Растворите порошок коллагеназы на магнитной мешалке.
- Пропустите раствор коллагеназы через стерильный фильтрующий блок 0,22 мкм в пробирку объемом 50 мл и держите его на льду на протяжении всего протокола.
- Инкубируют кальварию при 37 °C в течение 20 мин на шейкере при 300 об/мин для получения фракции 1.
- Откажитесь от переваривания фракции 1, промойте кальварию 5 мл фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) и выбросьте промывку.
- Инкубируют кальварию в 5 мл 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), содержащей 1 мг/мл BSA в PBS, рН 7,4 при 37 °C в течение 15 мин на шейкере при 300 об/мин.
- Соберите дайджест в коническую пробирку объемом 50 мл. Промойте кальварию 5 мл PBS и добавьте промывочный раствор в дайжест.
ПРИМЕЧАНИЕ: В каждый момент сбора переваривания и промывки пипеткой вводите кости в их раствор, чтобы отделить клетки от кости и предотвратить образование дублетов и клеточных агрегатов. - Чтобы получить фракцию 2, центрифугируют расщепление при 300 x g при 4 °C в течение 5 мин. Откажитесь от надосадочной жидкости, повторно суспендируйте гранулу в 8 мл α-минимальной незаменимой среды (MEM), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 100 МЕ / мл пенициллина G и 100 мкг / мл стрептомицина. Высевают семена на 10-сантиметровую культуральную посуду. Инкубировать фракцию 2 при 37 °C при 5%CO2.
- Инкубируют кальварию в 5 мл раствора коллагеназы при 37 ° C в течение 20 мин на шейкере при 300 об/мин.
- Чтобы собрать дробь 3, повторите шаги 2.5\u20122.6. Инкубировать фракцию 3 при 37 °C при 5%CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент кости станут меньше, и они будут превращены в фрагменты. Чтобы гарантировать, что кости случайно не попадут в перевариватели, что приведет к потере клеток в процессе, используйте пипетку с маленьким наконечником для сбора дайджестов (наконечники пипетки 1000\u2012200 мкл). - Инкубируют кальварию в 5 мл раствора коллагеназы при 37 ° C в течение 20 мин на шейкере при 300 об/мин.
- Чтобы собрать дробь 4, повторите шаги 2.5\u20122.6. Инкубировать фракцию 4 при 37 °C при 5%CO2.
- Инкубируйте кальварию в 5 мл 5 мМ ЭДТА, содержащей 1 мг / мл BSA в PBS (pH 7,4) при 37 ° C в течение 15 минут на шейкере при 300 об/мин.
- Чтобы собрать дробь 5, повторите шаги 2.5\u20122.6. Инкубировать фракцию 5 при 37 °C при 5%CO2. Остеоциты могут быть подготовлены к сортировке в тот же день или культивированы за 24 ч до сортировки.
3. Подготовка остеоцитов к сортировке клеток, активированных флуоресценцией
- Аспирируйте среду каждой фракции клеток и осторожно промойте 10 мл PBS дважды.
- Добавьте 5 мл 0,5% трипсина-ЭДТА в PBS и инкубируйте клетки в течение 5 мин при 37 ° C. Добавьте 5 мл 10% FBS α-MEM и пипетку, чтобы аккуратно отделить клетки. Объедините ячейки в каждой фракции, просеяв через сетчатый фильтр для клеток 40 мкм в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл.
- Промойте клетки 10 мл PBS и соберите путем просеивания через сетчатое фильтр для клеток 40 мкм в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл. Центрифугируйте ячейки при 300 x g при 4 °C в течение 5 мин.
- Аспирируйте надосадочную жидкость и добавьте в гранулу 10% FBS α-MEM. Отрегулируйте концентрацию клеток примерно до 1 x10,7 клеток/мл.
- Отфильтруйте ячейки в нейлоновой сетчатой трубке размером 35 мкм. В настоящее время ячейки готовы к работе с СУИМ.
- Для этого протокола используйте сопло размером 100 мкм. Собирательная жидкость должна состоять на 10% из FBS α-MEM. Храните сортируемый образец при перемешивании и при температуре 4 °C на протяжении всей сортировки, если это возможно.
- Перед сортировкой оптимизируйте стробирование, чтобы удалить артефакты и ячейки, отрегулировав область бокового рассеяния (SSC) и область прямого рассеяния (FSC). Избавьтесь от дублетов, отрегулировав ширину SSC по сравнению с высотой SSC и площадь FSC по сравнению с шириной FSC. GFP-отрицательные остеоциты следует использовать в качестве контроля для корректировки параметров инструмента сортировки.
- После завершения сбора клеток центрифугируйте клетки при 300 x g при 4 ° C в течение 10 мин. Вымойте клетки с помощью PBS. Центрифугируйте ячейки при 300 x g при 4 °C в течение 5 мин.
- Повторно приостановите ячейки и отрегулируйте количество по желанию, используя 10% FBS α-MEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Целью данного протокола является демонстрация процесса получения культур первичных остеоцитов из кальварии новорожденных мышей dmp1-topaz посредством процесса фракционирования с использованием коллагеназы для деградации коллагенового матрикса и ЭДТА для хелатирования кальция, после чего клетки подготавливаются к FACS для отделения остеоцитов от других клеточных популяций.
Методы получения первичных остеоцитов кальварии новорожденных мышей часто описывают использование фракций (1\u20128) для сортировки23. Чтобы проверить эффективность этого метода, мы сравнили выход остеоцитов, полученных из одной мышиной кальварии dmp1-топаза, начиная с фракций с 1 по 8. Фракции 1\u20128 сортировали отдельно, чтобы определить процентное содержание и выход остеоцитов из каждой фракции. После сортировки мы культивировали остеоциты в течение 24 ч на 96-луночной пластине, чтобы сравнить плотность посеянных клеток. Показано, что плотность остеоцитов во фракциях 2\u20125 выше, чем во фракции 1, а плотность остеоцитов начинает заметно снижаться во фракциях 6, 7 и 8 (рис. 1А).
Хотя процент остеоцитов, полученных среди всех фракций, не является статистически значимым (рис. 1B), плотность остеоцитов резко различается. Исследователи20 сообщили об использовании фракций 2\u20125 для выделения остеоцитов с помощью FACS, и мы показываем на рисунке 1 , что использование фракций 2\u20125 оптимизирует процесс получения остеоцитов и сокращает время сортировки.
На рисунке 2 показано количество клеток и стратегия стробирования, применяемая для выделения GFP-положительных клеток из GFP-отрицательных клеток, в которых в качестве контроля использовались клетки, полученные путем фракционирования GFP-отрицательных кальварий мыши. Остеоциты, полученные с помощью этого метода, были проанализированы на экспрессию генов Dmp1 и SOST, которые являются известными маркерами остеоцитов. Экспрессия мРНК Dmp1 и SOST выше в остеоцитах по сравнению с фракцией предварительной сортировки 2, которая известна как высокая фракция остеобластов (рис. 3A). На рисунке 3B показана морфология GFP-положительного остеоцита, сохраняющего звездчатую форму с дендритами, отходящими от тела клетки, культивируемого в течение 24 часов на пластиковой культуральной чашке после сортировки.
Рисунок 1: Эффективность фракционирования остеоцитов. (A) Микроскопические изображения плотности остеоцитов из фракций 1\u20128, посеянных на 96-луночную пластину, полученную через 24 часа сорта. Фракции 2\u20125 имеют более высокую плотность клеток, чем фракции 1 и 6\u20128. Масштабная линейка = 100 мкм. (B) Процент остеоцитов, полученных из фракций 1\u20128, измеренный программным обеспечением проточного цитометра. Результаты получены из трех отдельных репрезентативных экспериментов. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Выделение GFP-положительных остеоцитов с помощью флуоресцентной активированной клеточной сортировки. На верхней панели представлены клетки, выделенные из GFP-отрицательной кальварии однопометника C57Bl/6J в качестве контроля порога GFP. Нижняя панель представляет количество клеток и стробный контроль, практикуемый для выделения GFP-положительных остеоцитов из GFP-отрицательных клеток во фракции 2, полученных из кальварии мыши dmp1-topaz. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Характеристика остеоцитов после сортировки. (A) Относительная экспрессия мРНК Dmp1 и SOST клеток фракции 2, культивируемых в течение 24 часов, и остеоцитов, культивируемых в течение 24 часов после сортировки. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения. Статистические различия были выявлены с помощью t-критерия Стьюдента: * p < 0,05, **p < 0,01. (B) Микроскопическое изображение остеоцита, сохраняющего дендриты, выходящие наружу из тела клетки, культивируемое в течение 24 часов после сортировки. Масштабная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Первый выделенный остеоцит был получен из куриной кальварии7 , выделенной с помощью (OB7.3) или авиантного варианта PHEX; Однако этот метод ограничен наличием работоспособных антител, так как остеоцит-специфические антитела, которые также являются специфическими для вида, должны быть произведены. Исследователи использовали другую модификацию последовательного ферментативного процесса для получения остеоцитов из длинных костей мышей и крыс; Сообщается, что чистота этих культур составляет около 70%9. Разработка мышиной модели позволила сконструировать остеоциты, которые экспрессируют GFP на своей поверхности. Эта мышиная модель, наряду с FACS, была использована для получения чистых культур первичных остеоцитов20.
Мы опускаем использование фракций 1 и фракций 6\u20128, так как в этих фракциях отрывается небольшое количество остеоцитов. Использование фракций 2\u20125 дает наилучший выход остеоцитов за кратчайшее время обработки; Это ограничивает время обработки остеоцитов и предотвращает гибель клеток или возможное изменение клеточной сигнализации в результате стресса, которому клетка подвергается во время фракционирования. Мы также культивируем остеоциты для предварительной сортировки в течение 24 часов, что по умолчанию исключает неадгезивные суспензионные клетки (гемопоэтические клетки) во время подготовки к сортировке. Это сводит к минимуму загрязнение кроветворными клетками, экспрессирующими GFP22. Рабочий процесс, предусмотренный в этом протоколе, использует преимущества ранее опубликованных методов23 и сокращает время такого рода, обеспечивая эффективное и быстрое восстановление остеоцитов с минимальным загрязнением.
Критические шаги в протоколе включают получение чистой костной кальварии и обрезку мягких тканей из мозга или соединительной ткани, прикрепленной к кости, чтобы ограничить загрязнение адгезивных клеток (фибробластов и нервных клеток). Кроме того, пипетка клеток на этапах, которые включают получение и промывку переваривателей, имеет решающее значение, поскольку клеточные агрегаты и дублеты считываются как отходы во время сортировки и будут способствовать низкому выходу остеоцитов.
Остеоциты могут быть отсортированы без предварительного посева. Однако это означает, что большее количество клеток должно быть отсортировано, что увеличивает время сортировки и увеличивает вероятность гемопоэтического загрязнения. Это можно смягчить, применив предварительную сортировку истощения гемопоэтических клеток. Однако это обременительно и не рекомендуется для рутинных и периодических лабораторных анализов22. Проблемы могут возникнуть при сортировке из-за наличия крупных ячеистых агрегатов и дублетов, засоряющих поток жидкости сортировочной машины. В нашем протоколе это не было проблемой, но это можно решить, уменьшив содержание FBS буфера сортировки (менее 10%).
Этот протокол не имеет ограничений. В этом методе используются остеоциты мышей, которые не совсем похожи на остеоциты человека. Это ограничивает распространение результатов, полученных при изучении мышиных остеоцитов, на значимые клинические результаты. Протоколы выделения остеоцитов человека были описаны24, и исследователям рекомендуется использовать те виды клеток, которые лучше всего соответствуют их целям. Как и в случае с другими протоколами, количество остеоцитов, полученных с использованием этого протокола, ограничено, и для крупномасштабного анализа требуется большое количество мышей, однако, уменьшая время, необходимое для подготовки и сортировки остеоцитов, можно получить большее количество клеток за один период времени.
Остеоциты, полученные с помощью этого процесса, могут быть использованы для дальнейшего культивирования и совместного культивирования, анализа экспрессии генов, последующего анализа активации/ингибирования субстрата, молекулярного зондирования и окрашивания. Первичные клетки также могут быть использованы для построения 3D-модели матрикса остеоцитов, напоминающей нативную остеоцитарную среду, для изучения механотрансдукции и механозондирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана грантом JSPS KAKENHI от Японского общества содействия науке (No 19K10397 для Х.К. и No 18K09862 для И.М.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | Data aquisition and analysis | |
| BD Falcon Tube | BD Biosciences | 352235 | 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 μm nylon mesh. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, MO, USA | ||
| Collagenase | Wako, Osaka, Japan | 034-22363 | 0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum. |
| EDTA | Dojindo, Kumamoto, Japan | 5mM EDTA prepared with 0.1% BSA | |
| FACSAriaTM II | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest, Nuaillé, France | ||
| Isolation buffer | 70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES | ||
| Millex Sterile Filter Unit | Merck Millipore, Ireland | SLGV033RS | 0.22μm |
| Nylon cell strainer | FALCON, NY, USA | 40μm | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies, NY, USA | 0.5% x10. diluted to x1 in PBS | |
| α-MEM | Wako, Osaka, Japan | Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 μg/ml streptomycin |
References
- Manolagas, S. C. Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis. Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).
- Bonewald, L. F. Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).
- Bonewald, L. F.
- Feng, J. Q., et al. Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism. Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).
- Lane, N. E., et al. Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More. Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).
- van der Plas, A., Nijweide, P. J.
- Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).
- Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).
- Kramer, I., et al. Osteocyte Wnt/β-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).
- Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).
- Kato, Y., et al. Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).
- Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).
- Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Spatz, J. M., et al. The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro. The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).
- Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
- Sandberg, R., Ernberg, I. Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).
- Kalajzic, I., et al. Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene. Bone. 35 (1), 74-82 (2004).
- Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. Bone. 45 (4), 682-692 (2009).
- Nakashima, T., et al. Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression. Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).
- Kalajzic, I., et al. In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology. Bone. 54 (2), 296-306 (2013).
- Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes. Bone. 72, 34-42 (2015).
- Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M. Bone Research Protocols. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana Press. 55-66 (2012).
- Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. An improved method to isolate primary human osteocytes from bone. Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).
