Summary
Denne protokollen beskriver disseksjon av neonatal dmp1-topaz mus calvaria og isolering av osteocytter som uttrykker det grønne fluorescerende proteinet gjennom cellefordøyelse og fraksjonering, i tillegg til osteocytpreparasjon for fluorescensaktivert cellesortering (FACS).
Abstract
Osteocytten, en gang antatt å være en passiv beboer i beinet gitt backstage-funksjonen til å føle mekanisk belastning, blir nå brakt i søkelyset og har vist seg å ha flere hovedfunksjoner som aktivt å modifisere den ekstracellulære matrisen og danne et endokrint organ med lacunocanalicular systemet som omslutter det å sende meldinger til fjerne steder. På grunn av metodene som gjorde det mulig å teste osteocytten in vitro fra isolering av primære osteocytter til osteocyttlignende cellelinjer, opplever osteocytter nå en rungende interesse og en bølge av kunnskap om struktur og funksjon. Mange aspekter av osteocytbiologi og interaksjon med andre molekylære komponenter er ennå ikke oppdaget. I denne protokollen beskriver vi i detalj effektiv isolering av primære osteocytter fra dmp1-topaz neonatal mus calvaria, som uttrykker det grønne fluorescerende proteinet i osteocytter, gjennom cellefraksjonering og deretter anskaffelse av kulturer av primære osteocytter ved FACS.
Introduction
Osteocytter er terminalt differensierte celler fra osteoblastiske progenitorer som ble innebygd i deres utskilles matrise1. De er de mest tallrike og lengstlevende cellene blant beincellepopulasjoner. De bor i lacunae og har en karakteristisk stellatmorfologi med dendritter som strekker seg gjennom kanaler kalt canaliculi som danner et omfattende nettverk av kommunikasjon og metabolsk utveksling med omgivelsene og beinoverflaten2. Osteocytter koreograferer både osteoblaster og osteoklaster roller i beinremodellering, de er de primære mekanosensoriske cellene som gir tilpasning til mekanisk belastning3, er involvert i fosfathomeostase4 og benmatrisemineralisering5, og sammen med lacunocanalicular systemet fungerer de som et endokrine organ som signaliserer fjernt vev6.
Osteocytter ligger i en mineralisert matrise, noe som begrenser tilgjengeligheten og gjør isolasjonen utfordrende, og dermed hindrer in vitro-undersøkelse. En av de første isolasjonsmetodene beskrev isolerte osteocytter fra kylling calvaria ved hjelp av et osteocyttspesifikt monoklonalt antistoff (OB7.3)7 som senere ble kjent å være fuglevarianten av PHEX (PHosfatregulerende gen med homologi til endopeptidaser på X-kromosomet)8. Andre forskere brukte sekvensiell fordøyelse av rotte 9 ellermus 10 lange bein for å oppnå osteocytrike fraksjoner der osteocytrenhet ble rapportert å være rundt 70%9. Begrensninger i denne prosedyren inkluderer den suboptimale renheten av kulturer forurenset med andre celletyper i tillegg til osteocytter, og at osteocytter potensielt kan overgros av andre celler i kultur siden osteocytter har mistet evnen til å dele seg. Disse utfordringene begrenser bruken av langsiktige kulturer.
For å overvinne disse begrensningene ble forskjellige osteocytcellelinjer utviklet. MLO-Y4-cellelinjen11 og MLO-A5-cellelinjen12 er spesielt de mest studerte cellelinjene som er nyttige for studiet av osteocytter i tidlig stadium; Imidlertid er de mindre nyttige for å studere moden osteocyttsignalering, da de uttrykker lave nivåer av sklerostin og FGF2313, som begge er modne osteocytmarkører. Andre cellelinjer, inkludert IDG-SW3 14 og Ocy45415, uttrykker høye nivåer av sklerostin og FGF23 og er nyttige for å studere sent osteocyttstadium. Cellelinjer viser seg å være nyttige forskningsverktøy; Likevel kommer de ikke uten begrensninger, da de ikke fullt ut representerer biologien til primærcellen. Ulike cellelinjer representerer forskjellige utviklingsstadier av osteocyttmodenhetsspekteret, og cellelinjer klarer ikke å representere heterogeniteten til primære osteocytter16,17.
For å oppnå rene kulturer av primære osteocytter, benyttet forskerne seg av cre-musemodellen der 8-kb dmp1-promotoren brukes til å drive grønt fluorescerende protein (GFP) -uttrykk i osteocytter18,19. Dual transgene mus (pOB-Col 2.3- GFP-cyan og DMP1-GFP-topaz) av Paic et al.19 og dmp1-topaz transgene mus av Nakashima et al.20 har blitt brukt til å oppnå osteocytpopulasjoner. Der de benyttet sekvensiell fordøyelse og FACS av osteocytter som uttrykker GFP for å skaffe kulturer av primære osteocytter19,20. Retningen av cre i 10-kb dmp1 reportermus Ai9, som aktiverer tdTomato-proteinet, ble vist å være tilstede i osteocytter, osteoblaster, muskler og celler i beinmargen. 8-kb dmp1-promotoren hadde samme uttrykksmønster, men bare en andel osteoblaster og benmargceller uttrykte proteinet, noe som indikerer at 8-kb dmp1-promotoren er mer spesifikk21. Til tross for dette bør resultater oppnådd ved bruk av 8-kb dmp1-promotoren tolkes med forsiktighet, og genuttrykksprofiler bør rutinemessig utføres ved bruk av osteocyt vs. osteoblastspesifikke markører for å sikre at den oppnådde populasjonen er av høy nok renhet.
Osteoklastmarkører OSCAR og Dcstamp ble funnet i hematopoietiske ikke-utarmede vs. utarmede osteocytpopulasjoner, dette funnet førte forfatterne til å konkludere med at fordøyelser oppnådd ved fraksjonering av 8-kb dmp1-topaz neonatal calvaria og GFP-sortering er forurenset med hematopoietiske celler. Forurensning med hematopoietiske celler kunne ha blitt redusert ved å stramme GFP-sorteringsporten siden GFP-positive hematopoietiske celler hadde en rimelig lavere GFP-intensitet enn GFP-positive mesenkymale celler (osteocytter)22.
Metodene for å studere osteocytter in vitro har bidratt til det nyvell av informasjon om osteocytbiologi. Imidlertid forblir osteocyttisolering en arbeidsintensiv og langvarig prosedyre med lave celleutbytter. Den beskrevne metoden for beinfordøyelse ved bruk av kollagenase og EDTA, ofte opp til fraksjon 823, tar flere timer hvor osteocyt levedyktighet beskattes. Forskere har rapportert å bruke fraksjoner (2 \u20125) for cellesortering 20, og har vist at uttrykksprofilen til gener assosiert med osteocytter versus osteoblaster bekrefter suksessen med å isolere rene osteocytpopulasjoner20. I denne artikkelen beskriver vi prosessen med å oppnå fraksjoner (2\u20125), og vi sammenligner utbyttet av osteocytter fra hver fraksjon som starter med fraksjon 1 til 8 for å bestemme retur av osteocytter i hver fraksjon. Vi beskriver også disseksjon av nyfødt dmp1-topas mus calvaria og calvarial fordøyelse ved hjelp av kollagenase og etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), samt fremstilling av celler for FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer og dyrepleie ble utført i samsvar med Tohoku University regler og forskrifter.
1. Disseksjon av nyfødt dmp1-topas mus calvaria
- For denne protokollen, bruk 6\u20127 dager gamle valper med C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J-mus. Avlive mus med 5% isofluran inhalasjon og overfør deretter valpene til 70% etanol.
- Overfør den avlivede valpen til en ikke-behandlet kulturskål.
- Bruk saks og pinsett, ta tak i huden ved foten av skallen og gjør et snitt.
- Bruk det første snittet som utgangspunkt, kutt på begge sidesider av skallen foran ørene, fjern huden og avslør calvaria.
- Hold hodet fra nesebroen og skjær calvaria langs lambdoidsuturen. Klipp langs sidekantene på parietalbenene og utvid den til å inkludere frontpartiet.
- Separer calvaria fra det underliggende hjernevevet.
MERK: For å sikre en ren benete calvaria med minimal bløtvevsfesting må du ikke kutte dypt inn i beinet; Som referanse bør man kunne se skyggen av saksen under beinet. - Overfør calvaria til fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7,4 gjennom hele protokollen). Pass på at den konkave delen vender oppover.
2. Fraksjonering av nyfødt mus calvaria
- Overfør opptil 5 calvariae til en 50 ml konisk tube inneholdende 5 ml 2 mg/ml kollagenaseoppløsning. Bruk fersk kollagenaseoppløsning tilberedt like før bruk.
- For å tilberede en frisk kollagenaseoppløsning, tilsett kollagenasepulver til isolasjonsbuffer (70 mM NaCl, 10 mM NaHCO 3, 60 mM sorbitol,3 mMK2HPO4, 1 mM CaCl 2, 1 mg/ml bovint serumalbumin (BSA), 5 mg/ml glukose og 25 mM HEPES) ved2 mg/ml. Løs opp kollagenasepulveret på en magnetomrører.
- Kjør kollagenaseoppløsningen gjennom en 0,22 μm steril filterenhet i et 50 ml rør og hold den på is gjennom hele protokollen.
- Inkuber calvaria ved 37 °C i 20 minutter på en shaker ved 300 o / min for å oppnå fraksjon 1.
- Kast fordøyelsen av fraksjon 1, vask calvaria med 5 ml fosfatbufret saltvann (PBS) og kast vasken.
- Inkuber calvaria i 5 ml 5 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) inneholdende 1 mg/ml BSA i PBS, PH 7,4 ved 37 °C i 15 minutter på en shaker ved 300 rpm.
- Samle fordøyelsen i et 50 ml konisk rør. Vask calvaria med 5 ml PBS og tilsett vaskeoppløsningen i fordøyelsen.
MERK: På hvert punkt for å samle fordøyelsen og vaske, pipetter du beinene i løsningen for å løsne cellene fra beinet og for å forhindre dubletter og celleaggregater. - For å oppnå fraksjon 2, sentrifuger fordøyelsen ved 300 x g ved 4 °C i 5 minutter. Kast supernatanten, resuspender pelleten i 8 ml α-Minimum Essential Medium (MEM) inneholdende 10% føtal bovint serum (FBS), 100 IE / ml penicillin G og 100 mikrog / ml streptomycin. Frø på en 10 cm kulturfat. Inkuber fraksjon 2 ved 37 °C under 5 % CO2.
- Inkuber calvaria i 5 ml kollagenaseoppløsning ved 37 °C i 20 minutter på en shaker ved 300 o / min.
- Hvis du vil samle inn brøkdel 3, gjentar du trinn 2,5\u20122.6. Inkuber fraksjon 3 ved 37 °C under 5 % CO2.
MERK: På dette tidspunktet vil beinene bli mindre, og de vil bli redusert til fragmenter. For å sikre at ingen bein ved et uhell aspireres inn i fordøyelsen, noe som fører til celletap i prosessen, bruk en liten spisspipette for å samle fordøyelsene (1000 \u2012200 μL pipettespisser). - Inkuber calvaria i 5 ml kollagenaseoppløsning ved 37 °C i 20 minutter på en shaker ved 300 o / min.
- Hvis du vil samle inn brøkdel 4, gjentar du trinn 2,5\u20122.6. Inkuber fraksjon 4 ved 37 °C under 5 % CO2.
- Inkuber calvaria i 5 ml 5 mM EDTA inneholdende 1 mg/ml BSA i PBS (pH 7,4) ved 37 °C i 15 minutter på en shaker ved 300 rpm.
- Hvis du vil samle inn brøkdel 5, gjentar du trinn 2,5\u20122.6. Inkuber fraksjon 5 ved 37 °C under 5 % CO2. Osteocytter kan være forberedt på sortering samme dag eller dyrket opptil 24 timer før sortering.
3. Fremstilling av osteocytter for fluorescensaktivert cellesortering
- Aspirer mediet for hver cellefraksjon og vask forsiktig med 10 ml PBS to ganger.
- Tilsett 5 ml 0,5% trypsin-EDTA i PBS og inkuber cellene i 5 minutter ved 37 °C. Tilsett 5 ml 10% FBS α-MEM og pipette for å løsne cellene forsiktig. Kombiner cellene i hver fraksjon ved å sile gjennom en 40 μm cellesil i et 50 ml konisk sentrifugerør.
- Vask cellene med 10 ml PBS og samle ved sikting gjennom en 40 μm cellesil i et 50 ml konisk sentrifugerør. Sentrifuger cellene ved 300 x g ved 4 °C i 5 minutter.
- Aspirer supernatanten og tilsett 10% FBS α-MEM til pelleten. Juster cellekonsentrasjonen til ca. 1 x 107 celler/ml.
- Filtrer cellene i et 35 μm nylonnettkappet rør. Cellene er nå klare for FACS.
- For denne protokollen, bruk en dyse på 100 μm. Oppsamlingsvæsken skal bestå av 10% FBS α-MEM. Hold prøven sortert på omrøring og ved 4 °C i hele sorteringsperioden hvis mulig.
- Før sorteringen optimaliserer du gating for å fjerne artefakter og celler ved å justere SSC-området (sidepunkt) og FSC-området (foroverpunkt). Eliminer dubletter ved å justere SSC-bredde vs SSC-høyde og FSC-område vs FSC-bredde. GFP-negative osteocytter bør brukes som en kontroll for å justere parametrene til sorteringsinstrumentet.
- Etter at celleinnsamlingen er fullført, sentrifuger cellene ved 300 x g ved 4 °C i 10 minutter. Vask celler med PBS. Sentrifuger cellene ved 300 x g ved 4 °C i 5 minutter.
- Suspender cellene på nytt og juster tallet etter ønske ved å bruke 10% FBS α-MEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Formålet med denne protokollen er å demonstrere prosessen med å skaffe kulturer av primære osteocytter fra dmp1-topaz neonatal mus calvaria gjennom en fraksjoneringsprosess ved bruk av kollagennase for å nedbryte kollagenmatrisen og EDTA for kalsiumkelering, hvoretter celler fremstilles for FACS for å skille osteocytter fra andre cellepopulasjoner.
Metoder for å få tak i primære osteocytter fra neonatal mus calvaria beskriver ofte bruk av fraksjoner (1\u20128) for sortering23. For å teste effektiviteten av denne metoden sammenlignet vi utbyttet av osteocytter oppnådd fra en dmp1-topaz mus calvaria, fra fraksjoner 1 til 8. Fraksjon 1\u20128 ble sortert separat for å bestemme prosentandel og utbytte av osteocytter fra hver fraksjon. Etter sorteringen dyrket vi osteocytter i 24 timer på en 96-brønnsplate for å sammenligne tettheten av de frøede cellene. Tettheten av osteocytter i fraksjon 2-2 er vist å være høyere enn for fraksjon 1, og osteocytttettheten begynner å synke bemerkelsesverdig i fraksjonene 6, 7 og 8 (figur 1A).
Selv om prosentandelen osteocyt oppnådd blant alle fraksjoner ikke er statistisk signifikant (figur 1B), varierer tettheten av osteocytter dramatisk. Forskere20 har rapportert bruk av fraksjoner 2 \u20125 for å isolere osteocytter via FACS, og vi viser i figur 1 at bruk av fraksjoner 2 \u20125 optimaliserer prosessen for å oppnå osteocytter og reduserer tiden av typen.
Figur 2 viser antall celler og gating-strategi praktisert for å isolere GFP-positive fra GFP-negative celler der celler oppnådd ved fraksjonering av GFP-negativ mus calvaria ble brukt som kontroll. Osteocytter oppnådd gjennom denne metoden ble analysert for genuttrykk av Dmp1 og SOST, som er kjente osteocyttermarkører. Dmp1 og SOST mRNA-uttrykk er høyere i osteocytter sammenlignet med pre-sort fraksjon 2, som er kjent som en høy osteoblastfraksjon (figur 3A). Figur 3B viser morfologien til en GFP-positiv osteocytt som beholder en stjerneform med dendritter som strekker seg fra cellekroppen dyrket i 24 timer på en plastkulturparabol etter sortering.
Figur 1: Effektivitet av osteocytfraksjonering. (A) Mikroskopiske bilder av tettheten av osteocytter fra fraksjoner 1\u20128 sådd på en 96-brønnsplate fanget etter 24 timer av denne typen. Brøk 2\u20125 har høyere celletetthet enn brøk 1 og 6\u20128. Skala bar = 100 μm. (B) Prosentandel av osteocytter oppnådd fra fraksjoner 1 \u20128 målt av flowcytometerprogramvaren. Resultatene er hentet fra tre separate representative eksperimenter. Data er presentert som et gjennomsnitt ± standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Isolering av GFP-positive osteocytter via fluorescensaktivert cellesortering. Det øvre panelet representerer celler isolert fra GFP-negativ C57Bl/6J littermate calvaria som GFP-terskelkontroll. Det nedre panelet representerer antall celler og gatingkontroll som praktiseres for å isolere GFP-positive osteocytter fra GFP-negative celler i fraksjon 2 oppnådd fra dmp1-topaz mus calvaria. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Osteocyttkarakterisering etter sortering. (A) Relativ mRNA-ekspresjon av Dmp1 og SOST av fraksjon 2-celler dyrket i 24 timer og osteocytter dyrket i 24 timer etter sortering. Data er presentert som et gjennomsnitt ± standardavvik. Statistiske forskjeller ble påvist med Student t-test: * p < 0,05, **p < 0,01. (B) Mikroskopisk bilde av en osteocytt som holder dendritter som strekker seg utover fra cellekroppen dyrket i 24 timer etter sortering. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den første isolerte osteocytten var fra en kylling calvaria7 isolert ved bruk (OB7.3) eller aviantvarianten av PHEX; Imidlertid er denne metoden begrenset av tilgjengeligheten av brukbare antistoffer, da osteocyttspesifikke antistoffer som også er spesifikke, må fremstilles. Forskere brukte en annen modifikasjon av den sekvensielle enzymatiske prosessen for å oppnå osteocytter fra mus og rotte lange bein; Den rapporterte renheten til disse kulturene ble satt til ca. 70%9. Utviklingen av cre-musemodellen tillot engineering osteocytter, som uttrykker GFP på overflaten. Denne musemodellen, sammen med FACS, ble brukt til å oppnå rene kulturer av primære osteocytter20.
Vi utelater bruk av fraksjon 1 og fraksjon 6\u20128 da små mengder osteocytter kommer ut i disse fraksjonene. Bruk av fraksjoner 2\u20125 gir best mulig utbytte av osteocytter over kortest behandlingstid; Dette begrenser håndteringstiden til osteocytter og arbeider for å forhindre celledød eller en mulig endring i cellesignalering som følge av stresset cellen blir utsatt for under fraksjonering. Vi dyrker også osteocytter for 24 timer pre-sort, som som standard utelukker ikke-adherente suspensjonsceller (hematopoietiske celler) under sortering. Dette minimerer forurensning av hematopoietiske celler som uttrykker GFP22. Arbeidsflyten i denne protokollen utnytter tidligere publiserte metoder23 og forkorter tiden av den typen, noe som muliggjør en effektiv og rask osteocytgjenoppretting med minimal forurensning.
Kritiske trinn i protokollen inkluderer å skaffe en ren benete calvaria og trimming av bløtvev fra hjernen eller bindevevet festet til beinet for å begrense forurensningen av adherente celler (fibroblast og nevrale celler). Pipettering av cellene under trinn som inkluderer innhenting og vasking av fordøyelsene er også avgjørende, siden celleaggregater og dubletter leses som avfall under sortering og vil bidra til lavt utbytte av osteocytter.
Osteocytter kan sorteres uten tidligere kultur. Dette betyr imidlertid at et høyere antall celler må sorteres, noe som øker tiden av typen og øker sjansen for hematopoietisk forurensning. Dette kan reduseres ved å bruke hematopoietisk celleuttømming pre-sortering. Dette er imidlertid belastende og anbefales ikke for rutinemessig og batchlaboratorieanalyse22. Det kan oppstå problemer under sortering på grunn av tilstedeværelsen av store celleaggregater og dubletter tilstoppingsvæskestrøm av sorteringsmaskinen. I vår protokoll har dette ikke vært et problem, men dette kan løses ved å redusere FBS-innholdet i sorteringsbufferen (mindre enn 10%).
Denne protokollen kommer ikke uten begrensninger. Denne metoden benytter museosteocytter, som ikke helt ligner menneskelige osteocytter. Dette begrenser utvidelsen av resultatene oppnådd ved å studere murine osteocytter til meningsfulle kliniske resultater. Protokoller for isolering av humane osteocytter er beskrevet24, og forskere oppfordres til å bruke de celleartene som best tjener deres mål. Som med andre protokoller er mengdene osteocytter oppnådd ved hjelp av denne protokollen begrenset, og et stort antall mus kreves for storskala analyse, men ved å redusere tiden som trengs for å forberede og sortere osteocytter, kan høyere mengder celler kjøpes i en enkelt tidsramme.
Osteocytter oppnådd gjennom denne prosessen kan brukes til videre kultur og samkultur, genuttrykksanalyse, nedstrømsanalyse av substrataktivering / inhibering, molekylær probing og fargeapplikasjoner. Primære celler kan også brukes til å konstruere en 3D osteocytmatrisemodell som ligner det opprinnelige osteocytiske miljøet for studiet av mekanotransduksjon og mekanosensing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av et JSPS KAKENHI-stipend fra Japan Society for the Promotion of Science (nr. 19K10397 til HK og nr. 18K09862 til I.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | Data aquisition and analysis | |
| BD Falcon Tube | BD Biosciences | 352235 | 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 μm nylon mesh. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, MO, USA | ||
| Collagenase | Wako, Osaka, Japan | 034-22363 | 0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum. |
| EDTA | Dojindo, Kumamoto, Japan | 5mM EDTA prepared with 0.1% BSA | |
| FACSAriaTM II | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest, Nuaillé, France | ||
| Isolation buffer | 70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES | ||
| Millex Sterile Filter Unit | Merck Millipore, Ireland | SLGV033RS | 0.22μm |
| Nylon cell strainer | FALCON, NY, USA | 40μm | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies, NY, USA | 0.5% x10. diluted to x1 in PBS | |
| α-MEM | Wako, Osaka, Japan | Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 μg/ml streptomycin |
References
- Manolagas, S. C. Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis. Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).
- Bonewald, L. F. Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).
- Bonewald, L. F.
- Feng, J. Q., et al. Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism. Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).
- Lane, N. E., et al. Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More. Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).
- van der Plas, A., Nijweide, P. J.
- Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).
- Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).
- Kramer, I., et al. Osteocyte Wnt/β-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).
- Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).
- Kato, Y., et al. Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).
- Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).
- Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Spatz, J. M., et al. The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro. The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).
- Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
- Sandberg, R., Ernberg, I. Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).
- Kalajzic, I., et al. Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene. Bone. 35 (1), 74-82 (2004).
- Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. Bone. 45 (4), 682-692 (2009).
- Nakashima, T., et al. Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression. Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).
- Kalajzic, I., et al. In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology. Bone. 54 (2), 296-306 (2013).
- Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes. Bone. 72, 34-42 (2015).
- Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M. Bone Research Protocols. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana Press. 55-66 (2012).
- Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. An improved method to isolate primary human osteocytes from bone. Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).
