Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

opnåelse af primære osteocytter gennem murin calvarial fraktionering af GFP-ekspressive osteocytter

Published: June 2, 2020 doi: 10.3791/61513
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics, Department of Translational Medicine, Tohoku University Graduate School of Dentistry

Summary

Denne protokol beskriver dissektion af neonatal dmp1-topas musecalvaria og isolering af osteocytter, der udtrykker det grønne fluorescerende protein gennem cellefordøjelse og fraktionering, ud over osteocytpræparation til fluorescensaktiveret cellesortering (FACS).

Abstract

Osteocytten, der engang blev anset for at være en passiv beboer i knoglen givet backstage-funktionen til at registrere mekanisk belastning, bringes nu i rampelyset og har vist sig at have flere hovedfunktioner som aktivt at ændre den ekstracellulære matrix og danne et endokrin organ med det lacunocanalicular system, der omslutter det og sender beskeder til fjerne steder. På grund af de metoder, der gjorde det muligt at teste osteocytten in vitro fra isolering af primære osteocytter til osteocytlignende cellelinjer, oplever osteocytter nu en rungende interesse og en bølge af viden om struktur og funktion. Mange aspekter af osteocytbiologien og interaktion med andre molekylære komponenter er endnu ikke opdaget. I denne protokol beskriver vi detaljeret den effektive isolering af primære osteocytter fra dmp1-topas neonatal musecalvaria, som udtrykker det grønne fluorescerende protein i osteocytter gennem cellefraktionering og efterfølgende erhvervelse af kulturer af primære osteocytter af FACS.

Introduction

Osteocytter er terminalt differentierede celler fra osteoblastiske forfædre, der blev indlejret i deres udskillede matrix1. De er de mest rigelige og længstlevende celler blandt knoglecellepopulationer. De bor inden for lakuner og har en karakteristisk stellatmorfologi med dendritter, der strækker sig gennem kanaler kaldet canaliculi, der danner et omfattende netværk af kommunikation og metabolisk udveksling med deres omgivende miljø og knogleoverfladen2. Osteocytter koreograferer både osteoblaster og osteoklaster roller i knoglemodellering, de er de primære mekanosensoriske celler, der giver tilpasning til mekanisk belastning3, er involveret i fosfathomeostase4 og knoglematrixmineralisering5, og sammen med lacunocanalicular systemet fungerer de som et endokrin organ, der signalerer fjernt væv6.

Osteocytter er placeret i en mineraliseret matrix, hvilket begrænser tilgængeligheden og gør deres isolering udfordrende, hvilket forhindrer in vitro-undersøgelse. En af de første isolationsmetoder beskrev isolerede osteocytter fra kyllingecalvaria ved anvendelse af et osteocytspecifikt monoklonalt antistof (OB7.3)7, som senere blev kendt for at være den aviære variant af PHEX (PHosphate-regulerende gen med homologi til endopeptidaser på X-kromosomet)8. Andre forskere brugte sekventiel fordøjelse af rotte 9 eller mus 10 lange knogler for at opnå osteocytrige fraktioner, hvor osteocytrenhed blev rapporteret at være omkring70%9. Begrænsninger af denne procedure omfatter den suboptimale renhed af kulturer, der er forurenet med andre celletyper udover osteocytter, og at osteocytter potentielt kan overgros af andre celler i kultur, da osteocytter har mistet evnen til at dele sig. Disse udfordringer begrænser anvendeligheden af langsigtede kulturer.

For at overvinde disse begrænsninger blev forskellige osteocytcellelinjer udviklet. MLO-Y4-cellelinjen11 og MLO-A5-cellelinjen12 er især de mest undersøgte cellelinjer, som er nyttige til undersøgelse af osteocytter i det tidlige stadium; De er dog mindre nyttige til at studere moden osteocytsignalering, da de udtrykker lave niveauer af sclerostin og FGF2313, som begge er modne osteocytmarkører. Andre cellelinjer, herunder IDG-SW3 14 og Ocy45415, udtrykker høje niveauer af sclerostin og FGF23 og er nyttige til at studere det sene osteocytstadium. Cellelinjer viser sig at være nyttige forskningsværktøjer; Ikke desto mindre kommer de ikke uden begrænsninger, da de ikke fuldt ud repræsenterer biologien i den primære celle. Forskellige cellelinjer repræsenterer forskellige udviklingsstadier af osteocytmodenhedsspektret, og cellelinjer repræsenterer ikke heterogeniteten af primære osteocytter16,17.

For at opnå rene kulturer af primære osteocytter udnyttede forskere cre-musemodellen, hvor 8-kb dmp1-promotoren bruges til at drive grønt fluorescerende protein (GFP) ekspression i osteocytter18,19. Dual transgene mus (pOB-Col 2.3- GFP-cyan og DMP1-GFP-topas) af Paic et al.19 og dmp1-topas transgene mus af Nakashima et al.20 er blevet brugt til at opnå osteocytpopulationer. I hvilke de anvendte sekventiel fordøjelse og FACS af osteocytter, der udtrykker GFP for at erhverve kulturer af primære osteocytter19,20. Retningen af cre i 10-kb dmp1 reportermusen Ai9, som aktiverer tdTomato-proteinet, viste sig at være til stede i osteocytter, osteoblaster, muskler og celler i knoglemarven. 8-kb dmp1-promotoren havde det samme ekspressionsmønster, men kun en andel af osteoblaster og knoglemarvsceller udtrykte proteinet, hvilket indikerer, at 8-kb dmp1-promotoren er mere specifik21. På trods af dette bør resultater opnået ved anvendelse af 8-kb dmp1-promotoren fortolkes med forsigtighed, og genekspressionsprofiler bør rutinemæssigt udføres ved hjælp af osteocyt vs. osteoblastspecifikke markører for at sikre, at den opnåede population er af høj nok renhed.

Osteoklastmarkører OSCAR og Dcstamp blev fundet i hæmatopoietiske ikke-depleterede vs. udtømte osteocytpopulationer, dette fund førte forfatterne til at konkludere, at fordøjelser opnået ved fraktionering af 8-kb dmp1-topas neonatal calvaria og GFP-sortering er forurenet med hæmatopoietiske celler. Forurening med hæmatopoietiske celler kunne have været afbødet ved at stramme GFP-sorteringsporten, da GFP-positive hæmatopoietiske celler havde en rimelig lavere GFP-intensitet end GFP-positive mesenkymale celler (osteocytter)22.

Metoderne til undersøgelse af osteocytter in vitro har bidraget til den seneste rigdom af information om osteocytbiologi. Imidlertid forbliver osteocytisolering en arbejdskrævende og langvarig procedure med lave celleudbytter. Den beskrevne metode til knoglefordøjelse ved anvendelse af collagenase og EDTA, ofte op til fraktion 8,23, tager flere timer, hvor osteocyt levedygtighed beskattes. Forskere har rapporteret at bruge fraktioner (2-20125) til cellesortering 20 og har vist, at ekspressionsprofilen for gener forbundet med osteocytter versus osteoblaster bekræfter succesen med at isolere rene osteocytpopulationer20. I denne artikel beskriver vi processen med at opnå fraktioner (2-20125), og vi sammenligner udbyttet af osteocytter fra hver fraktion startende med fraktion 1 til 8 for at bestemme afkastet af osteocytter i hver fraktion. Vi beskriver også dissektion af nyfødt dmp1-topas mus calvaria og calvarial fordøjelse ved hjælp af collagenase og ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) samt forberedelse af celler til FACS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreprocedurer og dyrepleje blev udført i overensstemmelse med Tohoku University regler og forskrifter.

1. Dissektion af nyfødt dmp1-topas mus calvaria

  1. Til denne protokol skal du bruge 6-127 dage gamle hvalpe af C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J-mus. Afliv mus med 5% isofluran inhalation og overfør derefter hvalpene til 70% ethanol.
  2. Overfør den aflivede hvalp til en ikke-behandlet kulturskål.
  3. Brug saks og pincet til at tage fat i huden i bunden af kraniet og lave et snit.
  4. Brug det første snit som udgangspunkt, skær på begge laterale sider af kraniet foran ørerne, fjern huden og udsæt calvaria.
  5. Hold hovedet fra næsebroen og skær calvaria langs lambdoid sutur. Skær langs sidekanterne af parietalbenene og udvid den til at omfatte frontdelen.
  6. Adskil calvaria fra det underliggende hjernevæv.
    BEMÆRK: For at sikre en ren knoglekalvaria med minimal fastgørelse af blødt væv må du ikke skære dybt ind i knoglen; Som reference skal man kunne se skyggen af saksen under knoglen.
  7. Calvaria overføres til fosfatbufret saltvand (PBS, pH 7,4 i hele protokollen). Sørg for, at den konkave del vender opad.

2. Fraktionering af nyfødt musecalvaria

  1. Overfør op til 5 calvariae til et 50 ml konisk rør indeholdende 5 ml 2 mg/ml kollagenaseopløsning. Brug frisk kollagenaseopløsning tilberedt lige før brug.
    1. For at fremstille en frisk kollagenaseopløsning tilsættes kollagenasepulver til isolationsbufferen (70 mM NaCl, 10 mM NaHCO 3, 60 mM sorbitol,3 mM K 2 HPO4, 1 mM CaCl 2, 1 mg/ml bovint serumalbumin (BSA), 5 mg/ml glucose og 25 mM HEPES) ved2mg/ml. Opløs kollagenasepulveret på en magnetisk omrører.
    2. Kør kollagenaseopløsningen gennem en 0,22 μm steril filterenhed i et 50 ml rør og hold den på is i hele protokollen.
  2. Calvaria inkuberes ved 37 °C i 20 minutter på en ryster ved 300 o/min for at opnå fraktion 1.
  3. Kassér fordøjelsen af fraktion 1, vask calvaria med 5 ml fosfatbufret saltvand (PBS) og kassér vasken.
  4. Calvaria inkuberes i 5 ml 5 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) indeholdende 1 mg/ml BSA i PBS, PH 7,4 ved 37 °C i 15 minutter på en ryster ved 300 omdr./min.
  5. Opsaml fordøjelsen i et 50 ml konisk rør. Calvaria vaskes med 5 ml PBS og tilsættes vaskeopløsningen til fordøjelsen.
    BEMÆRK: På hvert tidspunkt for opsamling af fordøjelsen og vask, pipette knoglerne i deres opløsning for at løsne cellerne fra knoglen og for at forhindre dubletter og celleaggregater.
  6. For at opnå fraktion 2 centrifugeres fordøjelsen ved 300 x g ved 4 °C i 5 minutter. Supernatanten kasseres, pelletpen opslæmmes igen i 8 ml α-Minimum Essential Medium (MEM) indeholdende 10 % føtalt bovint serum (FBS), 100 IE/ml penicillin G og 100 μg/ml streptomycin. Frø på en 10 cm kulturskål. Inkuber fraktion 2 ved 37 °C under 5% CO2.
  7. Calvaria inkuberes i 5 ml kollagenaseopløsning ved 37 °C i 20 minutter på en shaker ved 300 rpm.
  8. Gentag trin 2.5\u20122.6 for at indsamle brøk 3. Der inkuberes fraktion 3 ved 37 °C under 5 % CO2.
    BEMÆRK: På dette tidspunkt bliver knoglerne mindre, og de reduceres til fragmenter. For at sikre, at ingen knogler ved et uheld bliver opsuget i fordøjelserne, hvilket fører til celletab i processen, skal du bruge en lille spidspipette til opsamling af fordøjelserne (1000-012200 μL pipettespidser).
  9. Calvaria inkuberes i 5 ml kollagenaseopløsning ved 37 °C i 20 minutter på en shaker ved 300 rpm.
  10. Gentag trin 2.5\u20122.6 for at indsamle brøk 4. Der inkuberes fraktion 4 ved 37 °C under 5 % CO2.
  11. Calvaria inkuberes i 5 ml 5 mM EDTA indeholdende 1 mg/ml BSA i PBS (pH 7,4) ved 37 °C i 15 minutter på en ryster ved 300 omdr./min.
  12. Gentag trin 2.5\u20122.6 for at indsamle brøk 5. Der inkuberes fraktion 5 ved 37 °C under 5 % CO2. Osteocytter kan forberedes til sortering samme dag eller dyrkes op til 24 timer før sortering.

3. Fremstilling af osteocytter til fluorescensaktiveret cellesortering

  1. Opsug mediet for hver cellefraktion og vask forsigtigt med 10 ml PBS to gange.
  2. Tilsæt 5 ml 0,5% trypsin-EDTA i PBS og inkuber cellerne i 5 minutter ved 37 °C. Tilsæt 5 ml 10% FBS α-MEM og pipette for at løsne cellerne forsigtigt. Kombiner cellerne i hver fraktion ved at sigte gennem en 40 μm cellesil i et 50 ml konisk centrifugerør.
  3. Cellerne vaskes med 10 ml PBS og opsamles ved at sigte gennem en 40 μm cellesi i et 50 ml konisk centrifugerør. Centrifuger cellerne ved 300 x g ved 4 °C i 5 minutter.
  4. Opsug supernatanten og tilsæt 10% FBS α-MEM til pelleten. Juster cellekoncentrationen til ca. 1 x 107 celler/ml.
  5. Filtrer cellerne i et 35 μm nylonnet capped rør. Cellerne er nu klar til FACS.
  6. Til denne protokol skal du bruge en dyse på 100 μm. Opsamlingsvæsken skal bestå af 10% FBS α-MEM. Opbevar prøven sorteret under omrøring og ved 4 °C under hele sorteringen, hvis det er muligt.
  7. Før sorteringen skal du optimere gating for at fjerne artefakter og celler ved at justere SSC-området (side scatter) og FSC-området (forward scatter). Fjern dubletter ved at justere SSC-bredde vs SSC-højde og FSC-område vs FSC-bredde. GFP-negative osteocytter bør anvendes som kontrol til at justere parametrene for sorteringsinstrumentet.
  8. Når celleopsamlingen er afsluttet, centrifugeres cellerne ved 300 x g ved 4 °C i 10 minutter. Vask celler med PBS. Centrifuger cellerne ved 300 x g ved 4 °C i 5 minutter.
  9. Suspender cellerne igen, og juster tallet som ønsket ved hjælp af 10% FBS α-MEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Formålet med denne protokol er at demonstrere processen med at opnå kulturer af primære osteocytter fra dmp1-topas neonatal musecalvaria gennem en fraktioneringsproces under anvendelse af collagenase til nedbrydning af kollagenmatrixen og EDTA til calciumchelation, hvorefter celler fremstilles til FACS for at adskille osteocytter fra andre cellepopulationer.

Metoder til opnåelse af primære osteocytter fra neonatal musecalvaria beskriver ofte brugen af fraktioner (1\u20128) til sortering23. For at teste effektiviteten af denne metode sammenlignede vi udbyttet af osteocytter opnået fra en dmp1-topas musecalvaria, startende fra fraktioner 1 til 8. Brøker 1-128 blev sorteret separat for at bestemme procentdelen og udbyttet af osteocytter fra hver fraktion. Efter sorteringen dyrkede vi osteocytter i 24 timer på en 96-brøndplade for at sammenligne densiteten af de frøede celler. Tætheden af osteocytter i fraktioner 2-20125 er vist at være højere end for fraktion 1, og osteocytdensiteten begynder at falde bemærkelsesværdigt i fraktionerne 6, 7 og 8 (figur 1A).

Selvom procentdelen af osteocyt opnået blandt alle fraktioner ikke er statistisk signifikant (figur 1B), varierer tætheden af osteocytter dramatisk. Forskere20 har rapporteret brugen af fraktioner 2\u20125 til isolering af osteocytter via FACS, og vi viser i figur 1 , at brug af fraktioner 2\u20125 optimerer processen til opnåelse af osteocytter og reducerer tiden af slagsen.

Figur 2 viser antallet af celler og gating-strategi, der blev praktiseret for at isolere GFP-positive fra GFP-negative celler, hvor celler opnået ved fraktionering af GFP-negativ musecalvaria blev anvendt som kontrol. Osteocytter opnået ved denne metode blev analyseret for genekspression af Dmp1 og SOST, som er kendte osteocytter markører. Dmp1- og SOST mRNA-ekspressioner er højere i osteocytter sammenlignet med præsorteringsfraktion 2, der er kendt som en høj osteoblastfraktion (figur 3A). Figur 3B viser morfologien af en GFP-positiv osteocyt, der bevarer en stellatform med dendritter, der strækker sig fra cellelegemet dyrket i 24 timer på en plastkulturskålpostsortering.

Figure 1
Figur 1: Effektiviteten af osteocytfraktionering. (A) Mikroskopiske billeder af massefylden af osteocytter fra fraktioner 1\u20128 podet på en 96-brønds plade fanget efter 24 timer af slagsen. Brøkdele 2-125 har en højere celletæthed end fraktionerne 1 og 6-128. Skalabjælke = 100 μm. (B) Procentdel osteocytter opnået fra fraktionerne 1\u20128 målt ved flowcytometersoftwaren. Resultaterne er afledt af tre separate repræsentative eksperimenter. Data præsenteres som en gennemsnitlig ± standardafvigelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Isolering af GFP-positive osteocytter via fluorescensaktiveret cellesortering. Det øverste panel repræsenterer celler isoleret fra GFP-negativ C57Bl/6J kuldmatcalvaria som GFP-tærskelkontrol. Det nederste panel repræsenterer antallet af celler og gating-kontrol, der praktiseres for at isolere GFP-positive osteocytter fra GFP-negative celler i fraktion 2 opnået fra dmp1-topas musecalvaria. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Osteocyt karakterisering post sort. (A) Relativ mRNA-ekspression af Dmp1 og SOST af fraktion 2-celler dyrket i 24 timer og osteocytter dyrket i 24 timer efter sortering. Data præsenteres som en gennemsnitlig ± standardafvigelse. Statistiske forskelle blev opdaget ved hjælp af elevens t-test: * p < 0,05, **p < 0,01. (B) Mikroskopisk billede af en osteocytholdende dendritter, der strækker sig udad fra cellelegemet dyrket i 24 timer efter sortering. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den første isolerede osteocyt var fra en kyllingecalvaria7 isoleret ved anvendelse af (OB7.3) eller den aviante variant af PHEX; Denne metode er imidlertid begrænset af tilgængeligheden af brugbare antistoffer, da osteocytspecifikke antistoffer, der også er speciespecifikke, skal fremstilles. Forskere brugte en anden modifikation af den sekventielle enzymatiske proces for at opnå osteocytter fra mus og rotte lange knogler; Den rapporterede renhed af disse kulturer blev fastsat til ca. 70%9. Udviklingen af cre-musemodellen tillod konstruktion af osteocytter, som udtrykker GFP på deres overflade. Denne musemodel blev sammen med FACS brugt til at opnå rene kulturer af primære osteocytter20.

Vi udelader brugen af fraktionerne 1 og fraktionerne 6\u20128, da små mængder osteocytter kommer ud i disse fraktioner. Brug af fraktioner 2\u20125 giver det bedst mulige udbytte af osteocytter over den korteste behandlingstid; Dette begrænser håndteringstiden for osteocytter og arbejder hen imod at forhindre celledød eller en mulig ændring i cellesignalering som følge af den stress, cellen udsættes for under fraktionering. Vi dyrker også osteocytter til 24 timers forsortering, hvilket som standard udelukker ikke-klæbende suspensionsceller (hæmatopoietiske celler) under sorteringsforberedelse. Dette minimerer forurening med hæmatopoietiske celler, der udtrykker GFP22. Arbejdsprocessen i denne protokol udnytter tidligere offentliggjorte metoder23 og forkorter den slagsens tid, hvilket giver mulighed for en effektiv og hurtig osteocytgenvinding med minimal forurening.

Kritiske trin i protokollen omfatter opnåelse af en ren knoglekalvaria og trimning af blødt væv fra hjernen eller bindevæv, der er fastgjort til knoglen for at begrænse forureningen af klæbende celler (fibroblast og neurale celler). Det er også afgørende at pipettere cellerne under trin, der inkluderer opnåelse og vask af fordøjelserne, da celleaggregater og dubletter læses som affald under sortering og vil bidrage til et lavt udbytte af osteocytter.

Osteocytter kan sorteres uden forudgående kultur. Dette betyder imidlertid, at et højere antal celler skal sorteres, hvilket øger sorteringstiden og øger chancen for hæmatopoietisk forurening. Dette kan afbødes ved at anvende hæmatopoietisk celleudtømning forsortering. Dette er imidlertid beskattende og anbefales ikke til rutinemæssig og batchlaboratorieanalyse22. Der kan opstå problemer under sortering på grund af tilstedeværelsen af store celleaggregater og dubletter, der tilstopper væskestrømmen i sorteringsmaskinen. I vores protokol har dette ikke været et problem, men dette kan løses ved at reducere FBS-indholdet i sorteringsbufferen (mindre end 10%).

Denne protokol kommer ikke uden begrænsninger. Denne metode anvender mus osteocytter, som ikke helt ligner humane osteocytter. Dette begrænser udvidelsen af resultaterne opnået ved at studere murine osteocytter til meningsfulde kliniske resultater. Protokoller til isolering af humane osteocytter er blevet beskrevet24, og forskere opfordres til at bruge de cellearter, der bedst tjener deres mål. Som med andre protokoller er mængderne af osteocytter opnået ved anvendelse af denne protokol begrænset, og et stort antal mus kræves til storskala analyse, men ved at reducere den tid, der er nødvendig til fremstilling og sortering af osteocytter, kan større mængder celler erhverves i en enkelt tidsramme.

Osteocytter opnået gennem denne proces kan anvendes til yderligere kultur og co-kultur, genekspressionsanalyse, nedstrømsanalyse af substrataktivering / hæmning, molekylær sondering og farvningsapplikationer. Primære celler kan også bruges til at konstruere en 3D-osteocytmatrixmodel, der ligner det oprindelige osteocytiske miljø til undersøgelse af mekanotransduktion og mekanosensering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvist støttet af et JSPS KAKENHI-tilskud fra Japan Society for the Promotion of Science (nr. 19K10397 til H.K. og nr. 18K09862 til I.M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD FACSDiva software BD Biosciences Data aquisition and analysis
BD Falcon Tube BD Biosciences 352235 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 μm nylon mesh.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich, MO, USA
Collagenase Wako, Osaka, Japan 034-22363 0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum.
EDTA Dojindo, Kumamoto, Japan 5mM EDTA prepared with 0.1% BSA
FACSAriaTM II BD Biosciences
Fetal bovine serum (FBS) Biowest, Nuaillé, France
Isolation buffer 70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES
Millex Sterile Filter Unit Merck Millipore, Ireland SLGV033RS 0.22μm
Nylon cell strainer FALCON, NY, USA 40μm
Trypsin-EDTA Life Technologies, NY, USA 0.5% x10. diluted to x1 in PBS
α-MEM Wako, Osaka, Japan Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 μg/ml streptomycin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Manolagas, S. C. Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis. Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).
  2. Bonewald, L. F. Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).
  3. Bonewald, L. F. Mechanosensation and Transduction in Osteocytes. BoneKEy osteovision. 3 (10), 7-15 (2006).
  4. Feng, J. Q., et al. Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism. Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).
  5. Lane, N. E., et al. Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).
  6. Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More. Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).
  7. van der Plas, A., Nijweide, P. J. Isolation and purification of osteocytes. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).
  8. Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).
  9. Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).
  10. Kramer, I., et al. Osteocyte Wnt/β-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).
  11. Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).
  12. Kato, Y., et al. Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).
  13. Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).
  14. Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
  15. Spatz, J. M., et al. The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro. The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).
  16. Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
  17. Sandberg, R., Ernberg, I. Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).
  18. Kalajzic, I., et al. Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene. Bone. 35 (1), 74-82 (2004).
  19. Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. Bone. 45 (4), 682-692 (2009).
  20. Nakashima, T., et al. Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression. Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).
  21. Kalajzic, I., et al. In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology. Bone. 54 (2), 296-306 (2013).
  22. Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes. Bone. 72, 34-42 (2015).
  23. Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M. Bone Research Protocols. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana Press. 55-66 (2012).
  24. Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. An improved method to isolate primary human osteocytes from bone. Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).

Tags

Tilbagetrækning udgave 160 Primær osteocyt Dmp1 SOST GFP fraktionering FACS
opnåelse af primære osteocytter gennem murin calvarial fraktionering af GFP-ekspressive osteocytter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marahleh, A., Kitaura, H., Ogawa,… More

Marahleh, A., Kitaura, H., Ogawa, S., Shen, W. R., Qi, J., Ohori, F., Noguchi, T., Nara, Y., Pramusita, A., Kinjo, R., Mizoguchi, I. Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes. J. Vis. Exp. (160), e61513, doi:10.3791/61513 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter