Summary
このプロトコルでは、蛍光活性化細胞選別(FACS)のための骨細胞調製に加えて、新生児dmp1-topazマウス頭蓋冠の解剖と、細胞消化と分画による緑色蛍光タンパク質を発現する骨細胞の単離について説明します。
Abstract
骨細胞は、かつては機械的負荷を感知する舞台裏の機能を与えられて骨の受動的な常駐であると考えられていましたが、今では脚光を浴びており、細胞外マトリックスを積極的に修飾し、それを囲むラクノカナキュラー系で内分泌器官を形成し、離れた部位にメッセージを送信するなど、複数の主要な機能を持っていることが示されています。初代骨細胞を単離して骨細胞様細胞株までin vitroで骨細胞を試験することが可能になった方法のおかげで、骨細胞は現在、構造と機能に関する大きな関心と知識の急増を経験しています。骨細胞の生物学や他の分子成分との相互作用の多くの側面はまだ発見されていません。このプロトコルでは、骨細胞で緑色蛍光タンパク質を発現するdmp1-topaz新生児マウス頭蓋冠からの初代骨細胞の効率的な単離について、細胞分画とその後のFACSによる初代骨細胞の培養の取得によって詳細に説明します。
Introduction
骨細胞は、それらの分泌マトリックス1に埋め込まれるようになった骨芽細胞前駆細胞からの最終分化細胞である。それらは骨細胞集団の中で最も豊富で最も長生きする細胞です。それらは裂孔内に存在し、樹状突起が小管と呼ばれるチャネルを通って伸びる特徴的な星状形態を有し、周囲の環境および骨表面との通信および代謝交換の広範なネットワークを形成する2。骨細胞は、骨リモデリングにおける骨芽細胞および破骨細胞の両方の役割を振り付け、それらは機械的負荷3への適応を付与する主要な機械感覚細胞であり、リン酸恒常性4 および骨基質石灰化5に関与し、ラクノカナリキュラー系とともに、遠方組織6にシグナル伝達する内分泌器官として作用する。
骨細胞は石灰化マトリックス内に位置するため、アクセスが制限され、単離が困難になり、in vitro調査が妨げられます。最初の単離方法の1つは、後にPHEX(X染色体上のエンドペプチダーゼと相同性を有するPHosphate調節遺伝子)8の鳥変異体であることが知られる骨細胞特異的モノクローナル抗体(OB7.3)7を使用してニワトリ頭蓋冠から単離された骨細胞について説明しました。他の研究者は、ラット9またはマウス10の長骨の逐次消化を使用して、骨細胞の純度が約70%であると報告されている骨細胞に富む画分を取得しました9。この手順の制限には、骨細胞以外の他の細胞タイプで汚染された培養物の純度が最適ではないこと、および骨細胞が分裂する能力を失ったため、骨細胞が培養中の他の細胞によって潜在的に増殖する可能性があることが含まれます。これらの課題は、長期的な文化の使いやすさを制限します。
これらの制限を克服するために、異なる骨細胞細胞株が開発された。MLO-Y4細胞株11およびMLO-A5細胞株12は、特に初期段階の骨細胞の研究に有用な最も広く研究されている細胞株である。しかし、それらは成熟骨細胞マーカーである低レベルのスクレロスチンとFGF2313を発現するため、成熟骨細胞シグナル伝達の研究にはあまり有用ではありません。IDG−SW3 14およびOcy45415を含む他の細胞株は、高レベルのスクレロスチンおよびFGF23を発現し、後期骨細胞期の研究において有用である。細胞株は有用な研究ツールであることが証明されています。それにもかかわらず、それらは初代細胞の生物学を完全に表していないため、制限なしに来るわけではありません。異なる細胞株は骨細胞成熟スペクトルの異なる発生段階を表し、細胞株は初代骨細胞の不均一性を表すことができません16,17。
初代骨細胞の純粋な培養物を得るために、研究者らは、8 kb dmp1プロモーターを使用して骨細胞における緑色蛍光タンパク質(GFP)発現を促進するcreマウスモデルを利用しました18,19。Paicらによる二重トランスジェニックマウス(pOB-Col 2.3-GFP-シアンおよびDMP1-GFP-topaz)19およびNakashimaらによるdmp1-topazトランスジェニックマウス20が、骨細胞集団を取得するために使用されている。その中で彼らは、初代骨細胞の培養物を取得するためにGFPを発現する骨細胞の逐次消化およびFACSを採用した19,20。tdTomatoタンパク質を活性化する10 kb dmp1レポーターマウスAi9のcreの方向は、骨髄内の骨細胞、骨芽細胞、筋肉、および細胞に存在することが示されました。8 kb dmp1プロモーターは同じ発現パターンを有していたが、骨芽細胞および骨髄細胞の一部のみがタンパク質を発現しており、これは8 kb dmp1プロモーターがより特異的であることを示している21。それにもかかわらず、8 kb dmp1プロモーターを使用して得られた結果は慎重に解釈する必要があり、得られた集団が十分に高い純度であることを確認するために、骨細胞と骨芽細胞特異的マーカーを使用して遺伝子発現プロファイルを日常的に実行する必要があります。
破骨細胞マーカーOSCARとDcstampは、造血非枯渇骨細胞集団と枯渇骨細胞集団で見出され、この発見により、著者らは、8 kb dmp1-topaz新生児頭蓋冠の分画とGFPソーティングから得られた消化物が造血細胞で汚染されていると結論付けました。GFP陽性造血細胞はGFP陽性間葉系細胞(骨細胞)よりもGFP強度が適度に低いため、造血細胞による汚染はGFPソートゲートを締めることで軽減できたはずです22。
in vitroで骨細胞を研究する方法は、骨細胞生物学に関する最近の豊富な情報に貢献しています。しかしながら、骨細胞の単離は、依然として労働集約的で時間のかかる手順であり、細胞収率は低い。コラゲナーゼおよびEDTAを用いた骨消化の記載された方法は、しばしば画分8から23まで、骨細胞の生存率が課税される数時間を要する。研究者らは、細胞選別に画分(2〜20)を使用したことを報告しており20、骨細胞に関連する遺伝子と骨芽細胞に関連する遺伝子の発現プロファイルが、純粋な骨細胞集団の単離の成功を確認することを示しました20。この記事では、フラクション(2〜2)を取得するプロセスについて説明し、フラクション1から8までの各フラクションからの骨細胞の収量を比較して、各フラクションの骨細胞の戻りを決定します。また、新生dmp1-topazマウス頭蓋冠の解剖とコラゲナーゼとエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を用いた頭蓋骨消化、およびFACS用細胞の調製についても説明します。
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Protocol
すべての動物の手順と動物の世話は、東北大学の規則と規則に従って行われました。
1. 新生児dmp1-トパーズマウス頭蓋冠の解剖
- このプロトコルでは、C57BL/6-Tg(Dmp1-トパーズ)1Ikal/Jマウスの6〜6日齢の子犬を使用します。5%イソフルラン吸入でマウスを安楽死させ、次に子犬を70%エタノールに移します。
- 安楽死させた子犬を未処理の培養皿に移します。
- はさみとピンセットを使用して、頭蓋骨の付け根の皮膚をつかみ、切開します。
- 最初の切開を出発点として、耳の前の頭蓋骨の両側を切り取り、皮膚を取り除き、頭蓋冠を露出させます。
- 鼻梁から頭を持ち、ラムドイド縫合糸に沿って頭蓋冠を切ります。頭頂骨の外側の縁に沿って切り、前部を含むように伸ばします。
- 下にある脳組織から頭蓋冠を分離します。
注意: 軟部組織の付着を最小限に抑えたきれいな骨の頭蓋冠を確保するために、骨の奥深くまで切り込まないでください。参考までに、骨の下のハサミの影が見えるはずです。 - 頭蓋冠をリン酸緩衝生理食塩水(PBS、プロトコル全体でpH 7.4)に移します。凹面部分が上を向いていることを確認してください。
2. 新生マウス頭蓋冠の分画
- 5 mLの2 mg/mLコラゲナーゼ溶液を含む50 mLのコニカルチューブに最大5つの頭蓋骨を移します。使用直前に調製した新鮮なコラゲナーゼ溶液を使用してください。
- 新鮮なコラゲナーゼ溶液を調製するには、コラゲナーゼ粉末を単離バッファー(70 mM NaCl、10 mM NaHCO 3、60 mM ソルビトール、3 mM K 2 HPO4、1 mM CaCl 2、1 mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)、5 mg/mLグルコース、25 mM HEPES)に2mg/mLで添加します。コラゲナーゼ粉末をマグネチックスターラーで溶解する。
- コラゲナーゼ溶液を0.22 μmの滅菌フィルターユニットに通し、50 mLチューブに入れ、プロトコル全体を通して氷上に保ちます。
- カルバリアを37°Cで300rpmの振とう機上で20分間インキュベートし、画分1を得た。
- 画分1の消化物を廃棄し、5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で頭蓋冠を洗浄し、洗浄液を廃棄します。.
- 頭蓋冠を5 mLの5 mLの5 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液に含み、PBS、pH 7.4のPBS溶液、pH 7.4、37°Cで300 rpmのシェーカーで15分間インキュベートします。
- ダイジェストを50 mLのコニカルチューブに集めます。頭蓋冠を5 mLのPBSで洗浄し、洗浄液をダイジェストに加えます。
注:消化物を収集して洗浄する各ポイントで、溶液中の骨をピペットで移動して、細胞を骨から切り離し、ダブレットと細胞凝集を防ぎます。 - 画分2を得るために、消化物を300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、10%ウシ胎児血清(FBS)、100 IU/mLペニシリンG、および100 μg/mLストレプトマイシンを含む8 mL αの最小必須培地(MEM)にペレットを再懸濁します。10 cmの培養皿に種をまきます。画分2を5%CO2下で37°Cでインキュベートします。
- 頭蓋骨を5 mLのコラゲナーゼ溶液中で37°C、300 rpmのシェーカーで20分間インキュベートします。
- 分数3を収集するには、手順2.5〜6を繰り返します。画分3を5%CO2下で37°Cでインキュベートします。
注:この時点で、骨は小さくなり、断片に縮小されます。骨が誤って消化物に吸引されてプロセス中の細胞損失につながることがないようにするには、消化物を収集するための小さなチップピペット(1000〜200μLのピペットチップ)を使用します。 - 頭蓋骨を5 mLのコラゲナーゼ溶液中で37°C、300 rpmのシェーカーで20分間インキュベートします。
- 分数4を収集するには、手順2.5〜6を繰り返します。画分4を5%CO2下で37°Cでインキュベートする。
- 頭蓋冠を5 mLの5 mL BSAを含む5 mL の PBS (pH 7.4) 溶液 PBS (pH 7.4) 中、37 °C でシェーカー上で 300 rpm のシェーカーで 15 分間インキュベートします。
- 分数5を収集するには、手順2.5〜6を繰り返します。画分5を5%CO2下で37°Cでインキュベートする。骨細胞は、同じ日に選別できるように準備することも、選別前に24時間まで培養することもできます。
3. 蛍光活性化細胞ソーティングのための骨細胞の調製
- 各細胞画分の培地を吸引し、10 mLのPBSで2回穏やかに洗浄します。
- PBSに5 mLの0.5%トリプシン-EDTAを加え、細胞を37°Cで5分間インキュベートします。 5 mLの10%FBS α-MEMとピペットを加えて、細胞を穏やかに剥離します。40 μmのセルストレーナーを通して50 mLの円錐形遠心管にふるいにかけることにより、各画分の細胞を結合します。
- 細胞を10 mLのPBSで洗浄し、40 μmのセルストレーナーを通して50 mLのコニカル遠心管にふるいにかけて回収します。細胞を300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、ペレットに10%FBS α-MEMを加えます。細胞濃度を約1 x 107 細胞/mLに調整します。
- 35 μmナイロンメッシュキャップ付きチューブで細胞をろ過します。これで、セルはFACSの準備が整いました。
- このプロトコルでは、100 μmサイズのノズルを使用します。収集液は10%FBS α-MEMで構成されている必要があります。可能であれば、攪拌中および仕分け全体を通して4°Cでサンプルを選別してください。
- ソートの前に、側方散乱(SSC)領域と前方散乱(FSC)領域を調整して、アーティファクトと細胞を除去するようにゲーティングを最適化します。SSC幅とSSC高さ、およびFSC面積とFSC幅を調整してダブレットを排除します。GFP陰性骨細胞は、ソート機器のパラメータを調整するためのコントロールとして使用する必要があります。
- 細胞回収が完了したら、細胞を300 x g 、4°Cで10分間遠心分離します。PBSで細胞を洗浄します。細胞を300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 細胞を再懸濁し、10%FBS α-MEMを用いて所望の数を調整する。
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Representative Results
このプロトコルの目的は、dmp1-topaz新生児マウス頭蓋冠から初代骨細胞の培養物を得るプロセスを実証することです コラゲナーゼを使用してコラーゲンマトリックスを分解し、EDTAを使用してカルシウムキレート化を行う分画プロセスを通じて、その後、FACS用に細胞を調製して骨細胞を他の細胞集団から分離します。
新生児マウス頭蓋冠から初代骨細胞を得るための方法は、しばしば選別のための画分(1〜128)の使用を説明する23。この方法の効率をテストするために、画分1から8までの1つのdmp1-topazマウス頭蓋冠から得られた骨細胞の収量を比較しました。画分1〜128を別々に選別して、各画分からの骨細胞の割合および収量を決定した。選別後、96ウェルプレート上で骨細胞を24時間培養し、播種した細胞の密度を比較した。画分2〜125の骨細胞の密度は画分1よりも高く、画分6、7、8では骨細胞の密度が著しく減少し始めます(図1A)。
すべての画分の中で得られた骨細胞の割合は統計的に有意ではありませんが(図1B)、骨細胞の密度は劇的に異なります。研究者20 は、FACSを介して骨細胞を単離するために画分2〜20125を使用することを報告しており、 図1 では、画分2〜20125を使用すると骨細胞を得るためのプロセスが最適化され、ソートの時間が短縮されることを示しています。
図2 は、GFP陰性マウス頭蓋冠の分画によって得られた細胞を対照として用いたGFP陰性細胞からGFP陽性を単離するために実施された細胞数とゲーティング戦略を示す。この方法で得られた骨細胞について、骨細胞マーカーとして知られているDmp1およびSOSTの遺伝子発現について解析した。Dmp1およびSOST mRNA発現は、高骨芽細胞画分として知られているプレソート画分2と比較した場合、骨細胞で高くなっています(図3A)。 図3B は、プラスチック培養皿上で24時間培養した細胞体から伸びる樹状突起を有する星形を保持するGFP陽性骨細胞の形態を示す。
図1:骨細胞分画の効率。 (A)96ウェルプレートに播種した画分1〜128の骨細胞密度の顕微鏡画像(24時間後に撮影)。画分2〜2〜5は、画分1および6〜6よりも高い細胞密度を有する。スケールバー = 100 μm。 (B)フローサイトメーターソフトウェアによって測定された画分1〜128から得られた骨細胞の割合。結果は、3つの別々の代表的な実験から導き出された。データは平均±標準偏差として表されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:蛍光活性化細胞ソーティングによるGFP陽性骨細胞の単離。 上のパネルは、GFP陰性C57Bl/6J同腹仔カルバリアからGFP閾値コントロールとして単離された細胞を表す。下のパネルは、dmp1-topazマウス頭蓋冠から得られた画分2のGFP陰性細胞からGFP陽性骨細胞を単離するために実施された細胞数およびゲーティングコントロールを表す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ソート後の骨細胞特性評価。 (A)選別後24時間培養した画分2細胞および24時間培養した骨細胞のDmp1およびSOSTの相対mRNA発現。データは平均±標準偏差として表されます。統計的差は、スチューデントのt検定を使用して検出されました:* p < 0.05、**p < 0.01。(B)選別後24時間培養した細胞体から外側に伸びる樹状突起を保持した骨細胞の顕微鏡像。スケールバー = 50 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
最初に単離された骨細胞は、(OB7.3)またはPHEXの鳥類変異体を使用して単離されたニワトリ頭蓋冠7 からのものでした。しかしながら、この方法は、種特異的でもある骨細胞特異的抗体を製造しなければならないので、実行可能な抗体の利用可能性によって制限される。研究者らは、マウスおよびラットの長骨から骨細胞を得るために、連続酵素プロセスの異なる改変を使用した。これらの培養物の報告された純度は約70%9に設定されました。creマウスモデルの開発により、表面にGFPを発現する骨細胞を改変することが可能になりました。このマウスモデルは、FACSと共に、初代骨細胞20の純粋な培養物を得るために使用された。
画分1および画分6〜6〜28は、これらの画分で少量の骨細胞が剥がれるため、使用を省略します。画分2〜2〜5を使用すると、最短の処理時間で骨細胞の可能な限り最高の収量が得られます。これにより、骨細胞の取り扱い時間が制限され、分画中に細胞が受けるストレスの結果としての細胞死または細胞シグナル伝達の変化の可能性を防ぐ方向に働きます。また、骨細胞を24時間プレソーティングで培養しますが、デフォルトでは、ソレト調製時に非接着性浮遊細胞(造血細胞)は除外されます。これにより、GFP22を発現する造血細胞による汚染が最小限に抑えられます。このプロトコルで提供されるワークフローは、以前に公開された方法23 を利用し、ソートの時間を短縮し、最小限の汚染で効率的かつ迅速な骨細胞回復を可能にする。
プロトコルの重要なステップには、きれいな骨の頭蓋冠を取得し、接着細胞(線維芽細胞および神経細胞)の汚染を制限するために、脳または骨に付着した結合組織から軟組織をトリミングすることが含まれます。また、細胞凝集体およびダブレットは選別中に廃棄物として読み取られ、骨細胞の低収率に寄与するため、消化物の取得および洗浄を含むステップ中に細胞をピペッティングすることは重要である。
骨細胞は、事前培養なしで選別することができる。ただし、これは、より多くの細胞を選別する必要があることを意味し、選別時間が長くなり、造血汚染の可能性が高まります。これは、造血細胞枯渇プレソートを適用することによって軽減することができる。ただし、これは負担がかかり、ルーチンおよびバッチラボ分析には推奨されません22。選別中に大きな細胞凝集体やダブレットの存在により、選別機の流体の流れが詰まるため、問題が発生する場合があります。私たちのプロトコルでは、これは問題ではありませんでしたが、ソートバッファのFBSコンテンツを減らすことで解決できます(10%未満)。
このプロトコルには制限がないわけではありません。この方法は、ヒトの骨細胞に完全に類似していないマウス骨細胞を利用します。これは、マウス骨細胞を研究することによって得られた結果を意味のある臨床転帰に拡張することを制限する。ヒト骨細胞の単離のためのプロトコルが説明されており24、研究者は彼らの目標に最も適した細胞種を使用することが奨励されています。他のプロトコールと同様に、このプロトコールで得られる骨細胞の量は限られており、大規模な解析には多数のマウスが必要ですが、骨細胞の調製やソーティングにかかる時間を短縮することで、1つの時間枠でより多くの細胞を取得することができます。
このプロセスで得られた骨細胞は、さらなる培養および共培養、遺伝子発現解析、基質活性化/阻害の下流解析、分子プロービング、および染色アプリケーションに使用できます。初代細胞を使用して、メカノトランスダクションおよびメカノセンスの研究のために、天然の骨細胞環境に似た3D骨細胞マトリックスモデルを構築することもできます。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
本研究の一部は、日本学術振興会のJSPS科研費(日本学術振興会)の助成を受けて行われました(第19K10397号、第18K09862号)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | Data aquisition and analysis | |
| BD Falcon Tube | BD Biosciences | 352235 | 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 μm nylon mesh. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, MO, USA | ||
| Collagenase | Wako, Osaka, Japan | 034-22363 | 0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum. |
| EDTA | Dojindo, Kumamoto, Japan | 5mM EDTA prepared with 0.1% BSA | |
| FACSAriaTM II | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest, Nuaillé, France | ||
| Isolation buffer | 70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES | ||
| Millex Sterile Filter Unit | Merck Millipore, Ireland | SLGV033RS | 0.22μm |
| Nylon cell strainer | FALCON, NY, USA | 40μm | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies, NY, USA | 0.5% x10. diluted to x1 in PBS | |
| α-MEM | Wako, Osaka, Japan | Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 μg/ml streptomycin |
References
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