Summary
פרוטוקול זה מתאר דיסקציה של קלבריה עכברית dmp1-topaz בילוד ובידוד של אוסטיאוציטים המבטאים את החלבון הפלואורסצנטי הירוק באמצעות עיכול ושבירה של תאים, בנוסף להכנת אוסטיאוציטים למיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS).
Abstract
האוסטאוציט, שבעבר נחשב לתושב פסיבי של העצם בהתחשב בתפקוד מאחורי הקלעים של חישת עומס מכני, מובא כעת לאור הזרקורים והוכח שיש לו פונקציות עיקריות רבות כמו שינוי פעיל של המטריצה החוץ תאית ויצירת איבר אנדוקריני עם המערכת הלאקונקנאליקולרית התוחמת אותו ושולח הודעות לאתרים מרוחקים. הודות לשיטות שאפשרו לבחון את האוסטיאוציטים במבחנה מבידוד אוסטיאוציטים ראשוניים לשורות תאים דמויי אוסטיאוציטים, אוסטיאוציטים חווים כעת עניין מהדהד ונחשול של ידע על מבנה ותפקוד. היבטים רבים של הביולוגיה של אוסטיאוציטים ואינטראקציה עם רכיבים מולקולריים אחרים עדיין לא התגלו. בפרוטוקול זה, אנו מתארים בפירוט את הבידוד היעיל של אוסטיאוציטים ראשוניים מקלבריה של עכבר ילודים dmp1-topaz, המבטאים את החלבון הפלואורסצנטי הירוק באוסטיאוציטים, באמצעות שבירת תאים ולאחר מכן רכישת תרביות של אוסטיאוציטים ראשוניים על ידי FACS.
Introduction
אוסטיאוציטים הם תאים ממוינים סופניים מאבות אוסטאובלסטיים שהוטמעו במטריצה המופרשת שלהם1. הם התאים הנפוצים ביותר ומאריכי החיים ביותר בקרב אוכלוסיות תאי עצם. הם שוכנים בתוך לאקונה ויש להם מורפולוגיה סטלטלית אופיינית עם דנדריטים המשתרעים דרך ערוצים הנקראים canaliculi ויוצרים רשת נרחבת של תקשורת וחילופי חילוף חומרים עם סביבתם ומשטח העצם2. אוסטיאוציטים כוריאוגרפים הן אוסטאובלסטים והן אוסטאוקלסטים תפקידים בעיצוב מחדש של העצם, הם התאים המכנו-סנסוריים העיקריים המעניקים הסתגלות לעומס מכני3, מעורבים בהומאוסטזיס פוספט4 ובמינרליזציה של מטריצת עצם5, ויחד עם המערכת הלאקונקנאליקולרית, הם פועלים כאיבר אנדוקריני המאותת לרקמות מרוחקות6.
אוסטיאוציטים ממוקמים בתוך מטריצה מינרלית, המגבילה את הנגישות והופכת את בידודם למאתגר, ובכך מעכבת חקירה חוץ גופית. אחת משיטות הבידוד הראשונות תיארה אוסטיאוציטים מבודדים מקלבריה עוף באמצעות נוגדן חד-שבטי ספציפי לאוסטאוציטים (OB7.3)7 אשר מאוחר יותר נודע כגרסה העופות של PHEX (גן מווסת PHosphate עם הומולוגיה לאנדופפטידאזות על כרומוזום X)8. חוקרים אחרים השתמשו בעיכול רציף של חולדה 9 או עכבר 10 עצמות ארוכות כדי להשיג שברים עשירים באוסטיאוציטים שבהם דווח על טוהר אוסטיאוציטים בסביבות70%9. מגבלות הליך זה כוללות את הטוהר התת-אופטימלי של תרביות מזוהמות בסוגי תאים אחרים מלבד אוסטיאוציטים, וכי אוסטיאוציטים עלולים להיות מגודלים על ידי תאים אחרים בתרבית מכיוון שאוסטיאוציטים איבדו את היכולת להתחלק. אתגרים אלה מגבילים את השימושיות של תרבויות ארוכות טווח.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, פותחו קווי תאים אוסטיאוציטים שונים. קו התאים MLO-Y411 וקו התאים MLO-A512 הם בעיקר קווי התאים הנחקרים ביותר אשר שימושיים לחקר אוסטיאוציטים בשלב מוקדם; עם זאת, הם פחות שימושיים לחקר איתות אוסטיאוציטים בוגר מכיוון שהם מבטאים רמות נמוכות של סקלרוסטין ו- FGF2313, שניהם סמני אוסטיאוציטים בוגרים. קווי תאים אחרים, כולל IDG-SW3 14 ו- Ocy45415, מבטאים רמות גבוהות של סקלרוסטין ו- FGF23 ושימושיים בחקר שלב האוסטיאוציטים המאוחר. קווי תאים מתגלים ככלי מחקר שימושי; עם זאת, הם אינם באים ללא מגבלות מכיוון שהם אינם מייצגים באופן מלא את הביולוגיה של התא הראשוני. קווי תאים שונים מייצגים שלבים התפתחותיים שונים של ספקטרום הבשלות של אוסטיאוציטים, וקווי תאים אינם מייצגים את ההטרוגניות של אוסטיאוציטים ראשוניים16,17.
כדי להשיג תרביות טהורות של אוסטיאוציטים ראשוניים, החוקרים ניצלו את מודל עכבר CRE שבו מקדם dmp1 של 8-kb משמש להנעת ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) באוסטיאוציטים18,19. עכברים טרנסגניים כפולים (pOB-Col 2.3- GFP-cyan ו- DMP1-GFP-topaz) על ידי Paic et al.19 ועכברים טרנסגניים dmp1-topaz על ידי Nakashima et al.20 שימשו להשגת אוכלוסיות אוסטיאוציטים. שבו הם השתמשו בעיכול רציף ו- FACS של אוסטיאוציטים המבטאים GFP כדי לרכוש תרביות של אוסטיאוציטים ראשוניים 19,20. כיוון ה-cre בעכבר הכתב Ai9 של 10 קילו-בתים dmp1, המפעיל את חלבון tdTomato, הוכח כקיים באוסטיאוציטים, אוסטאובלסטים, שרירים ותאים בתוך מח העצם. למקדם dmp1 של 8 קילובייט הייתה תבנית ביטוי זהה, אך רק חלק מהאוסטאובלסטים ותאי מח העצם ביטאו את החלבון, מה שמצביע על כך שמקדם dmp1 של 8 קילובייט הוא ספציפי יותר21. למרות זאת, יש לפרש בזהירות את התוצאות המתקבלות באמצעות מקדם dmp1 8-kb, ופרופילי ביטוי גנים צריכים להתבצע באופן שגרתי באמצעות סמנים ספציפיים לאוסטאובלסטים לעומת אוסטאובלסטים כדי להבטיח שהאוכלוסייה המתקבלת היא בעלת טוהר גבוה מספיק.
סמני אוסטאוקלסט OSCAR ו- Dcstamp נמצאו באוכלוסיות אוסטיאוציטים לא מדולדלים לעומת אוכלוסיות אוסטיאוציטים מדולדלות, ממצא זה הוביל את המחברים למסקנה כי תקצירים המתקבלים משברים של 8-kb dmp1-topaz קלבריה יילודים ומיון GFP מזוהמים בתאים המטופויטיים. ניתן היה למתן את הזיהום בתאים המטופויטיים על ידי הידוק שער המיון של GFP, מאחר שלתאים המטופויטיים חיוביים ל-GFP הייתה עוצמת GFP נמוכה באופן סביר מאשר לתאים מזנכימליים חיוביים ל-GFP (אוסטיאוציטים)22.
השיטות לחקר אוסטיאוציטים במבחנה תרמו לעושר המידע האחרון על ביולוגיה של אוסטיאוציטים. עם זאת, בידוד אוסטיאוציטים נותר הליך עתיר עבודה וארוך עם תפוקת תאים נמוכה. השיטה המתוארת של עיכול עצם באמצעות collagenase ו EDTA לעתים קרובות עד חלק 823, לוקח כמה שעות שבהן כדאיות אוסטיאוציטים הוא מס. חוקרים דיווחו על שימוש בשברים (2\u20125) למיון תאים 20, והראו כי פרופיל הביטוי של גנים הקשורים לאוסטיאוציטים לעומת אלה של אוסטאובלסטים מאשר את ההצלחה של בידוד אוכלוסיות אוסטיאוציטים טהורים20. במאמר זה נתאר את תהליך קבלת השברים (2\u20125), ונשווה את תפוקת האוסטיאוציטים מכל שבר החל משבריב 1 עד 8 כדי לקבוע את חזרתם של אוסטיאוציטים בכל שבר. אנו מתארים גם את הדיסקציה של קלבריה עכבר dmp1-topaz שזה עתה נולד ועיכול קלווריאלי באמצעות collagenase וחומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA), כמו גם הכנת תאים עבור FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים והטיפול בבעלי חיים בוצעו בהתאם לכללים ולתקנות של אוניברסיטת טוהוקו.
1. דיסקציה של קלבריה עכבר dmp1-topaz שזה עתה נולד
- עבור פרוטוקול זה, השתמש בגורים בני 6\u20127 של עכברי C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J. הרדימו עכברים עם שאיפת איזופלורן 5% ולאחר מכן העבירו את הגורים לאתנול 70%.
- העבירו את הגור שעבר המתת חסד לצלחת תרבית לא מטופלת.
- בעזרת מספריים ופינצטה, לתפוס את העור בבסיס הגולגולת ולעשות חתך.
- באמצעות החתך הראשון כנקודת מוצא, לחתוך משני הצדדים הרוחביים של הגולגולת מול האוזניים, להסיר את העור, ולחשוף את calvaria.
- החזיקו את הראש מגשר האף וחתכו את הקלבריה לאורך תפר הלמבדואיד. חותכים לאורך הקצוות הרוחביים של עצמות הקודקוד ומרחיבים אותו כך שיכלול את החלק הקדמי.
- להפריד את calvaria מרקמת המוח הבסיסית.
הערה: כדי להבטיח קלבריה גרמית נקייה עם חיבור רקמות רכות מינימלי לא לחתוך עמוק לתוך העצם; לשם השוואה, אדם צריך להיות מסוגל לראות את הצל של המספריים מתחת לעצם. - מעבירים את הקלבריה לתמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS, pH 7.4 לאורך כל הפרוטוקול). ודא שהחלק הקעור פונה כלפי מעלה.
2. שבירה של קלבריה עכבר שזה עתה נולד
- מעבירים עד 5 קלבריה לצינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל 5 מ"ל של תמיסת קולגנאז 2 מ"ג/מ"ל. יש להשתמש בתמיסת collagenase טרייה שהוכנה ממש לפני השימוש.
- להכנת תמיסת collagenase טרייה, יש להוסיף אבקת collagenase למאגר בידוד (70 mM NaCl, 10 mM NaHCO 3, 60 mM סורביטול,3 mM K 2 HPO4, 1 mM CaCl 2, אלבומין בסרום בקר 1 מ"ג/מ"ל (BSA), 5 מ"ג/מ"ל גלוקוז ו-25 מ"מ HEPES) במינון2מ"ג/מ"ל. ממיסים את אבקת הקולגנאז על מערבל מגנטי.
- הפעל את תמיסת הקולגנאז דרך יחידת מסנן סטרילית של 0.22 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מ"ל ושמור אותה על קרח לאורך כל הפרוטוקול.
- לדגור את calvaria ב 37 ° C במשך 20 דקות על שייקר ב 300 סל"ד כדי לקבל חלק 1.
- השליכו את העיכול של חלק 1, שטפו את הקלבריה עם 5 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) והשליכו את השטיפה.
- לדגור את calvaria ב 5 מ"ל של 5 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) המכיל 1 מ"ג / מ"ל BSA ב PBS, PH 7.4 ב 37 ° C במשך 15 דקות על שייקר ב 300 סל"ד.
- לאסוף את digest בצינור חרוטי 50 מ"ל. לשטוף את calvaria עם 5 מ"ל של PBS ולהוסיף את פתרון לשטוף לעכל.
הערה: בכל נקודה של איסוף העיכול והשטיפה, פיפטה של העצמות בתמיסה שלהם כדי לנתק את התאים מהעצם ולמנוע כפילויות וצברי תאים. - כדי להשיג חלק 2, צנטריפוגה את העיכול ב 300 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות. יש להשליך את הסופרנטנט, להשהות מחדש את הגלולה ב-8 מ"ל של α-Minimum Essential Medium (MEM) המכיל 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), 100 IU/מ"ל פניצילין G ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין. זרעו על צלחת תרבית בקוטר 10 ס"מ. לדגור על חלק 2 ב 37 ° C תחת 5% CO2.
- לדגור את calvaria ב 5 מ"ל של תמיסת collagenase ב 37 ° C במשך 20 דקות על שייקר ב 300 סל"ד.
- כדי לאסוף את מקטע 3, חזור על שלבים 2.5\u20122.6. לדגור על חלק 3 ב 37 ° C תחת 5% CO2.
הערה: בשלב זה, העצמות יהפכו קטנות יותר, והן יצטמצמו לרסיסים. כדי להבטיח שאף עצם לא יישאב בטעות לתוך העיכול, מה שמוביל לאובדן תאים בתהליך, השתמשו בפיפטת קצה קטנה לאיסוף העיכול (1000\u2012200 μL פיפטה קצוות). - לדגור את calvaria ב 5 מ"ל של תמיסת collagenase ב 37 ° C במשך 20 דקות על שייקר ב 300 סל"ד.
- כדי לאסוף את מקטע 4, חזור על שלבים 2.5\u20122.6. לדגור על חלק 4 ב 37 ° C תחת 5% CO2.
- לדגור את calvaria ב 5 מ"ל של 5 mM EDTA המכיל 1 מ"ג / מ"ל BSA ב PBS (pH 7.4) ב 37 ° C במשך 15 דקות על שייקר ב 300 סל"ד.
- כדי לאסוף את מקטע 5, חזור על שלבים 2.5\u20122.6. לדגור על חלק 5 ב 37 ° C תחת 5% CO2. אוסטיאוציטים יכולים להיות מוכנים למיון באותו יום או בתרבית עד 24 שעות לפני המיון.
3. הכנת אוסטיאוציטים למיון תאים מופעל פלואורסצנטי
- שאפו את המדיום של כל חלק תא ושטפו בעדינות עם 10 מ"ל PBS פעמיים.
- הוסף 5 מ"ל של 0.5% טריפסין-EDTA ב- PBS ודגור על התאים במשך 5 דקות ב 37 ° C. הוסף 5 מ"ל של 10% FBS α-MEM ופיפטה כדי לנתק את התאים בעדינות. שלב את התאים בכל שבר על ידי סינון דרך מסננת תאים 40 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל.
- לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של PBS ולאסוף על ידי סינון דרך מסננת תאים 40 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות.
- שאפו את הסופרנאטנט והוסיפו 10% FBS α-MEM לכדור. התאם את ריכוז התא לכ- 1 x 107 תאים/מ"ל.
- סנן את התאים בצינור רשת ניילון בגודל 35 מיקרומטר. התאים מוכנים כעת ל- FACS.
- עבור פרוטוקול זה, השתמש בפייה בגודל 100 מיקרומטר. נוזל האיסוף צריך להיות מורכב מ -10% FBS α-MEM. יש לשמור את הדגימה ממוינת בטמפרטורה של 4°C בכל המיון, במידת האפשר.
- לפני המיון, מטב את ה- gating להסרת לכלוכים ותאים על-ידי התאמת אזור הפיזור הצדדי (SSC) ואזור הפיזור הקדמי (FSC). בטל כפילויות על-ידי התאמת רוחב SSC לעומת גובה SSC ואזור FSC לעומת רוחב FSC. יש להשתמש באוסטיאוציטים שליליים של GFP כבקרה להתאמת הפרמטרים של מכשיר המיון.
- לאחר השלמת איסוף התאים, צנטריפוגו את התאים ב 300 x גרם ב 4 ° C במשך 10 דקות. לשטוף תאים עם PBS. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות.
- השעה מחדש את התאים והתאם את המספר לפי הצורך באמצעות 10% FBS α-MEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את התהליך של קבלת תרביות של אוסטיאוציטים ראשוניים מקלבריה של עכבר ילודים dmp1-topaz באמצעות תהליך שבר באמצעות collagenase כדי לפרק את מטריצת הקולגן ו- EDTA עבור כלציית סידן, ולאחר מכן תאים מוכנים ל- FACS כדי להפריד אוסטיאוציטים מאוכלוסיות תאים אחרות.
שיטות להשגת אוסטיאוציטים ראשוניים מקלבריה עכברית ילודים מתארות לעתים קרובות את השימוש בשברים (1\u20128) למיון23. כדי לבחון את יעילותה של שיטה זו, השווינו את תפוקת האוסטיאוציטים שהתקבלו מקלבריה אחת של עכבר dmp1-topaz, החל משברים 1 עד 8. שברים 1\u20128 מוינו בנפרד כדי לקבוע את אחוז ותפוקת האוסטיאוציטים מכל שבר. לאחר המיון, תרבנו אוסטיאוציטים במשך 24 שעות על צלחת של 96 בארות כדי להשוות את צפיפות תאי הזרעים. צפיפות האוסטיאוציטים בשברים 2-u20125 מוצגת כגבוהה יותר מזו של שבר 1, וצפיפות האוסטיאוציטים מתחילה לרדת במידה ניכרת בשברים 6, 7 ו-8 (איור 1A).
אף על פי שאחוז האוסטיאוציטים המתקבל בין כל השברים אינו מובהק סטטיסטית (איור 1B), צפיפות האוסטיאוציטים שונה באופן דרמטי. חוקרים20 דיווחו על שימוש בשברים 2\u20125 לבידוד אוסטיאוציטים באמצעות FACS, ואנו מראים באיור 1 ששימוש בשברים 2\u20125 מייעל את התהליך לקבלת אוסטיאוציטים ומקצר את זמן המיון.
איור 2 מראה את מספר התאים ואסטרטגיית ה-gating שתורגלו כדי לבודד תאים חיוביים ל-GFP מתאים שליליים ל-GFP, שבהם תאים שהתקבלו באמצעות שבירה של קלבריה עכברית שלילית ל-GFP שימשו כביקורת. אוסטיאוציטים שהתקבלו בשיטה זו נותחו לביטוי גנים של Dmp1 ו- SOST, שהם סמני אוסטיאוציטים ידועים. ביטויי mRNA של Dmp1 ו-SOST גבוהים יותר אצל אוסטיאוציטים בהשוואה למקטע 2 שלפני המיון, שידוע כפרק אוסטאובלסט גבוה (איור 3A). איור 3B מראה את המורפולוגיה של אוסטיאוציטים חיוביים ל-GFP השומרים על צורה מהממת עם דנדריטים המשתרעים מגוף התא בתרבית במשך 24 שעות על צלחת תרבית פלסטיק לאחר המיון.
איור 1: יעילות של שבר אוסטיאוציטים. (A) תמונות מיקרוסקופיות של צפיפות האוסטיאוציטים משברים 1\u20128 שנזרעו על לוח בן 96 בארות שנלכדו לאחר 24 שעות מאותו סוג. לשברים 2\u20125 צפיפות תאים גבוהה יותר מאשר לשברים 1 ו-6\u20128. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B) אחוז האוסטיאוציטים המתקבלים משברים 1\u20128 כפי שנמדד על ידי תוכנת ציטומטר הזרימה. התוצאות נגזרות משלושה ניסויים מייצגים נפרדים. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: בידוד של אוסטיאוציטים חיוביים ל-GFP באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי. הלוח העליון מייצג תאים שבודדו מ-C57Bl/6J littermate calvaria שלילי ל-GFP כבקרת סף GFP. הפאנל התחתון מייצג את מספר התאים ובקרת ה-gating הנהוגה לבידוד אוסטיאוציטים חיוביים ל-GFP מתאים שליליים ל-GFP במקטע 2 המתקבל מקלבריה עכברית dmp1-topaz. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אפיון אוסטאוציטים לאחר מיון. (A) ביטוי mRNA יחסי של Dmp1 ו-SOST של תאי שבר 2 בתרבית במשך 24 שעות ואוסטיאוציטים בתרבית במשך 24 שעות לאחר המיון. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן. הבדלים סטטיסטיים זוהו באמצעות מבחן t של התלמיד: * p < 0.05, **p < 0.01. (B) תמונה מיקרוסקופית של אוסטאוציטים השומרים על דנדריטים המשתרעים החוצה מגוף התא בתרבית במשך 24 שעות לאחר המיון. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
האוסטיאוציטים המבודדים הראשונים היו מקלבריה עוף7 שבודד באמצעות (OB7.3) או הגרסה העופית של PHEX; עם זאת, שיטה זו מוגבלת על ידי הזמינות של נוגדנים מעשיים, כמו נוגדנים ספציפיים אוסטיאוציטים כי הם גם ספציפיים specie צריך להיות מיוצר. החוקרים השתמשו בשינוי שונה של התהליך האנזימטי הרציף כדי לקבל אוסטיאוציטים מעצמות ארוכות של עכברים וחולדות; הטוהר המדווח של תרבויות אלה נקבע על כ-70%9. פיתוח מודל עכבר ה-cre איפשר הנדסת אוסטיאוציטים, המבטאים GFP על פני השטח שלהם. מודל עכבר זה, יחד עם FACS, שימש להשגת תרביות טהורות של אוסטיאוציטים ראשוניים20.
אנו משמיטים את השימוש בשברים 1 ובשברים 6\u20128 מכיוון שכמויות קטנות של אוסטיאוציטים יורדות בשברים אלה. שימוש בשברים 2\u20125 נותן את התשואה הטובה ביותר האפשרית של אוסטיאוציטים על פני זמן העיבוד הקצר ביותר; זה מגביל את זמן הטיפול של אוסטיאוציטים ופועל למניעת מוות תאי או שינוי אפשרי באיתות התא כתוצאה מהלחץ שהתא נתון בו במהלך השבירה. אנו גם תרבית אוסטיאוציטים במשך 24 שעות לפני המיון, אשר כברירת מחדל, אינו כולל תאים מתרחיפים שאינם דבקים (תאים hematopoietic) במהלך הכנת המיון. זה ממזער זיהום על ידי תאים hematopoietic המבטאים GFP22. זרימת העבודה המסופקת בפרוטוקול זה מנצלת את שיטות23 שפורסמו בעבר ומקצרת את הזמן מהסוג המאפשר התאוששות אוסטיאוציטים יעילה ומהירה עם זיהום מינימלי.
שלבים קריטיים בפרוטוקול כוללים השגת קלבריה גרמית נקייה וחיתוך רקמות רכות מהמוח או מרקמת החיבור המחוברת לעצם כדי להגביל את הזיהום של תאים דבקים (פיברובלסטים ותאים עצביים). כמו כן, צנרת התאים בשלבים הכוללים קבלה ושטיפה של העיכול היא קריטית, שכן אגרגטים וכפילים של תאים נקראים כפסולת במהלך המיון ויתרמו לתפוקה נמוכה של אוסטיאוציטים.
ניתן למיין אוסטיאוציטים ללא תרבית מוקדמת. עם זאת, משמעות הדבר היא כי מספר גבוה יותר של תאים צריך להיות ממוין, להגדיל את הזמן של הסוג ולהגדיל את הסיכוי של זיהום hematopoietic. ניתן למתן זאת על ידי החלת דלדול תאים המטופויטיים לפני המיון. עם זאת, זה מס ולא מומלץ לניתוח מעבדה שגרתי אצווה22. בעיות עלולות להתעורר בעת מיון עקב נוכחות של צברי תאים גדולים וכפילים סותמים את זרימת הנוזל של מכונת המיון. בפרוטוקול שלנו, זה לא היה בעיה, אבל זה יכול להיפתר על ידי הפחתת תוכן FBS של מאגר מיון (פחות מ -10%).
פרוטוקול זה אינו מגיע ללא מגבלות. שיטה זו משתמשת באוסטיאוציטים של עכברים, שאינם דומים לחלוטין לאוסטיאוציטים אנושיים. זה מגביל את הרחבת התוצאות המתקבלות על ידי חקר אוסטיאוציטים מורין לתוצאות קליניות משמעותיות. פרוטוקולים לבידוד אוסטיאוציטים אנושיים תוארו24, והחוקרים מעודדים להשתמש במיני התאים המשרתים בצורה הטובה ביותר את מטרותיהם. בדומה לפרוטוקולים אחרים, כמויות האוסטיאוציטים המתקבלות באמצעות פרוטוקול זה מוגבלות, ומספר רב של עכברים נדרשים לאנליזה בקנה מידה גדול, אולם על ידי הפחתת הזמן הדרוש להכנת ומיון אוסטיאוציטים, ניתן לרכוש כמויות גדולות יותר של תאים במסגרת זמן אחת.
אוסטיאוציטים המתקבלים בתהליך זה יכולים לשמש לתרבית נוספת ולתרבות משותפת, ניתוח ביטוי גנים, ניתוח במורד הזרם של הפעלת / עיכוב המצע, חיטוט מולקולרי ויישומי צביעה. תאים ראשוניים יכולים לשמש גם לבניית מודל תלת-ממדי של מטריצת אוסטיאוציטים הדומה לסביבה האוסטיאוציטית הטבעית לחקר מכנוטרנסדוקציה ומכנוסנסינג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק JSPS KAKENHI מהאגודה היפנית לקידום המדע (מס' 19K10397 ל- H.K. ומס' 18K09862 ל- I.M).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | Data aquisition and analysis | |
| BD Falcon Tube | BD Biosciences | 352235 | 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 μm nylon mesh. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, MO, USA | ||
| Collagenase | Wako, Osaka, Japan | 034-22363 | 0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum. |
| EDTA | Dojindo, Kumamoto, Japan | 5mM EDTA prepared with 0.1% BSA | |
| FACSAriaTM II | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest, Nuaillé, France | ||
| Isolation buffer | 70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES | ||
| Millex Sterile Filter Unit | Merck Millipore, Ireland | SLGV033RS | 0.22μm |
| Nylon cell strainer | FALCON, NY, USA | 40μm | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies, NY, USA | 0.5% x10. diluted to x1 in PBS | |
| α-MEM | Wako, Osaka, Japan | Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 μg/ml streptomycin |
References
- Manolagas, S. C. Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis. Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).
- Bonewald, L. F. Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).
- Bonewald, L. F.
- Feng, J. Q., et al. Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism. Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).
- Lane, N. E., et al. Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More. Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).
- van der Plas, A., Nijweide, P. J.
- Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).
- Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).
- Kramer, I., et al. Osteocyte Wnt/β-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).
- Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).
- Kato, Y., et al. Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).
- Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).
- Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Spatz, J. M., et al. The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro. The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).
- Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
- Sandberg, R., Ernberg, I. Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).
- Kalajzic, I., et al. Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene. Bone. 35 (1), 74-82 (2004).
- Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. Bone. 45 (4), 682-692 (2009).
- Nakashima, T., et al. Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression. Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).
- Kalajzic, I., et al. In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology. Bone. 54 (2), 296-306 (2013).
- Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes. Bone. 72, 34-42 (2015).
- Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M. Bone Research Protocols. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana Press. 55-66 (2012).
- Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. An improved method to isolate primary human osteocytes from bone. Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).
