Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Präparation von neonatalen dmp1-Topas-Mausschädeln und die Isolierung von Osteozyten, die das grün fluoreszierende Protein exprimieren, durch Zellverdau und Fraktionierung sowie die Osteozytenpräparation für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS).
Abstract
Der Ostezyt, von dem man einst annahm, dass er ein passiver Bewohner des Knochens ist, da er hinter den Kulissen die Funktion hat, mechanische Belastungen zu erfassen, wird nun ins Rampenlicht gerückt und es hat sich gezeigt, dass er mehrere Hauptfunktionen hat, wie z. B. die aktive Modifikation der extrazellulären Matrix und die Bildung eines endokrinen Organs mit dem lakunokanalikulären System, das es umschließt, das Nachrichten an entfernte Orte sendet. Dank der Methoden, die es ermöglichten, den Osteozyten in vitro zu testen, von der Isolierung primärer Osteozyten bis hin zu osteozytenähnlichen Zelllinien, erfahren Osteozyten heute ein durchschlagendes Interesse und einen Wissensschub über Struktur und Funktion. Viele Aspekte der Osteozytenbiologie und der Wechselwirkung mit anderen molekularen Komponenten sind noch nicht entdeckt. In diesem Protokoll beschreiben wir detailliert die effiziente Isolierung von primären Osteozyten aus dmp1-topas-neonatalen Mausschäumen, die das grün fluoreszierende Protein in Osteozyten exprimieren, durch Zellfraktionierung und anschließenden Erwerb von Kulturen primärer Osteozyten mittels FACS.
Introduction
Osteozyten sind terminale differenzierte Zellen aus osteoblastischen Vorläuferzellen, die in ihre sezernierte Matrix eingebettet wurden1. Sie sind die am häufigsten vorkommenden und langlebigsten Zellen unter den Knochenzellpopulationen. Sie befinden sich in Lakunen und haben eine charakteristische Sternmorphologie mit Dendriten, die sich durch Kanäle erstrecken, die als Canaliculi bezeichnet werden und ein ausgedehntes Netzwerk der Kommunikation und des Stoffwechselaustauschs mit ihrer Umgebung und der Knochenoberfläche bilden2. Osteozyten choreografieren sowohl die Rolle von Osteoblasten als auch von Osteoklasten beim Knochenumbau, sie sind die primären mechanosensorischen Zellen, die die Anpassung an mechanische Belastungen gewährleisten3, sind an der Phosphathomöostase4 und der Knochenmatrixmineralisierung5 beteiligt und fungieren zusammen mit dem lakunokanalikulären System als endokrines Organ, das entfernte Gewebe signalisiert6.
Osteozyten befinden sich in einer mineralisierten Matrix, was die Zugänglichkeit einschränkt und ihre Isolierung erschwert, was die In-vitro-Untersuchung erschwert. Eine der ersten Isolierungsmethoden beschrieb isolierte Osteozyten aus Hühnerschädeln unter Verwendung eines osteozytenspezifischen monoklonalen Antikörpers (OB7.3)7 , von dem später bekannt wurde, dass es sich um die aviäre Variante von PHEX (PHosphate-regulierendes Gen mit Homologie zu Endopeptidasen auf dem X-Chromosom) handelte8. Andere Forscher verwendeten die sequentielle Verdauung von langen Knochen von Ratte9 oder Maus 10, um osteozytenreiche Fraktionen zu erhalten, bei denen die Reinheit der Osteozyten bei etwa70 % lag9. Zu den Einschränkungen dieses Verfahrens gehört die suboptimale Reinheit von Kulturen, die neben Osteozyten auch mit anderen Zelltypen kontaminiert sind, und dass Osteozyten möglicherweise von anderen Zellen in Kultur überwachsen werden könnten, da Osteozyten die Fähigkeit zur Teilung verloren haben. Diese Herausforderungen schränken die Nutzbarkeit langfristiger Kulturen ein.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden verschiedene Osteozytenzelllinien entwickelt. Die MLO-Y4-Zelllinie11 und die MLO-A5-Zelllinie12 sind insbesondere die am weitesten untersuchten Zelllinien, die für die Untersuchung der Osteozyten im Frühstadium nützlich sind. Sie sind jedoch weniger nützlich für die Untersuchung der Signalübertragung reifer Osteozyten, da sie geringe Mengen an Sclerostin und FGF2313 exprimieren, die beide reife Osteozytenmarker sind. Andere Zelllinien, darunter IDG-SW3 14 und Ocy45415, exprimieren hohe Konzentrationen von Sclerostin und FGF23 und sind nützlich für die Untersuchung des späten Osteozytenstadiums. Zelllinien erweisen sich als nützliche Forschungswerkzeuge; Dennoch sind sie nicht ohne Einschränkungen, da sie die Biologie der Primärzelle nicht vollständig repräsentieren. Unterschiedliche Zelllinien repräsentieren unterschiedliche Entwicklungsstadien des Osteozytenreifespektrums, und Zelllinien repräsentieren nicht die Heterogenität der primären Osteozyten16,17.
Um Reinkulturen von primären Osteozyten zu erhalten, nutzten die Forscher das cre-Mausmodell, in dem der 8-kb-dmp1-Promotor verwendet wird, um die Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) in Osteozyten zu steuern18,19. Zwei transgene Mäuse (pOB-Col 2.3-GFP-cyan und DMP1-GFP-topaz) von Paic et al.19 und dmp1-topaz-transgene Mäuse von Nakashima et al.20 wurden verwendet, um Osteozytenpopulationen zu erhalten. Dabei nutzten sie die sequentielle Verdauung und das FACS von Osteozyten, die GFP exprimieren, um Kulturen von primären Osteozyten zu erwerben19,20. Es konnte gezeigt werden, dass die Richtung von cre in der 10-kb dmp1-Reportermaus Ai9, die das tdTomato-Protein aktiviert, in Osteozyten, Osteoblasten, Muskeln und Zellen im Knochenmark vorhanden ist. Der 8-kb dmp1-Promotor hatte das gleiche Expressionsmuster, aber nur ein Teil der Osteoblasten und Knochenmarkzellen exprimierte das Protein, was darauf hindeutet, dass der 8-kb dmp1-Promotor spezifischer ist21. Trotzdem sollten Ergebnisse, die mit dem 8-kb-dmp1-Promotor erzielt wurden, mit Vorsicht interpretiert werden, und Genexpressionsprofile sollten routinemäßig unter Verwendung von Osteozyten- vs. Osteoblasten-spezifischen Markern erstellt werden, um sicherzustellen, dass die erhaltene Population von ausreichend hoher Reinheit ist.
Die Osteoklastenmarker OSCAR und Dcstamp wurden in hämatopoetischen nicht depletierten vs. depletierten Osteozytenpopulationen gefunden, was die Autoren zu der Schlussfolgerung führte, dass Verdauen, die durch Fraktionierung von 8-kb dmp1-topas neonatalen Calvaria und GFP-Sortierung erhalten wurden, mit hämatopoetischen Zellen kontaminiert sind. Die Kontamination mit hämatopoetischen Zellen hätte durch eine Straffung des GFP-Sortiertors gemildert werden können, da GFP-positive hämatopoetische Zellen eine relativ geringere GFP-Intensität aufwiesen als GFP-positive mesenchymale Zellen (Osteozyten)22.
Die Methoden zur Untersuchung von Osteozyten in vitro haben zu der jüngsten Fülle an Informationen über die Osteozytenbiologie beigetragen. Die Isolierung von Osteozyten ist jedoch nach wie vor ein arbeitsintensives und langwieriges Verfahren mit geringen Zellausbeuten. Die beschriebene Methode des Knochenaufschlusses unter Verwendung von Kollagenase und EDTA, oft bis zur Fraktion 823, dauert mehrere Stunden, in denen die Lebensfähigkeit der Osteozyten beansprucht wird. Forscher haben berichtet, dass Fraktionen (2\u20125) für die Zellsortierung 20 verwendet wurden, und haben gezeigt, dass das Expressionsprofil von Genen, die mit Osteozyten assoziiert sind, im Vergleich zu denen von Osteoblasten den Erfolg der Isolierung reiner Osteozytenpopulationen bestätigt20. In diesem Artikel beschreiben wir den Prozess der Gewinnung von Fraktionen (2\u20125) und vergleichen die Ausbeute an Osteozyten aus jeder Fraktion, beginnend mit Fraktion 1 bis 8, um die Rückgabe von Osteozyten in jeder Fraktion zu bestimmen. Wir beschreiben auch die Präparation von neugeborenen dmp1-Topas-Mausschädeln und die Schädelstockverdauung mit Kollagenase und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) sowie die Vorbereitung von Zellen für FACS.
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Protocol
Alle Tierbehandlungen und die Tierpflege wurden in Übereinstimmung mit den Regeln und Vorschriften der Tohoku-Universität durchgeführt.
1. Sektion der neugeborenen dmp1-Topas-Maus Calvaria
- Verwenden Sie für dieses Protokoll 6 bis 7 Tage alte Welpen von C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J-Mäusen. Euthanasieren Sie Mäuse mit 5% Isofluran-Inhalation und setzen Sie die Welpen dann in 70% Ethanol um.
- Übertragen Sie den eingeschläferten Welpen in eine unbehandelte Kulturschale.
- Fassen Sie mit Schere und Pinzette die Haut an der Schädelbasis und machen Sie einen Schnitt.
- Schneiden Sie mit dem ersten Schnitt als Ausgangspunkt auf beiden seitlichen Seiten des Schädels vor den Ohren, entfernen Sie die Haut und legen Sie die Schädeldecke frei.
- Halten Sie den Kopf vom Nasenrücken und schneiden Sie die Schädeldecke entlang der Lambdoidnaht. Schneiden Sie entlang der seitlichen Ränder der Scheitelknochen und verlängern Sie sie bis zum vorderen Teil.
- Trennen Sie den Schädeldach vom darunter liegenden Hirngewebe.
Anmerkungen: Um eine saubere knöcherne Schädeldecke mit minimalem Weichteilansatz zu gewährleisten, schneiden Sie nicht tief in den Knochen ein. Als Referenz sollte man in der Lage sein, den Schatten der Schere unter dem Knochen zu sehen. - Übertragen Sie den Schädeldeckel in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4 während des gesamten Protokolls). Stellen Sie sicher, dass der konkave Teil nach oben zeigt.
2. Fraktionierung der Schädeldecke von neugeborenen Mäusen
- Übertragen Sie bis zu 5 Calvariae in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 5 ml 2 mg/ml Kollagenase-Lösung. Verwenden Sie frische Kollagenase-Lösung, die kurz vor der Anwendung zubereitet wird.
- Zur Herstellung einer frischen Kollagenaselösung wird Kollagenasepulver in den Isolationspuffer (70 mM NaCl, 10 mM NaHCO 3, 60 mM Sorbitol,3 mMK2HPO4, 1 mM CaCl 2, 1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 5 mg/ml Glukose und 25 mM HEPES) mit2 mg/ml gegeben. Das Kollagenase-Pulver auf einem Magnetrührer auflösen.
- Lassen Sie die Kollagenaselösung durch eine 0,22 μm sterile Filtereinheit in ein 50-ml-Röhrchen laufen und bewahren Sie sie während des gesamten Protokolls auf Eis auf.
- Inkubieren Sie den Schädeldach bei 37 °C für 20 Minuten auf einem Schüttler bei 300 U/min, um Fraktion 1 zu erhalten.
- Verwerfen Sie den Aufschluss von Fraktion 1, waschen Sie die Schädeldecke mit 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und entsorgen Sie die Wäsche.
- Inkubieren Sie den Schädeldach in 5 ml 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) mit 1 mg/ml BSA in PBS, PH 7,4 bei 37 °C für 15 min auf einem Schüttler bei 300 U/min.
- Sammeln Sie den Aufschluss in einem konischen 50-ml-Röhrchen. Waschen Sie den Golgatha mit 5 ml PBS und fügen Sie die Waschlösung dem Aufschluss hinzu.
Anmerkungen: Pipettieren Sie die Knochen an jedem Punkt des Sammelns und Waschens in ihrer Lösung, um die Zellen vom Knochen zu lösen und Dubletten und Zellaggregate zu verhindern. - Um Fraktion 2 zu erhalten, wird der Aufschluss bei 300 x g bei 4 °C für 5 min zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet erneut in 8 ml α-Minimum Essential Medium (MEM), das 10 % fötales Kälberserum (FBS), 100 I.E./ml Penicillin G und 100 μg/ml Streptomycin enthält. Auf einer 10 cm Kulturschale aussäen. Fraktion 2 bei 37 °C unter 5 % CO2 inkubieren.
- Inkubieren Sie die Schädeldecke in 5 ml Kollagenaselösung bei 37 °C für 20 min auf einem Shaker bei 300 U/min.
- Um Bruch 3 zu erfassen, wiederholen Sie die Schritte 2.5 bis 2.6. Fraktion 3 bei 37 °C unter 5 % CO2 inkubieren.
HINWEIS: An diesem Punkt werden die Knochen kleiner und sie werden in Fragmente zerlegt. Um sicherzustellen, dass keine Knochen versehentlich in die Verdauungen abgesaugt werden, was zu Zellverlust führt, verwenden Sie eine kleine Spitzenpipette zum Auffangen der Verdauungen (1000\u2012200 μL Pipettenspitzen). - Inkubieren Sie die Schädeldecke in 5 ml Kollagenaselösung bei 37 °C für 20 min auf einem Shaker bei 300 U/min.
- Um Bruch 4 zu erfassen, wiederholen Sie die Schritte 2.5 bis 6. Fraktion 4 bei 37 °C unter 5% CO2 inkubieren.
- Inkubieren Sie den Schädeldeckel in 5 ml 5 mM EDTA mit 1 mg/ml BSA in PBS (pH 7,4) bei 37 °C für 15 Minuten auf einem Schüttler bei 300 U/min.
- Um Bruch 5 zu erfassen, wiederholen Sie die Schritte 2.5 bis 20122.6. Fraktion 5 bei 37 °C unter 5 % CO2 inkubieren. Osteozyten können noch am selben Tag für die Sortierung vorbereitet oder bis zu 24 Stunden vor der Sortierung kultiviert werden.
3. Vorbereitung von Osteozyten für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung
- Aspirieren Sie das Medium jeder Zellfraktion und waschen Sie es vorsichtig zweimal mit 10 ml PBS.
- Fügen Sie 5 ml 0,5%iges Trypsin-EDTA in PBS hinzu und inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei 37 °C. Fügen Sie 5 ml 10% FBS α-MEM hinzu und pipettieren, um die Zellen sanft zu lösen. Kombinieren Sie die Zellen in jeder Fraktion, indem Sie sie durch ein 40-μm-Zellsieb in ein konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen sieben.
- Waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS und sammeln Sie sie, indem Sie sie durch ein 40-μm-Zellsieb in ein konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen sieben. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g bei 4 °C für 5 min.
- Saugen Sie den Überstand an und fügen Sie dem Pellet 10 % FBS α-MEM hinzu. Stellen Sie die Zellkonzentration auf ca. 1 x 107 Zellen/ml ein.
- Filtern Sie die Zellen in einem 35 μm dicken Röhrchen mit Nylonnetzverschluss. Die Zellen sind nun bereit für FACS.
- Verwenden Sie für dieses Protokoll eine Düse mit einer Größe von 100 μm. Die Sammelflüssigkeit sollte zu 10 % aus FBS α-MEM bestehen. Halten Sie die zu sortierende Probe unter Rühren und wenn möglich bei 4 °C.
- Optimieren Sie vor dem Sortieren das Gating, um Artefakte und Zellen zu entfernen, indem Sie den SSC-Bereich (Side Scatter) und den FSC-Bereich (Forward Scatter) anpassen. Eliminieren Sie Dubletten, indem Sie SSC-Breite vs. SSC-Höhe und FSC-Fläche vs. FSC-Breite anpassen. GFP-negative Osteozyten sollten als Kontrolle verwendet werden, um die Parameter des Sortierinstruments einzustellen.
- Nachdem die Zellentnahme abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g bei 4 °C für 10 Minuten. Waschen Sie die Zellen mit PBS. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g bei 4 °C für 5 min.
- Suspendieren Sie die Zellen erneut und passen Sie die Anzahl mit 10 % FBS-α-MEM wie gewünscht an.
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Representative Results
Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, den Prozess der Gewinnung von Kulturen primärer Osteozyten aus dmp1-topaz neonatalen Mausschädeln durch einen Fraktionierungsprozess unter Verwendung von Kollagenase zum Abbau der Kollagenmatrix und EDTA für die Calciumchelation zu demonstrieren, wonach die Zellen für FACS vorbereitet werden, um Osteozyten von anderen Zellpopulationen zu trennen.
Methoden zur Gewinnung primärer Osteozyten aus neonatalen Mausschäumen beschreiben häufig die Verwendung von Brüchen (1\u20128) zur Sortierung23. Um die Effizienz dieser Methode zu testen, verglichen wir die Ausbeute an Osteozyten, die aus einer dmp1-Topas-Maus-Calvaria gewonnen wurden, ausgehend von den Fraktionen 1 bis 8. Die Fraktionen 1 bis 8 wurden separat sortiert, um den Prozentsatz und die Ausbeute an Osteozyten aus jeder Fraktion zu bestimmen. Nach der Sortierung kultivierten wir Osteozyten für 24 Stunden auf einer 96-Well-Platte, um die Dichte der ausgesäten Zellen zu vergleichen. Die Dichte der Osteozyten in den Fraktionen 2–5 ist höher als die der Fraktion 1, und die Osteozytendichte nimmt in den Fraktionen 6, 7 und 8 deutlich ab (Abbildung 1A).
Obwohl der prozentuale Anteil der erhaltenen Osteozyten unter allen Fraktionen statistisch nicht signifikant ist (Abbildung 1B), unterscheidet sich die Dichte der Osteozyten dramatisch. Forscher20 haben über die Verwendung der Fraktionen 2-5 zur Isolierung von Osteozyten über FACS berichtet, und wir zeigen in Abbildung 1 , dass die Verwendung der Fraktionen 2-5 den Prozess zur Gewinnung von Osteozyten optimiert und die Zeit der Sorte verkürzt.
Abbildung 2 zeigt die Anzahl der Zellen und die Gating-Strategie, die praktiziert wurden, um GFP-positive von GFP-negativen Zellen zu isolieren, in denen Zellen, die durch Fraktionierung von GFP-negativen Maus-Schädelstöcken gewonnen wurden, als Kontrolle verwendet wurden. Die mit dieser Methode gewonnenen Osteozyten wurden auf die Genexpression von Dmp1 und SOST untersucht, bei denen es sich um bekannte Osteozytenmarker handelt. Die mRNA-Expression von Dmp1 und SOST ist in Osteozyten höher als in der Vorsortierungsfraktion 2, die als hohe Osteoblastenfraktion bezeichnet wird (Abbildung 3A). Abbildung 3B zeigt die Morphologie eines GFP-positiven Osteozyten, der eine Sternform mit Dendriten beibehält, die sich aus dem Zellkörper erstrecken und 24 h lang auf einer Kunststoffkulturschale nach der Sortierung kultiviert wurden.
Abbildung 1: Effizienz der Osteozytenfraktionierung. (A) Mikroskopische Aufnahmen der Dichte von Osteozyten aus den Fraktionen 1-88, die auf einer 96-Well-Platte gesät wurden, aufgenommen nach 24 Stunden dieser Sorte. Die Fraktionen 2\u20125 haben eine höhere Zelldichte als die Fraktionen 1 und 6\u20128. Maßstabsbalken = 100 μm. (B) Prozentsatz der Osteozyten, die aus den Fraktionen 1-88 gewonnen wurden, gemessen mit der Durchflusszytometer-Software. Die Ergebnisse stammen aus drei separaten repräsentativen Experimenten. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Isolierung von GFP-positiven Osteozyten mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung. Das obere Bild zeigt Zellen, die aus GFP-negativen C57Bl/6J-Wurfgeschwistern als GFP-Schwellenkontrolle isoliert wurden. Das untere Bild stellt die Anzahl der Zellen und die Gating-Kontrolle dar, die praktiziert wurden, um GFP-positive Osteozyten aus GFP-negativen Zellen in Fraktion 2 zu isolieren, die aus dmp1-Topas-Maus-Schädelstöcken gewonnen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Charakterisierung von Osteozyten nach der Sortierung. (A) Relative mRNA-Expression von Dmp1 und SOST von Zellen der Fraktion 2, die für 24 h kultiviert wurden, und von Osteozyten, die für 24 h nach der Sortierung kultiviert wurden. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Statistische Unterschiede wurden mit Hilfe des Student-t-Tests ermittelt: * p < 0,05, **p < 0,01. (B) Mikroskopische Aufnahme einer Osteozyten mit Dendriten, die sich nach außen aus dem Zellkörper erstrecken und 24 Stunden nach der Sortierung kultiviert wurden. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Der erste isolierte Osteozyten stammte aus einer Huhn-Calvaria7 , die mit Hilfe von (OB7.3) oder der avianten Variante von PHEX isoliert wurde. Diese Methode ist jedoch durch die Verfügbarkeit von praktikablen Antikörpern begrenzt, da Osteozyten-spezifische Antikörper hergestellt werden müssen, die auch speziesspezifisch sind. Die Forscher verwendeten eine andere Modifikation des sequenziellen enzymatischen Prozesses, um Osteozyten aus langen Knochen von Mäusen und Ratten zu gewinnen. Die berichtete Reinheit dieser Kulturen wurde auf etwa 70 %9 festgelegt. Die Entwicklung des Cre-Mausmodells ermöglichte es, Osteozyten zu züchten, die GFP auf ihrer Oberfläche exprimieren. Dieses Mausmodell wurde zusammen mit FACS verwendet, um Reinkulturen von primären Osteozytenzu erhalten 20.
Wir verzichten auf die Verwendung der Fraktionen 1 und 6\u20128, da sich in diesen Fraktionen nur geringe Mengen an Osteozyten ablösen. Die Verwendung der Fraktionen 2\u20125 ergibt die bestmögliche Ausbeute an Osteozyten bei kürzesten Verarbeitungszeiten; Dies begrenzt die Handhabungszeit von Osteozyten und verhindert den Zelltod oder eine mögliche Veränderung der Zellsignalübertragung als Folge des Stresses, dem die Zelle während der Fraktionierung ausgesetzt ist. Wir kultivieren Osteozyten auch für eine 24-stündige Vorsortierung, wobei nicht adhärente Suspensionszellen (hämatopoetische Zellen) bei der Sortiervorbereitung standardmäßig ausgeschlossen werden. Dies minimiert die Kontamination durch hämatopoetische Zellen, die GFP22 exprimieren. Der in diesem Protokoll vorgesehene Arbeitsablauf nutzt die Vorteile bereits veröffentlichter Methoden23 und verkürzt die Zeit der Sorte, was eine effiziente und schnelle Wiederherstellung der Osteozyten mit minimaler Kontamination ermöglicht.
Zu den entscheidenden Schritten im Protokoll gehören die Gewinnung eines sauberen knöchernen Schädeldachs und das Beschneiden von Weichgewebe aus dem Gehirn oder Bindegewebe, das am Knochen befestigt ist, um die Kontamination von adhärenten Zellen (Fibroblasten und Nervenzellen) zu begrenzen. Auch das Pipettieren der Zellen während der Schritte, die die Gewinnung und das Waschen der Digests umfassen, ist von entscheidender Bedeutung, da Zellaggregate und Dubletten bei der Sortierung als Abfall gelesen werden und zu einer geringen Ausbeute an Osteozyten beitragen.
Osteozyten können ohne vorherige Kultur sortiert werden. Dies bedeutet jedoch, dass eine größere Anzahl von Zellen sortiert werden muss, was die Zeit der Sortierung verlängert und die Wahrscheinlichkeit einer hämatopoetischen Kontamination erhöht. Dies kann durch die Anwendung von hämatopoetischer Zelldepletion vorsortiert gemildert werden. Dies ist jedoch anstrengend und wird für Routine- und Batch-Laboranalysen nicht empfohlen22. Beim Sortieren können Probleme auftreten, da große Zellaggregate und Dubletten den Flüssigkeitsfluss der Sortiermaschine verstopfen. In unserem Protokoll war dies kein Problem, aber es kann gelöst werden, indem der FBS-Inhalt des Sortierpuffers reduziert wird (weniger als 10%).
Dieses Protokoll ist nicht ohne Einschränkungen. Bei dieser Methode werden Maus-Osteozyten verwendet, die den menschlichen Osteozyten nicht ganz ähneln. Dies schränkt die Ausweitung der Ergebnisse aus der Untersuchung von Maus-Osteozyten auf aussagekräftige klinische Ergebnisse ein. Protokolle für die Isolierung menschlicher Osteozyten wurdenbeschrieben 24, und die Forscher werden ermutigt, die Zellspezies zu verwenden, die ihren Zielen am besten dient. Wie bei anderen Protokollen sind die Mengen an Osteozyten, die mit diesem Protokoll gewonnen werden, begrenzt, und eine große Anzahl von Mäusen wird für die groß angelegte Analyse benötigt, aber durch die Verringerung der Zeit, die für die Vorbereitung und Sortierung von Osteozyten benötigt wird, können größere Mengen an Zellen in einem einzigen Zeitrahmen gewonnen werden.
Die durch diesen Prozess gewonnenen Osteozyten können für weitere Kulturen und Co-Kulturen, Genexpressionsanalysen, nachgelagerte Analysen der Substrataktivierung/-hemmung, molekulare Sondierungen und Färbeanwendungen verwendet werden. Primärzellen können auch verwendet werden, um ein 3D-Osteozytenmatrixmodell zu konstruieren, das der nativen osteozytären Umgebung für die Untersuchung von Mechanotransduktion und Mechanosenz ähnelt.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil durch ein JSPS KAKENHI-Stipendium der Japan Society for the Promotion of Science (Nr. 19K10397 an H.K. und Nr. 18K09862 an I.M.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | Data aquisition and analysis | |
| BD Falcon Tube | BD Biosciences | 352235 | 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 μm nylon mesh. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, MO, USA | ||
| Collagenase | Wako, Osaka, Japan | 034-22363 | 0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum. |
| EDTA | Dojindo, Kumamoto, Japan | 5mM EDTA prepared with 0.1% BSA | |
| FACSAriaTM II | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest, Nuaillé, France | ||
| Isolation buffer | 70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES | ||
| Millex Sterile Filter Unit | Merck Millipore, Ireland | SLGV033RS | 0.22μm |
| Nylon cell strainer | FALCON, NY, USA | 40μm | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies, NY, USA | 0.5% x10. diluted to x1 in PBS | |
| α-MEM | Wako, Osaka, Japan | Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 μg/ml streptomycin |
References
- Manolagas, S. C. Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis. Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).
- Bonewald, L. F. Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).
- Bonewald, L. F.
- Feng, J. Q., et al. Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism. Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).
- Lane, N. E., et al. Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More. Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).
- van der Plas, A., Nijweide, P. J.
- Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).
- Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).
- Kramer, I., et al. Osteocyte Wnt/β-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).
- Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).
- Kato, Y., et al. Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).
- Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).
- Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Spatz, J. M., et al. The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro. The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).
- Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
- Sandberg, R., Ernberg, I. Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).
- Kalajzic, I., et al. Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene. Bone. 35 (1), 74-82 (2004).
- Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. Bone. 45 (4), 682-692 (2009).
- Nakashima, T., et al. Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression. Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).
- Kalajzic, I., et al. In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology. Bone. 54 (2), 296-306 (2013).
- Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes. Bone. 72, 34-42 (2015).
- Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M. Bone Research Protocols. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana Press. 55-66 (2012).
- Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. An improved method to isolate primary human osteocytes from bone. Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).
