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Developmental Biology

माइक्रोकंपुटेड टोमोग्राफी का उपयोग करके ड्रोसोफिला मेलनोगास्टर की पूरी पशु इमेजिंग

Published: September 2, 2020 doi: 10.3791/61515
Automatic Translation
1
1Department of Molecular Biology, University of Wyoming

Summary

एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है जो माइक्रोकंप्यूटेड टोमोग्राफी का उपयोग करके विकास के किसी भी चरण में बरकरार ड्रोसोफिला मेलनोगास्टर के दृश्य के लिए अनुमति देता है।

Abstract

बायोमेडिकल इमेजिंग उपकरण जीन से जीवों तक, स्थानिक तराजू में आणविक तंत्र की जांच की अनुमति देते हैं। एक अच्छी तरह से विशेषता वाले मॉडल जीव ड्रोसोफिला मेलनोगेस्टर को कोशिकाओं और ऊतकों के स्तर पर जीन फंक्शन को समझने के लिए प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के इस्तेमाल से फायदा हुआ है । इमेजिंग प्लेटफार्मों का अनुप्रयोग जो पूरे अक्षुण्ण जीव के स्तर पर जीन समारोह की समझ के लिए अनुमति देता है, आनुवंशिक तंत्र के बारे में हमारे ज्ञान को और बढ़ाएगा। यहां एक पूरी पशु इमेजिंग विधि प्रस्तुत की गई है जो माइक्रोकंप्यूटेड टोमोग्राफी (μ-सीटी) का उपयोग करके किसी भी विकासात्मक चरण में ड्रोसोफिला की कल्पना करने के लिए आवश्यक कदमों को रेखांकित करती है। μ-सीटी के फायदों में ऊतक विच्छेदन या समाशोधन विधियों की आवश्यकता के बिना माइक्रोन-स्तर के संकल्प पर सटीक 3डी जानकारी का उत्पादन करने के लिए वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध इंस्ट्रूमेंटेशन और न्यूनतम हाथों पर समय शामिल है। छवि विश्लेषण और 3 डी प्रतिपादन में तेजी लाने वाले सॉफ़्टवेयर के साथ जोड़ा गया, किसी भी ऊतक या अंग प्रणाली का विस्तृत रूपात्मक विश्लेषण वर्णनात्मक और परिकल्पना परीक्षण अध्ययन दोनों के लिए विकास, शरीर विज्ञान और शरीर रचना के तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए किया जा सकता है। एक इमेजिंग वर्कफ़्लो का उपयोग करके जिसमें इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, लाइट माइक्रोस्कोपी और μ-सीटी के उपयोग को शामिल किया गया है, जीन फ़ंक्शन का गहन मूल्यांकन किया जा सकता है, इस प्रकार इस शक्तिशाली मॉडल जीव की उपयोगिता को आगे बढ़ाया जा सकता है।

Introduction

इमेजिंग विधियां जो किसी वस्तु की आंतरिक संरचनाओं की विस्तृत जांच के लिए अनुमति देती हैं, बिना किसी वस्तु की समग्र 3 डी वास्तुकला को नष्ट किए भौतिकी, इंजीनियरिंग, सामग्री विज्ञान, पुरातत्व, जीवाश्म विज्ञान, भूविज्ञान और जीव विज्ञान1,2,3,4,5,6,7,8, 9सहित कई विभिन्न विषयों के लिए व्यापक रूप से फायदेमंद साबितहुई हैं। . इन अविनाशी इमेजिंग विधियों में, एक्स-रे आधारित प्लेटफॉर्म विशेष रूप से उच्च ऊर्जा एक्स-रे की क्षमता के कारण कई अलग-अलग नमूना प्रकारों और सामग्रियों को दृश्यमान प्रकाश तरंगों की तुलना में न्यूनतम बिखरने के साथ प्रवेश करने के लिए उपयोगी होते हैं। गणना टोमोग्राफी (सीटी), माइक्रोकंप्यूटेड टोमोग्राफी (μ-सीटी), नैनोकंप्कुटल्यूटेड टोमोग्राफी (नैनो-सीटी), और सिंक्रोट्रॉन माइक्रोटॉमोग्राफी, इसलिए, मीटर से लेकर माइक्रोन तक के नमूनों के एक्स-रे आधारित इमेजिंग के लिए प्राथमिक प्रौद्योगिकियों के रूप में उभरी है, मिलीमीटर से उप-माइक्रोन संकल्प क्षमताओं10,11,12,13, 14।

हालांकि ये प्लेटफ़ॉर्म नमूना आकार और संकल्प को संतुलित करने के लिए उनके डिजाइन, एक्स-रे ज्यामिति और घटकों में भिन्न होते हैं, वे सभी छवि कैप्चर के लिए एक ही बुनियादी सिद्धांत पर भरोसा करते हैं: एक्स-रे का एक स्रोत जो वस्तु के माध्यम से यात्रा करता है और डिटेक्टर द्वारा कैप्चर किया जाता है। एक्स-रे बीम का अंतर क्षीणता के रूप में यह वस्तु के भीतर अलग घनत्व के माध्यम से गुजरता है छवि विपरीत उत्पन्न करता है । 3डी डेटा या तो नमूना या डिटेक्टर को घुमाकर प्राप्त किया जाता है, 2D प्रक्षेपण छवियों की एक श्रृंखला एकत्र करता है जिसे एल्गोरिदम का उपयोग करके टोमोग्राम में खंगाला जाता है जिसमें 3डी जानकारी होती है जिसका रिज़ॉल्यूशन एक्स, वाई, जेड15में आइसोट्रोपिक है। कई बेंचटॉप μ-सीटी स्कैनर के लिए जो इमेजेड की जा रही वस्तु पर एक्स-रे प्रोजेक्ट करने के लिए शंकु-बीम एक्स-रे ज्यामिति का उपयोग करते हैं, फेल्डकामम्प एल्गोरिदम का उपयोग न्यूनतम त्रुटियों16के साथ वस्तु को सही ढंग से पुनर्निर्मित करने के लिए किया जाता है।

किसी दिए गए प्लेटफ़ॉर्म का संकल्प मुख्य रूप से सिस्टम मापदंडों जैसे एक्स-रे बीम (स्पॉट आकार), स्कैनर ज्यामिति (वस्तु से एक्स-रे स्रोत तक की दूरी), डिटेक्टर पर पिक्सल का आकार और नियोजित पुनर्निर्माण एल्गोरिदम द्वारा निर्धारित किया जाता है। अतिरिक्त कारक, जैसे स्कैनर कंपन, एक्स-रे बीम में उतार-चढ़ाव, नमूना आंदोलन, और वस्तु की कल्पना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले भौतिक प्रकार या रासायनिक दाग वास्तविक दुनिया इमेजिंग कॉन्डिक्शन15के तहत स्थानिक संकल्प को भी काफी प्रभावित कर सकते हैं।

जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए, सीटी और μ-सीटी ने शरीर रचना विज्ञान, शरीर विज्ञान, विकास और रोग तंत्र की हमारी समझ को आगे बढ़ाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, जो मानव रोगी निदान दोनों के लिए एक उपकरण के रूप में और मॉडल जीवों17, 18के लिए एक प्रीक्लिनिकल इमेजिंग प्लेटफॉर्म के रूप में कार्य कर रहा है। उदाहरण के लिए, माउस इंटरनेशनल फेनोटाइपिंग कंसोर्टियम, जिसका लक्ष्य माउस जीनोम में हर जीन के कार्य की पहचान करना है, उनकी फेनोटाइपिंग पाइपलाइन19के हिस्से के रूप में μ-सीटी का उपयोग करता है। उनके परिणाम विकास और रोग प्रक्रियाओं में शामिल जीन को समझने के लिए महत्वपूर्ण रहे हैं, जबकि माउस शरीर रचना विज्ञान और विकास20के लिए एटलस के रूप में भी सेवा कर रहे हैं। जेब्राफिश और चूहों जैसे अन्य मॉडल जीवों ने भी कई जीन म्यूटेंट17, 21,22, 23के पूरे पशु फेनोटाइपिंग करने के लिए μ-सीटी के उपयोग को पूरीतरहसे अपनाया है।

मॉडल जीवों के साथ पूरे पशु इमेजिंग के संयोजन का लाभ यह है कि किसी दिए गए जैविक प्रक्रिया के लिए जीन फ़ंक्शन की मशीनी समझ पूरी तरह से पता लगाया जा सकता है। यह मॉडल जीवों में अच्छी तरह से विशेषता वाले जीनोम और कई आनुवंशिक उपकरणों के कारण संभव है जो अलग-अलग विकासात्मक टाइमपॉइंट, विशिष्ट ऊतकों, व्यक्तिगत कोशिकाओं और यहां तक कि उपकोशिकीय ऑर्गेनेल्स पर जीन फ़ंक्शन के सटीक हेरफेर की अनुमति देते हैं। इनमें यूएएस/जीएल4 सिस्टम (और इसके कई डेरिवेटिव), CRISPR/Cas9 और आरएनएआई24,25, 26जैसी बाइनरी एक्सप्रेशन सिस्टम शामिल हैं । जब इन आनुवंशिक उपकरणों का उपयोग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, प्रकाश माइक्रोस्कोपी (फ्लोरोसेंट और गैर-फ्लोरोसेंट) से मिलकर एक शक्तिशाली इमेजिंग पाइपलाइन के साथ किया जाता है, और μ-सीटी जैसे पूरे पशु इमेजिंग, अणुओं, कोशिकाओं, ऊतकों, अंगों का गहन मूल्यांकन, और पूरे जीव को प्राप्त किया जा सकता है, जिससे जीन समारोह की बहुत गहरी समझ हो सकती है।

यह प्रोटोकॉल गैर-स्तनधारी मॉडल जीव ड्रोसोफिला मेलनोगेस्टर में μ-सीटी के उपयोग पर केंद्रित है, जिसके असंख्य आनुवंशिक उपकरणों ने कई आणविक तंत्र26, 27को स्पष्ट करने में मदद कीहै। इसे गैर-मॉडलकीटों 1,28, 29,30, 31,32में पिछले प्रोटोकॉल से अपनाया गया था, और इसजानवर33, 34, 35,36,36,37,38,39 में इसके उपयोग के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए ड्रोसोफिला में पिछले μ-सीटी अध्ययनों से दूर बनाता है। ,40,41. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्कैनर का उपयोग करके फ्लाई μ-सीटी डेटासेट के सफल नमूना तैयारी, इमेजिंग और विश्लेषण के लिए कदम रेखांकित किए गए हैं। इस प्रोटोकॉल के साथ, फ्लाई के सभी विकासात्मक चरणों को वर्णनात्मक और परिकल्पना-परीक्षण अध्ययन दोनों के लिए उच्च संकल्प पर कल्पना की जा सकती है, जिसमें वर्गीकरण, शरीर रचना विज्ञान, विकास, शरीर विज्ञान और रोग27शामिल हैं। यह प्रोटोकॉल लगभग किसी भी कीट और यहां तक कि गैर-जीवित सामग्रियों को इमेजिंग के लिए भी उपयोगी होगा, जिन्हें μ-सीटी द्वारा दृश्य को बढ़ाने के लिए छवि विपरीत के लिए रासायनिक धुंधला की आवश्यकता होती है।

Protocol

1. नमूना चयन और क्यूटिकल तैयारी

  1. इमेजिंग के लिए उपयुक्त विकासात्मक समय बिंदु (भ्रूण, लार्वा, पिल्ला, या वयस्क) चुनें।
    1. भ्रूणीय चरणों के लिए, अंगूर के रस आगर प्लेटों पर पिंजरे महिलाओं खमीर पेस्ट के साथ गंदा और हर 30-60 मिनट अंडे इकट्ठा । इन भ्रूणों को 25 डिग्री सेल्सियस पर विकसित करने के लिए छोड़ दें जब तक उचित चरण तक नहीं पहुंच जाता है।
    2. लार्वा चरणों के लिए, समय पर भ्रूण संग्रह प्रयोगों से पहले और दूसरे इंस्टार एकत्र करें। सीधे गैर भीड़ शर्तों के तहत भोजनशीशी के पक्ष से 3 instars भटक उठाओ ।
    3. पुपल टाइमिंग के लिए, सफेद प्री-प्यूप (उल्टे सर्पिल) एकत्र करें और उस समय पर ध्यान दें जब क्यूटिकल भूरा होने लगता है। पशु क्यूटिकल ब्राउनिंग के बाद निर्धारित समय बिंदुओं पर पुपल विकास के 15 चरणों के माध्यम से प्रगति करेंगे और तदनुसार42एकत्र किए जा सकते हैं।
    4. eclosion के बाद कुंवारी के रूप में वयस्कों को इकट्ठा करें और आवश्यक समय के लिए एक खाद्य शीशी में उम्र के लिए अनुमति दें (उदाहरण के लिए, पूर्ण आंत विकास के लिए 5 दिन)।
  2. 1x फॉस्फेट बफर खारा (0.5% पीबीएसटी) में 0.5% ट्राइटन एक्स-100 के 1 मिलीएल युक्त 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 5-50 जानवरों को स्थानांतरित करें। बेंचटॉप पर समय-समय पर ट्यूब का दोहन करते समय, हाइड्रोफोबिक कोटिंग को हटाने में सहायता करने और जानवरों को पूरी तरह से जलमग्न होने की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    1. भ्रूण, लार्वा और प्यूपल चरणों के लिए, ट्यूब को 20 एस के लिए 100 डिग्री सेल्सियस तक सेट किए गए हीट ब्लॉक में रखकर आगे के विकास को गिरफ्तार करें और 5 मिनट के लिए आरटी में ठंडा होते हैं।
      नोट: पशु भी तरल नाइट्रोजन३७में फ्लैश जमे हुए किया जा सकता है ।

2. फिक्सेशन और धुंधला

  1. 0.5% पीबी एस्ट निकालें और बोइन के समाधान का 1 मिलियन जोड़ें। जानवरों को पूरी तरह से जलमग्न करने के लिए नल ट्यूब।
    सावधानी: बोइन के समाधान में फॉर्मलडिहाइड होता है। यह त्वचा और आंखों के लिए तीव्र विषाक्तता का कारण हो सकता है अगर गिरा दिया और घातक हो सकता है अगर निगल लिया । हैंडलिंग करते समय दस्ताने, सुरक्षा चश्मा और एक प्रयोगशाला कोट पहनें।
    नोट: अतिरिक्त निर्धारण तकनीकों को भी नियोजित किया जा सकता है, जैसे इथेनॉल का उपयोग। अन्य फिक्सेटिव्स की खूबियों को रेफरी1,30में विस्तार से वर्णित किया गया है ।
    1. भ्रूण और वयस्क नमूनों के लिए, आरटी में 16-20 घंटे के लिए बेंचटॉप पर इनक्यूबेट ।
    2. लार्वा और प्यूपल नमूनों के लिए, आर टी में 2 घंटे के लिए जानवरों को ठीक करें। डिस्कार्ड बोइन के समाधान को छोड़ें और 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ धोएं। 1x पीबीएस युक्त एक बहु-अच्छी विच्छेदन डिश में स्थानांतरित करें और किसी भी अंतर्निहित नरम ऊतक को बाधित न करने के लिए सावधान रहने के लिए पूर्वकाल और पीछे के क्यूटिकल में छेद करने के लिए धारक से जुड़े एक छोटे मिन्यूटियन पिन का उपयोग करें।
    3. लार्वा और प्यूपल नमूनों को एक माइक्रोफ्यूज ट्यूब में वापस स्थानांतरित करें और ताजा बोइन के समाधान के 1 एमएल जोड़ें। आरटी में 24 घंटे के लिए बेंचटॉप पर इनक्यूबेट ।
  2. बोइन का समाधान निकालें और μ-सीटी वॉश बफर (0.1 एम एनए2एचपीओ4,1.8% सुक्रोज) या 1x पीबीएस के 1 एमएल के साथ 30 मिनट के लिए नमूना धोएं।
  3. उचित धुंधला समाधान के 1 एमसीएल जोड़ें और 2-7 दिनों के लिए बेंचटॉप पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: दाग विकल्प कई कारकों पर निर्भर करेगा, लेकिन आम तौर पर प्रवेश, इनक्यूबेशन समय, और संकल्प के बीच एक संतुलन है । सामान्य तौर पर, फॉस्फोटंगस्टिक एसिड (पीटीए) नरम ऊतक के बेहतर विपरीत और संकल्प प्रदान करता है, लेकिन क्यूटिकल के यांत्रिक व्यवधान और इनक्यूबेशन बार लंबे समय की आवश्यकता होती है। विभिन्न दाग प्रकारों के गुणों को रेफरी में विस्तार से वर्णित किया गया है ।1.
    1. आयोडीन धुंधला करने के लिए, 0.1 एन आई 2 केआई (लुगोल सॉल्यूशन) के1एमसीएल का उपयोग करें। 2 दिनों के लिए इनक्यूबेट। वयस्क क्यूटिकल का और व्यवधान आवश्यक नहीं है।
    2. फॉस्फोटंगस्टिक एसिड (पीटीए) धुंधला करने के लिए, पानी में पतला 0.5% (w/v) समाधान के 1 एमएल का उपयोग करें। वयस्क क्यूटिकल को बाधित करें, या तो माउथपार्ट्स को हटाकर या छाती या पेट के क्यूटिकल में छेद को एक धारक से जुड़े एक छोटे मिन्यूटियन पिन के साथ काटते हैं। 5-7 दिनों के लिए इनक्यूबेट, या अधिक समय तक यदि ऊतक धुंधला गैर-समरूप दिखाई देता है।
  4. 30 मिनट के लिए अल्ट्रापुरे पानी या 1x पीबीएस के 1 एमएल के साथ धोएं। रिपीट वॉश स्टेप। एक महीने तक अल्ट्रापुरे पानी या 1x पीबीएस में आरटी पर जानवरों को स्टोर करें।
  5. यदि हाइड्रेटेड रहते हुए जानवरों को स्कैन किया जाना है, तो सीधे सेक्शन 4 पर जाएं। यदि नमूने के लंबे समय तक संरक्षण की आवश्यकता है, तो प्रोटोकॉल की धारा 3 पर आगे बढ़ें।

3. क्रिटिकल पॉइंट सुखाने (वैकल्पिक)

  1. नमूने पर एक इथेनॉल (एटोह) निर्जलीकरण श्रृंखला करें: 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 100%। आदेश में प्रत्येक एकाग्रता के लिए 1 घंटे के लिए एटोह समाधान के 1 एमसीएल जोड़ें और बेंचटॉप पर इनक्यूबेट करें।
  2. अंतिम 100% EtOH सोख के बाद, ताजा 100% EtOH के साथ बदलें और रात भर बेंचटॉप पर नमूना इनक्यूबेट दें।
  3. निर्माता के निर्देशों के बाद नमूनों के महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने का प्रदर्शन करें।
    नोट: इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सुविधाओं में आम तौर पर एक महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने की मशीन होती है (सामग्री की तालिकादेखें) जो एटोह निर्जलीकरण के बाद नमूने के सुखाने का प्रदर्शन करेगी।

4. नमूना बढ़ते

  1. गंभीर बिंदु सूखे नमूनों के लिए, घूर्णन चरण के चक के भीतर फिट करने के लिए डिज़ाइन की गई कीट पिन या अन्य धारक के लिए गर्म गोंद के नमूने या इसे प्लास्टिक या ग्लास केशिका ट्यूब (~ 1.0-1.25 मिमी आंतरिक व्यास) में रखें।
  2. हाइड्रेटेड नमूनों के लिए, पानी के साथ एक P10 पिपेट टिप भरें और रिसाव को रोकने के लिए या तो गर्मी सीलिंग या पैराफिन फिल्म द्वारा संकीर्ण अंत को सुरक्षित करें।
    सावधानी: किसी भी कनेक्शन को कसकर लपेटना सुनिश्चित करें ताकि पानी स्कैनर में लीक न हो और नुकसान का कारण बन सके।
    1. संदंश का उपयोग करके पिपेट टिप पर एक नमूना स्थानांतरित करें। एक लंबी, पतली वस्तु का उपयोग करना, जैसे कि एक सुस्त 20 जी सुई या कोई अन्य पिपेट टिप, ध्यान से नमूने को टिप के नीचे धकेलता है जब तक कि यह इसे जगह में रखने के लिए पिपेट टिप की दीवार से संपर्क नहीं करता है।
    2. लंबे स्कैन के दौरान पानी के वाष्पीकरण को रोकने के लिए पैराफिन फिल्म के साथ पिपेट टिप के उद्घाटन को कवर करें।
    3. घूर्णन चरण(चित्रा 1ए-सी)के चक के भीतर फिट करने के लिए डिज़ाइन किए गए धारक का उपयोग करके P10 पिपेट माउंट करें।

5. स्कैनिंग

  1. दिन के लिए इमेजिंग से पहले मशीन के किसी भी आवश्यक अंशांकन प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: ये निर्माता द्वारा भिन्न होंगे और उचित चरणों को निर्धारित करने के लिए आवेदन विशेषज्ञ से परामर्श करने की सिफारिश की जाती है। कृपया इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सेटअप और सॉफ्टवेयर के बारे में विशिष्ट जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें। आम तौर पर, कैमरे पर एक समान पृष्ठभूमि पिक्सेल तीव्रता सुनिश्चित करने के लिए चक से जुड़े किसी भी 'लड़खड़ा' को हटाने के लिए एक चरण अक्ष संरेखण जैसे अंशांकन और कैमरे पर समान पृष्ठभूमि पिक्सेल तीव्रता सुनिश्चित करने के लिए फ्लैट-फील्ड सुधार प्रदर्शन करने के लिए सबसे अच्छा संकल्प और डेटासेट के लिए इष्टतम इमेजिंग स्थितियां प्रदान करते हैं जो कई स्कैन में तुलनीय हैं।
  2. सॉफ्टवेयर के ऊपरी बाएं कोने में'ओपन डोर'आइकन पर क्लिक करके घूर्णन चरण चक तक पहुंच प्राप्त करने के लिए स्कैनर दरवाजा खोलें। सैंपल होल्डर के बेस के आसपास कॉलर कस कर सैंपल अटैच करें।
    नोट: स्कैनर संरेखण बनाए रखने के लिए घूर्णन चक के लिए नमूना संलग्न करते समय कोमल दबाव का उपयोग करें।
  3. इष्टतम संकल्प और इसके विपरीत के लिए स्कैनर को नियंत्रित करने वाले सॉफ्टवेयर में स्कैनिंग पैरामीटर सेट करें।
    नोट: ये एक्स-रे स्रोत, कैमरा/डिटेक्टर के रूप में अनुभवजन्य निर्धारित करने की आवश्यकता होगी, और प्रत्येक स्कैनर की ज्यामिति निर्माता द्वारा भिंन होगा । सर्वश्रेष्ठ मापदंडों का चयन करने के लिए अतिरिक्त जानकारी यहां43,साथ ही निर्माता के आवेदन विशेषज्ञ से भी पाई जा सकती है।
    1. एक्स-रे स्रोत शक्ति नियंत्रणखोलें (विकल्प | एक्स-रे स्रोत)। 3-40 केवी और वर्तमान को 100-110 μA करने के लिए एक्स-रे वोल्टेज सेट करने के लिए स्लाइडर बार का उपयोग करें 3-4W बिजली के साथ एक एक्स-रे बीम और बढ़ाया संकल्प के लिए एक छोटे से स्थान आकार का उत्पादन करने के लिए ।
    2. अधिग्रहण मोड संवाद का उपयोग करें(विकल्प | अधिग्रहण मोड)कैमरा एक्सपोजर समय 500-800 एमएस के लिए निर्धारित करने के लिए।
    3. कैमरा सेटिंग्स और स्थिति के आधार पर वांछित छवि पिक्सेल आकार (~ 700 एनएम से 4 माइक्रोन) सेट करने के लिए सॉफ्टवेयर के तल पर आवर्धक ग्लास आइकन के बगल में स्थित स्लाइडर बार का उपयोग करें। यह स्कैन के दौरान प्राप्त किए गए प्रक्षेपण छवियों की संख्या निर्धारित करता है, जिसमें अधिक अनुमानों के साथ बेहतर संकल्प लेकिन लंबे समय तक स्कैन किया जाता है (प्रतिनिधि परिणामदेखें)।
    4. क्लिक करें और अपने 360 ° रोटेशन पथ के साथ नमूना स्थानांतरित करने के लिए सॉफ्टवेयर के तल पर घूर्णन तीर के बगल में स्थित स्लाइडर बार खींचें। सुनिश्चित करें कि नमूना देखने के क्षेत्र के भीतर रहता है।
  4. सॉफ्टवेयर के शीर्ष पर'स्टार्ट एक्विजिशन'आइकन (ब्लू सर्कल एरो आइकन) पर क्लिक करें। एक संवाद बॉक्स दिखाई देता है जो अतिरिक्त स्कैनिंग मापदंडों को सेट करने की अनुमति देता है, और फ़ाइल और आउटपुट फ़ोल्डर जहां स्कैन को नाम से बचाया जाएगा।
    1. यादृच्छिक आंदोलन को 10 और औसत 4-6 फ्रेम में सेट करें। उपयोग की जाने वाली कैमरा सेटिंग के आधार पर रोटेशन चरण की गणना स्वचालित रूप से की जाती है।
  5. एक्विजिशन डायलॉग बॉक्स पर'ओके'क्लिक करके स्कैन शुरू करें। एक दूसरी प्रगति बार संवाद प्रतीत होता है कि स्कैन समय से पता चलता है । स्कैनर अब रोटेशन पथ के साथ नमूने के प्रक्षेपण छवियों(चित्रा 1D)की एक श्रृंखला प्राप्त करेगा और निगरानी की जरूरत नहीं है ।

6. पुनर्निर्माण

  1. टोमोग्राम उत्पन्न करने के लिए, प्रक्षेपण छवियों का उपयोग करके छवि पुनर्निर्माण करें।
    नोट: जबकि शंकु बीम ज्यामिति स्कैनर से छवियों के लगभग सभी पुनर्निर्माण फेल्डकामप एल्गोरिदम16पर भरोसा करते हैं, व्यक्तिगत पैरामीटर सॉफ्टवेयर कार्यान्वयन के आधार पर भिन्न होंगे और अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किए जाने चाहिए। निम्नलिखित सेटिंग्स, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर के लिए विशिष्ट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग गाइड के रूप में किया जा सकता है। अंतिम पुनर्निर्माण के लिए सर्वोत्तम मूल्यों का चयन करने के लिए एक पुनरावृत्ति फैशन में किए जाने वाले गलत संरेखण क्षतिपूर्ति, रिंग विरूपण में कमी, और बीम सख्त सुधार (अधिकांश फ्लाई नमूनों के लिए 0%) जैसे पैरामीटर किए जाते हैं। उन्नत उपयोगकर्ताओं के लिए जो पुनर्निर्माण प्रक्रिया पर अधिक नियंत्रण चाहते हैं, यहां मैटलैब इंटरफेसदेखें 44।
  2. संदर्भ स्कैन45 (क्रियाएं |) के आधार पर एक बदलाव-सुधार एल्गोरिदम का उपयोग करके एक प्रारंभिक छवि संरेखण करें एक संदर्भ स्कैन के साथ X/Y संरेखण) ।
  3. प्रत्येक पुनर्निर्माण पैरामीटर को ठीक करें(| शुरू करें ठीक ट्यूनिंग) । यह एक 'पैरामीटर फाइन-ट्यूनिंग' संवाद बॉक्स को सक्रिय करता है।
    1. 'नेक्स्ट'से लेकर'पोस्ट-अलाइनमेंट'पर क्लिक करके अलाइनमेंट को फाइन ट्यून करें। पुनरावृत्तियों की संख्या को पांच और पैरामीटर चरण को 1.0 तक सेट करें। पूर्वावलोकन की एक श्रृंखला उत्पन्न करने के लिए स्टार्ट बटन पर क्लिक करें। ठीक से गठबंधन किया है कि छवि का चयन करें।
      नोट: एक ठीक से गठबंधन छवि धुंधली नहीं होगी या 'कतरनी' कलाकृतियों को प्रदर्शित नहीं करेगी जहां एक अन्यथा निरंतर संरचना (जैसे कि क्यूटिकल) विभाजित दिखाई देती है।
    2. ठीक धुन इसके बगल में क्लिक करके अंगूठी विरूपण साक्ष्य कमी। पुनरावृत्तियों की संख्या को पांच और पैरामीटर चरण को 1.0 तक सेट करें। पूर्वावलोकन की एक श्रृंखला उत्पन्न करने के लिए स्टार्ट बटन पर क्लिक करें। उस छवि का चयन करें जिसमें रिंगों की सबसे कम संख्या होती है।
  4. एक बार जब उपरोक्त मापदंडों को सर्वश्रेष्ठ छवि देने के लिए अनुकूलित कर लिया गया है, तो सुनिश्चित करें कि चयनित मानों को सेटिंग टैब(सेटिंग्स) में ठीक से दर्शाया गया है।
  5. हिस्टोग्राम का उपयोग करके किसी भी अंतिम चमक और विपरीत मूल्यों को समायोजित करें, थोड़ी गहराई और प्रकार जैसे पैरामीटर फाइल करें, और कम्प्यूटेशनल समय(आउटपुट)को कम करने के लिए ब्याज की संरचनाओं (जैसे, पूरी फ्लाई या सिर) को शामिल करते हुए ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) का उपयोग करें।
  6. पुनर्निर्माण शुरू करें(| शुरू करें शुरू करो) । यदि कई पुनर्निर्माण की आवश्यकता है, तो वर्तमान छवि को बैच प्रबंधक में जोड़ें(स्टार्ट | बैच में जोड़ें) और शेष छवियों के लिए चरण 6.2-6.5 दोहराएं।

7. छवि विश्लेषण

  1. दो और तीन आयामों में टोमोग्राम की कल्पना करें और फ्रीवेयर या वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर के साथ आगे मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सॉफ़्टवेयर का विवरण सामग्री तालिकामें उपलब्ध है। अन्य सॉफ्टवेयर पैकेज जो μ-सीटी डेटासेट का मूल्यांकन करने में सक्षम हैं, उनमें फिजी46,सेग3डी (www.seg3D.org)47,और आईटीके-स्नैप48,प्लस वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर (जैसे, अमीरा) जैसे फ्रीवेयर विकल्प शामिल हैं। विभाजन प्रक्रिया को अर्ध-स्वचालित करने के लिए मशीन-लर्निंग आधारित एल्गोरिदम को नियोजित करने वाले अन्य अनुप्रयोगों से गति कार्यप्रवाह में मदद मिल सकती है और मानव पूर्वाग्रह (जैसे, बायोमेडिसा49)को कम किया जा सकता है।
  2. सॉफ्टवेयर में टोमोग्राम फाइल आयात करें(फाइल | आयात छवि फ़ाइलें)। फ़ाइल से जुड़े मेटाडेटा को स्वचालित रूप से विंडो में लोड करना चाहिए, लेकिन छवि गुणों से मेल खाने के लिए मैन्युअल रूप से सेट किया जा सकता है।
  3. ब्याज की संरचना को सेगमेंट करने के लिए, स्क्रीन के बाएं हाथ की ओर सेगमेंट टैब पर क्लिक करें। ब्याज का एक नया क्षेत्र (आरओआई)(बेसिक | बनाएं नया), इसे एक नाम दें और एक उपयुक्त रंग का चयन करें।
  4. सीमा सीमा को परिभाषित करें जिसमें ब्याज की संरचना शामिलहै (रेंज | स्लाइडर बार का उपयोग करके रेंज को परिभाषित करें)।
  5. एक उपयुक्त 2D या 3D आरओआई पेंटर टूल मोड(आरओआई पेंटर | का चयन करें तूलिका विकल्प) ।
  6. दहलीज द्वारा परिभाषित क्षेत्र को पेंट करना; बाएं माउस कुंजी को पकड़ते समय सीटीआरएल कुंजी दबाएं और पकड़ें। किसी क्षेत्र को हटाने के लिए, बाएं माउस कुंजी को पकड़ते समय शिफ्ट कुंजी दबाएं और पकड़ें।
    नोट: परिपत्र या वर्ग तूलिका के आकार को बदलने के लिए, बस माउस पहिया स्क्रॉल करते हुए या तो Ctrl या शिफ्ट चाबियां पकड़े ।
  7. अपने पूरे जेड-वॉल्यूम में ब्याज की संरचना को पेंट करना जारी रखें।
  8. आरओआई को मेष (निर्यात | में परिवर्तित करें एक मेष | के लिए सामान्य)।
  9. ऊपरी दाएं हाथ के कोने में डेटा प्रॉपर्टीज और सेटिंग्स पैनल में इस पर क्लिक करके जाल ओवरले को हाइलाइट करें।
  10. उपयुक्त संख्या में पुनरावृत्तियों का उपयोग करके जाल को चिकना करें(चिकनी मेष | पुनरावृत्तियां)।
    नोट: तुलना की जाने वाली सभी छवियों के लिए एक ही जाल चौरसाई पुनरावृत्ति मूल्य का उपयोग करें।
  11. सुनिश्चित करें कि जाल रॉय(सतह क्षेत्र, वॉल्यूम और फेरेट व्यास)के माप बुनियादी रूपोमेट्रिक विश्लेषण के लिए स्क्रीन के दाहिने हाथ की ओर सूचना पैनल में प्रदर्शित किए जाते हैं। ऑब्जेक्ट एनालिसिस मॉड्यूल का उपयोग करके अतिरिक्त विश्लेषण किया जा सकता है।
  12. जाल वस्तु और पूरे टोमोग्राम छवि को प्रस्तुत करें और 3 डी में कल्पना करें। ऑब्जेक्ट का वीडियो जेनरेट करने के लिए बिल्ट-इन मूवी मेकर का उपयोग करें(राइट माउस क्लिक | दर्शक(कुंजी जोड़ें) से अलग-अलग फ्रेम का उपयोग करके मूवी मेकर दिखाएं।
    नोट: कुछ सुविधाओं को हाइलाइट करने के लिए दाएं हाथ के पैनल में विजुअल इफेक्ट्स टैब का उपयोग करके फिल्म में कई दृश्य संवर्द्धन भी लागू किए जा सकते हैं।
  13. मूवी मेकर में एक्सपोर्ट एनिमेशन बटन का उपयोग करके देखने के लिए वीडियो का निर्यात करें।

Representative Results

चित्रा 2 एक भ्रूण की छवियों से पता चलताहै, 3 instar लार्वा, pharate वयस्क चरण (P7) पर pupae, और एक वयस्क महिला आयोडीन और एक वाणिज्यिक बेंचटॉप स्कैनर का उपयोग कर पानी में हाइड्रेटेड चित्रित के साथ दाग मक्खी । उत्कृष्ट संरक्षण और यहां तक कि नाजुक ऊतकों का धुंधला होना स्पष्ट है, जिससे सभी प्रमुख अंगों को आसानी से पहचाना जा सकता है और मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण और 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन के लिए उपयोग किया जाता है।

आमतौर पर, स्कैन जो नमूने की कम प्रक्षेपण छवियां प्राप्त करते हैं, स्कैन की तुलना में कम रिज़ॉल्यूशन प्रदान करते हैं जो अधिक प्रक्षेपण छवियां प्राप्त करते हैं, ट्रेडऑफ के साथ स्कैनिंग में समय बिताया जाता है। हालांकि स्कैन समय साधन और अन्य स्कैनिंग मापदंडों से भिन्न होगा, स्कैन जो कुछ सौ अनुमानों (~ 3 माइक्रोन इमेज पिक्सेल आकार) को प्राप्त करते हैं, लगभग 30 मिनट प्रति नमूना लेता है, जबकि हजारों प्रक्षेपण छवियों (700 एनएम-1.25 माइक्रोन इमेज पिक्सेल आकार) से मिलकर स्कैन 8-16 एच ले सकते हैं। एक ही वयस्क फ्लाई हेडकेस की तुलना 'धीमी' (हजारों अनुमानों) और 'फास्ट' (सैकड़ों अनुमानों) स्कैन मोड में ली गई है, जो चित्र 3में दिखाई गई है। महत्वपूर्ण बात यह है कि मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण 'धीमी' और 'फास्ट' स्कैन(चित्र 3सी)40के बीच भिन्न नहीं होते हैं। इसलिए, हमारी इमेजिंग पाइपलाइन, रूपोमेट्रिक विश्लेषण के लिए पर्याप्त रूप से बड़े नमूना आकार उत्पन्न करने के लिए तेजी से स्कैन का उपयोग करती है, और उच्च संकल्प पर किसी भी रूपात्मक या शारीरिक दोषों की कल्पना करने के लिए धीमी गति से स्कैन करती है। सॉफ्टवेयर (चरण 7) का उपयोग करके, किसी भी ऊतक या ब्याज की अंग प्रणाली को खंडित किया जा सकता है और मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता है और फिल्म निर्माता(मूवी 1)का उपयोग करके 3 डी में कल्पना की जा सकती है।

चित्रा 4 पीटीए और इमेज्ड हाइड्रेटेड (पानी) के साथ दाग फ्लाई पेट का एक उदाहरण दिखाता है या एक्स-रे माइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिका)पर महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने (सीपीडी) का पालन करता है। पीटीए के संयोजन और इस मंच की क्षमताओं द्वारा वहन किया गया विस्तार इन छवियों में आसानी से स्पष्ट है, जैसे कि मिडगट की व्यक्तिगत एपिथेलिया कोशिकाएं और टेस्ट के भीतर शुक्राणु बंडल आसानी से हल हो जाते हैं। जबकि सीपीडी छवि हाइड्रेटेड नमूने की तुलना में मामूली वृद्धि का संकल्प दिखाती है, नाजुक ऊतकों (जैसे कि क्यूटिकल के पास वसा कोशिकाओं) के अल्ट्रास्ट्रक्चर का बेहतर संरक्षण हाइड्रेटेड नमूनों(मूवी 2)के साथ हासिल किया जाता है।

Figure 1
चित्रा 1: स्कैनर डिजाइन और μ सीटी के लिए बढ़ते नमूने का अवलोकन । }एककमर्शियल बेंचटॉप μ-सीटी स्कैनर । (ख)स्कैनर के अंदर देखें । एक्स-रे स्रोत (दाएं) एक्स-रे उत्सर्जित करता है जो एक घूर्णन चरण (पीला तीर) पर स्थित नमूने से गुजरता है। इन एक्स-रे का क्षीणन छवि विपरीत उत्पन्न करता है क्योंकि वे नमूने के माध्यम से और डिटेक्टर पर गुजरते हैं, जिसमें एक प्रस्फुटन स्क्रीन होती है जो एक्स-रे को फोटॉन और एक मानक सीसीडी कैमरा (बाएं) में परिवर्तित करती है। (ग)एक वयस्क फल बढ़ते पानी में हाइड्रेटेड इमेजिंग के लिए उड़ते हैं । पाइपट टिप और पीतल धारक के बीच कनेक्शन अंक पैराफिन फिल्म में लपेटा जाता है ताकि रिसाव और स्कैनर को संभावित क्षति को रोका जा सके। मंच चक पर भी प्रकाश डाला जाता है। ध्यान दें कि पिपेट टिप थोड़ा ऑफ-एक्सिस तैनात किया गया था, जिसके कारण अंतिम पुनर्निर्माण में लंबा स्कैन समय और कम संकल्प हुआ। (घ)एक वयस्क महिला फ्लाई की एक एकल 2D प्रक्षेपण छवि; इन अनुमानों के हजारों के सैकड़ों रोटेशन धुरी के साथ एक स्कैन के दौरान प्राप्त कर रहे है और पुनर्निर्माण के लिए आइसोट्रोपिक संकल्प और सटीक 3 डी जानकारी युक्त tomograms उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है । स्केल बार्स (सी) = 2 मिमी पी, पीछे; वी, वेंट्रल। इस आंकड़े को Schoborg एट अल४०से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: सभी ड्रोसोफिला मेलनोगेस्टर जीवन चक्र चरणों, μ सीटी द्वारा चित्रित । पानी में आयोडीन और इमेज्ड हाइड्रेटेड के साथ दाग नमूने। दिखाया गया है एक एकल 2D टुकड़ा है। (एक)एक भ्रूण जिसने गैस्ट्रुलेशन (तारक) के शुरुआती दौर को पूरा कर लिया है। (ख)एक तिहाई इंस्टार लार्वा । (ग)कायापलट के दौरान एक P7 pharate वयस्क । (घ)एक वयस्क महिला । विभिन्न अंगों पर प्रकाश डाला जाता है: बीडब्ल्यूएम, शरीर की दीवार की मांसपेशियां; बीआर, मस्तिष्क; सीडी, कार्डिया; सीआर, फसल; डीएलएमएस, पृष्ठीय देशांतर मांसपेशियां; डीवीएम, पृष्ठीय वेंट्रल मांसपेशियां; ई-विज्ञापन, आई-एंटेनाल डिस्क; उन्हें, भ्रूण; एफबी, वसा निकाय; FBCs, वसा शरीर की कोशिकाओं; एच, दिल; एचजी, हिंडगट; ला, लैमिना; एल, पैर; एमजी, मिडगुट; राजभाषा, मस्तिष्क ऑप्टिक पालि; Ov, ovipositor; पीसी, पुपल क्यूटिकल; एसजी, लार ग्रंथियों; वीएनसी, वेंट्रल नर्व कॉर्ड; डब्ल्यू, विंग; WD, विंग डिस्क. स्केल बार्स (ए) = 100 माइक्रोन; (ख) -(D) = 500 माइक्रोन डी, पृष्ठीय; ए, पूर्वकाल; एल, बाएं। स्कैनिंग पैरामीटर: स्रोत से नमूना दूरी (मिमी): (ए, डी) 36.5, (बी) 48.8, (C) 40.3। कैमरा दूरी (मिमी) के लिए स्रोत: (ए, डी) ३५०, (बी, सी) २८५ । कैमरा पिक्सेल आकार (μm): (A-D) ११.६ । इमेज पिक्सल साइज (μm): (A, D) १.२, (B) १.९, (C) १.७ । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: स्कैनिंग पैरामीटर और इमेज रिज़ॉल्यूशन मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण को नहीं बदलते हैं। एक वयस्क सिर दोनों(ए, ए')'फास्ट' स्कैनर सेटिंग्स (अनुमानों के सैकड़ों) और(बी, बी')'धीमी गति से' स्कैनर सेटिंग्स (अनुमानों के हजारों) का उपयोग करके स्कैन किया जाता है। मस्तिष्क पीले रंग में रेखांकित किया जाता है। (ग)धीमी और तेज स्कैन से मस्तिष्क की मात्रा माप। हाइलाइट की गई संरचनाएं: अल; एंटेनाल लोब; सीबी, केंद्रीय मस्तिष्क; एफबी, प्रशंसक के आकार का शरीर; एफसी, वसा कोशिकाएं; ला, लैमिना; लो, लोउल्ला; विपक्ष के नेता, लोबुला प्लेट; मुझे, मेडुला; पुनः, रेटिना। n = 5, वेल्च का टी-टेस्ट। एनएस = महत्वपूर्ण नहीं है। स्केल बार = 100 माइक्रोन। स्कैनिंग पैरामीटर: स्रोत से नमूना दूरी (मिमी): (ए) 44.4, (बी) 36.5। कैमरा दूरी (मिमी) के लिए स्रोत: (ए) ३४८ (बी) ३५० । कैमरा पिक्सेल आकार (μm): (ए-बी) ११.६ । इमेज पिक्सल साइज (μm): (A) 2.95, (B) 1.2. इस आंकड़े को Schoborg एट अल४०से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एक्स-रे माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेज डे ड्रोसोफिला मेलनोगास्टर पेट। पेट 0.5% पीटीए और इमेज्ड हाइड्रेटेड (पानी) या महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने (सीपीडी) के बाद के साथ दाग थे। (A)क्रिटिकल पॉइंट सूखे पेट, वाईजेड के नजरिए से दिखाया गया है और (ए') XZ परिप्रेक्ष्य में। (ख)हाइड्रेटेड पेट, वाईजेड के नजरिए से दिखाया गया है और (B') XZ परिप्रेक्ष्य में दिखाया गया है। विभिन्न अंगों पर प्रकाश डाला जाता है: एफसी, वसा कोशिकाएं; एचजी, हिंडगट; एमजी, मिडगुट; एसपी, स्पर्म पंप; ते, टेस्ट्स। स्केल बार्स (ए) = 250 माइक्रोन डी, पृष्ठीय; ए, पूर्वकाल; एल, बाएं। स्कैनिंग पैरामीटर: स्रोत से नमूना दूरी (मिमी): (ए) 6.7, (बी) 7. कैमरा दूरी (मिमी) के लिए स्रोत: (ए) 28 (B) २९.५ । उद्देश्य: (ए-बी) 4X. इमेज पिक्सल साइज (μm): (A-B) ०.६५ । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

फिल्म 1: ड्रैगनफ्लाई में मूवी मेकर का उपयोग करके 3डी में प्रदान किया गया एक तिहाई इंस्टार लार्वा। हाइलाइट किए गए अंगों में मस्तिष्क (पीला), आंख-एंटीनाल कल्पनाशील डिस्क (लाल), वसा शरीर (नीला) और शरीर की दीवार की मांसपेशियां (हरी) शामिल हैं। कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

फिल्म 2: पानी में इमेज किए गए नमूनों की तुलना या महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने का पालन करें। 0.5% पीटीए के साथ दाग पेट दिखाए जाते हैं। दोनों पेट समान छवि पिक्सेल आकार सेटिंग्स (0.65 μm) के साथ स्कैन किया गया। 2डी स्लाइस की एक श्रृंखला को पृष्ठीय सतह पर शुरू होने वाले और पेट की वेंट्रल सतह पर समाप्त होने वाले 'जेड-स्टैक' प्रारूप (वाईजेड) में दिखाया गया है। अंगों पर प्रकाश डाला: एफसी, वसा कोशिकाओं; एमजी, मिडगुट; एसपी, स्पर्म पंप; ते, टेस्ट्स। स्कैनिंग पैरामीटर: स्रोत से नमूना दूरी (मिमी): (ए) 6.7, (बी) 7. कैमरा दूरी (मिमी) के लिए स्रोत: (ए) 28 (B) २९.५ । उद्देश्य: (ए-बी) 4X. इमेज पिक्सल साइज (μm): (A-B) ०.६५ । कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

सभी विकास चरणों में बरकरार ड्रोसोफिला मेलानोगेस्टर की कल्पना करना एक चुनौती बनी हुई है, मुख्य रूप से इस जानवर में पाए जाने वाले मोटी, पिगमेंटेड क्यूटिकल के साथ प्रकाश माइक्रोस्कोपी की असंगति के कारण। जबकि चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई), ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (OCT), और ऊतक समाशोधन के साथ मिलकर अल्ट्रामाइक्रोस्कोपी जैसे अन्य पूरे पशु इमेजिंग तरीकों का उपयोग मक्खियों में सफलता के साथ किया गया है50,51,52,53,54,μ-सीटी कई फायदे प्रस्तुत करते हैं जो इसे इस जीव13,15,30 के पूरे पशु इमेजिंग के लिए आदर्श बनाते हैं। . एक्स-रे आसानी से पिगमेंटेड क्यूटिकल में प्रवेश करते हैं और उनकी छोटी तरंगदैर्ध्य उप-माइक्रोन इमेजिंग के लिए अनुमति देती है। लेबलिंग के लिए व्यापक रूप से उपलब्ध रसायनों में न्यूनतम निवेश की आवश्यकता होती है और कोई विशेष बेंच कौशल13नहीं । μ-सीटी स्कैनर भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, और लागत प्रकाश माइक्रोस्कोपी प्लेटफार्मों के बराबर हैं, जबकि विषयों (भूविज्ञान, जीवाश्म विज्ञान, इंजीनियरिंग, आदि) की व्यापक श्रृंखला के लिए भी अधिक आकर्षक है कि एक संस्थान में इसकी उपलब्धता से भी लाभ उठा सकते हैं । सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे स्रोतों का उपयोग उच्च रिज़ॉल्यूशन μ-सीटी इमेजिंग के लिए फिक्स्ड और जीवितकीटों के 31,55, 56के लिए भी किया जा सकता है, लेकिन वाणिज्यिक बेंचटॉप स्कैनर की तुलना में कम सुलभ हैं।

यह प्रोटोकॉल फ्लाई वयस्कों, पिल्ला, लार्वा और सेलुलराइज्ड भ्रूण की μ-सीटी छवियों को प्राप्त करने का एक कुशल तरीका प्रदान करता है। ध्यान दें कि ऊपर उल्लिखित कई चरणों के लिए, इमेजिंग के लिए नमूने तैयार करने के लिए वैकल्पिक तरीके भी लागू किए जा सकते हैं। अन्य अध्ययनों में कीड़ों में उपयोग के लिए विभिन्न निर्धारण, लेबलिंग और सुखाने के कदमों की विस्तृत तुलना प्रदान की गई है और इस तकनीक को अपनाने में रुचि रखने वालों को प्रत्येकदृष्टिकोण1, 4, 13,29,30,30,57के गुणों का मूल्यांकन करने के लिए प्रोत्साहित कियाजाताहै। हालांकि यह प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सीधा है, कुछ उपयोगी सुझाव प्रस्तुत किए जाते हैं।

सबसे पहले, अक्षुण्ण नमूनों के क्यूटिकल को बाधित करते समय देखभाल की जानी चाहिए जैसे कि अंतर्निहित नरम ऊतकों को काफी बाधित नहीं किया जाता है। पोकिंग से पहले बोइन के समाधान में 2 घंटे के लिए लार्वा और प्रारंभिक प्यूपल चरणों को निर्धारण करना महत्वपूर्ण है। यह ऊतक को कठोर करेगा और हीमोलिम्फ की मात्रा को सीमित करेगा जो क्यूटिकल छेद से बाहर निकल जाएगा, जो अंग वास्तुकला को बदल सकता है। यदि ब्याज की संरचना (ओं) वहां स्थित है तो वयस्क के व्यक्तिगत शरीर खंड (सिर, छाती और पेट) को अलग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, आंत या केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के 3 डी वास्तुकला को बाधित करने के बजाय इन खंडों के माध्यम से सफाई से टुकड़ा करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। समय के लिए के रूप में, वयस्कों को आम तौर पर केवल 16 बजे की आवश्यकता है । पूर्ण निर्धारण के लिए, जबकि लार्वा और प्यूपल चरणों को 24 घंटे की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, यदि आयोडीन या पीटीए धुंधला असमान प्रतीत होता है, तो नमूना को तब तक कम करने के लिए समाधान में वापस रखा जा सकता है जब तक कि धुंधला भी हासिल नहीं हो जाता है। अंत में, हाइड्रेटेड नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर नहीं रखा जाना चाहिए, क्योंकि यह कमरे के तापमान पर वार्मिंग के बाद शरीर गुहा के भीतर हवा के बुलबुले के गठन को प्रेरित करने लगता है।

दूसरा, नमूना बढ़ते उपकरण, मंच प्रकार के अनुसार भिंन होगा और क्या नमूना हाइड्रेटेड रहने की जरूरत है या महत्वपूर्ण बिंदु सूख गया है । यदि हाइड्रेटेड है, तो सुनिश्चित करें कि नमूना रिसाव नहीं करता है और संभवतः स्कैनर को नष्ट कर देता है। जब एक पिपेट टिप के अंदर नमूना बढ़ते, एक सुस्त वस्तु के साथ धीरे धक्का सुनिश्चित करें जब तक नमूनों मामूली प्रतिरोध मुठभेड़ों और स्थानांतरित नहीं कर सकते । बहुत मुश्किल धक्का से हीकित विकृति और अंतर्निहित संरचनात्मक दोष हो सकते हैं। इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि नमूना धारक में संभव के रूप में रोटेशन की धुरी के करीब के रूप में गठबंधन किया है। किसी भी लड़खड़ा देखने के बड़े क्षेत्र के कारण स्कैन समय में वृद्धि होगी और पुनर्निर्माण के बाद अंतिम tomogram के संकल्प को कम ।

तीसरा, प्रक्षेपण छवियों को प्राप्त करने के लिए स्कैनर सेटिंग्स भी साधन के अनुसार भिन्न होंगे। स्कैनर की संकल्प क्षमताओं को अधिकतम करने के लिए, एक्स-रे बीम स्पॉट आकार जितना संभव हो उतना छोटा होना चाहिए (5-10 माइक्रोन)। यह एक्स-रे वोल्टेज और वर्तमान सेटिंग्स को संतुलित करके प्राप्त किया जा सकता है जैसे कि कुल बिजली 3-4 डब्ल्यू है। इन सेटिंग्स और कैमरे पर उचित जोखिम समय के साथ, नमूना और इष्टतम छवि विपरीत द्वारा उचित एक्स-रे बीम तनु को प्राप्त किया जा सकता है। वस्तु और एक्स-रे स्रोत के बीच एल्यूमीनियम या कॉपर फिल्टर का उपयोग सबसे अच्छी छवि के विपरीत के लिए इष्टतम एक्स-रे ऊर्जा सेटिंग्स को ठीक करने या उच्च संचालित स्रोतों के लिए पर्याप्त रूप से बीम को कम करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। छवि रिज़ॉल्यूशन के लिए, यह दाग प्रकार, प्रक्षेपण छवियों की संख्या, छवि पिक्सेल आकार, कैमरा स्थिति, नमूना आंदोलन, स्कैनर कंपन और पुनर्निर्माण मापदंडों सहित कई अलग-अलग चरों पर निर्भर करेगा। ज्ञात आकार मार्कर युक्त एक बार पैटर्न प्रेत (क्यूआरएम जीएमबीएच) किसी दिए गए स्कैनर और कैमरा सेटिंग के लिए स्थानिक संकल्प का मूल्यांकन करने में मदद कर सकता है।

यह इमेजिंग महत्वपूर्ण बिंदु सूखे या हाइड्रेटेड नमूनों के गुणों का मूल्यांकन करने लायक भी है। सोम्बके एट अल ने दो तरीकों का तुलनात्मक आकलन किया और आर्थ्रोपोड्स30से जुड़े μ-सीटी अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने को बेहतर पाया। हालांकि, हाइड्रेटेड नमूनों के लाभ यह हैं कि जानवरों को कम रासायनिक और यांत्रिक जोखिम के अधीन किया जाता है जो मात्रात्मक और रूपात्मक कलाकृतियों दोनों का कारण बन सकता है। यह भी नाजुक ऊतकों सीपीडी से बेहतर संरक्षित करने के लिए जाता है । हालांकि, हाइड्रेटेड नमूनों में बहुत कम शेल्फ जीवन होता है और निर्धारण के बाद एक महीने से बाद में चित्रित नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि ऊतक क्षरण और कम छवि गुणवत्ता उस बिंदु पर स्पष्ट हो जाती है। इसके अलावा, हाइड्रेटेड नमूनों का समाधान एक महत्वपूर्ण बिंदु सूखे नमूने से थोड़ा कम होगा, क्योंकि एक्स-रे को प्लास्टिक पिपेट टिप और आसपास के तरल (पानी या बफर) दोनों के माध्यम से भी प्रवेश करना होगा। क्रिटिकल पॉइंट सूखे नमूनों को बहुत लंबे समय तक संरक्षित किया जा सकता है, खासकर जब ड्रिराइट पर रखा जाता है। उन्हें सीधे एक्स-रे बीम पथ में पंखों या पैरों को एक कीट पिन में चिपकाकर और बढ़ते प्रक्रिया को सरल बनाते हुए चरण चक में रखकर भी रखा जा सकता है। हालांकि, इन नमूनों के व्यापक इथेनॉल निर्जलीकरण ऊतक सिकुड़न और नाजुक ऊतक वास्तुकला के नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, यही वजह है कि इन प्रभावों को कम करने के लिए EtOH सांद्रता बढ़ाने की एक श्रृंखला प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है । फिर भी, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पैराफॉर्मेल्डिहाइड निर्धारण और यहां तक कि आयोडीन धुंधला सहित रासायनिक उपचार के सभी रूपों ऊतक सिकुड़न58,59का कारण बन सकता है। जबकि न तो विधि एक जीवित मक्खी में 'वास्तविक अंग आकार' के माप प्रदान करेगा, रूपांतरित माप अभी भी मान्य हैं जब उत्परिवर्ती और जंगलीताकार जानवरों की तुलना इतनी देर तक निर्धारण, धुंधला, और सुखाने के कदम नमूनों के दोनों सेटों के लिए समान रूप से किए जाते हैं - अधिमानतः समानांतर में।

अंत में, μ सीटी ड्रोसोफिला33, 34, 35, 36,37,38,39,40, 41के लिए एक उपयोगी संपूर्ण पशु इमेजिंग उपकरण प्रदान करता है। कई अन्य अध्ययनों ने कीट वर्गीकरण, पारिस्थितिकी, शरीर विज्ञान, विकास और शरीर रचना विज्ञान के विभिन्न पहलुओं को समझने के लिए इस तकनीक की शक्ति का प्रदर्शन किया है जो मक्खियों1,28,30, 31, 32,55, 56,57में भविष्य के अध्ययनों को सूचित करने में मदद कर सकता है . इस जीव में पहले से ही व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले आनुवंशिक और हल्के माइक्रोस्कोपी उपकरणों के साथ संयुक्त, μ-सीटी खुद को एक प्रयोगात्मक पाइपलाइन के भीतर रख सकता है जो जीनोटाइप और फेनोटाइप के बीच गहरी समझ के लिए अनुमति देता है।

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा या वित्तीय हितों की घोषणा करता है ।

Acknowledgments

इसमें से कोई भी नासिर रुसान के समर्थन के बिना संभव नहीं होता । मैं एच डौग मॉरिस, डेनिएल Donahue, और NIH माउस इमेजिंग सुविधा और प्रशिक्षण और उपयोगी चर्चा के लिए माइक्रो फोटोनिक्स के बेन दर्द के ब्रेंडा Klaunberg शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । मैं भी Xradia ५२० वर्सा पर पेट के नमूनों स्कैनिंग के लिए Zeiss के Mansoureh Norouzi रेड शुक्रिया अदा करता हूं । लॉरेन स्मिथ, सामंथा स्मिथ, और राहेल एनजी भी स्कैनिंग के साथ मदद की । माइक मार्श ऑफ ऑब्जेक्ट रिसर्च सिस्टम्स ने ड्रैगनफ्लाई तकनीकी सहायता प्रदान की। मैं नेशनल हार्ट, फेफड़े और रक्त संस्थान (1K22HL137902-01) और व्योमिंग विश्वविद्यालय से स्टार्ट अप फंड्स के समर्थन के लिए भी आभारी हूं। मैं गुमनाम समीक्षकों को उनके मददगार सुझावों और टिप्पणियों के लिए भी धन्यवाद देता हूं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% Ethanol For critical point drying
Bouin's Solution Sigma-Aldrich HT10132 For animal fixation
Critical Point Dryer Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300)
Dragonfly Software Object Research Systems For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html
Heat Block For microfuge tubes
Image Analysis Workstation Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering
Iodine Solution (I2KI) Fisher Scientific SI86-1 For staining
Microcomputed Tomography Scanner Bruker Skyscan 1172 Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 µm pixel size.
Microcomputed Tomography Scanner Software Bruker For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.)
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-15 For poking hole in cuticle
NRecon Image Reconstruction Software Bruker Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry
P10 pipet tips Genesee Scientific 24-120 Sample mounting
Phosphate Buffered Saline Resarch Products International P32060-4000.0 Dilute to 1X with water before use
Phosphotungstic Acid Hydrate Sigma-Aldrich 79690-25g For staining
Pin Holder Fine Science Tools 26018-17 For Minutien Pins
Triton X-100 Research Products International 111036 To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST)
X-Ray Microscope Zeiss Xradia 520 Versa Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD™)

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 163 ड्रोसोफिला मेलनोगास्टर,माइक्रोकंप्यूटेड टोमोग्राफी प्रीक्लिनिकल इमेजिंग इमेज एनालिसिस ह्यूमन डिजीज मॉडलिंग फेनोटाइपिंग
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Schoborg, T. A. Whole Animal Imaging … More

Schoborg, T. A. Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography. J. Vis. Exp. (163), e61515, doi:10.3791/61515 (2020).

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