Summary
فيبرين هو المسؤول عن تشكيل جلطة خلال الهباس والجلطات. يمكن استخدام المقايسات العكرة والجلطات (TEG) كأدوات تآزرية توفر تقييمًا تكميليًا للجلطة. يمكن لهذه التقنيات اثنين معا إعطاء مزيد من البصيرة في كيفية تأثير ظروف التخثر تشكيل جلطة الفيبرين.
Abstract
الجلطة هو السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم. فيبرين (ogen) هو البروتين المسؤول في المقام الأول عن تشكيل الجلطة أو تجلط الدم. ولذلك، وصف تشكيل جلطة الفيبرين مفيد لدراسة تجلط الدم. يتم استخدام العكرة والجلطات (TEG) على نطاق واسع في المختبرات لرصد تشكيل الجلطة. التعكر يقيس بشكل حيوي الإرسال الضوء من خلال هيكل جلطة الليفين عن طريق مطياف وغالبا ما تستخدم في مختبرات البحوث. TEG هي تقنية اللزجة المتخصصة التي تقيس قوة تجلط الدم مباشرة وتستخدم في المقام الأول في البيئات السريرية لتقييم الهزى المرضى. مع مساعدة من هاتين الادوات, هذه الدراسة يصف طريقة لتميز جلطة في المختبر في المختبر باستخدام نموذج مبسطة الجلطات الفيبرينوجين / ثرومبين. وقد تمت مقارنة اتجاهات البيانات عبر كلتا التقنيتين في ظل ظروف تخثر مختلفة. تشكلت جلطات الفينة البشرية والبفينة جنبًا إلى جنب في هذه الدراسة حيث تستخدم عوامل تخثر البقر غالبًا كبدائل لعوامل التخثر البشرية في البيئات السريرية والبحثية. تظهر النتائج أن TEG والعكارة تتبع تشكيل جلطة عبر طريقتين متميزتين وعندما تستخدم معا توفير قوة جلطة تكميلية والألياف المعلومات الهيكلية عبر ظروف تخثر متنوعة.
Introduction
تجلط الدم هو التكوين المرضي لجلطات الدم في الجسم التي تمنع الدورة الدموية مما يؤدي إلى ارتفاع معدلات المراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم. هناك 1 إلى 2 حالات من الجلطات الدموية الوريدية و 2 إلى 3 حالات من أمراض الأوعية الدموية الناجمة عن الجلطات لكل 1000 شخص سنويا1،2. هنا هو طريقة الاستفادة من الجلطات (TEG) والعكر لرصد تشكيل جلطة تحت ظروف تخثر مختلفة. فيبرين (ogen) هو البروتين الأساسي المسؤول عن تشكيل الجلطة في الجسم. في الخطوات النهائية من تتالي التخثر ، يتم شقوق الفيبرينوبيتيدات من الفيبرينوجين عن طريق ثرومبين بدء البلمرة من مونومرات الفيبرين غير قابلة للذوبان كما تطور الجلطة3،4. لفهم تشكيل الجلطة في تجلط الدم المرضي ، من الضروري توصيف تكوين الفيبرين في ظل ظروف تخثر متنوعة. وقد استخدمت عدة جلطة الرصد المقايسة لدراسة تشكيل جلطة الفيبرين في المختبر. Prothrombin الوقت (PT / INR) وتنشيط جزء من تخثر الوقت (aPTT) هما اختبار السريرية المشتركة التي تقيس سلامة مسار تخثر محددة. ومع ذلك، فإنها تستخدم الوقت باعتبارها المتغير الوحيد الذي لا يعطي أي إشارة إلى خصائص جلطة فيزيائية5. المجهر الإلكتروني يسمح التصور من البنية الدقيقة لجلط الفيبرين شكلت تماما ولكن لا يوفر أي معلومات عن عملية تشكيل جلطة نفسها6. من بين جميع المقايسات ، تقدم مقايسات التعكر و TEG القدرة على تتبع خصائص الجلطة ديناميكيًا مع مرور الوقت. هذه التقنيات تمكن من قياس شامل تخثر الملامح ، وبالتالي ، وتوفير بعض الفائدة على غيرها من أدوات توصيف تجلط الفيبرين.
على وجه التحديد، تستخدم على نطاق واسع لم مقايسات التعكر (أو تجلط) للبحث والتطبيقات السريرية بسبب تطبيقه التبسيطي وسهولة الوصول إلى مطياف في مختبرات البحوث. هذه المقاييس تسمح بقياس ديناميكي لـ إحالة الضوء من خلال جلطة تشكيلية من خلال أخذ قراءات متكررة فردية في طول موجة محدد (الأكثر شيوعًا عند طول الموجة في نطاق 350 – 700 نانومتر)7. ويمكن أيضا أن تكون درجة الحرارة في غرفة القراءة تعديلها. كما شكل هلام الفيبرين, يتم تقليل كمية الضوء الذي ينتقل من خلال شبكة البروتين مما تسبب في زيادة في امتصاص مع مرور الوقت. وبالمثل، يقلل الامتصاص عندما تتحلل شبكة الجلطة. يمكن بسهولة أن تكون مقايسات التعكر متعددة باستخدام تنسيق لوحة متعددة البئر للسماح لفحص عينة عالية الإنتاجية في كل من 96 - و 384-جيدا لوحات. يمكن اشتقاق العديد من خصائص الجلطة من منحنى تتبع التعكر (الامتصاص على قياس الوقت) التي تشمل: التعكر الأقصى، والوقت إلى أقصى عكرة، والوقت لتجلط بداية، ومعدل تشكيل جلطة (Vmax). ويمكن أيضا أن تستمد نسبة الألياف الفيبرين/ طول من البيانات التعكر الخام لتقدير سمك الألياف الفيبرين8,9,10.
يستخدم TEG في المقام الأول في الإعداد السريري لتقييم المرضى 'الهزات وجلط. كما أنها تستخدم عادة في التطبيقات الجراحية لتحديد متى الأدوية المضادة للfibrinolytic أو منتجات الدم hemostatic ينبغي أن تدار11,12. يحدث تشكيل الجلطات داخل كوب TEG مع إضافة جميع مكونات التخثر إلى الكأس قبل بدء الفحص. الكأس، مع جلطة متطورة، يدور جسديا ضد دبوس الذي يتم إدراجه في مركزه وجهاز استشعار التواء الكهروميكانيكية يقيس قوة اللزوجة المتزايدة من جلطة. ويتم هذا الفحص عادة في درجة الحرارة الفسيولوجية من 37 درجة مئوية; ومع ذلك، يمكن ضبط درجة الحرارة يدويا على الصك. السعة القصوى (MA) ، ومعدل التفاعل (R) ، ووقت الحركة (K) ، وα - زاوية (زاوية) ، والوقت إلى أقصى سعة (TMA) يتم استخراجها من قبل برنامج TEG من تتبع TEG الديناميكي. وعادة ما تقارن هذه القيم مع النطاقات السريرية الطبيعية لتقييم حالة تخثر المريض. في حين TEG ليست على وجه التحديد فيزيتروم، كما أنها تقيس قوة جلطة في وحدات ملليمتر، فإنه لا توفر البيانات الهامة جلطة فيزيلاستيك ووظائف كأداة قيمة صنع القرار السريري للأطباء لاتخاذ قرار لإدارة منتجات الدم محددة وضبط الجرعات العلاجية13. عندما يتم استخدام كل من TEG وتكديرية مع بعضها البعض، فإنها توفر معلومات تكميلية توصيف جلطة وقوة جلطة ويتم استخراجها بسهولة من TEG وسمك الألياف الفيبرين يمكن الوصول إليها عن طريق قياسات التعكر البصرية.
كما الفيبرين هو عنصر حاسم في تجلط الدم, توصيف تجلط فيبرين في ظل ظروف تشكيل جلطة متنوعة يمكن أن توفر رؤية قيمة في كيفية متغير معين يساهم في عملية تشكيل جلطة والخصائص النهائية جلطة. يمكن أن يوفر فهم هذا التوجيه لتشخيص الخثار وتطوير العلاجات. للحصول على توصيف جلطة الفيبرين أكثر تمثيلا، يمكن استبدال البلازما لرصد تشكيل جلطة كما يشبه في ظروف تخثر الجسم الحي بشكل أوثق من نظام نموذج الفبرينوجين / ثرومبين مبسطة. ومع ذلك ، نظرًا للطبيعة المعقدة لسلسلة التخثر ، فإن تشكيل الجلطات باستخدام البلازما يزيد من تعقيدها ، مما يجعل من الصعب عزل تأثير العوامل الفردية. استخدام نموذج مبسطة الفيبرينوجين / ثرومبين يمنع الحاجة إلى بدء تتالي تخثر كامل مما يسمح لعزل الخطوة النهائية تشكيل الفيبرين. من خلال تضمين اثنين من مكونات تشكيل الفيبرين الرئيسية (الفيبرينوجين والثرومبين)، هذا الإعداد يخلق حالة تكوين جلطة تسيطر عليها للغاية. من المهم أيضا أن نلاحظ أنه في حين يتم استخدام نموذج الجلطة المبسطة هنا، يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لتوصيف الجلطات أكثر تعقيدا من خلال تضمين عوامل تخثر إضافية. في هذه الدراسة، يتم تنفيذ توصيف تجلط الفيبرين باستخدام العكرة و TEG من قبل تركيزات مختلفة من الفيبرينوجين والثرودة، والقوة الأيونية، والدرجات والدرجات الرئوية، وتركيز البروتين الكلي في محلول التخثر لمحاكاة مختلف في ظروف تخثر الجسم الحي14. وقد أدرجت في القسم 5 تفاصيل تتعلق بهذه الاختلافات في البروتوكول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الفوسفات المالحة العازلة (PBS)
ملاحظة: تم استخدام برنامج تلفزيوني طوال هذه الدراسة حيث أن الأقوال الموصوفة لا تتطلب إضافة الكالسيوم. من المهم أن نلاحظ أنه عند إضافة الكالسيوم، وغالبا ما تستخدم لإعادة الكالسية منتجات الدم سيتrated، وينبغي تجنب برنامج تلفزيوني كما هو معروف الكالسيوم للترسب في مخازن الفوسفات.
- جعل 0.01 م، درجة الH 7.4 PBS العازلة عن طريق خلط 137 mM كلوريد الصوديوم، 1.8 mm فوسفات البوتاسيوم أحادية الباب، 10 mM فوسفات الصوديوم ديباسيتش و 2.7 mM كلوريد البوتاسيوم في المياه DI.
- تحقق من درجة الحموضة العازلة باستخدام مسبار درجة الحموضة وضبط درجة الحموضة باستخدام هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك حسب الحاجة.
- استخدام هذا برنامج تلفزيوني لإعداد الفيبرينوجين وتخثر المقايسات (ما لم ينص على خلاف ذلك).
ملاحظة: يقترح العازلة لإعادة تكوين مسحوق الفيبرينوجين منذ إعادة الإماهة في المياه DI يمكن أن يؤدي إلى هطول الفيبرينوجين حتى عند 37 درجة مئوية.
2- تحضير وتخزين البروتينات
ملاحظة: في جميع أنحاء البروتوكول يتم إعداد تركيزات مخزون البروتين بتركيزات مختلفة للتكدر و TEG للسماح لنسبة ثابتة من الملح، DI المياه، برنامج تلفزيوني وغيرها من العوامل المتبقية في حلول التخثر النهائية.
- إعداد وتخزين الفيبرينوجين
ملاحظة: تشمل الملوثات الموجودة في الفيبرينوجين المتاح تجاريا كمية كبيرة من العامل الثالث عشر، والكميات المتبقية من عوامل التخثر الأخرى، ومخزن التخزين المؤقت والأملاح. في وجود الكالسيوم، ومن المعروف أن العامل الثالث عشر عبر شبكة تجلط الفيبرين. يساهم هذا التأثير في تشديد هيكل الجلطة وتعزيز قوة الجلطة التي تؤثر على توصيف الفيبرين. يمكن استخدام مجموعات الأنشطة المتاحة تجاريا لتحديد مستويات العامل النشط الثاني عشر. ولتقليل التغير الناجم عن العامل الثاني عشري، ينبغي تصميم التجارب مع استبعاد الكالسيوم أو ينبغي أن تدرج في هذا البروتوكول خطوات إضافية لإزالة العامل الثاني عشر. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي تقييم ملح تخزين البروتين ونوع العازلة، وإذا لزم الأمر يمكن إجراء غسيل الكلى من لنقل إلى مخزن العمل المفضل.- وزن و aliquot مسحوق الفيبرينوجين الlyophilized (البقري أو الإنسان) في أنابيب 2 مل في 20 ملغ من البروتين لكل أنبوب وتخزين aliquots في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
- السماح الفيبرينوجين aliquot للتأقلم مع RT (درجة حرارة الغرفة) لمدة 10 دقائق في يوم التجربة. إعادة تكوين الفيبرينوجين بإضافة 600 μL من برنامج تلفزيوني إلى aliquot 20 دقيقة قبل الاستخدام.
- خذ 10 ميكرولتر من الفيبرينوجين وتمييعه مع 190 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في لوحة الأشعة فوق البنفسجية شفافة 96-well أو cuvette. تحديد تركيز الفيبرينوجين عن طريق أخذ امتصاص في 280 نانومتر عن طريق مطياف تجاري وبرامجها.
- حساب تركيز الفيبرينوجين (ملغ / مل) باستخدام قانون البيرة. إعداد 12 ملغ / مل (لمعكرة المقايسات) و 3.2 ملغ / مل (لتيغ) الفيبرينوجين الأسهم الحلول عن طريق مزيد من التخفيف مع برنامج تلفزيوني (ما لم ينص على خلاف ذلك).
ملاحظة: تحديد تركيز الفيبرينوجين (ملغ / مل) بموجب قانون البيرة:
معامل الانقراض المولى: ɛ = 400 513 لترمول -1 سم-1 عند 280 نانومتر؛ طول الـ Pathlength (L)؛ عامل التخفيف (D); الوزن الجزيئي (MW) = 340،000 da. ɛ مشتق بضرب E0.1٪ = 1.51 (280 نانومتر) (معامل الانقراض، الذي قدمه المورد) مع ميغاواط.
- إعداد وتخزين الخثارة
- إعادة تشكيل ثرومبين مزيل الlyophilized (البقري أو الإنسان، 1000 يو الأسهم) في 200 ميكرولتر من المياه deionized (DI) لجعل 200 ميكرولتر من 5000 U/mL ثرومبين الأسهم الحل.
- جعل 5 ميكرولتر (20 يو / أنبوب) aliquots من الحل والحفاظ aliquots المجمدة في -20 درجة مئوية.
- ذوبان ثرومبين aliquots في RT لمدة 15 دقيقة في يوم التجربة وجعل ثرومبين حل العمل عن طريق تمييعه إلى 20 U/mL لمقايسات التعكر و 18 U/ mL لتيغ مع المياه DI (ما لم يحدد خلاف ذلك).
ملاحظة: ينبغي اتخاذ الاحتياطات للحفاظ على نشاط الانزيم الذي يمكن تحقيقه من خلال الحفاظ على الانزيمات على الجليد أثناء ذوبان الجليد واستخدامها؛ ومع ذلك، لم يلاحظ أي انخفاض في نشاط الخثارات عند استخدامها مباشرة بعد ذوبان في RT.
3- التعكر
- استخدام أي مطياف متاح تجارياً يحتوي على نطاق امتصاص يتراوح بين 350 و700 نانومتر وبرنامجاً مقابلاً لرصد عكرة الجلطة بمرور الوقت (انظر جدول المواد).
- قم بتشغيل المطياف وافتح برنامج التحليل المقابل.
- حدد لوحة 1 وفتح علامة التبويب إعدادات لوحة. انقر فوق وضع ABS و Kinetic لمراقبة قراءة امتصاص ديناميكية مع مرور الوقت.
- حدد 550 نانومتر (أو أي قيمة في نطاق 350 – 700 نانومتر) في علامة التبويب الطول الموجي وضبط إجمالي وقت التشغيل ليكون 60 دقيقة مع فاصل زمني من 30 s في علامة التبويب التوقيت. حدد الآبار ذات الأهمية للقراءة من خلال تسليط الضوء على الآبار. ضبط إعدادات أخرى إذا لزم الأمر.
ملاحظة: إن تحديد طول موجة في الطرف السفلي من النطاق (حوالي 350 نانومتر) يجلب حساسية أفضل ولكن الامتصاص قد يتجاوز أيضاً حد الكشف عن المطياف. الطول الموجي الأكثر شيوعا لقياس التعكر هو 405 نانومتر في الأدب. ومع ذلك، يستخدم هذا البروتوكول 550 نانومتر للتأكد من أن قيم التعكر الديناميكية ضمن حد الكشف عن كافة التجارب. يجب أن يكون الفاصل الزمني المحدد للقراءة قصيرًا قدر الإمكان لتحقيق أعلى مستوى من حساسية الفحص. وسيتوقف ذلك على مطياف الآبار وعدد الآبار التي تُقرأ أثناء عملية فحص معينة. - اتخاذ الأشعة فوق البنفسجية شفافة 96-جيدا لوحة. مايette 140 μL PBS في بئر التي يتم اختيارها للقراءة. إضافة وخلط 10 μL من ثرومبين (20 U/mL) في البئر.
ملاحظة: لا تستخدم لوحات فحص عالية الربط لتقليل ربط البروتين غير محدد إلى سطح البئر. وهذا يمكن أن يؤثر على تشتت البروتين في المحلل ويؤدي إلى تباين عالية في التشايس. - بدء تخثر فورا عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من الفيبرينوجين (12 ملغ / مل) في البئر للحصول على 200 μL تخثر الحل مع تركيز النهائي من 3 ملغ / مل الفيبرينوجين و 1 U / مل ثرومبين. خلط محتويات في البئر عن طريق pipetting صعودا وهبوطا خمس مرات مع الحرص على تجنب خلق فقاعات في الحل لأنها سوف تؤثر على امتصاص عن طريق تشتت الضوء.
ملاحظة: استخدم ماصة متعددة القنوات عند تشغيل عينات جلطة متعددة على نفس اللوحة في نفس الوقت. سجل فروق التوقيت عبر الآبار والفترة الزمنية السابقة للقراءة الأولى من قبل الصك لتعويض أوقات التخثر. - ضع لوحة 96-well في حامل وانقر فوق ابدأ في البرنامج لبدء قراءة التعكر في RT.
ملاحظة: إذا كان تنفيذ المقايسة في درجة حرارة مرتفعة ثم يجب الحفاظ على مطياف، لوحة، والكواشف جميع في درجة الحرارة المطلوبة قبل بدء جلطة. - بعد الانتهاء، استرداد بيانات التعكر والحصول على منحنى تتبع التعكر عن طريق رسم تغيير الامتصاص مع مرور الوقت في برنامج تآمر.
- اشتقاق Turbماكس (التعكر الأقصى يدل على سمك الألياف الفيبرين وكثافة شبكة الفيبرين) عن طريق اتخاذ أقصى قيمة امتصاص للمنحنى مع مرور الوقت.
ملاحظة: يمكن حساب نسبة كتلة الألياف الفيبرينية/الطولية من قيم التعكر باستخدام المعادلة الواردة في المخطوطة التالية8. - حساب 90% التعكر الأقصى بضرب TurbMax بنسبة 90%. اشتقاقوقت Turb عن طريق حساب الوقت من بدء تجلط إلى 90٪ التعكر الأقصى.
ملاحظة: الوقت إلى 90% التعكر الأقصى هو مقياس أكثر موثوقية من الوقت إلى التعكر الأقصى المطلق لأنه يمثل أفضل وقت جلطة من خلال القضاء على فترة تكوين الجلطة النهائية متغير للغاية. معلمات تخثر إضافية مثل تخثر الوقت (الوقت من بداية الاختبار إلى عندما يبدأ الامتصاص في الزيادة)، ومعدل تشكيل الجلطة (Vmax، أكبر منحدر من المنطقة الخطية في منحنى تتبع التعكر) يمكن أيضا استخراج من تتبع التعكر.
4. تخثر الدم (TEG)
- بدوره على محلل الجلطات وانتظر درجة الحرارة لتستقر عند 37 درجة مئوية.
- فتح TEG - البرمجيات. بمجرد تسجيل الدخول، قم بإنشاء اسم تجربة تحت قسم المعرف.
- إجراء اختبار إلكتروني لجميع القنوات باتباع المطالبات التي تظهر على الشاشة. ضع الرافعة مرة أخرى إلى موضع التحميل بمجرد اكتمال جميع الشيكات.
ملاحظة: مطلوب اختبار E-TEG وينبغي إجراؤه في كل مرة عند استخدام الأداة. مطلوب TEG التحكم في التخثر اختبار (باستخدام TEG المستوى 1 والمستوى 2 الضوابط) في الفواصل العادية المقترحة الشركة المصنعة عند استخدامها للعينات السريرية. - انقر فوق علامة التبويب TEG، إدخال معلومات عينة للقنوات التي سيتم استخدامها. ضع كوب TEG غير المصقول في قناته المقابلة. حرك الناقل إلى الأعلى واضغط على الجزء السفلي من الكوب 5 مرات للصق الدبوس على قضيب الالتواء. خفض الناقل واضغط على كوب إلى أسفل في قاعدة الناقل حتى أنه "النقرات".
- Pipette 20 μL من محلول الخثار (18 U/mL) في كأس TEG. بدء تخثر فورا عن طريق إضافة 340 ميكرولتر من الفيبرينوجين (3.2 ملغ / مل) في كأس TEG للحصول على 360 ميكرولتر حل مع تركيز النهائي من 3 ملغ / مل الفيبرينوجين و 1 U / مل ثرومبين في الكأس. خلط محتويات عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا خمس مرات.
ملاحظة: يجب إضافة عوامل التخثر المحتملة أو غيرها من مكونات الاهتمام أثناء هذه الخطوة مع الحرص على الحفاظ دائمًا على حجم نهائي 360 ميكرولتر في كوب TEG. - حرك حامل الكوب المحملة لأعلى، حرك الرافعة إلى موضع القراءة وانقر فوق ابدأ في البرنامج لبدء قراءة TEG.
- بمجرد الانتهاء من TEG (بعد حوالي ساعة) ، واسترداد المعلمات TEG والحصول على منحنى تتبع TEG عن طريق رسم السعة على مر الزمن في برنامج رسم.
- جمع MA كماماكس TEG (الحد الأقصى من السعة يدل على قوة جلطة) و TMA كماTEG الوقت (الوقت إلى أقصى سعة) من البرنامج.
ملاحظة: يتم حساب MA بواسطة البرنامج على أنه السعة القصوى في الوقت الذي يكون فيه السعة أقل من انحراف 5٪ على مدى فترة 3 دقيقة من الوقت. يتم تحديد TMA على أنه الوقت من معدل توليد الخثرة الأقصى (بالقرب من نقطة الانقسام) إلى MA. قد تكون المعلمات الأخرى مفيدة أيضًا في تقييمها عند إجراء تحليل الجلطة. بعض الأمثلة على هذه المعلمات تشمل: R-time (الوقت من بداية الاختبار إلى عندما تصل السعة 2 مم)، K (الوقت من نهاية R إلى عندما تصل السعة إلى 20 مم)، ألفا (منحدر الخط بين R و K)، وCLT (زمن تجلط).
5. فيبرين التوصيف في ظل ظروف تخثر مختلفة
ملاحظة: إجراء تجارب توصيف الفيبرين عن طريق تحوير متغير محدد في حلول التخثر مثل: تركيزات الفيبرينوجين والثرودبين، والقوة الأيونية، والثَكَرَ، وتركيزات البروتين الكلي. ويرد في هذا القسم وصف للمستحضرات التجريبية التي تتضمن هذه المتغيرات التي يمكن أن تكون مثالاً؛ ومع ذلك، يمكن استبدال عوامل تخثر أخرى وشروط الفائدة كذلك. اختر بعناية نظام عازل مناسب مع الأخذ بعين الاعتبار كل متطلبات فحص فريدة من نوعها. بالنسبة إلى التعكر و المعايرات TEG، قم بتضمين التحكم في المخزن المؤقت فقط لضمان طرح دقيق للخلفية أثناء تحليل تأثير هذه المتغيرات.
- تركيز الفيبرينوجين متفاوت (1، 2، 3، 4، 5 ملغ/مل)
- اضبط الخطوة 2.1.4 لإعداد مخزون الفيبرينوجين بتركيزات مختلفة (4، 8، 12، 16، 20 ملغ/مل لمعاينات التعكر و1.1، 2.1، 3.2، 4.2، 5.3 ملغ/مل لـ TEG).
- ضبط الخطوة 3.6 إلى "إضافة 50 ميكرولتر الفيبرينوجين (4, 8, 12, 16, 20 ملغ /مل) في آبار متعددة من 96 جيدا لوحة" لمعادلات التعكر.
- ضبط الخطوة 4.5 إلى "إضافة 340 ميكرولتر الفيبرينوجين (1.1, 2.1, 3.2, 4.2, 5.3 ملغ / مل) في أكواب TEG واضحة" لـ TEG.
- تركيز ثرومبين متفاوت (0.1، 0.3، 0.6، 0.8، 1، 2.5، 5، 10 U/mL)
- ضبط الخطوة 2.2.3 لإعداد مخزون الخثارات بتركيزات مختلفة (2، 6، 12، 16، 20، 50، 100، 200 U/mL لم مقايسات التعكر و 1.8، 5.4، 10.8، 14.4، 18، 45، 90، 180 U/mL لـ TEG).
- ضبط الخطوة 3.5 إلى "إضافة 10 μL ثرومبين (2، 6، 12، 16، 20، 50، 100، 200 U/mL) في آبار متعددة من 96 جيدا لوحة" لمقايسات التعكر.
- ضبط الخطوة 4.5 إلى "ماص 20 μL ثرومبين (1.8، 5.4، 10.8، 14.4، 18، 45، 90، 180 U/mL) في أكواب TEG واضحة" لـ TEG.
- قوة الأيونية المختلفة (0.05، 0.13، 0.14، 0.15، 0.16، 0.17 و 0.3 م)
- حل كلوريد الصوديوم (21، 101، 111، 121، 131، 141، و 271 م م) جنبا إلى جنب مع 1.8 mm فوسفات البوتاسيوم أحادية الباب، 10 mM فوسفات الصوديوم ديباسيتش و 2.7 mM كلوريد البوتاسيوم في المياه DI لجعل 0.01 M PBS الحلول مع نقاط قوة الإيمونية متفاوتة.
- ضبط الخطوة 1.3 لاستخدام برنامج تلفزيوني المحرز في نقاط القوة الأيونية المختلفة لإعداد الفيبرينوجين وحلول تخثر لكل من التعكر و TEG المقايسات.
- متغيّر للرِكَم الهَوَيّة (5.8، 6.6، 7.3، 7.4، 7.5، 8.0)
- حل فوسفات الصوديوم ديباسيتش (0.7، 3.2، 7.7، 8.1، 8.4، 9.5 م) وفوسفات البوتاسيوم أحادية الباسي (8.2، 6.0، 2.0، 1.7، 1.4، 0.5 م م) جنبا إلى جنب مع 2.7 mM كلوريد البوتاسيوم وكلوريد الصوديوم (153، 147، 138، 137، 136، 134 م) لجعل 0.01 M برنامج تلفزيوني الحلول مع درجة PH متفاوتة وقوة الأيونية النهائية في 0.165 M.
- تحقق من قيمة درجة الـ PH عن طريق مسبار درجة PH، ثم قم بضبط درجة اله PH عند الحاجة.
- ضبط الخطوة 1.3 لاستخدام برنامج تلفزيوني المحرز في درجة PH مختلفة لإعداد الفيبرينوجين وتخثر حل لكل من التعكر و TEG المقايسات.
- اختلاف تركيز الألبومات (0، 20، 40، 50، 60، 80، 100 ملغ/مل)
- حل 2 غرام من الزى الألبومين في 500 μL من برنامج تلفزيوني في RT لمدة 20 دقيقة في يوم التجربة.
- تحديد تركيز الألبومات باستخدام نفس الإجراء المذكور في الخطوة 2.1.3 و 2.1.4 مع معامل انقراض العث من 43,800 مولL −1 سم−1 (في 280 نانومتر) لألبولين.
- إعداد الزلال في الأسهم بتركيزات مختلفة.
- ضبط الخطوة 3.5 إلى "ماصة 40 ميكرولتر برنامج تلفزيوني في بئر التي يتم تحديدها للقراءة وإضافة 10 μL ثرومبين (20 U/mL)". ضبط الخطوة 3.6 إلى "بدء تخثر فورا عن طريق إضافة 50 ميكرولتر الفيبرينوجين (12 ملغ / مل) مع 100 μL الألبومين (0، 40، 80، 100، 120، 160، 200 ملغ/مل) في آبار متعددة إلى تركيز نهائي من 3 ملغ/مل فيبرينوجين، 1 U/mL ثرومبين و0، 20، 40، 50، 60، 80، 100 ملغم/مل الألبومين في الآبار.
- ضبط الخطوة 4.5 إلى "بدء التخثر على الفور عن طريق إضافة خليط من 200 ميكرولتر الألبومين (36، 72، 90، 108، 144، 180 ملغم/مل) و140 ميكرولتر 7.7 ملغ/مل فيبينوجين في أكواب تي جي للحصول على محلول تخثر 360 ميكرولتر مع تركيز نهائي من 3 ملغم/مل فيبرينوجين، 1 U/mL ثرومبين و0، 20، 40، 50، 60، 80، 100 ملغ/مل الألبومين في أكواب TEG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التجارب الموضحة في الشكل 1 هي منحنيات تتبع التعكر التمثيلية لجلطات الـ فيبرين الإنسان والسفينية على مستويات مختلفة من الفيبرينوجين. تظهر منحنيات التتبع التمثيلي TEG لتشكيل جلطة الفيبرين على مستويات مختلفة من الفيبرينوجين في الشكل 2. كل من منحنيات التتبع تثبت أنه بعد فترة تأخر بعد بدء الجلطة، تجلط أو زيادة سعة الجلطة مع مرور الوقت ومستويات قبالة في نهاية تشكيل جلطة. يتم استخدام قيمة نقطة النهاية لتكوين الجلطة الأقصى والوقت الذي يتم فيه تكوين الجلطة الأقصى من كل مقايسة لتقييم ملامح جلطة مشكلة تمامًا وعملية التخثر الشاملة. التعكر الأقصى (TurbMax)والوقت إلى التعكر الأقصى(زمنالتورب) هما المعلمتان المشتقتان من التعكر بينما يتم اشتقاق السعة القصوى (TEGMax)والوقت إلى أقصى سعة(TEG Time)من TEG.
بالإضافة إلى ذلك، Turbماكس هو مقياس بصري لهيكل جلطة الذي يدل على سمك الألياف الفيبرين وكثافة شبكة الفيبرين. TEGMax هو مقياس ميكانيكي يعكس قوة الجلطة المطلقة. أنها تمثل جوانب مختلفة من جلطة التي يمكن أن تتغير مستقلة عن بعضها البعض على أساس النتائج السابقة لدينا14. معا، فإن القيمتين توفران رؤية تكميلية حول البنى المجهرية الجلطة، مثل مدى كثافة الألياف في شبكة الفيبرين. لنرى بوضوح كيف يؤثر تعديل متغير التخثر على النتائج، تم تنظيم البيانات وتقديمها باستخدام مخططات الاتجاه. وترد أمثلة تمثيلية لكل من اتجاهات بيانات التعكر و TEG في الشكل 3. على مستوى أعلى من الفيبرينوجين في حل التخثر، جميع القيم الأربعة(Turb ماكس،TEG ماكس،تورب الوقت وTEG الوقت)زيادة. من هذه النتائج، يمكن تفسير أن أعلى مستوى الركيزة الفيبرينوجين النتائج في شبكة ليفية أكثر كثافة الحد من انتقال الضوء من خلال جلطة (أكبر Turbماكس). هذه الشبكة تشديد يعزز أيضا قوة جلطة (أكبر TEGماكس). إن التهطال في كل منوقت Turb وTEG الوقت يشير إلى أن البلمرة الفيبرين يعوق في زيادة مستويات الفيبرينوجين. تظهر اتجاهات TurbMax و TEGMax للمتغيرات التي اختبرتها مجموعتنا وتفسيراتها في الجدول 1.
الشكل 1: أمثلة تمثيلية من منحنى تتبع التعكرة جلطة (0 إلى 30 دقيقة). تتبع التعكر من الأبقار (A) والإنسان (ب) تشكيل الفيبرين مع مرور الوقت في تركيزات مختلفة من الفيبرينوجين (1، 2، 3، 4، 5 ملغ /مل) مع 1 U/mL الأنواع مطابقة ثرومبين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: أمثلة تمثيلية من منحنى تتبع TEG (0 إلى 30 دقيقة). تيغر اتساع تتبعات من الأبقار (A) والإنسان (B) تشكيل الفيبرين مع مرور الوقت في تركيزات مختلفة الفيبرينوجين (1، 2، 3، 4، 5 ملغ / مل) مع 1 U / مل الأنواع مطابقة ثرومبين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: أمثلة تمثيلية عن اتجاهات بيانات التعكر و TEG. اتجاهات البيانات من Turbماكس وتورب الوقت (A) واتجاهات TEGMax و TEGTime (B) لتركيزات مختلفة من الأبقار أو الفيبرينوجين البشري (1، 2، 3، 4، 5 ملغ/مل) مع أنواع 1U/mL مطابقة ثرومبين. جميع نقاط البيانات وأشرطة الخطأ هي متوسطات وانحرافات معيارية للـ (عكرة) ومكررات (TEG). وقد أعيد استخدام هذا الرقم من [تسنغ، 2020]14. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| المتغيرات | نتائج الاتجاه | تفسيرات |
| زيادة مستوى الفيبرينوجين | زيادة توربوماكس و TEGماكس | تشكيل ألياف الألياف الليفية أكثر إحكاما وشبكة الليفية أكثر كثافة |
| زيادة مستوى الخثرة، درجة الH وقوة الأيونية | انخفض Turbماكس، زيادة TEGماكس | تشكيل ألياف الفيبرين أرق وأكثر إحكاما |
| زيادة مستوى الألبومات | زيادة Turbماكس، انخفض TEGماكس | تشكيل ألياف الفيبرين سمكا وأكثر مرونة |
الجدول 1: نتائج وتفسيرات "تربماكس" و"TEGMax".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوضح هذا البروتوكول استخدام أداتين توصيفي جلطات مميزة اختبار نموذج مبسط لتخثر الفيبرينوجين/الجلطات باستخدام المكونات المتاحة تجارياً. كل من TEG وتكدر من السهل إجراء. أنها لا توفر فقط فحص نقطة النهاية جلطة مثل تشكيل الحد الأقصى جلطة (ماكسTurb و TEGماكس)وأوقات تشكيل جلطة(وقت Turb والوقتTEG)ولكن أيضا تقييم عملية تشكيل جلطة ديناميكية. وهذا يجعل TEG والعكارة أدوات قيمة لتوصيف جلطة لإضافة إلى طرق بديلة مثل: SEM، PT، aPTT، أو جلطة الريولوجيا، والتي يمكن أن يكون إجراءات تجريبية معقدة أو التركيز فقط على اختبار جانب جلطة واحدة. كما تقدم العكر ونتائج TEG معاً صورة أكثر اكتمالاً عن كيفية تأثير متغير التخثر على خصائص الجلطة.
بالإضافة إلى متغيرات التخثر المفصلة في هذا البروتوكول، هناك العديد من المتغيرات الأخرى التي يمكن دراستها من خلال الاستفادة من هذه التقنيات. يمكن تعديل هذا البروتوكول عن طريق تعديل: درجة الحرارة، ومستويات الكالسيوم، ومستويات عامل التخثر، وإضافة المنشطات أو مثبطات جلطة، أو إضافة وكلاء الأدوية، على سبيل المثال لا الحصر. ويمكن دراسة هذه المتغيرات باستخدام كل من نظام نموذج الفبرينوجين / ثرومبين المبسطة أو باستخدام البلازما. دراسة عوامل التخثر يتطلب دراسة متأنية والإعداد يجري التأكد من توفير المناسبة تنشيط تجلط المنبع بدء مسار التخثر. والعكر و TEG هي أيضا أدوات فعالة تستخدم لمراقبة هضم الجلطة. يمكن تعديل البروتوكول لتوصيف تشكيل جلطة الفيبرين والتحلل في وجود مضادات التخثر أو العوامل الخثارية. من المهم أن نلاحظ أنه يجب إضافة العامل العلاجي قبل بدء الجلطة عند استخدام TEG حيث يتم إغلاق نظام التخثر وظيفيًا عندما يكون الجهاز قيد التشغيل مع دبوس يجلس في كأس اختبار TEG. مع ذلك، TEG غير قادر على أن تستخدم لاختبار الملف الوصفي العلاجي لعامل الجلطات في جلطة موجودة.
وفي هذا البروتوكول، أجريت كل من المقايستين في ظل ظروفهما التجريبية المستخدمة عادة. يتم تنفيذ TEG عادة في 37 درجة مئوية ويتم إجراء مقايسات التعكر في درجة حرارة الغرفة (RT). التركيز على هذا الأسلوب توصيف هو تحديد وتفسير نتائج الاتجاه أن متغير معين لديه على التخثر. الأهم من ذلك، التحكم في درجة الحرارة باستخدام TEG مباشرة كما هي الأنابيب الكواشف مباشرة في درجة حرارة التحكم في كأس TEG. التحكم في درجة الحرارة في محك العكر أقل مباشرة كما يتم خلط الكواشف التخثر والشروع في لوحة جيدة قبل أن توضع داخل مطياف ساخنة. يمكن أن يكون من الصعب معدل وجود محلول التخثر والتخثر الدافئ داخل الغرفة بالنسبة لمعدل تكوين الجلطات والحفاظ على جميع الكواشف واللوحة عند درجة حرارة مرتفعة قبل وضعها في الغرفة الساخنة ، وغالباً ما يؤدي إلى سوء التكاثر. الحفاظ على درجة حرارة ثابتة بخلاف درجة حرارة الغرفة لمقايس التعكر هو أكثر تعقيدا عند تعدد عبر العديد من الآبار. خطوة أخرى حاسمة لضمان نتيجة التعكر موثوقة وقابلة للتكرار هي خلط البئر لبدء التخثر. كما مباشرة ثرومبين-الفيبرينوجين الانقسام سريع, خلط البئر قبل بدء تجلط يمكن التحايل على تشكيل الفيبرين غير موحدة.
ويمكن أيضا تعديل هذا البروتوكول بسهولة لتوصيف جلطة شكلتها العينات السريرية مثل البلازما الغنية بالصفائح الدموية أو البلازما الصفيحات الفقيرة. ويوصى سحب الدم سيتد كما تم التحقق من صحة سابقا من قبل بروتوكولات TEG القياسية. يمكن فصل البلازما الغنية بالصفائح الدموية وطبقية الصفيحات الفقيرة من الدم الكامل المصاقل عن طريق الطرد المركزي في 200 وأكثر من 2000 × ز لمدة 15 دقيقة في RT ، على التوالي. في حالات التعكر أو التشايس، يمكن البدء في الجلطات مع إضافة كلوريد الكالسيوم الزائد (11 mM). ومع ذلك، منذ الفوسفات يمكن ربط الكالسيوم مما أدى إلى هطول الأمطار، يجب تجنب برنامج تلفزيوني عند استخدام الكالسيوم كما مبادر جلطة. عند دراسة تشكيل جلطة البلازما الغنية بالصفائح الدموية، من المهم النظر في تسوية الصفائح الدموية كمربك كبير عند تشغيل مقايسات تشكيل جلطة في ظل الظروف التي تشكيل جلطة بطيئة. القضايا المتعلقة تسوية الصفائح الدموية هي أقل تأثيرا عندما تشكيل تجلط سريع. وهذا مهم بشكل خاص بالنسبة للمكاشفات العكرة حيث تعتمد دقة الفحص وقابلية التكاثر إلى حد كبير على تجانس الكواشف في البئر. إذا سمح التصميم التجريبي، يمكن استخدام الكاولين (غالباً ما يستخدم كمبادر جلطة لـ TEG) أو غيرها من المنشطات الجسيمات المشحونة سلباً لتسريع بدء جلطة البلازما من خلال توفير مساحة سطحية إضافية لتنشيط مسار الاتصال السريع لسلسلة التخثر. الأهم من ذلك، يجب أن تكون مختلطة مع تعليق المنشط تماما مع حلول تخثر لتجنب تسوية. عند استخدام مساحة سطحية أو الجسيمات المشحونة على أساس تخثر المنشط ضمان أن الضوابط الأساسية اللازمة تؤخذ في الاعتبار كما الكواشف نفسها قد تسهم في السلب و البراعة في المقايسات العكرة. بالإضافة إلى ذلك، قد يكون الاستقرار مشكلة مع إضافات أكبر على أساس الجسيمات مثل الكاولين.
وينبغي معالجة عينات الدم كله بعناية عند النظر في استخدام المقايسات التعكر منذ خلايا الدم الحمراء تسهم بشكل كبير في امتصاص في الطول الموجي العكر القياسية. لهذا السبب، قياس الدم كله عن طريق التعكر غالبا ما يتجاوز حد الكشف عن معظم الطيف وعادة ما يكون غير ممكن. قد تكون الطرق البديلة لتوصيف الدم كله ضرورية أو التخفيف قبل تشغيل الأقوال العكرة على عينات الدم التي تحتوي على خلايا الدم الحمراء هو أيضا ممكن. TEG والعكر، عند استخدامها معا، وتوفير لتشكيل تجلط شامل والهضم توصيف من خلال الجمع بين قياسات متميزة لقوة جلطة والألياف الفيبرين / مورفولوجيا شبكة لكل من درجة عالية من التحكم في الحد الأدنى من البروتين تخثر المقاييس وعينات البلازما السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
اي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Albumin from human serum | Millipore Sigma | A1653 | ≥96%, lyophilized powder |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | ≥96%, lyophilized powder |
| Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear) | Haemonetics | REF 6211 | |
| Fibrinogen, Bovine Plasma | Millipore Sigma | 341573 | contains more than 95% clottable protein |
| Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma | Millipore Sigma | 341578 | Contains ≥ 95% clottable proteins. |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | 60130 | ≥99.5% purity |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P9791 | ≥98% purity |
| SevenEasy pH Meter | Mettler Toledo | S20 | |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | 71378 | ≥99.5% purity |
| Sodium phosphate dibasic | Millipore Sigma | 71636 | ≥99.5% purity |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system | Molecular Devices | M5 | |
| TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system | Haemonetics | 07-022 | |
| Thrombin, Bovine | Millipore Sigma | 605157 | |
| Thrombin, Human Plasma, High Activity | Millipore Sigma | 605195 |
References
- Beckman, M. G., Hooper, W. C., Critchley, S. E., Ortel, T. L. Venous Thromboembolism. A Public Health Concern. American Journal of Preventive Medicine. 38, 4 Suppl 495-501 (2010).
- Goldhaber, S. Z., Bounameaux, H. Pulmonary embolism and deep vein thrombosis. The Lancet. 379 (9828), 1835-1846 (2012).
- Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Mechanisms of fibrin polymerization and clinical implications. Blood. 121 (10), 1712-1719 (2013).
- Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50 (6), 1079-1093 (1986).
- Tripathi, M. M., et al. Clinical evaluation of whole blood prothrombin time (PT) and international normalized ratio (INR) using a Laser Speckle Rheology sensor. Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).
- Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L.
- Carr, M. E., Hermans, J. Size and Density of Fibrin Fibers from Turbidity. Macromolecules. 11 (1), 46-50 (1978).
- Carr, M. E., Shen, L. L., Hermans, J. A. N., Chapel, H. Mass-Length Ratio of Fibrin Fibers from Gel Permeation and Light Scattering. 16, 1-15 (1977).
- Gabriel, D. A., Muga, K., Boothroyd, E. M. The Effect of Fibrin Structure on Fibrinolysis. , 24259-24263 (1992).
- Wolberg, A. S., Gabriel, D. A., Hoffman, M. Analyzing fibrin clot structure using a microplate reader. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 13 (6), 533-539 (2002).
- da Luz, L. T., Nascimento, B., Rizoli, S. Thrombelastography (TEG): practical considerations on its clinical use in trauma resuscitation. Scandinavian Journal of Trauma, Resuscitation and Emergency Medicine. 21 (1), 29 (2013).
- Whitten, C. W., Greilich, P. E. Thromboelastography: past, present, and future . Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 92 (5), 1223-1225 (2000).
- Ranucci, M., Laddomada, T., Ranucci, M., Baryshnikova, E. Blood viscosity during coagulation at different shear rates. Physiological Reports. 2 (7), 1-7 (2014).
- Zeng, Z., Fagnon, M., Nallan Chakravarthula, T., Alves, N. J. Fibrin clot formation under diverse clotting conditions: Comparing turbidimetry and thromboelastography. Thrombosis Research. 187, 48-55 (2020).
