Summary
피브린은 혈전증과 혈전증 중 응고 형성에 책임이 있습니다. 탁도 검사 및 혈전(TEG)은 응고의 보완적인 평가를 제공하는 시너지 도구로 활용할 수 있다. 이 두 가지 기술은 응고 조건이 피브린 응고 형성에 미치는 영향에 대한 더 많은 통찰력을 줄 수 있습니다.
Abstract
혈전증은 전 세계적으로 주요 사망 원인입니다. 피브린(ogen)은 혈전 형성 또는 혈전증을 주로 담당하는 단백질입니다. 따라서, 피브린 응고 형성을 특성화하는 것은 혈전증의 연구에 유익하다. 탁도 및 혈전 세포법(TEG)은 모두 혈전 형성을 모니터링하기 위한 시험관 내 실험에서 널리 활용된다. 탁도는 분광계를 통해 피브린 응고 구조를 통해 광 투과를 동적으로 측정하며 종종 연구 실험실에서 사용됩니다. TEG는 혈전 강도를 직접 측정하고 주로 환자의 hemostasis를 평가하기 위해 임상 설정에서 활용되는 전문 점탄성 기술입니다. 이 두 가지 도구의 도움으로, 이 연구는 단순화 된 피브리노겐 / 트롬빈 응고 모델을 사용하여 체외 피브린 응고를 특성화하는 방법을 설명합니다. 두 기술의 데이터 추세는 다양한 응고 조건에서 비교되었습니다. 인간과 소 피브린 혈전은 소 응고 요인이 종종 임상 및 연구 설정에 있는 인간 응고 요인에 대용품으로 이용되기 때문에 이 연구에서 나란히 형성되었습니다. 결과는 TEG와 탁도트랙 응고형성이 두 가지 방법을 통해, 함께 활용될 때 다양한 응고 조건에 걸쳐 보완적인 응고 강도와 섬유 구조 정보를 제공한다는 것을 보여줍니다.
Introduction
혈전증은 전 세계적으로 높은 이환율과 사망률로 이어지는 혈액 순환을 차단하는 신체의 혈전의 병리학적 형성입니다. 정맥 혈전 색전증의 1-2 케이스 및 1000명 당 혈전증 유도 혈관 질환의 2 ~3 의 경우 매년1,,2가있습니다. 여기에 제시된 혈전 성형술(TEG) 및 탁도를 활용하여 다양한 응고 조건하에서 응고 형성을 모니터링하는 방법이 있다. 피브린 (ogen)은 신체의 혈전 형성을 담당하는 1 차 단백질입니다. 응고 폭포의 마지막 단계에서, 혈전이 진행됨에 따라 불용성 피브린 단량제의 중합화를 시화하는 혈전에 의해 피브리노펩티드는 피브리노겐으로부터 갈라지며3,,4. 병리학 적 혈전증의 혈전 형성을 이해하려면 다양한 응고 상황에서 피브린 형성을 특성화해야합니다. 여러 응고 모니터링 실험체는 시험관내에서 피브린 응고 형성을 연구하기 위해 활용되었습니다. 프로트롬빈 시간 (PT/INR) 및 활성화 된 부분 혈소 세포 세포 세포 (aPTT)는 특정 응고 경로의 무결성을 측정하는 두 가지 일반적인 임상 적 소이다. 그러나 시간을 물리적 응고 속성5의표시를 제공하지 않는 유일한 변수로 사용합니다. 전자 현미경 검사는 완전히 형성된 피브린 응고의 미세 구조의 시각화를 허용하지만 응고 형성 공정 자체에 대한 정보를 제공하지않습니다 6. 모든 애세 중, 탁도 에세이 및 TEG는 시간이 지남에 따라 동적으로 응고 특성을 추적 할 수있는 기능을 제공합니다. 이러한 기술은 포괄적인 응고 프로파일을 측정할 수 있으므로 다른 피브린 응고 특성화 도구에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다.
특히, 탁도 분석(또는 응고 석탁법)은 단순한 구현과 연구 실험실에서 분광기의 광범위한 접근성으로 인해 연구 및 임상 응용에 널리 사용됩니다. 이 분석법은 정의된 파장에서 개별 반복 판독값을 취하여 성형 응고를 통해 광 투과감을 역동적으로 측정할 수 있게 한다(가장 일반적으로 350 ~700nm 범위의 파장에서)7. 판독 챔버의 온도도 조절될 수 있다. 피브린 젤이 형성됨에 따라 단백질 네트워크를 통과하는 빛의 양이 감소되어 시간이 지남에 따라 흡수도가 증가합니다. 마찬가지로 응고 네트워크가 저하되면 흡광도가 줄어듭니다. 탁도 검사는 멀티플럭스화할 수 있으며 멀티플렉션을 사용하여 멀티플렉션하여 96-384웰 플레이트 모두에서 높은 처리량 샘플 스크리닝을 할 수 있습니다. 여러 응고 특성은 최대 탁도, 최대 탁도시간, 응고 개시 시간 및 응고 형성 속도(Vmax)를 포함하는 탁도 추적 곡선(시간 측정에 따른 흡광도)에서 파생될 수 있습니다. 피브린 섬유 질량/길이 비율은 또한 피브린 섬유 두께8,,9,,10을추정하기 위해 원시 탁도 데이터로부터 도출될 수 있다.
TEG는 주로 환자의 혈전 및 혈전 용해를 평가하기 위해 임상 환경에서 활용됩니다. 또한 일반적으로 항 섬유성 용해성 약물 또는 혈전성 혈액 제품이11,,12를투여해야 하는지 결정하기 위해 외과 응용 분야에서 일반적으로 사용된다. 혈전 형성은 분석이 시작되기 전에 컵에 추가되는 모든 응고 성분과 TEG 컵 내부에서 발생합니다. 진화하는 응고를 가진 컵은 중앙에 삽입되는 핀을 물리적으로 회전시키고 전기 기계 적 비틀림 센서는 응고의 증가점탄성 강도를 측정합니다. 이 분석은 전형적으로 37°C의 생리학적 온도에서 수행됩니다. 그러나 기기에서 온도를 수동으로 조정할 수 있습니다. 최대 진폭(MA), 반응 속도(R), 운동 시간(K), α-angle(Angle), 및 최대 진폭(TMA)까지의 시간은 동적 TEG 추적으로부터 TEG 소프트웨어에 의해 추출된다. 이 값은 전형적으로 환자의 응고 상태를 평가하기 위하여 임상 정상 범위와 비교됩니다. TEG는 정확하게 비스코머는 아니지만 밀리미터 단위로 응고 강도를 측정하기 때문에 의사가 특정 혈액 제품을 투여하고 치료 투여13을조정하기로 결정하는 귀중한 임상 의사 결정 도구로 중요한 점탄성 응고 데이터 및 기능을 제공합니다. TEG와 탁도 분석이 모두 함께 활용될 때, 응고 강도와 운동학이 TEG에서 쉽게 추출되고 피브린 섬유 두께가 광학 탁도 측정에 의해 접근할 수 있기 때문에 보완형 응고 특성화 정보를 제공합니다.
피브린은 혈전의 중요한 구성 요소이기 때문에 다양한 응고 형성 조건 하에서 피브린 응고 특성화는 특정 변수가 혈전 형성 과정 및 궁극적 인 응고 특성에 기여하는 방법에 대한 귀중한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이를 이해하면 혈전증 진단 및 치료 개발을 위한 지침을 제공할 수 있습니다. 보다 대표적인 피브린 응고 특성화를 얻기 위해 플라즈마는 단순화된 피브리노겐/트롬빈 모델 시스템보다 생체 내 응고 조건과 유사하므로 혈전 형성을 모니터링하기 위해 대체될 수 있다. 그러나 응고 폭포의 복잡한 특성으로 인해 플라즈마를 사용하는 응고 형성이 복잡성을 추가하여 개별 요인의 영향을 격리하기가 더 어려워집니다. 단순화 된 피브리노겐 / 트롬빈 모델을 사용하면 최종 피브린 형성 단계를 격리 할 수있는 전체 응고 캐스케이드를 시작할 필요가 없습니다. 2개의 중요한 피브린 형성 성분 (fibrinogen 및 혈전증)을 포함시킴으로써, 이 설치는 고도로 통제된 응고 형성 조건을 만듭니다. 또한 단순화된 응고 모델을 여기에서 사용하는 동안 이 프로토콜을 활용하여 추가 응고 계자를 포함시켜 보다 복잡한 혈전을 특성화할 수도 있습니다. 본 연구에서는, 피브린 응고 특성화는 다양한 피브리노겐 및 트롬빈 농도, 이온 강도, pH 및 응고 용액에서 의 총 단백질 농도에 의해 수행되어 생체 내 응고 상황에서 다른모방한다(14). 프로토콜에 대한 이러한 변형에 대한 세부 사항은 섹션 5에 포함되어 있습니다.
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Protocol
1. 인산염 완충식염식염수(PBS) 제제
참고: PBS는 칼슘의 첨가를 요구하지 않았던 기술된 분석으로 이 연구 전반에 걸쳐 사용되었습니다. 칼슘을 첨가할 때, 종종 석회화 성혈액 제품을 재석량에 사용하는 경우, 칼슘이 인산염 완충액에 침전되는 것으로 알려져 있기 때문에 PBS를 피해야 합니다.
- 0.01M, pH 7.4 PBS 완충제를 137m 염화나트륨, 1.8mm 칼륨 인산염 모노베이직, 10mMM 나트륨 인산염 디베이직, 2.7mM의 염화칼륨을 DI 워터에 혼합하여 만듭니다.
- pH 프로브를 사용하여 완충pH를 확인하고 필요에 따라 수산화 나트륨 또는 염산나트륨을 사용하여 pH를 조정합니다.
- 피브리노겐 및 응고 용 색채 의 준비를 위해이 PBS를 사용합니다 (달리 명시되지 않는 한).
참고: 완충은 DI 수에서 수화하면 37°C에서도 피브리노겐 강수량을 초래할 수 있기 때문에 피브리노겐 분말을 재구성하는 것이 좋습니다.
2. 단백질의 준비 및 저장
참고: 프로토콜 전반에 걸쳐 단백질 재고 농도는 최종 응고 용액에서 염, DI 물, PBS 및 기타 잔류 인자의 일관된 비율을 허용하기 위해 탁도 및 TEG에 대한 상이한 농도로 제조됩니다.
- 피브리노겐의 준비 및 보관
참고: 시판되는 피브리노겐의 오염 물질에는 상당한 양의 인자 XIII, 다른 응고 요인, 저장 버퍼 및 염의 잔류량이 포함됩니다. 칼슘이 존재할 때, 인자 XIII는 피브린 응고 네트워크를 교차 연결하는 것으로 알려져 있다. 이 효과는 강화된 응고 구조와 향상된 응고 강도가 피브린 특성에 영향을 미치는 데 기여합니다. 시판되는 활동 키트를 사용하여 활성 인자 XIIIA 수준을 확인할 수 있습니다. 요인 XIIIa로 인한 가변성을 최소화하기 위해 칼슘을 배제하거나 추가 단계의 경우 XIIIa를 제거하는 실험을 이 프로토콜에 통합해야 합니다. 또한, 단백질 저장 염 및 완충 타입을 평가해야 하며 필요한 경우 투석이 바람직한 분석 작업 버퍼로 전송하도록 수행될 수 있다.- 튜브 당 단백질 20 mg에서 2 mL 튜브에서 2 mL 튜브에서 무게 및 알리코 리오필화 된 피브리노겐 분말 (소 또는 인간)을 최대 6 개월 동안 -20 °C에 저장합니다.
- 실험 당일 10분 동안 RT(실온)에 적응하는 피브리노겐 알리쿼트를 허용한다. 사용하기 20분 전에 ALIquot에 PBS의 600 μL을 추가하여 피브리노겐을 재구성합니다.
- 10 μL의 피브리노겐을 자외선 투명 96웰 플레이트 또는 큐벳에 190μL의 PBS로 희석하십시오. 상용 분광계와 소프트웨어를 통해 280nm에서 흡수성을 취하여 피브리노겐 농도를 결정합니다.
- 맥주의 법칙을 사용하여 피브리노겐 농도(mg/mL)를 계산합니다. PBS를 사용하여 추가 희석을 통해 12 mg/mL(탁도 표약용) 및 3.2 mg/mL(TEG용) 피브리노겐 스톡 솔루션을 PBS로 추가 희석하여 준비합니다(달리 명시되지 않는 한).
참고: 맥주법에 의한 피브리노겐 농도 결정(mg/mL) :
어금니 멸종 계수: θ = 513,400 L 몰-1cm -1 에서 280 nm; 경로 길이(L); 희석 계수(D); 분자량(MW) = 34,000 Da θ는 MW와 함께 E0.1% = 1.51 (280 nm)(멸종 계수, 공급업체에 의해 주어진 소멸 계수)을 곱하여 파생된다.
- 혈소판의 준비 및 보관
- 5000 U/mL 혈소용 용액의 200 μL을 만들기 위해 200 μL의 디온화(DI) 물 200μL에서 lyophilized 혈소(소 또는 인간, 1000 U 주식)를 재구성합니다.
- 용액의 5 μL (20 U /tube) 알리쿼트를 만들고 aliquots를 -20 °C에서 얼어 붙은 상태로 유지하십시오.
- 실험 당일 15분 동안 RT에서 트롬빈 알리코트를 해동하고, 탁도 표고용 U/mL 20개, DI 수분으로 TEG의 경우 18U/mL로 희석하여 트롬빈 작동 솔루션을 만듭니다(달리 명시되지 않는 한).
참고: 해동 및 사용 중 얼음에 효소를 유지 하 여 달성 할 수 있는 효소 활동을 유지 하기 위해 예방 조치를 취해야 한다; 그러나, RT에서 해동 후 직접 활용될 때 혈전 활성의 감소는 관찰되지 않았다.
3화 탁도
- 350-700 nm의 흡광범위와 해당 소프트웨어가 있는 시판 가능한 분광계를 사용하여 시간이 지남에 따라 응고 탁도를 모니터링합니다(재료 표참조).
- 분광기를 켜고 해당 분석 소프트웨어를 엽니다.
- 플레이트 1 및 오픈 플레이트 설정 탭을 선택합니다. ABS 모드와 Kinetic을 클릭하여 시간이 지남에 따라 동적 흡광도 판독을 모니터링합니다.
- 파장 탭에서 550nm(또는 350~700nm 범위의 값)를 선택하고 타이밍 탭에서 30초 간격으로 총 런타임을 60분으로 조정합니다. 우물을 강조하여 읽기에 대한 관심의 우물을 선택합니다. 필요한 경우 다른 설정을 조정합니다.
참고: 범위의 하부 끝(약 350nm)에서 파장을 선택하면 감도가 향상되지만 흡광도는 분광계의 검출 한계를 초과할 수도 있습니다. 탁도 측정을 위해 가장 일반적으로 사용되는 파장은 문헌에서 405 nm입니다. 그러나 이 프로토콜은 550nm를 사용하여 동적 탁도 값이 모든 실험에 대한 검출 한계 내에 있는지 확인합니다. 선택한 판독 간격은 가장 높은 수준의 분석 감도를 달성하기 위해 가능한 한 짧아야 합니다. 이것은 분광계와 주어진 분석 중에 읽히는 우물의 수에 따라 달라집니다. - UV 투명 96웰 플레이트를 가져 가라. 판독을 위해 선택되는 우물에서 파이펫 140 μL PBS. 10 μL의 트롬빈(20 U/mL)을 잘 넣고 섞는다.
참고: 높은 결합 분석 플레이트를 사용하여 우물 표면에 대한 비특이적 단백질 결합을 최소화하지 마십시오. 이것은 용액에 있는 단백질 분산에 영향을 미치고 높은 분석 가변성을 초래할 수 있었습니다. - 3 mg/mL 피브리노겐과 1 U/mL 혈전의 최종 농도를 가진 200 μL 응고 용액을 얻기 위하여 우물에 50 μL(12 mg/mL)를 첨가하여 즉시 응고를 시작한다. 용액의 거품 생성을 피하기 위해 5번 위아래로 파이프를 사용하여 우물의 내용을 혼합하여 빛을 산란하여 흡수도에 영향을 미칩니다.
참고: 같은 플레이트에서 여러 개의 응고 샘플을 동시에 실행할 때 멀티채널 파이펫을 사용합니다. 응고 시간을 상쇄하기 위해 계측기에서 처음 읽기 전 우물과 기간에 걸쳐 시간 차이를 기록합니다. - 홀더에 96웰 플레이트를 놓고 소프트웨어에서 시작을 클릭하여 RT에서 탁도 판독을 시작합니다.
참고: 높은 온도에서 분석체를 수행하는 경우 분광계, 플레이트 및 시약은 모두 응고 개시 전에 원하는 온도에서 유지관리되어야 합니다. - 완료되면 튜도 데이터를 검색하고 플로팅 소프트웨어에서 시간이 지남에 따라 흡광도 변화를 플로팅하여 탁도 추적 곡선을 가져옵니다.
- 시간이 지남에 따라 곡선의 최대 흡광도 값을 취하여 TurbMax(피브린 섬유 두께 및 피브린 네트워크 밀도를 나타내는 최대 탁도)를 추출합니다.
참고: 피브린 섬유 질량/길이 비율은 다음 원고8에제공된 방정식을 사용하여 탁도 값에서 계산할 수 있다. - 터브최대값을 90% 곱해 90%까지 곱하여 최대 탁도 90%를 계산합니다. 응고 개시에서 최대 탁도 90%까지 시간을 계산하여 터브시간을 추출합니다.
참고: 최대 탁도90%까지의 시간은 매우 가변적인 최종 응고 형성 기간을 제거하여 응고 시간을 더 잘 나타내기 때문에 절대 최대 탁도에 걸리는 시간보다 더 신뢰할 수 있는 메트릭입니다. 응고 개시 시간(시험 시작부터 흡광도 증가시까지의 시간) 및 응고 형성 속도(탁도 추적 곡선에서 선형 영역의 가장 큰 경사)와 같은 추가 응고 파라미터도 탁도 추적에서 추출될 수 있다.
4. 혈전 성형술 (TEG)
- 혈전골 분석기를 켜고 온도가 37°C에서 안정될 때까지 기다립니다.
- TEG 오픈 - 소프트웨어. 로그인한 후 ID 섹션 아래에 실험 이름을 만듭니다.
- 화면 소프트웨어 프롬프트를 따라 모든 채널에 대한 전자 테스트를 수행합니다. 모든 검사가 완료되면 레버를 로드 위치에 다시 배치합니다.
참고: TEG 전자 테스트가 필요하며 계측기를 사용할 때마다 수행해야 합니다. TEG 응고 제어 어약(TEG 레벨 1 및 레벨 2 컨트롤 사용)은 임상 샘플에 활용될 때 일반 제조업체제안 간격에서 요구된다. - 사용할 채널에 대한 TEG 탭, 입력 샘플 정보를 클릭합니다. 해당 채널에 코팅되지 않은 명확한 TEG 컵을 배치합니다. 캐리어를 위로 밀어 내고 컵 하단을 5번 눌러 핀을 비틀림 막대에 부착합니다. 캐리어를 낮추고 컵을 "클릭"할 때까지 캐리어 베이스로 아래쪽으로 누릅니다.
- 파이펫 20 템빈 용액의 피펫 20 μL (18 U/mL) TEG 컵에. 3mg/mL 피브리노겐과 1U/mL 혈전의 최종 농도를 가진 360 μL 응고 용액을 얻기 위해 TEG 컵에 340 μL(3.2 mg/mL)을 추가하여 즉시 응고를 시작한다. 5회 위아래로 피펫팅하여 내용들을 섞는다.
참고: TEG 컵에서 360 μL의 최종 부피를 항상 유지하도록 주의하는 이 단계에서 잠재적 응고 요인 또는 기타 관심 성분을 추가해야 합니다. - 컵로드 된 캐리어를 밀어 읽기 위치로 레버를 이동하고 TEG 판독을 시작하기 위해 소프트웨어에서 시작을 클릭합니다.
- TEG가 완료되면(약 1시간 후) TEG 매개 변수를 검색하고 플로팅 소프트웨어에서 시간이 지남에 따라 진폭을 플로팅하여 TEG 추적 곡선을 가져옵니다.
- 소프트웨어에서 TEGMax(최대 진폭은 응고 강도를 나타내는 최대 진폭)과 TMA를 TEG시간(최대 진폭시간)으로 수집합니다.
참고: MA는 진폭이 3분 동안 5% 미만의 편차를 가지는 당시의 최대 진폭으로 소프트웨어에 의해 계산됩니다. TMA는 최대 혈전 발생 속도(분할 점 근처)에서 MA까지의 시간으로 결정됩니다. 다른 매개 변수는 응고 분석을 수행할 때 평가하는 데 유용할 수도 있습니다. 이러한 매개 변수의 몇 가지 예로는 R-time(진폭이 2mm에 도달하면 테스트 시작시간), K(진폭이 20mm에 도달하면 R 의 끝에서 시간), 알파(R와 K 사이의 선의 경사), CLT(응고 용해 시간)이 포함됩니다.
5. 다른 응고 조건에서 피브린 특성화
참고: 피브리노겐 및 트롬빈 농도, 이온 강도, pH 및 총 단백질 농도와 같은 응고 솔루션에서 특정 변수를 조절하여 피브린 특성화 실험을 수행합니다. 이러한 예제 변수를 가진 실험 적 제제는 이 섹션에 설명되어 있습니다. 그러나 다른 응고 요인과 관심 조건도 대체 될 수 있습니다. 각 고유 분석 요구 사항을 고려하여 적합한 버퍼 시스템을 신중하게 선택합니다. 탁도 및 TEG 분석의 경우 이러한 변수의 효과를 분석하면서 정확한 배경 뺄셈을 보장하는 버퍼 전용 컨트롤을 포함합니다.
- 다양한 피브리노겐 농도(1, 2, 3, 4, 5 mg/mL)
- 단계 2.1.4 다른 농도에서 피브리노겐 재고를 준비 (4, 8, 12, 16, 20 탁도 표사및 1.1, 2.1, 3.2, 4.2, 5.3 TEG에 대한 mg/mL).
- 단계 3.6을 조정하여 "50 μL 피브리노겐(4, 8, 12, 16, 20 mg/mL)을 96웰 플레이트의 여러 우물에 첨가하여 탁도 도형 에 대해 말합니다.
- 단계 4.5를 조정하여 TEG에 대해 "340 μL 피브리노겐(1.1, 2.1, 3.2, 4.2, 5.3 mg/mL)을 명확한 TEG 컵에 넣습니다.
- 다양한 트롬빈 농도 (0.1, 0.3, 0.6, 0.8, 1, 2.5, 5, 10 U/mL)
- 단계 2.2.3 다른 농도에서 혈전 재고를 준비하도록 조정하십시오 (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 U/mL 탁도 표사 및 1.8, 5.4, 10.8, 14.4, 18, 45, 90, 180 U/mL TEG용 U/mL).
- 단계 3.5를 조정하여 "10 μL 혈소판(2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, U/mL)을 96웰 플레이트의 여러 우물에 추가한다"고 튜탁도 에세이를 사용합니다.
- 단계 4.5에서 "파이펫 20 μL 트롬빈(1.8, 5.4, 10.8, 14.4, 18, 45, 90, 180 U/mL)을 TEG에 대한 명확한 TEG 컵으로 조정합니다.
- 이온 강도 변화(0.05, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17 및 0.3M)
- 염화나트륨(21, 101, 111, 121, 131, 141, 271mMMM)과 1.8mM 칼륨 인산염 단원, 10mMM나트륨 인산염 디베이직, 2.7mm 염화나트륨을 DI 수에 2.7mm의 염화나트륨을 함유하여 0.01MS PBS의 다양한 효능을 발휘한다.
- 단계 1.3을 조정하여 다양한 이온 강도로 만든 PBS를 사용하여 탁도 및 TEG 저술을 위한 피브리노겐 및 응고 솔루션을 준비합니다.
- [pH]
- 인산나트륨 디베이직(0.7, 3.2, 7.7, 8.1, 8.4, 9.5mMMM) 및 칼륨 인산염 모노베이직(8.2, 6.0, 2.0, 1.7, 1.4, 0.5 mMMMM)와 함께 염화 나트륨(153, 147, 138, 137, 136, 134mMMMMMMMM)을 0.01 MPBS 솔루션으로 만들고 pH와 최종 ionic 강도 0.05.05.
- pH 프로브를 통해 버퍼 pH 값을 확인하고 필요한 경우 pH를 조정합니다.
- 단계 1.3을 조정하여 다른 pH에서 만든 PBS를 사용하여 탁도 및 TEG 저술을 모두 위한 피브리노겐 및 응고 솔루션을 준비합니다.
- 다양한 알부민 농도(0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/mL)
- 실험 당일 20분 동안 RT에서 PBS500 μL에 lyophilized 알부민 2g을 녹입니다.
- 알부민용 43,800 L 몰-1cm -1(280nm에서)의 어금니 소멸 계수로 2.1.3 단계 및2.1.4 단계에서 언급된 동일한 절차를 사용하여 알부민 농도를 결정한다.
- 다른 농도에서 알부민 재고를 준비합니다.
- 단계 3.5에서 "피펫 40 μL PBS를 판독용으로 선택된 우물로 조정하고 10 μL 혈소 (20 U/mL)를 추가하십시오." 단계 3.6을 조정하여 "100 μL 알부민(0)을 사용하여 50 μL 피브리노겐(12 mg/mL)을 추가하여 즉시 응고를 시작하십시오. 40, 80, 100, 120, 160, 200 mg/mL) 여러 우물로 최종 농도 3 mg/mL 피브리노겐, 1 U/mL 혈소및 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/mL 알부민.
- 단계 4.5를 조정하여 "200 μL 알부민(36, 72, 90)의 혼합물을 추가하여 즉시 응고를 시작하십시오. 108, 144, 180 mg/mL) 및 140 μL 7.7 mg/mL 피브리노겐을 TEG 컵에 넣고 3mg/mL 피브리노겐, 1 U/mL 혈전 및 0, 20, 40, 50, 60, 80 mg/80 mg/80 mg의 최종 농도를 가진 360 μL 응고 용액을 획득했습니다."
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Representative Results
도 1에 나타난 실험은 서로 다른 피브리노겐 수준에서 인간과 소 피브린 혈전의 대표적인 탁도 추적 곡선이다. 상이한 피브리노겐 수준에서 피브린 응고 형성을 위한 대표적인 TEG 추적 곡선이 도 2에도시된다. 두 추적 곡선 모두 응고 개시 후 지연 기간 이후에 응고 편도 또는 응고 진폭이 혈전 형성의 끝에 시간과 레벨이 증가한다는 것을 보여줍니다. 최대 응고 형성의 끝점 값과 각 분석에서 최대 응고 형성에 시간이 사용되어 완전히 형성된 응고및 전체 응고 공정의 특징을 평가합니다. 최대 탁도(TurbMax)및 최대 탁도(TurbTime)까지의시간은 탁도로부터 파생된 두 개의 파라미터이며 최대 진폭(TEGMax)및 최대 진폭(TEGTime)까지의시간은 TEG로부터 파생된다.
또한 TurbMax는 피브린 섬유 두께와 피브린 네트워크 밀도를 나타내는 응고 구조의 광학 측정값입니다. TEGMax는 절대 응고 강도를 반영하는 기계적 측정값입니다. 그들은 우리의 이전 연구 결과에 따라 서로 독립적으로 변경할 수있는 혈전의 다른 측면을 나타냅니다14. 이 두 값을 종합하면 섬유가 피브린 네트워크에 얼마나 조밀한지 와 같은 응고 미세 구조에 대한 상호 보완적인 통찰력을 제공합니다. 응고 변수를 수정하는 것이 결과에 미치는 영향을 명시적으로 확인하려면 추세 플롯을 사용하여 데이터가 더 구성되고 제시되었습니다. 도 3에도 3에 도 3에 도3및 TEG 데이터 동향의 대표적인 예가 표시됩니다. 응고 용액에서 더 높은 수준의 피브리노겐에서 네 가지 값(터브맥스,TEG맥스,터브시간 및 TEG시간)이모두 증가합니다. 이러한 결과로부터, 더 높은 피브리노겐 기판 수준이 응고(더 큰 TurbMax)를통한 광 전달을 제한하는 조밀한 섬유질 네트워크를 초래한다는 것을 해석할 수 있다. 이 강화된 네트워크는 응고 강도(더 큰 TEGMax)를향상시킵니다. 터브시간과 TEG시간의 신장은 피브린 중합화가 증가 된 fibrinogen 수준에서 방해된다는 것을 나타냅니다. 우리 그룹이 테스트한 변수에 대한 TurbMax 및 TEGMax의 동향과 해석은 표 1에표시됩니다.
그림 1: 응고 탁도 추적 곡선의 대표적인 예(0~30분). 소 (A) 및 인간 (B) 피브린 형성의 탁도 추적 다른 fibrinogen 농도에서 시간이 지남에 따라 (1, 2, 3, 4, 5 mg/mL) 와 함께 1 U/mL 종 일치 혈소판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: TEG 추적 곡선의 대표적인 예(0~30분). TEG 진폭 추적소(A)및 인간(B)피브린 형성은 다른 피브리노겐 농도에서 시간이 지남에 따라 형성 (1, 2, 3, 4, 5 mg/mL) 와 1 U/mL 종 일치 혈전. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 탁도 및 TEG 데이터 추세의 대표적인 예입니다. TurbMax 및 TurbTime Time(A)의 데이터 동향및 TEGMax 및 TEGATime Time(B)의 추세는 1U/mL 종과 일치하는 1U/mL 종과 다른 소 또는 인간 피브리노겐 농도(1, 2, 3, 4, 5 mg/ml)에 대한 추세입니다.B 모든 데이터 포인트 및 오류 막대는 삼중(탁도) 및 중복(TEG)의 평균 및 표준 편차입니다. 이 수치는 [Zeng, 2020]14에서재사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 변수 | 추세 결과 | 해석 |
| 피브리노겐 레벨 증가 | 터브맥스 증가 및 TEG최대 | 더 단단한 피브린 섬유와 밀도가 높은 섬유질 네트워크의 형성 |
| 증가 된 트롬빈 수준, pH 및 이온 강도 | 터브최대감소, TEG최대 증가 | 얇고 단단한 피브린 섬유의 형성 |
| 알부민 레벨 증가 | 터브최대증가, TEG최대 감소 | 더 두껍고 느슨한 피브린 섬유의 형성 |
표 1: 터브맥스와 TEGMax의결과및 해석.
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Discussion
이 프로토콜은 시판되는 부품을 사용하여 간소화된 피브리노겐/트롬빈 응고 모델을 테스트하는 두 개의 서로 다른 응고 특성화 도구의 활용을 보여줍니다. TEG와 탁도 세약 모두 수행하기 쉽습니다. 최대 응고 형성(TurbMax 및 TEGMax)및 응고 형성 시간(TurbTime 및 TEGTime)과같은 엔드 포인트 응고 검사를 제공할 뿐만 아니라 동적 응고 형성 공정을 평가합니다. 이로 인해 TEG 및 탁도 는 복잡한 실험 절차를 갖거나 단일 응고 측면 테스트에만 집중할 수 있는 SEM, PT, aPTT 또는 응고 유경학과 같은 대체 방법에 추가하기 위해 응고 특성화를 위한 유용한 도구입니다. 탁도 및 TEG 결과는 응고 가변이 응고 특성에 미치는 영향에 대한 보다 완벽한 프로파일을 제공합니다.
이 프로토콜에 자세히 설명된 응고 변수 외에도 이러한 기술을 활용하는 다른 많은 변수가 있습니다. 이 프로토콜은 온도, 칼슘 수준, 응고 인자 수준, 응고 활성제 또는 억제제의 추가 또는 의약품 제제의 첨가를 조정하여 수정할 수 있습니다. 이러한 변수는 단순화된 피브리노겐/트롬빈 모델 시스템을 모두 사용하거나 플라즈마를 사용하여 잠재적으로 연구될 수 있다. 응고 요인을 연구하려면 신중한 고려와 조정 경로를 개시하는 적절한 업스트림 응고 활성화를 위해 반드시 필요한 설치가 필요합니다. 탁도 및 TEG는 응고 소화를 모니터링하는 데 사용되는 효과적인 도구이기도 합니다. 프로토콜은 항응고제 또는 혈전용제의 존재시 피브린 응고 형성 및 용액을 특성화하도록 변형될 수 있다. TEG 분석컵에 장착된 핀으로 기기가 작동중일 때 응고 시스템이 기능적으로 닫히면서 TEG를 사용할 때 혈전 개시 전에 치료제를 첨가해야 한다는 점에 유의해야 한다. 즉, TEG는 기존 혈전에서 혈전용제의 치료 프로파일을 테스트하는 데 사용할 수 없습니다.
이 프로토콜에서, 두 분석 모두 일반적으로 활용 된 실험 조건하에서 수행되었다. TEG는 일반적으로 37°C에서 수행되며 탁도 표고는 실온(RT)에서 수행됩니다. 이 특성화 방법의 강조는 특정 변수가 응고에 있는 추세 결과를 결정하고 해석하는 것입니다. 중요한 것은 시약이 온도 제어 TEG 컵에 직접 피펫화되기 때문에 TEG를 활용한 온도를 제어하는 것은 간단하다는 것입니다. 응고 시약이 가열 된 분광계 내에 배치되기 전에 잘 플레이트에서 시작되기 때문에 탁도 분석에서 온도 제어는 덜 간단합니다. 챔버 내에서 플레이트 및 응고 용액이 따뜻해지는 속도는 응고 형성 속도에 비해 느리고 가열 된 챔버에 배치하기 전에 모든 시약및 플레이트를 높은 온도에서 유지하기가 어려울 수 있으며 종종 불량한 분석 재현성을 초래합니다. 탁도 해석을 위해 실온 이외의 일정한 온도를 유지하는 것은 많은 우물을 가로 질러 멀티플 링 할 때 더 복잡합니다. 안정적이고 재현 가능한 탁도 결과를 보장하는 또 다른 중요한 단계는 응고를 시작하기 위해 우물을 혼합하는 것입니다. 직접 혈전 -피브리노겐 분열이 빠르기 때문에 응고 개시 전에 우물을 혼합하면 비 균일 한 피브린 형성을 우회 할 수 있습니다.
이 프로토콜은 또한 혈소판이 풍부한 혈장 또는 혈소판 이불량 한 혈장과 같은 임상 샘플에 의해 형성 된 혈전을 특성화하기 위해 쉽게 변형 될 수 있습니다. Citrated 혈액 무승부는 표준 TEG 프로토콜에 의해 이전에 검증되었기 때문에 권장됩니다. 혈소판이 풍부하고 혈소판이 좋지 못한 혈장은 RT에서 15분 동안 200및 2,000 x g 이상의 원심분리를 통해 정혈전혈액에서 분리될 수 있다. 탁도 또는 TEG 분석에서, 혈전은 과잉 염화칼슘(11mM)을 첨가하여 개시될 수 있다. 그러나 인산염은 강수량의 결과로 칼슘에 결합할 수 있기 때문에 칼슘을 응고 개시자로 사용할 때 PBS를 피해야 합니다. 혈소판이 풍부한 혈전 형성을 연구할 때 혈전 형성이 느린 조건에서 혈전 형성 을 실행할 때 혈소판 정착을 중요한 confounder로 고려하는 것이 중요합니다. 혈소판 정착에 관한 문제는 혈전 형성이 빠르면 덜 영향을 미칩니다. 이것은 분석 정확도와 재현성이 주로 우물에서 시약의 균일성에 의존하는 탁도 분석에 특히 중요합니다. 실험 설계가 허락하는 경우, 카올린(TEG용 응고 개시기로 자주 활용됨) 또는 기타 음하전입자 활성제는 응고 캐케이드의 빠른 접촉 경로 활성화를 위한 추가 표면적을 제공함으로써 플라즈마 응고 개시 속도를 높이는 데 사용될 수 있다. 중요한 것은, 활성화기 서스펜션은 침전을 피하기 위해 응고 솔루션과 철저히 혼합되어야한다는 것입니다. 표면적 또는 충전된 입자 기반 응고 활성제를 사용하는 경우 시약 자체가 탁도 측정기의 흡수도에 기여할 수 있기 때문에 필요한 배경 컨트롤을 고려해야 합니다. 또한, 침전은 카올린과 같은 더 큰 입자 기반 첨가제의 문제일 수 있다.
적혈구가 표준 탁도 파장의 흡수도에 크게 기여하기 때문에 전혈 샘플은 탁도 애법의 사용을 고려할 때 신중하게 처리되어야합니다. 이러한 이유로, 탁도를 통해 전혈의 측정은 종종 대부분의 분광계의 검출 한계를 초과하고 일반적으로 가능하지 않습니다. 전혈을 특성화하는 대체 방법은 적혈구를 포함하는 혈액 샘플에 대한 탁도 검사를 실행하기 전에 필요하거나 희석이 가능할 수 있습니다. TEG와 탁도는 함께 사용될 때 응고 강도및 피브린 섬유/네트워크 형태에 대한 뚜렷한 측정을 결합하여 고도로 제어된 최소 단백질 응고 측정 및 임상 플라즈마 샘플을 결합하여 포괄적인 응고 형성 및 소화 특성화를 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
없음.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Albumin from human serum | Millipore Sigma | A1653 | ≥96%, lyophilized powder |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | ≥96%, lyophilized powder |
| Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear) | Haemonetics | REF 6211 | |
| Fibrinogen, Bovine Plasma | Millipore Sigma | 341573 | contains more than 95% clottable protein |
| Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma | Millipore Sigma | 341578 | Contains ≥ 95% clottable proteins. |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | 60130 | ≥99.5% purity |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P9791 | ≥98% purity |
| SevenEasy pH Meter | Mettler Toledo | S20 | |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | 71378 | ≥99.5% purity |
| Sodium phosphate dibasic | Millipore Sigma | 71636 | ≥99.5% purity |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system | Molecular Devices | M5 | |
| TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system | Haemonetics | 07-022 | |
| Thrombin, Bovine | Millipore Sigma | 605157 | |
| Thrombin, Human Plasma, High Activity | Millipore Sigma | 605195 |
References
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