Summary
Fibrin ansvarar för proppbildning under hemostas och trombos. Grumlighet analyser och tromboelastograhy (TEG) kan utnyttjas som synergistiska verktyg som ger kompletterande bedömning av en propp. Dessa två tekniker tillsammans kan ge mer insikt i hur koagulationsförhållanden påverkar fibrin clotbildningen.
Abstract
Trombos är en ledande dödsorsak över hela världen. Fibrin(ogen) är det protein som primärt ansvarar för proppbildning eller trombos. Därför karaktärisera fibrin clot bildning är fördelaktigt att studera trombos. Grumlighet och tromboelastografi (TEG) är båda allmänt utnyttjas in vitro-analyser för övervakning av clot bildning. Turbiditet mäter dynamiskt ljussläpancen genom en fibrinkoagulationsstruktur via en spektrometer och används ofta i forskningslaboratorier. TEG är en specialiserad viskoelastisk teknik som direkt mäter blodproppsstyrka och primärt utnyttjas i kliniska miljöer för att bedöma patienternas hemostas. Med hjälp av dessa två verktyg beskriver denna studie en metod för att karakterisera en in vitro fibrin-propp med hjälp av en förenklad fibrinogen/trombin-proppmodell. Datatrender mellan båda teknikerna jämfördes under olika koagulationsförhållanden. Fibrinkoagel av människor och nötkreatur bildades sida vid sida i denna studie eftersom koaguleringsfaktorer för nötkreatur ofta används som ersättning till levringsfaktorer hos människor i kliniska och forskningsrelaterade miljöer. Resultaten visar att TEG och grumlighet spår clot bildandet via två distinkta metoder och när utnyttjas tillsammans ger kompletterande clot styrka och fiber strukturell information över olika koagulation villkor.
Introduction
Trombos är den patologiska bildandet av en blodpropp i kroppen som blockerar blodcirkulationen leder till hög sjuklighet och dödlighet i hela världen. Det finns 1 till 2 fall av venös tromboembolism och 2 till 3 fall av trombos-inducerad kärlsjukdomar per 1000 personer årligen1,2. Presenteras här är en metod hävstångseffekt thromboelastography (TEG) och grumlighet att övervaka koagulationsbildning under olika koagulationsförhållanden. Fibrin(ogen) är det primära protein som är ansvarig för proppbildning i kroppen. I de sista stegen i koagulationskaskaden klyses fibrinopeptider från fibrinogen genom att trombin initierar polymerisation av olösliga fibrinmonomerer när proppenutvecklar 3,4. För att förstå proppbildning i patologisk trombos är det nödvändigt att karakterisera fibrinbildning under olika koagulationsfall. Flera clot övervakning assays har utnyttjats för att studera fibrin clot bildning in vitro. Protrombintid (PT/INR) och aktiverad partiell tromboplastintid (aPTT) är två vanliga kliniska analyser som mäter integriteten hos en specifik koagulationsväg. De använder dock tid som den enda variabeln som inte ger någon indikation på fysiska proppegenskaper5. Elektronmikroskopi möjliggör visualisering av mikrostrukturen hos en helt bildad fibrinkoagel men ger ingen information om själva proppformningsprocessen6. Bland alla analyser, grumlighet assays och TEG erbjuder möjligheten att spåra koagel egenskaper dynamiskt över tiden. Dessa tekniker möjliggör måttet på omfattande koagulationsprofiler och därför, ge viss nytta över andra fibrin clot karakteriseringsverktyg.
Specifikt, grumlighet analyser (eller clot grumlighet) används i stor utsträckning för forskning och kliniska tillämpningar på grund av dess förenklade genomförande och den breda tillgängligheten av spektrometrar i forskningslaboratorier. Denna analys gör att en dynamisk mätning av ljus transmittans genom en formande propp genom att ta individuella repetitiva avläsningar vid en definierad våglängd (oftast vid en våglängd i intervallet 350 – 700 nm)7. Temperatur i läskammaren kan också justeras. Som fibrin gel former, mängden ljus som färdas genom proteinet nätverket minskar orsakar en ökning av absorbans över tiden. På samma sätt minskar absorbansen när proppnätverket bryts ned. Grumlighet analyser kan enkelt multiplexas med hjälp av en multi-well plattan format för att möjliggöra hög genomströmning prov screening i både 96- och 384-brunns plattor. Flera proppegenskaper kan härledas från en grumlighetsspårningskurva (absorbans över tidsmätning) som inkluderar: maximal grumlighet, tid till maximal grumlighet, tid till proppansjukning, och proppbildningshastighet (Vmax). En fibrin fiber massa / längd förhållandet kan också härledas från rå grumlighet data för att uppskatta fibrin fiber tjocklek8,9,10.
TEG utnyttjas främst i den kliniska inställningen för att bedöma patienternas hemostas och clot lysis. Det är också vanligt förekommande i kirurgiska tillämpningar för att avgöra när anti-fibrinolytiska läkemedel eller hemostatiska blodprodukter bör administreras11,12. Proppbildning sker inuti en TEG-kopp med alla koagulationskomponenter som tillsätts i koppen innan analysen påbörjas. Koppen, med evolverande propp, fysiskt roterar mot ett stift som sätts in i dess centrum och en elektromekanisk vridsensor mäter den ökande viskoelastiska styrkan i proppen. Denna analys utförs typiskt vid den fysiologiska temperaturen på 37 °C; temperaturen kan dock justeras manuellt på instrumentet. Maximal amplitud (MA), reaktionshastighet (R), kinetiktid (K), α-vinkel (Vinkel) och tid till maximal amplitud (TMA) extraheras av TEG-programvaran från den dynamiska TEG-spårningen. Dessa värden jämförs vanligtvis med kliniska normala intervall för att bedöma en patients koagulationstillstånd. Medan TEG är inte just en viskometer, eftersom det mäter koagel styrka i millimeter enheter, det ger viktiga viskoelastiska proppdata och fungerar som ett värdefullt kliniskt beslut verktyg för läkare att besluta att administrera specifika blodprodukter och justera terapeutiska doser13. När både TEG och grumlighet analyser utnyttjas tillsammans, de ger kompletterande koagel karakterisering information som koagel styrka och kinetik är lätt utvinns från TEG och fibrin fiber tjocklek kan nås genom optisk grumlighet mätningar.
Eftersom fibrin är en kritisk komponent i en blodpropp kan fibrin clot-karakterisering under olika koagelbildningsförhållanden ge värdefull insikt i hur en specifik variabel bidrar till koagelbildningsprocessen och de ultimata koagelegenskaperna. Förstå detta kan ge vägledning för trombos diagnos och utvecklingen av therapeutics. För att få en mer representativ fibrinkoagulationskaraktärisering kan plasma ersättas med att övervaka koagulationsbildningen då det liknar in vivo-koagulationsförhållanden närmare än ett förenklat fibrinogen/thrombin-modellsystem. Men på grund av koagulationskaskadens invecklade natur bidrar proppbildningen med hjälp av plasma till komplexiteten, vilket gör det svårare att isolera effekten av enskilda faktorer. Genom att utnyttja en förenklad fibrinogen/trombinmodell förhindras behovet av att initiera hela koagulationskaskaden som möjliggör isolering av det slutliga fibrinbildningssteget. Genom att inkludera två stora fibrin bildar komponenter (fibrinogen och trombin), skapar denna inställning en mycket kontrollerad proppbildning skick. Det är också viktigt att notera att medan den förenklade clot modellen används här, detta protokoll kan också utnyttjas för att karakterisera mer komplexa blodproppar genom att inkludera ytterligare koagulationsfaktorer. I denna studie, fibrin clot karakterisering med hjälp av grumlighet och TEG utförs av varierande fibrinogen och trombin koncentrationer, joniska styrka, pH, och total proteinkoncentration i koagulationslösningen att efterlikna olika in vivo koagulation omständigheter14. Detaljer angående dessa variationer till protokollet har inkluderats i avsnitt 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av fosfatbuffertsaltlösning (PBS)
OBS: PBS användes under hela denna studie som de beskrivna assays inte kräver tillsats av kalcium. Det är viktigt att notera att när du lägger till kalcium, ofta utnyttjas för att åter förkalka citrated blodprodukter, PBS bör undvikas som kalcium är känt för att fälla ut i fosfat buffertar.
- Gör en 0,01 M, pH 7,4 PBS buffert genom att blanda 137 mM natriumklorid, 1,8 mM kaliumfosfat monobasisk, 10 mM natriumfosfatdikbasic och 2,7 mM kaliumklorid i DI vatten.
- Verifiera buffert pH med hjälp av en pH-sond och justera pH-värdet med hjälp av natriumhydroxid eller saltsyra efter behov.
- Använd denna PBS för beredning av fibrinogen och koagulationsanalyser (om inte annat anges).
OBS: Buffert föreslås att rekonstruera fibrinogenpulver eftersom rehydrering i DI vatten kan resultera i fibrinogen nederbörd även vid 37 °C.
2. Beredning och lagring av proteiner
OBS: Under hela protokollet framställs proteinstockskoncentrationerna i olika koncentrationer för grumlighet och TEG för att möjliggöra det konsekventa förhållandet mellan salt, DI-vatten, PBS och andra restfaktorer i de slutliga koagulationslösningarna.
- Beredning och lagring av fibrinogen
OBS: Föroreningar i kommersiellt tillgängliga fibrinogen inkluderar en betydande mängd faktor XIII, restmängder av andra koagulationsfaktorer, lagringsbuffert och salter. I närvaro av kalcium, faktor XIII är känt för att korslänka fibrin clot nätverket. Denna effekt bidrar till en åtstramad proppstruktur och förstärkt proppstyrka som påverkar fibrinkarakteriseringen. Kommersiellt tillgängliga aktivitetssatser kan användas för att fastställa aktiva faktor XIIIa-nivåer. För att minimera variabilitet orsakad av faktor XIIIa, bör experiment utformas med uteslutande av kalcium eller ytterligare steg för att avlägsna faktor XIIIa bör införlivas i detta protokoll. Dessutom bör proteinlagring salt och buffert typ bedömas och vid behov dialys kan utföras för att överföra till en föredragen analys arbetsbuffert.- Väg och alikvotera lyofiliserat fibrinogenpulver (nötkreatur eller människa) i 2 mL-rör vid 20 mg protein per rör och förvara alikvoter vid -20 °C i upp till 6 månader.
- Låt fibrinogen alikvoten acklimatisera sig till RT (rumstemperatur) i 10 minuter samma dag som försöket pågår. Rekonstruera fibrinogen genom att lägga till 600 μL PBS till alikvoten 20 min före användning.
- Ta 10 μL fibrinogen och späd ut den med 190 μL PBS i en UV-transparent 96-brunnsplatta eller en cuvette. Bestäm fibrinogenkoncentrationen genom att ta absorbans vid 280 nm via en kommersiell spektrometer och dess programvara.
- Beräkna fibrinogenkoncentrationen (mg/mL) med hjälp av Bes lag. Förbered 12 mg/mL (för turbiditetsanalyser) och 3,2 mg/mL (för TEG) fibrinogenlagerlösningar genom ytterligare utspädning med PBS (om inte annat anges).
OBS: Fibrinogen koncentrationsbestämning (mg/mL) enligt Bes lag:
Molar utdöende koefficient: ɛ = 513.400 L mol-1 cm-1 vid 280 nm; Pathlängd (L); Utspädningsfaktor (D); Molekylvikt (MW) = 340 000 Da. ɛ härleds genom att E0,1 % multipliceras med MW.
- Beredning och lagring av trombin
- Rekonstruera lyophilized trombin (nötkreatur eller människa, 1000 U lager) i 200 μL avjoniserat (DI) vatten för att göra 200 μL av 5000 U/mL trombin lager lösning.
- Gör 5 μL (20 U/tube) alikvoter av lösningen och håll alikvoter frysta vid −20 °C.
- Thaw thrombin alikvoter vid RT i 15 min på dagen för experiment och göra trombin arbetslösning genom att späda ut den till 20 U/mL för grumlighet analyser och 18 U/mL för TEG med DI vatten (om inte annat anges).
OBS: Försiktighetsåtgärder bör vidtas för att upprätthålla enzymaktivitet som kan åstadkommas genom att upprätthålla enzymer på is under upptining och användning; dock observerades ingen minskning av trombinaktiviteten när den utnyttjades direkt efter upptining vid RT.
3. Grumlighet
- Använd valfri spektrometer som har en absorbansomfång på 350 - 700 nm och en motsvarande programvara för att övervaka koagelsturbiditet över tid (se Tabell över material).
- Slå på spektrometern och öppna motsvarande analysprogramvara.
- Välj platta 1 och fliken Inställningar för öppna plåt. Klicka på ABS-läge och Kinetic för att övervaka en dynamisk absorbansläsning över tid.
- Välj 550 nm (eller något värde i intervallet 350 – 700 nm) i våglängdsfliken och justera den totala körtiden till att vara 60 min med ett intervall på 30 s i tidtagningsfliken. Välj brunnar av intresse för läsning genom att markera brunnarna. Justera andra inställningar om det behövs.
OBS: Att välja en våglängd i den nedre änden av intervallet (cirka 350 nm) ger en bättre känslighet men absorbans kan också överstiga spektrometerns detektionsgräns. Den mest utnyttjade våglängden för grumlighetsmätning är 405 nm i litteraturen; dock använder detta protokoll 550 nm för att säkerställa att de dynamiska grumlighetsvärdena ligger inom detektionsgränsen för alla experiment. Det valda avläsningsintervallet bör vara så kort som möjligt för att uppnå högsta nivå av analyskänslighet. Detta beror på spektrometern och antalet brunnar som läses under en viss analys. - Ta en UV-transparent 96-brunnsplatta. Pipett 140 μL PBS i en brunn som är vald för läsning. Tillsätt och blanda 10 μL trombin (20 U/mL) i brunnen.
OBS: Använd inte högbindningsanalysplattor för att minimera ospecifik proteinbindning till brunnsytan. Detta skulle kunna påverka proteinspridning i lösningen och resultera i hög analysvariation. - Påbörja koagulation omedelbart genom att tillsätta 50 μL fibrinogen (12 mg/mL) i brunnen för att få en 200 μL-koagulationslösning med en slutkoncentration på 3 mg/mL fibrinogen och 1 U/mL-trombin. Blanda innehållet i brunnen genom pipettering upp och ner fem gånger var noga med att undvika skapandet av bubblor i lösningen eftersom de kommer att påverka absorbans genom att sprida ljus.
OBS: Använd en flerkanalig pipetter när du kör flera proppprover på samma platta samtidigt. Registrera tidsskillnader över brunnar och tidsperioden före den första läsningen av instrumentet för att kompensera koagulationstider. - Placera 96-brunnsplattan i hållaren och klicka på Start i programvaran för att starta grumlighetsläsningen vid RT.
OBS: Om utförandet av analysen vid en förhöjd temperatur då spektrometer, platta, och reagenser måste alla bibehållas vid önskad temperatur före proppinitiering. - När den är klar, hämta grumlighet data och få en grumlighet spåra kurva genom att rita absorbans förändring över tiden i en plottning programvara.
- Härleda TurbMax (maximal grumlighet som tyder på fibrinfibertjocklek och fibrinnätverkets densitet) genom att ta kurvans maxabsorbansvärde över tiden.
OBS: Fibrin fiber massa/ längd förhållandet kan beräknas från grumlighet värden med hjälp av ekvationen som tillhandahålls i följande manuskript8. - Beräkna 90% maximal grumlighet genom att multiplicera TurbMax med 90%. Härleda TurbTid genom att beräkna tid från proppinitiering till 90% maximal grumlighet.
OBS: Tiden till 90% maximal grumlighet är ett mer tillförlitligt mått än tid till absolut maximal grumlighet eftersom det bättre representerar propptid genom att eliminera den mycket varierande slutliga koagelbildningsperioden. Ytterligare koagulationsparametrar som proppansjukningstid (tid från teststart till när absorbansen börjar öka), och koagelbildningshastighet (Vmax, den största lutningen av den linjära regionen i grumlighetsspårningskurvan) kan också extraheras från grumlighetsspårningarna.
4. Tromboelastografi (TEG)
- Sätt på tromboelastografanalysatorn och vänta tills temperaturen stabiliseras vid 37 °C.
- Öppna TEG - programvara. När du har loggat in skapar du ett experimentnamn under ID-avsnittet.
- Genomför ett e-test för alla kanaler genom att följa uppmaningarna om programvara på skärmen. Placera spaken tillbaka till lastläget när alla kontroller är klara.
OBS: Ett TEG e-test krävs och bör genomföras varje gång när instrumentet används. TEG koagulering kontroll analyser (med hjälp av TEG nivå 1 och nivå 2 kontroller) krävs vid den vanliga tillverkaren föreslog intervall när utnyttjas för kliniska prover. - Klicka på fliken TEG, mata in exempelinformation för kanaler som ska användas. Placera en tydlig obestruken TEG-kopp i dess motsvarande kanal. Skjut bärselen upp till toppen och tryck på koppen botten 5-gånger för att fästa stiftet på torsionsstaven. Sänk bären och tryck ned koppen i bärbasen tills den "klickar".
- Pipett 20 μL trombinlösning (18 U/mL) i TEG-koppen. Påbörja koagulation omedelbart genom att addera 340 μL fibrinogen (3,2 mg/mL) i TEG-koppen för att få en 360 μL koagulationslösning med en slutkoncentration på 3 mg/mL fibrinogen och 1 U/mL-trombin i koppen. Blanda innehållet genom att pipettera upp och ner fem gånger.
OBS: Potentiella koagulationsfaktorer eller andra komponenter av intresse bör läggas till under detta steg var noga med att alltid hålla en slutlig volym på 360 μL i TEG-koppen. - Skjut koppen lastade bäraren upp, flytta spaken till läspositionen och klicka på Start i programvaran för att initiera TEG-behandlingen.
- När TEG är klar (efter ungefär en timme), hämta TEG parametrar och få en TEG spårningskurva genom att rita amplitud över tiden i en plottning programvara.
- Samla MA som TEGMax (maximal amplitud är vägledande för clot styrka) och TMA som TEGTime (tid till maximal amplitud) från programvaran.
OBS: MA beräknas av programvaran som den maximala amplituden vid den tidpunkt då amplituden har mindre än 5% avvikelse under en 3-minutersperiod. TMA bestäms som tiden från den maximala trombgenerationshastigheten (nära delningspunkten) till MA. Andra parametrar kan också vara användbara att bedöma när du utför koagelanalysen. Några exempel på dessa parametrar är: R-time (tiden från teststart till när amplituden når 2 mm), K (tiden från slutet av R till när amplituden når 20 mm), alfa (lutning av linje mellan R och K), och CLT (propplystid).
5. Fibrin karakterisering under olika koagulationsförhållanden
OBS: Utför fibrinkarakteriseringsexperiment genom att modulera en specifik variabel i koagulationslösningarna som: fibrinogen- och trombinkoncentrationer, jonisk styrka, pH, och totala proteinkoncentrationer. Experimentella förberedelser med dessa exempelvariabler beskrivs i detta avsnitt; men andra koagulationsfaktorer och villkor av intresse kan också ersättas. Välj noga ett lämpligt buffertsystem med hänsyn till varje unik assay krav. För grumlighet och TEG analyser, inkludera en buffert endast kontroll för att säkerställa en korrekt bakgrund subtraktion samtidigt analysera effekten av dessa variabler.
- Varierande fibrinogenkoncentration (1, 2, 3, 4, 5 mg/mL)
- Justera steg 2.1.4 för att förbereda fibrinogenbeståndet vid olika koncentrationer (4, 8, 12, 16, 20 mg/mL för grumlighetsanalyser och 1,1, 2,1, 3,2, 4,2, 5,3 mg/mL för TEG).
- Justera steg 3.6 för att "tillsätta 50 μL fibrinogen (4, 8, 12, 16, 20 mg/mL) i flera brunnar av 96 brunnsplattan" för grumlighetsanalyser.
- Justera steg 4.5 för att "tillsätta 340 μL fibrinogen (1.1, 2.1, 3.2, 4.2, 5.3 mg/mL) i tydliga TEG koppar" för TEG.
- Varierande trombinkoncentration (0,1, 0,3, 0,6, 0,8, 1, 2,5, 5, 10 U/mL)
- Justera steg 2.2.3 för att förbereda trombinlager vid olika koncentrationer (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 U/mL för turbiditetsanalyser och 1,8, 5,4, 10,8, 14,4, 18, 45, 90, 180 U/mL för TEG).
- Justera steg 3.5 för att "tillsätta 10 μL trombin (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 U/mL) i flera brunnar av 96 brunnsplattan" för grumlighetsanalyser.
- Justera steg 4.5 till "pipet 20 μL trombin (1,8, 5,4, 10,8, 14,4, 18, 45, 90, 180 U/mL) i tydliga TEG-koppar" för TEG.
- Varierande jonisk styrka (0,05, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17 och 0,3 M)
- Lös natriumklorid (21, 101, 111, 121, 131, 141, och 271 mM) tillsammans med 1,8 mM kaliumfosfat monobasiska, 10 mM natriumfosfat dibasic och 2,7 mM kaliumklorid i DI vatten för att göra 0,01 M PBS lösningar med varierande joniska styrkor.
- Justera steg 1.3 för att använda PBS som görs vid olika joniska styrkor för att förbereda fibrinogen- och koagulationslösningar för både grumlighet och TEG-analyser.
- Varierande pH (5,8, 6,6, 7,3, 7,4, 7,5 och 8,0)
- Lös natriumfosfatdbasic (0.7, 3.2, 7.7, 8.1, 8.4, 9.5 mM) och kaliumfosfatmonbasic (8.2, 6.0, 2.0, 1.7, 1.4, 0.5 mM) tillsammans med 2.7 mM kaliumklorid och natriumklorid (153, 147, 138, 137, 136, 134 mM) för att göra 0.01 M PBS lösningar med varierande pH och en slutlig jonisk styrka på 0.165 M.
- Verifiera buffert pH-värde via pH-sond och justera pH-värdet om det behövs.
- Justera steg 1.3 för att använda PBS som görs vid olika pH för att förbereda fibrinogen och koagulationslösning för både grumlighet och TEG-analyser.
- Varierande albuminkoncentration (0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/mL)
- Lös 2 g lyofilat albumin i 500 μL PBS vid RT i 20 min på experimentdagen.
- Bestäm albuminkoncentration med samma procedur som nämns i steg 2.1.3 och 2.1.4 med en molarutdöende koefficient på 43 800 L mol−1 cm−1 (vid 280 nm) för albumin.
- Förbered albumin lager vid olika koncentrationer.
- Justera steg 3.5 till "Pipette 40 μL PBS i en brunn som är vald för avläsning och tillsätt 10 μL trombin (20 U/mL)". Justera steg 3.6 till "Initiera koagulering omedelbart genom att addera 50 μL fibrinogen (12 mg/mL) med 100 μL albumin (0, 40, 80, 100, 120, 160, 200 mg/mL) i flera brunnar till en slutkoncentration på 3 mg/mL fibrinogen, 1 U/mL trombin och 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/mL-albumin i brunnar."
- Justera steg 4.5 till "Initiera koagulering omedelbart genom att lägga till en blandning av 200 μL albumin (36, 72, 90, 108, 144, 180 mg/mL) och 140 μL 7,7 mg/mL fibrinogen i TEG koppar för att få en 360 μL koagulationslösning med en slutkoncentration på 3 mg/mL fibrinogen, 1 U/mL trombin och 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/mL albumin i TEG koppar."
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De experiment som visas i figur 1 är representativa grumlighetsspårningskurvor av fibrinkoaglar hos människa och nötkreatur vid olika fibrinogennivåer. Representativa TEG-kalkeringskurvor för fibrinkoagulationsbildning vid olika fibrinogennivåer visas i figur 2. Båda tracing kurvor visar att efter en eftersläpning period efter propp initiering, clot grumlighet eller koagel amplitud ökar med tiden och planar ut i slutet av proppbildning. Ett endpointvärde av maximal proppbildning och tiden till maximal proppbildning från varje analys används för att bedöma funktionerna hos en helt bildad propp och den övergripande koagulationsprocessen. Maximal grumlighet (TurbMax) och tid till maximal grumlighet (TurbTime) är de två parametrarna som härrör från grumlighet medan maximal amplitud (TEGMax) och tid till maximal amplitud (TEGTime) härstammar från TEG.
Dessutom är TurbMax ett optiskt mått på koagelstruktur vilket är indikativt för fibrinfibertjocklek och fibrinnätverkets densitet. TEGMax är ett mekaniskt mått som återspeglar absolut proppstyrka. De representerar olika aspekter av en propp som kan förändras oberoende av varandra baserat på våra tidigare resultat14. Sammantaget ger de två värdena kompletterande insikt om koagelmikrostrukturerna, som hur täta fibrerna packas i fibrinnätet. För att uttryckligen se hur modulering av en koagulationsvariabel påverkar resultaten, ordnades data ytterligare och presenterades med hjälp av trendplaner. Representativa exempel på både grumlighet och TEG-datatrender visas i figur 3. Vid en högre nivå av fibrinogen i koagulationslösningen ökar alla fyra värden (TurbMax, TEGMax, TurbTime och TEGTime) ökar. Av dessa resultat kan man tolka att en högre fibrinogensubstratnivå resulterar i ett tätare fibröst nätverk som begränsar ljustransmissionen genom proppen (större TurbMax). Detta åtdragna nätverk ökar också proppstyrkan (större TEGMax). Töjningen av både TurbTime och TEGTime indikerar att fibrinpolymerisering hämmas vid ökade fibrinogennivåer. Trenderna för TurbMax och TEGMax för variabler som testats av vår grupp och deras tolkningar visas i tabell 1.
Figur 1: Representativa exempel på koagel grumlighetsspårningskurva (0 till 30 min). Grumlighetsspårningar av bovin (A) och human (B) fibrinbildning över tiden vid olika fibrinogenkoncentrationer (1, 2, 3, 4, 5 mg/mL) med 1 U/mL-arter matchade trombin. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Representativa exempel på TEG-kalkeringskurva (0 till 30 min). TEG amplitudspårningar av bovin (A) och human (B) fibrinbildning över tiden vid olika fibrinogenkoncentrationer (1, 2, 3, 4, 5 mg/mL) med 1 U/mL-arter avstämda trombin. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa exempel på grumlighet och TEG-datatrender. Datatrender för TurbMax och TurbTime (A) och trender för TEGMax och TEGTime (B) för olika fibrinogenkoncentrationer av nötkreatur eller människa (1, 2, 3, 4, 5 mg/ml) med 1U/mL-arter matchade trombin. Alla datapunkter och felstaplar är medelvärden och standardavvikelser av tre exemplar (Turbiditet) och dubbletter (TEG). Denna siffra har återanvänts från [Zeng, 2020]14. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| Variabler | Trend resultat | Tolkningar |
| Ökad fibrinogennivå | Ökad TurbMax och TEGMax | Bildande av stramare fibrinfibrer och tätare fibrösa nätverk |
| Ökad trombinnivå, pH och jonisk styrka | Minskade TurbMax, ökade TEGMax | Bildande av tunnare och stramare fibrinfibrer |
| Ökad albumin nivå | Ökad TurbMax, Minskad TEGMax | Bildande av tjockare och lösare fibrinfibrer |
Tabell 1: Resultat och tolkningar av TurbMax och TEGMax.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll visar utnyttjandet av två distinkta clot karakterisering verktyg testa en förenklad fibrinogen/trombin clot modell med hjälp av kommersiellt tillgängliga komponenter. Både TEG och grumlighet analyser är lätta att genomföra. De ger inte bara slutpunktskoagelundersökningar som max clot-bildning (TurbMax och TEGMax) och proppbildningstider (TurbTime och TEGTime) utan bedömer även den dynamiska proppformningsprocessen. Detta gör TEG och grumlighet värdefulla verktyg för clot karakterisering att lägga till alternativa metoder såsom: SEM, PT, aPTT, eller clot reologi, som kan ha komplicerade experimentella förfaranden eller fokusera bara på testning av en enda propp aspekt. Turbiditet och TEG resultat tillsammans erbjuder också en mer komplett profil av hur en koagulation variabel påverkar koagel egenskaper.
Förutom de koagulationsvariabler som beskrivs i detta protokoll finns det många andra variabler som kan studeras hävstångseffekt dessa tekniker. Detta protokoll kan ändras genom att justera: temperatur, kalciumnivåer, koagulationsfaktornivåer, tillsats av proppaktivatorer eller hämmare, eller tillsats av farmaceutiska medel, för att nämna några. Dessa variabler kan potentiellt studeras med hjälp av både det förenklade fibrinogen/trombinmodellsystemet eller med hjälp av plasma. Studera koagulering faktorer kräver noggrant övervägande och setup vara säker på att ge för korrekt uppströms clot aktivering initiera koagulationsvägen. Grumlighet och TEG är också effektiva verktyg som används för att övervaka koagel matsmältningen. Protokollet kan modifieras för att karakterisera fibrin clot bildning och lys i närvaro av antikoagulantia eller trombolytiska medel. Det är viktigt att notera att det terapeutiska medlet måste tillsättas före proppinitiering när TEG används eftersom koagulationssystemet är funktionellt slutet när instrumentet är i drift med stiftet sittande i TEG-analyskoppen. Med det sagt, TEG är oförmögen att användas för att testa den terapeutiska profilen av ett trombolytiskt medel i en befintlig propp.
I detta protokoll, båda assays genomfördes under deras vanligen utnyttjas experimentella förhållanden. TEG utförs vanligen vid 37 °C och grumlighetsanalyser utförs vid rumstemperatur (RT). Tonvikten i denna karakteriseringsmetod är att bestämma och tolka de trendresultat som en specifik variabel har på koagulation. Viktigt, kontrollera temperatur utnyttja TEG är okomplicerad som reagenser pipetteras direkt i en temperaturkontrollerad TEG kopp. Temperaturkontroll i en grumlighetsanalys är mindre okomplicerad eftersom koagulationsreagens blandas och initieras i en brunnsplatta innan de placeras inom en uppvärmd spektrometer. Hastigheten med vilken plattan och koagulationslösningen varm inom kammaren är långsam i förhållande till koagelbildningshastigheten och att upprätthålla alla reagenser och plattan vid förhöjd temperatur före placering i den uppvärmda kammaren kan vara svårt och resulterar ofta i dålig analysåtergivningsbarhet. Att upprätthålla en stadig temperatur än rumstemperatur för grumlighet analyser är ytterligare komplicerat när multiplexing över många brunnar. Ett annat kritiskt steg för att säkerställa en tillförlitlig och reproducerbar grumlighet resultat är att blanda brunnen för att inleda koagulering. Som direkt trombin-fibrinogen klyvning är snabb, blanda väl innan clot initiering kan kringgå icke-enhetlig fibrinbildning.
Detta protokoll kan också enkelt modifieras för att karakterisera en propp som bildas av kliniska prover som trombocytrik plasma eller trombocytfattig plasma. Citrated blod drar rekommenderas som de har validerats tidigare av standard TEG protokoll. Trombocytrik och blodplättsfattig plasma kan separeras från citraterat helblod via centrifugering vid 200 respektive över 2 000 x g i 15 min vid RT. Vid grumlighet eller TEG-analyser kan proppar initieras med tillsats av överskott av kalciumklorid (11 mM). Men eftersom fosfat kan binda till kalcium vilket resulterar i utfällning, pbs bör undvikas när kalcium används som propp initiatorn. Vid studier av trombocytrika plasmakoagelbildning är det viktigt att betrakta trombocytavsättning som en betydande confounder när man kör koagelbildningsanalyser under förhållanden där koagelbildningen är långsam. Frågor om trombocyt lösa är mindre slagkraftiga när blodpropp bildas är snabb. Detta är särskilt viktigt för grumlighetsanalyser där analysens noggrannhet och reproducerbarhet till stor del förlitar sig på homogeniteten hos reagenserna i brunnen. Om experimentell design tillåter, kaolin (ofta utnyttjas som en propp initiator för TEG) eller andra negativt laddade partikel aktivatorer kan användas för att påskynda plasma clot initiering genom att tillhandahålla ytterligare yta för snabbare kontakt utbildningsavsnitt aktivering av koagulering kaskad. Viktigt, aktivator suspensioner bör blandas noggrant med koagulationslösningar för att undvika att lösa. Vid utnyttjande av en yta eller laddad partikelbaserad proppaktivator se till att nödvändiga bakgrundskontroller beaktas eftersom reagenserna själva kan bidra till absorptivitet i grumlighetsanalyser. Dessutom, lösa kan vara ett problem med större partikel-baserade tillsatser såsom kaolin.
Helblodsprover bör bearbetas noggrant när man överväger användning av grumlighetsanalyser eftersom röda blodkroppar bidrar avsevärt till absorbans vid standardvåglängder av grumlighet. Av denna anledning överskrider mätningen av helblod via grumlighet ofta detektionsgränsen för de flesta spektrometrar och är typiskt sett inte genomförbart. Alternativa metoder för att karakterisera helblod kan vara nödvändigt eller utspädning före rinnande grumlighet assays på blodprov som innehåller röda blodkroppar är också möjligt. TEG och grumlighet, när de används tillsammans, ger för omfattande koagel bildning och rötning karakterisering genom att kombinera distinkta mätningar för clot styrka och fibrin fiber/nätverk morfologi för både mycket kontrollerade minimal protein koagulering analyser och kliniska plasma prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Albumin from human serum | Millipore Sigma | A1653 | ≥96%, lyophilized powder |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | ≥96%, lyophilized powder |
| Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear) | Haemonetics | REF 6211 | |
| Fibrinogen, Bovine Plasma | Millipore Sigma | 341573 | contains more than 95% clottable protein |
| Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma | Millipore Sigma | 341578 | Contains ≥ 95% clottable proteins. |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | 60130 | ≥99.5% purity |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P9791 | ≥98% purity |
| SevenEasy pH Meter | Mettler Toledo | S20 | |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | 71378 | ≥99.5% purity |
| Sodium phosphate dibasic | Millipore Sigma | 71636 | ≥99.5% purity |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system | Molecular Devices | M5 | |
| TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system | Haemonetics | 07-022 | |
| Thrombin, Bovine | Millipore Sigma | 605157 | |
| Thrombin, Human Plasma, High Activity | Millipore Sigma | 605195 |
References
- Beckman, M. G., Hooper, W. C., Critchley, S. E., Ortel, T. L. Venous Thromboembolism. A Public Health Concern. American Journal of Preventive Medicine. 38, 4 Suppl 495-501 (2010).
- Goldhaber, S. Z., Bounameaux, H. Pulmonary embolism and deep vein thrombosis. The Lancet. 379 (9828), 1835-1846 (2012).
- Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Mechanisms of fibrin polymerization and clinical implications. Blood. 121 (10), 1712-1719 (2013).
- Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50 (6), 1079-1093 (1986).
- Tripathi, M. M., et al. Clinical evaluation of whole blood prothrombin time (PT) and international normalized ratio (INR) using a Laser Speckle Rheology sensor. Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).
- Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L.
- Carr, M. E., Hermans, J. Size and Density of Fibrin Fibers from Turbidity. Macromolecules. 11 (1), 46-50 (1978).
- Carr, M. E., Shen, L. L., Hermans, J. A. N., Chapel, H. Mass-Length Ratio of Fibrin Fibers from Gel Permeation and Light Scattering. 16, 1-15 (1977).
- Gabriel, D. A., Muga, K., Boothroyd, E. M. The Effect of Fibrin Structure on Fibrinolysis. , 24259-24263 (1992).
- Wolberg, A. S., Gabriel, D. A., Hoffman, M. Analyzing fibrin clot structure using a microplate reader. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 13 (6), 533-539 (2002).
- da Luz, L. T., Nascimento, B., Rizoli, S. Thrombelastography (TEG): practical considerations on its clinical use in trauma resuscitation. Scandinavian Journal of Trauma, Resuscitation and Emergency Medicine. 21 (1), 29 (2013).
- Whitten, C. W., Greilich, P. E. Thromboelastography: past, present, and future . Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 92 (5), 1223-1225 (2000).
- Ranucci, M., Laddomada, T., Ranucci, M., Baryshnikova, E. Blood viscosity during coagulation at different shear rates. Physiological Reports. 2 (7), 1-7 (2014).
- Zeng, Z., Fagnon, M., Nallan Chakravarthula, T., Alves, N. J. Fibrin clot formation under diverse clotting conditions: Comparing turbidimetry and thromboelastography. Thrombosis Research. 187, 48-55 (2020).
