Summary
フィブリンは、止血症および血栓症の間に血栓形成を担当する。濁度アッセイおよびトロンボエラストグラヒ(TEG)は、血栓の相補的評価を提供する相乗的なツールとして利用することができる。これらの2つの技術を組み合わせることで、凝固条件がフィブリン血栓形成にどのような影響を与えるかについてのより多くの洞察を与えることができる。
Abstract
血栓症は世界的に主要な死因である。フィブリン(オーゲン)は、主に血栓形成または血栓症の原因となるタンパク質です。したがって、フィブリン血栓形成の特徴付けは、血栓症の研究に有益である。濁度および血栓芽細胞検査(TEG)は、血栓形成を監視するためのインビトロアッセイで広く利用されている。濁度は、分光計を介してフィブリン血栓構造を通して光透過率を動的に測定し、しばしば研究室で使用されます。TEGは、血液凝固強度を直接測定する特殊な粘弾性技術であり、主に患者の止血を評価するために臨床現場で利用されています。これら2つのツールの助けを借りて、この研究は、単純化されたフィブリノーゲン/トロンビン血栓モデルを使用してインビトロフィブリン血栓を特徴付けるための方法を説明する。両方の技術のデータ傾向は、様々な凝固条件下で比較された。牛凝固因子は、臨床および研究現場におけるヒト凝固因子の代替としてしばしば使用されるため、この研究ではヒトおよびウシのフィブリン血栓が並んで形成された。結果は、TEGと濁度トラック血栓形成が2つの異なる方法を介して、かつ一緒に利用される場合、多様な凝固条件にわたって相補的な血栓強度および繊維構造情報を提供することを示す。
Introduction
血栓症は、世界中の高い罹患率と死亡率につながる血液循環を遮断する体内の血栓の病理学的形成である。静脈血栓塞栓症の1〜2例と、年間1000人当たりの血栓症誘発血管疾患の2〜3例1,がある。血栓芽細胞検査(TEG)と濁度を利用して、様々な凝固条件下で血栓形成を監視する方法を紹介します。フィブリン(オーゲン)は、体内の血栓形成を担う一次タンパク質です。凝固カスケードの最終段階では、血栓が発達するに従って不溶性フィブリンモノマーの重合を開始するトロンビンによってフィブリノーゲンからフィブリノペプチドが切断される3,4。4病理的血栓症における血栓形成を理解するには、多様な凝固状況下でフィブリン形成を特徴付ける必要がある。複数の血栓モニタリングアッセイは、インビトロでのフィブリン血栓形成を研究するために利用されてきた。プロトロンビン時間(PT/INR)および活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)は、特定の凝固経路の完全性を測定する2つの一般的な臨床アッセイである。しかし、それらは、物理血栓プロパティ5を示さない唯一の変数として時間を使用します。電子顕微鏡法は、完全に形成されたフィブリン血栓の微細構造の可視化を可能にするが、血栓形成プロセス自体に関する情報を提供しない6。すべてのアッセイの中で、濁度アッセイおよびTEGは、時間の経過とともに血栓特性を動的に追跡する能力を提供する。これらの技術は、包括的な凝固プロファイルの測定を可能にし、したがって、他のフィブリン凝固特性測定ツールよりもいくつかの利点を提供する。
具体的には、濁度アッセイ(または血栓タービディメトリー)は、その単純な実装と研究室での分光計の広いアクセシビリティのために研究と臨床用途に広く使用されています。このアッセイは、定義された波長(最も一般的には350-700 nmの範囲の波長で)で個々の反復測定値を取ることによって形成血栓を通して光透過率の動的測定を可能にする7。読書室の温度はまた調節することができる。フィブリンゲルが形成されるに伴い、タンパク質ネットワークを通過する光量が減少し、時間の経過とともに吸光度が増加します。同様に、血栓ネットワークが劣化すると吸光度が低下する。濁度アッセイは、マルチウェルプレート形式を使用して簡単に多重化することができ、96ウェルプレートと384ウェルプレートの両方で高スループットのサンプルスクリーニングが可能です。いくつかの血栓特性は、最大濁度、最大濁度までの時間、凝固する時間、および血栓形成速度(Vmax)を含む濁度トレーシング曲線(経時の吸光度)から導き出すことができます。フィブリン繊維質量/長さ比は、フィブリン繊維の,厚さ8、9、109を推定するために生8の濁度データからも導き出すことができます。10
TEGは、主に患者の止血症および血栓のリシスを評価するために臨床現場で利用される。また、抗線維化分解薬や止血性血液製剤をいつ投与すべきかを決定するために、外科用途で一般的に使用されます11,,12.血栓形成は、アッセイ開始前にカップに全ての凝固成分が加えられるTEGカップの内部で起こる。カップは、進化する血栓で、その中心に挿入されたピンに対して物理的に回転し、電気機械トーションセンサーは血栓の粘弾性強度の増加を測定する。このアッセイは、典型的には37°Cの生理学的温度で行われる。ただし、温度は、機器上で手動で調整することができます。最大振幅(MA)、反応速度(R)、運動時間(K)、α角(角度)、および最大振幅(TMA)までの時間は、動的TEGトレーシングからTEGソフトウェアによって抽出される。これらの値は、典型的には、患者の凝固状態を評価するために臨床正常範囲と比較される。TEGは正確には粘度計ではありませんが、ミリ単位の血栓強度を測定するため、医師が特定の血液製剤を投与し、治療的投与を調整することを決定するための貴重な臨床意思決定ツールとして重要な粘弾性血栓データおよび機能を提供します。TEGと濁度アッセイの両方を併用すると、凝固強度とキネティクスがTEGから容易に抽出され、フィブリン繊維厚が光学的濁度測定によってアクセスできるため、相補的な血栓特性評価情報を提供します。
フィブリンは血栓の重要な成分であるため、多様な血栓形成条件下でのフィブリン血栓特徴付けは、特定の変数が血栓形成プロセスおよび最終的な血栓特性にどのように寄与するかについての貴重な洞察を提供することができる。これを理解することは、血栓症診断と治療薬の開発のためのガイダンスを提供することができます。より代表的なフィブリン血栓の特徴を得るために、プラズマは、単純化されたフィブリノーゲン/トロンビンモデルシステムよりも密接に生体内凝固条件に似ているため、血栓形成を監視するために置き換えることができます。しかし、凝固カスケードの複雑な性質により、プラズマを用いた血栓形成は複雑さを増し、個々の因子の影響を分離することがより困難になります。単純化フィブリノーゲン/トロンビンモデルを利用することで、凝固カスケード全体を開始する必要がなくなり、最終的なフィブリン形成ステップの分離が可能になります。2つの主要なフィブリン形成成分(フィブリノーゲンおよびトロンビン)を含めることによって、このセットアップは高度に制御された血栓形成条件を作成する。また、ここでは簡略化された血栓モデルを使用する一方で、このプロトコルを利用して、追加の凝固因子を含めることによってより複雑な血栓を特徴付けることもできます。本研究では、濁度およびTEGを用いたフィブリン血栓特性解析は、フィブリノーゲンおよびトロンビン濃度、イオン強度、pH、および全タンパク質濃度を生体内凝固環境において異なることを模倣する凝固液中での異なる濃度によって行われる。プロトコルに対するこれらのバリエーションに関する詳細は、セクション5に含まれています。
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Protocol
1. リン酸緩衝液生理食塩分の調製 (PBS)
注:記載されたアッセイはカルシウムの添加を必要としなかったので、PBSはこの研究を通じて使用された。カルシウムを添加する際に、しばしば、クチレートされた血液製剤を再石灰化するために利用される、カルシウムがリン酸塩緩衝液中に沈殿することが知られているので、PBSは避けるべきであることに注意することが重要である。
- 137 mM の塩化ナトリウム、1.8 mM リン酸カリウム一塩基、10 mM リン酸ナトリウム塩基、2.7 mM 塩化カリウムを DI 水中に混合して 0.01 M、pH 7.4 PBS バッファーを作ります。
- pHプローブを使用してバッファーpHを検証し、必要に応じて水酸化ナトリウムまたは塩酸を使用してpHを調整します。
- フィブリノーゲンおよび凝固アッセイの調製には、このPBSを使用してください(特に指定がない限り)。
注:DI水中での再水和は37°Cでもフィブリノーゲン沈殿を生じる可能性があるため、バッファーはフィブリノーゲン粉末を再構成することが示唆されています。
2. タンパク質の調製と保存
注:プロトコル全体を通して、タンパク質ストック濃度は、最終的な凝固液中の塩、DI水、PBSおよび他の残留因子の一貫した比率を可能にするために、濁り度とTEGのために異なる濃度で調製される。
- フィブリノーゲンの調製と保管
注:市販のフィブリノーゲン中の汚染物質は、かなりの量の因子XIII、他の凝固因子の残留量、貯蔵バッファーおよび塩を含む。カルシウムの存在下では、第1III因子はフィブリン血栓ネットワークを架橋することが知られている。この効果は、凝固した血栓構造とフィブリンの特性に影響を与える血栓強度の強化に寄与する。市販のアクティビティキットを使用して、アクティブ因子XIIIaレベルを決定できます。因子XIIIaによって引き起こされる変動を最小限に抑えるために、実験はカルシウムの排除または因子XIIAを除去するための追加のステップをこのプロトコルに組み込むべきであると設計されるべきである。さらに、タンパク質貯蔵塩および緩衝液タイプを評価し、必要に応じて透析を行い、好ましいアッセイ作業バッファーに移すことができる。- 1チューブあたり20mgのタンパク質で2mLチューブで2mLチューブで凍結乾燥フィブリノーゲン粉末(ウシまたはヒト)を計量し、アリコートを6ヶ月間-20°Cで保存します。
- 実験当日10分間、フィブリノーゲンアリコートをRT(室温)に順応させます。使用前に600μLのPBSをアリコート20分に添加してフィブリノーゲンを再構成する。
- フィブリノーゲンを10μLとし、UV透明96ウェルプレートまたはキュベットで190μLのPBSで希釈します。市販の分光計とそのソフトウェアを介して280 nmで吸光度を取ることによってフィブリノーゲン濃度を決定します。
- ビールの法則を用いてフィブリノーゲン濃度(mg/mL)を計算します。PBSで更に希釈して12mg/mL(濁度アッセイ用)と3.2mg/mL(TEG用)フィブリノーゲンストック溶液を準備します(特に指定がない限り)。
注:ビールの法則によるフィブリノーゲン濃度決定(mg/mL):
モル絶滅係数: ɛ = 513,400 L モル-1 cm-1 で 280 nm;パスの長さ (L)。希釈係数 (D);分子量(MW)=340,000 Da. ɛ は、E0.1%= 1.51 (280 nm) (廃棄係数、サプライヤーによって与えられる) を MW に掛けることによって導出されます。
- トロンビンの準備と保管
- 凍結乾燥したトロンビン(ウシまたはヒト、1000 Uストック)を200μLの脱イオン(DI)水で再構成し、5000 U/mLトロンビンストック溶液の200 μLを作ります。
- 溶液の5μL(20 U/チューブ)アリコートを作り、アリコートを−20°Cで凍結してください。
- 実験当日にRTでトロンビンアリコートを15分間解凍し、濁度アッセイでは20 U/mL、DI水でTEG用に18 U/mLに希釈してトロンビン作業溶液を作ります(特に指定がない限り)。
注:解凍および使用時に氷上で酵素を維持することによって達成することができる酵素活性を維持するために予防措置を取る必要があります。しかし、RTで解凍した直後に利用した場合、トロンビン活性の低下は認められなかった。
3. 濁り
- 350 ~700 nmの吸光度範囲を持つ市販の分光計と、時間の経過に伴う血栓の濁度を監視する対応するソフトウェアを使用してください( 材料表を参照)。
- 分光計をオンにして、対応する解析ソフトウェアを開きます。
- プレート 1を選択し、プレート設定タブを開きます。時間の経過に応じ、動的吸光度の読み取りを監視するには、ABSモードとキネティックをクリックします。
- 波長タブで550 nm(または350~700 nmの範囲の任意の値)を選択し、合計実行時間をタイミングタブで30秒の間隔で60分に調整します。井戸を強調表示することによって読書のための興味の井戸を選択します。必要に応じて、他の設定を調整します。
注:範囲の下端(約350 nm)で波長を選択すると感度が向上しますが、吸光度は分光器の検出限界を超える可能性もあります。濁度測定に最も一般的に利用される波長は、文献で405 nmです。ただし、このプロトコルは、動的濁度値がすべての実験の検出限界内であることを確認するために 550 nm を使用します。選択された読み取り間隔は、アッセイ感度の最高レベルを達成するためにできるだけ短くする必要があります。これは、特定のアッセイ中に読み取られる分光計と井戸の数に依存します。 - UV透明の96ウェルプレートを取ります。読書のために選ばれた井戸のピペット140 μL PBS。10 μLのトロンビン(20 U/mL)をウェルに加えて混ぜます。
注:高結合アッセイプレートを使用して、ウェル表面への非特異的タンパク質結合を最小限に抑えないでください。これは、溶液中のタンパク質分散に影響を与え、高いアッセイ変動をもたらす可能性があります。 - 50 μLのフィブリノーゲン(12 mg/mL)をウェルに加えて直ちに凝固を開始し、3 mg/mL フィブリノーゲンと 1 U/mL トロンビンの最終濃度で 200 μL 凝固液を得ます。水の中の内容物を5回ピペットで混ぜ、光を散乱させることで吸光度に影響を与えるため、溶液中に泡が生じないように注意してください。
注:同じプレート上で複数の血栓サンプルを同時に実行する場合は、マルチチャンネルピペットを使用します。測定器が最初に読み取る前の井戸と時間差を記録して、凝固時間をオフセットします。 - ホルダーに96ウェルプレートを置き、ソフトウェアの [開始 ]をクリックして、RTで濁度の読み取りを開始します。
注:高温でアッセイを行う場合、分光器、プレート、試薬はすべて、血栓開始前に所望の温度で維持されなければなりません。 - 完成したら、濁度データを取得し、プロットソフトウェアで時間の経過に伴う吸光度変化をプロットすることによって濁度トレース曲線を取得します。
- 時間の経過に伴う曲線の最大吸光度値を取ることによってTurbMax( フィブリン繊維厚さとフィブリンネットワーク密度の最大濁度を示す)を導き出します。
注:フィブリン繊維質量/長さ比は、以下の原稿8に記載された式を使用して濁度値から計算することができます。 - ターブマックスに90%を掛けることで、90%の 最大濁度を計算します。血栓開始から90%の最大濁度までの時間を計算することによってターブタイム を導き出す。
注:90%最大濁度までの時間は、非常に可変的な最終血栓形成期間を排除することによって血栓時間をよりよく表すので、絶対的な最大濁度に時間よりも信頼性の高い指標です。血栓発症時間(試験開始から吸光度が増加し始める時間)、血栓形成速度(Vmax、濁度トレース曲線における線形領域の最大の傾き)などの追加の凝固パラメータも、濁度トレースから抽出することができる。
4. 血栓芽細胞学 (TEG)
- 血栓ガストグラフ分析装置をオンにし、温度が37 °Cで安定するのを待ちます。
- TEG - ソフトウェアを開きます。ログインしたら、ID セクションの下に実験名を作成します。
- 画面のソフトウェアプロンプトに従って、すべてのチャンネルに対してeテストを実施します。すべてのチェックが完了したら、レバーをロード位置に戻します。
メモ:TEG eテストが必要であり、計測器を使用する際は毎回行う必要があります。TEG凝固制御アッセイ(TEGレベル1およびレベル2コントロールを用いた)は、臨床サンプルに利用される場合、定期的な製造業者が提案した間隔で必要とされる。 - TEGタブをクリックし、使用するチャネルのサンプル情報を入力します。対応するチャネルに透明なコーティングされていない TEG カップを配置します。キャリアを上までスライドさせ、カップ底を5回押してピンをトーションロッドに貼り付けます。キャリアを下げ、カップを「クリック」するまでキャリアベースに下向きに押し込みます。
- ピペット20 μLのトロンビン溶液(18 U/mL)をTEGカップに入れた。340 μL のフィブリノーゲン(3.2 mg/mL)を TEG カップに加えて、3 mg/mL フィブリノーゲンと 1 U/mL トロンビンの最終濃度で 360 μL 凝固液を得ることによって、直ちに凝固を開始します。内容物を上下に5回ピペットで混ぜます。
注: 潜在的な凝固因子または関心のある他のコンポーネントは、TEGカップ内で常に360 μLの最終容積を維持するように注意して、このステップ中に追加する必要があります。 - カップに積まれたキャリアをスライドさせて、レバーを読み取り位置に移動し、ソフトウェアで [開始 ]をクリックしてTEG読み取りを開始します。
- TEG が完了したら (約 1 時間後に)、TEG パラメーターを取得し、プロット ソフトウェアで時間の経過に伴う振幅をプロットして TEG トレース 曲線を取得します。
- ソフトウェアから TEGMax (最大振幅は血栓強度を示す) と TMA を TEG時間 (最大振幅までの時間) として収集します。
注: MA は、3 分間の時間の間に振幅が 5% 未満の偏差を持つ時点で最大振幅としてソフトウェアによって計算されます。TMAは、最大血栓発生速度(分割点付近)からMAまでの時間として決定される。他のパラメータは、血栓解析を実行する際に評価するのに役立つ場合もあります。これらのパラメータの例としては、R-time(試験開始から振幅が2mmに達するまでの時間)、K(Rの終わりから振幅が20mmに達するまでの時間)、アルファ(RとKの間の線の傾き)、CLT(血栓の起血症時間)が含まれます。
5. 異なる凝固条件下でのフィブリン特性
注:フィブリノーゲンおよびトロンビン濃度、イオン強度、pH、および全タンパク質濃度などの凝固液中の特定の変数を調節することによって、フィブリン特性評価実験を行います。これらの例の変数を含む実験用の準備については、このセクションで説明します。しかし、他の凝固因子や関心条件も置き換えることができます。それぞれのユニークなアッセイ要件を考慮して、適切なバッファシステムを慎重に選択します。濁度およびTEGアッセイのために、これらの変数の効果を分析しながら正確な背景減算を確実にする制御のみバッファを含む。
- フィブリノーゲン濃度の変化 (1, 2, 3, 4, 5 mg/mL)
- ステップ 2.1.4 を調整して、異なる濃度でフィブリノーゲンストックを調製します (4, 8, 12, 16, 濁度アッセイの場合は 20 mg/mL,1.1, 2.1, 3.2, 4.2, TEG用 5.3 mg/mL)。
- ステップ3.6を調整して、濁度アッセイのために「50 μLフィブリノーゲン(4、8、12、16、20 mg/mL)を96ウェルプレートの複数のウェルに加える」。
- TEG のステップ 4.5 を調整して、TEG の「340 μL フィブリノーゲン (1.1、2.1、3.2、4.2、5.3 mg/mL)をクリア TEG カップに加える」。
- 様々なトロンビン濃度(0.1、0.3、0.6、0.8、1、2.5、5、10 U/mL)
- ステップ2.2.3を調整して、異なる濃度(2、6、12、16、20、50、100、200 U/mL(濁アッセイの場合は2、6、12、16、200 U/mL、1.8、5.4、10.8、14.4、18、45、90、180 U/mL)を調整します。
- ステップ3.5を調整して、濁度アッセイのために「10 μLトロンビン(2、6、12、16、20、50、100、200 U/mL)を96ウェルプレートの複数のウェルに加える」。
- ステップ 4.5 を TEG 用の「ピペット 20 μL トロンビン(1.8,5.4,10.8,14.4,18,45,90,180 U/mL)に調整する」
- イオン強度の変化 (0.05, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17, 0.3 M)
- 塩化ナトリウム(21、101、111、121、131、141、271mM)を1.8 mMリン酸カリウム一塩基、10mMリン酸二塩基ナトリウム、2.7 mM塩化カリウムと共に溶解し、イオン強度の異なる0.01MPBS溶液を作ります。
- 異なるイオン強度で作られたPBSを使用して、濁度とTEGアッセイの両方にフィブリノーゲンおよび凝固液を調製するようにステップ1.3を調整します。
- pH (5.8、6.6、7.3、7.4、7.5、および 8.0)
- リン酸二塩基ナトリウム(0.7,3.2,7.7,8.1,8.4,9.5mM)及びリン酸カリウム一塩基(8.2, 6.0,2.0,1.7,1.4,0.5mM)と2.7 mM塩化カリウムおよび塩化ナトリウム(153,147,138,137,136,134 mM)と共に、pHおよび0.165Mの最終的なイオン強度を有する0.01 M PBS溶液を作る。
- pHプローブを介してバッファpH値を確認し、必要に応じてpHを調整します。
- ステップ1.3を調整して異なるpHで作られたPBSを使用して、濁度およびTEGアッセイの両方に対してフィブリノーゲンおよび凝固液を調製する。
- アルブミン濃度の変化 (0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/mL)
- 実験当日に20分間RTで500μLのPBSに凍結乾燥したアルブミン2gを溶解する。
- アルブミンのモルのモルの絶滅係数 43,800 L-1 cm-1 cm (280 nm) のステップ 2.1.3 と 2.1.4 で述べたのと同じ手順を使用してアルブミン濃度を決定します。
- 異なる濃度でアルブミンストックを準備します。
- ステップ 3.5 を「読み取り用に選択されたウェル内のピペット 40 μL PBS」に調整し、10 μL トロンビン (20 U/mL) を加えます。ステップ 3.6 を「50 μL フィブリノーゲン (12 mg/mL) と 100 μL アルブミン (0, ) を加えてすぐに凝固を開始する」 40,80,100,120,160,160mg/mL)を複数の井戸に入れ、3mg/mLフィブリノーゲン、1 U/mLトロンビン、0、20、40、50、60、80、100mg/mLアルブミンをウェルに入れた。
- ステップ 4.5 を「200 μL アルブミン (36, 72, 90, ) の混合物を加えてすぐに凝固を開始する 108、144、180 mg/mL)および140 μL 7.7 mg/mLフィブリノーゲンをTEGカップに入れ、3mg/mLフィブリノーゲン、1 U/mLトロンビン、0、20、40、50、60、80、80、10mggのカップで最終濃度の360 μL凝固液を得る。
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Representative Results
図1に示す実験は、異なるフィブリノーゲンレベルにおけるヒトおよびウシフィブリン血栓の代表的な濁度トレース曲線である。異なるフィブリノーゲンレベルでのフィブリン血栓形成のための代表的なTEGトレーシング曲線を図2に示す。両方のトレース曲線は、血栓開始後のラグ期間の後、血栓濁度または血栓振幅が時間の経過とともに増加し、血栓形成の終わりにはずれくなることを示しています。各アッセイから最大血栓形成の終点値と最大血栓形成までの時間は、完全に形成された血栓の特徴および全体的な凝固プロセスを評価するために使用される。最大濁度(ターブマックス)および最大濁度(ターブタイム)は濁度に由来する2つのパラメータであり、最大振幅(TEGMax)と最大振幅までの時間(TEG時間)はTEGに由来します。
さらに、ターブマックスは、フィブリン繊維の厚さとフィブリンネットワーク密度を示す血栓構造の光学的尺度です。TEGMaxは絶対血栓強度を反映する機械的な測定です。彼らは、私たちの以前の知見14に基づいて互いに独立して変化することができる血栓の異なる側面を表しています。2つの値を組み合わせることで、繊維がフィブリンネットワークにどれだけ密に詰められるかなど、血栓の微細構造に関する補完的な洞察を提供します。凝固変数の調節が結果に与える影響を明確に確認するために、データはさらに整理され、トレンドプロットを使用して表示されます。濁度とTEGデータの傾向の両方の代表的な例を図3に示す。凝固液中のフィブリノーゲンの高いレベルでは、4つの値(ターブマックス、TEGマックス、ターブタイム、およびTEG時間)が増加します。Timeこれらの結果から、フィブリノーゲン基質レベルが高いほど、血栓を通る光透過を制限する繊維状ネットワークが密集すること(より大きなTurbMax)をもたらすと解釈できる。この強化されたネットワークはまた血栓の強さを高める(より大きいTEGの最大)。ターブ時間とTEG時間の両方の伸びは、フィブリン重合がフィブリノーゲンレベルの増加で妨げられていることを示しています。グループでテストした変数のターブマックスとTEGマックスの傾向とその解釈を表1に示します。
図1:血栓濁度トレーシングカーブの代表的な例(0〜30分)。異なるフィブリノーゲン濃度(1、2、3、4、5 mg/mL)でのウシ(A)およびヒト(B)フィブリンの濁度トレースはトロンビンと一致した1つのU/mL種を有する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:TEGトレース曲線の代表例(0~30分)。異なるフィブリノーゲン濃度(1、2、3、4、5 mg/mL)でのウシ(A)およびヒト(B)のTEG振幅トレースはトロンビンに一致した1つのU/mL種を有する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:濁り度とTEGデータの傾向の代表例。ターブマックスとターブタイム(A)のデータ動向と、1U/mL種の異なる牛またはヒトフィブリノーゲン濃度(1、2、3、4、5 mg/ml)のTEGMaxおよびTEG時間(B)の傾向はトロンビンと一致した。すべてのデータポイントと誤差範囲は、三重化 (濁度) と重複 (TEG) の平均値と標準偏差です。●このフィギュアは「Zeng、2020」14から14再利用されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 変数 | トレンドの結果 | 解釈 |
| フィブリノーゲンレベルの増加 | ターブマックスとTEGマックスの増加 | よりタイトなフィブリン繊維と高密度繊維網の形成 |
| トロンビンレベル、pHおよびイオン強度の向上 | ターブマックスを減少、TEGマックスを増加 | より薄く、より緊密なフィブリン繊維の形成 |
| アルブミンレベルの向上 | 増加ターブマックス、減少TEGマックス | より厚く、より緩いフィブリン繊維の形成 |
表1:ターブマックス とTEGマックスの結果と解釈.
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Discussion
このプロトコルは、市販のコンポーネントを使用して単純化されたフィブリノーゲン/トロンビン血栓モデルをテストする2つの異なる血栓特徴付けツールの利用を実証する。TEGおよび濁度アッセイは、いずれも容易に実施できます。それらは、最大血栓形成(ターブマックス およびTEGマックス)および血栓形成時間(ターブ時間 およびTEG時間)のような終点血栓検査を提供するだけでなく、動的血栓形成プロセスを評価する。これにより、複雑な実験手順を持つか、単一の血栓の側面のテストにのみ焦点を当てることができるSEM、PT、aPTT、または血栓の学理などの代替方法に追加するための血栓特性評価のためのTEGと濁度の貴重なツールを作ります。濁度とTEGの結果を合わせると、凝固変数が血栓特性にどのように影響を与えるのか、より完全なプロファイルを提供します。
このプロトコルで詳しく説明する凝固変数に加えて、これらの手法を活用して研究できる変数も数多くあります。このプロトコルは、温度、カルシウムレベル、凝固因子レベル、クロット活性化剤または阻害剤の添加、または医薬品の添加を調整することによって変更することができます。これらの変数は、単純化されたフィブリノーゲン/トロンビンモデルシステムの両方を使用するか、プラズマを使用して研究できる可能性があります。凝固因子を研究するには、凝固経路を開始する適切な上流血栓活性化を確実に行うことを慎重に検討し、セットアップする必要があります。濁度およびTEGはまた血栓の消化を監視するために使用される有効な用具である。プロトコルは、抗凝固剤または血栓溶解剤の存在下でフィブリン血栓形成および溶解を特徴付けるために変更することができる。TEGアッセイカップにピンを装着して作動する場合、凝固システムが機能的に閉じられるため、凝固システムを使用する場合は、凝固開始前に治療剤を添加する必要があることに注意することが重要です。そうは言うまでも、TEGは既存の血栓中の血栓溶解剤の治療プロファイルをテストするために使用することができない。
このプロトコルでは、両方のアッセイが一般的に利用される実験条件下で行われた。TEGは一般的に37°Cで行われ、濁度アッセイは室温(RT)で行われる。この特性評価手法の重点は、特定の変数が凝固に持つトレンドの結果を決定し、解釈することです。重要なことに、TEGを利用した温度制御は、試薬が温度制御されたTEGカップに直接配管されるため、簡単です。濁度アッセイにおける温度制御は、凝固試薬が混合され、加熱分光器内に配置される前にウェルプレートで開始されるため、あまり簡単ではありません。チャンバー内のプレートおよび凝固液が、クロット形成速度に比べて遅く、すべての試薬とプレートを高温で保つのは難しい場合があり、しばしば試作の再現性が悪い結果となる。濁度アッセイの室温以外の安定した温度を維持することは、多くの井戸を横切って多重化する場合にさらに複雑です。信頼性が高く再現性のある濁度の結果を確保するためのもう一つの重要なステップは、凝固を開始するために井戸を混合することです。直接トロンビンフィブリノーゲン切断が速いように、血栓開始前によく混合すると、不均一なフィブリン形成を回避することができる。
このプロトコルは、血小板が豊富な血漿や血小板不良血漿などの臨床サンプルによって形成された血栓を特徴付けるために容易に変更することができる。彼らは標準TEGプロトコルによって以前に検証されているように、クビレート血液の引き出しをお勧めします.血小板が豊富で血小板不良血漿は、それぞれRTで15分間200xg以上の遠心分離を介してクエント全g血から分離することができる。濁度またはTEGアッセイでは、過剰な塩化カルシウム(11mM)を添加して血栓を開始することができる。しかし、リン酸は沈殿をもたらすカルシウムに結合することができるので、血栓のイニシエーターとしてカルシウムを使用する場合はPBSを避けるべきである。血小板が豊富な血漿血栓形成を研究する際には、血栓形成が遅い条件で血栓形成アッセイを実行する際に、血小板の沈降を重要なコンファウンダーとして検討することが重要です。血小板形成が速い場合、血小板の沈降に関する問題は影響を受けにくい。これは、アッセイの精度と再現性が井戸内の試薬の均質性に大きく依存する濁度アッセイにとって特に重要です。実験設計が許せば、カオリン(しばしばTEG用の血栓開始剤として利用される)または他の負に荷電した粒子活性化剤は、凝固カスケードの迅速な接触経路活性化のための付加的な表面積を提供することによって血漿凝固開始をスピードアップするために使用することができる。重要なことに、活性化剤懸濁液は、沈降を避けるために凝固液と十分に混合されるべきである。表面積または荷電粒子ベースの血栓活性化剤を利用する場合、試薬自体が濁度アッセイの吸収性に寄与する可能性があるため、必要なバックグラウンドコントロールが考慮されるようにしてください。さらに、沈降はカオリンなどのより大きな粒子ベースの添加剤で問題になる可能性があります。
赤血球は標準的な濁度波長での吸光度に大きく寄与するので、濁度アッセイの使用を検討する際には、全血サンプルを慎重に処理する必要があります。このため、濁度を介した全血の測定は、多くの場合、ほとんどの分光計の検出限界を超え、典型的には実現不可能である。全血を特徴付ける別の方法は、赤血球を含む血液サンプルに対して濁度アッセイを実行する前に必要であるか希釈する必要がある場合もある。TEGと濁度を併用すると、高度に制御された最小限のタンパク質凝固アッセイと臨床血漿サンプルの両方に対して、血栓強度とフィブリン繊維/ネットワーク形態に関する明確な測定値を組み合わせることで、包括的な血栓形成と消化特性を提供します。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
なし。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Albumin from human serum | Millipore Sigma | A1653 | ≥96%, lyophilized powder |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | ≥96%, lyophilized powder |
| Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear) | Haemonetics | REF 6211 | |
| Fibrinogen, Bovine Plasma | Millipore Sigma | 341573 | contains more than 95% clottable protein |
| Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma | Millipore Sigma | 341578 | Contains ≥ 95% clottable proteins. |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | 60130 | ≥99.5% purity |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P9791 | ≥98% purity |
| SevenEasy pH Meter | Mettler Toledo | S20 | |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | 71378 | ≥99.5% purity |
| Sodium phosphate dibasic | Millipore Sigma | 71636 | ≥99.5% purity |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system | Molecular Devices | M5 | |
| TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system | Haemonetics | 07-022 | |
| Thrombin, Bovine | Millipore Sigma | 605157 | |
| Thrombin, Human Plasma, High Activity | Millipore Sigma | 605195 |
References
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