Summary
Фибрин отвечает за образование тромбов во время гемостаза и тромбоза. Анализы турбитии и тромбоэластогры (TEG) могут быть использованы в качестве синергетический инструмент, который обеспечивает дополнительную оценку сгустка. Эти два метода вместе может дать более глубокое представление о том, как свертывание условия влияют на образование сгустка фибрина.
Abstract
Тромбоз является основной причиной смерти во всем мире. Фибрин (оген) является белок в первую очередь отвечает за образование тромбов или тромбоза. Поэтому для изучения тромбоза полезно характеризование образования фибринового сгустка. Турбичность и тромбоэластография (TEG) широко используются в пробирке анализы для мониторинга образования тромбов. Турбичность динамически измеряет передачу света через структуру сгустка фибрина через спектрометр и часто используется в исследовательских лабораториях. TEG является специализированным вязко-вязкостатический метод, который непосредственно измеряет силу сгустка крови и в первую очередь используется в клинических условиях для оценки гемостаз пациентов. С помощью этих двух инструментов, это исследование описывает метод для характеристики тромба фибрина in vitro с помощью упрощенной модели сгустка фибриногена/тромба. Тенденции данных по обоим методам сравнивались в различных условиях свертывания крови. Человеческие и бычьи сгустки фибрина были сформированы бок о бок в этом исследовании, как бычьего свертывания факторов часто используются в качестве заменителей факторов свертывания человека в клинических и научно-исследовательских условиях. Результаты показывают, что TEG и мутность отслеживать образование тромбов с помощью двух различных методов и при использовании вместе обеспечивают дополнительную силу сгустка и волокна структурной информации через различные условия свертывания.
Introduction
Тромбоз является патологическим образованием тромба в организме, который блокирует кровообращение, что приводит к высокой заболеваемости и смертности во всем мире. Есть от 1 до 2 случаев венозной тромбоэмболии и от 2 до 3 случаев тромбоза индуцированных сосудистых заболеваний на 1000человек в год 1,2. Здесь представлен метод, использующий тромбоэластографию (TEG) и мутность для мониторинга образования тромбов при различных условиях свертывания крови. Фибрин (оген) является основным белком, который отвечает за образование тромбов в организме. На заключительных этапах каскада коагуляции фибринопептиды расщепляются из фибриногена путем тромбина, инициируя полимеризацию нерастворимых мономеров фибринапомере развития тромба3,4. Чтобы понять образование тромбов при патологическом тромбозе, необходимо охарактеризовать образование фибрина при различных обстоятельствах свертывания крови. Несколько анализов мониторинга сгустка были использованы для изучения образования сгустка фибрина в пробирке. Протромбиново время (PT/INR) и активированное частичное время тромбопластина (aPTT) являются двумя общими клиническими анализами, которые измеряют целостность конкретного пути свертывания. Тем не менее, они используют время в качестве единственной переменной, которая не дает никаких указаний на физические свойствасгустка 5. Электронная микроскопия позволяет визуализировать микро-структуру полностью сформированного фибринового сгустка, но не дает никакой информации о процессе формирования тромба6. Среди всех анализов, мутность анализы и TEG предлагают возможность отслеживать характеристики сгустка динамически с течением времени. Эти методы позволяют измерять всеобъемлющие профили свертывания и, следовательно, обеспечивают некоторую выгоду по отношению к другим инструментам характеристики сгустка фибрина.
В частности, анализ мутности (или мутбиметрия сгустка) широко используется для исследований и клинического применения из-за его упрощенного внедрения и широкой доступности спектрометров в исследовательских лабораториях. Этот анализ позволяет динамическое измерение передачи света через формирование сгустка, принимая отдельные повторяющиеся показания на определенной длине волны (чаще всего на длине волны в диапазоне 350 - 700 нм)7. Температура в считывной камере также может быть скорректирована. По мере того как гель фибрина формирует, количество света которое перемещает через сеть протеина уменьшен причиняя увеличение в поглощении над временем. Аналогичным образом, абсорбт уменьшается, когда сеть сгустков ухудшается. Анализы турбити могут быть легко мультиплексированы с использованием формата мульти-хорошо пластины, чтобы обеспечить высокую пропускную способность образца скрининга в обоих 96- и 384-хорошо пластин. Несколько характеристик сгустка могут быть получены из кривой отслеживания мутности (поглощение с течением времени измерения), которые включают в себя: максимальная мутность, время до максимальной мутности, время начала сгустка, и скорость образования сгустка (Vmax). Соотношение массы/длины фибринового волокна также может быть получено из необработанных данных о мутности для оценкитолщины фибринового волокна 8,,9,,10.
TEG в первую очередь используется в клинических условиях для оценки гемостаза пациентов и лиза тромба. Он также широко используется в хирургических приложениях, чтобы определить, когда антифибринолитические препараты или гемостатические продукты кровидолжны быть введены 11,12. Образование сгустка происходит внутри чашки TEG со всеми компонентами свертывания добавляются в чашку до начала анализа. Чашка, с развивающимся сгустком, физически вращается против штифта, который вставляется в его центр, а электромеханический датчик коксиона измеряет возрастающую вязко-вязкую прочность сгустка. Этот анализ обычно проводится при физиологической температуре 37 градусов по Цельсию; однако, температура может быть вручную отрегулирована на приборе. Максимальная амплитуда (MA), скорость реакции (R), время кинетики (K), угол (угол) и время максимальной амплитуды (TMA) извлекаются программным обеспечением TEG из динамического отслеживания TEG. Эти значения обычно сравниваются с клиническими нормальными диапазонами для оценки состояния свертывания пациента. Хотя TEG не является точно вискометром, так как он измеряет прочность сгустка в миллиметровых единицах, он обеспечивает важные вязкоэлетические данные сгустка и функционирует как ценный клинический инструмент принятия решений для врачей, чтобы принять решение о введении конкретных продуктов крови и настроить терапевтическуюдозирование 13. Когда как TEG и мутность анализы используются вместе, они обеспечивают дополнительную информацию характеристики сгустка, как сила сгустка и кинетики легко извлекаются из TEG и толщины волокна фибрина могут быть доступны для оптических измерений мутности.
Поскольку фибрин является важнейшим компонентом сгустка крови, характеристика сгустка фибрина при различных условиях образования тромбов может дать ценную информацию о том, как определенная переменная способствует процессу образования тромбов и конечным свойствам сгустка. Понимание этого может обеспечить руководство для диагностики тромбоза и развития терапии. Чтобы получить более репрезентативную характеристику сгустка фибрина, плазма может быть заменена для мониторинга образования тромбов, поскольку она напоминает условия свертывания виво более тесно, чем упрощенная система модели фибриногена/тромбина. Однако из-за сложного характера каскада коагуляции образование тромбов с использованием плазмы усугубляет сложность, что затрудняет изоляцию воздействия отдельных факторов. Использование упрощенной модели фибриногена/тромбина предотвращает необходимость инициировать весь каскад свертывания, позволяющий изоляцию заключительного шага формирования фибрина. Путем включая 2 главных компонента образования fibrin (фибриноген и тромбин), эта установка создает высоки контролируемое условие образования сгустка. Важно также отметить, что, хотя упрощенная модель сгустка используется здесь, этот протокол также может быть использован для характеристики более сложных сгустков, включая дополнительные факторы свертывания. В этом исследовании, фибринового сгустка характеристики с использованием мутности и TEG проводятся путем различных концентраций фибриногена и тромбина, ионическая сила, рН, и общая концентрация белка в свертываемости раствора для имитации различных обстоятельств свертываниявиво 14. Подробная информация об этих изменениях в протоколе была включена в раздел 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка фосфатного буферного солевого раствора (PBS)
ПРИМЕЧАНИЕ: PBS был использован на протяжении всего этого исследования, как описанные анализы не требуют добавления кальция. Важно отметить, что при добавлении кальция, часто используется для повторного кальцификации цитированных продуктов крови, PBS следует избегать, как кальций, как известно, осаждаются в фосфатных буферов.
- Сделать 0,01 М, рН 7,4 PBS буфера путем смешивания 137 мМ хлорида натрия, 1,8 мМ фосфат фосфата фосфата, 10 м натрия фосфат дибазий и 2,7 мМ м хлорида калия в воде DI.
- Проверить буфер рН с помощью зонда рН и настроить рН с использованием гидроксида натрия или соляной кислоты по мере необходимости.
- Используйте этот PBS для подготовки фибриногена и свертывания анализов (если иное не указано).
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер предлагается воссоздать фибриногенный порошок, так как регидратация в воде DI может привести к фибриногену осадков даже при 37 градусов по Цельсию.
2. Приготовление и хранение белков
ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всего протокола концентрации белковых запасов готовятся в различных концентрациях для мутности и TEG, чтобы обеспечить последовательное соотношение соли, ВОДЫ DI, PBS и других остаточных факторов в окончательных растворах свертывания.
- Приготовление и хранение фибриногена
ПРИМЕЧАНИЕ: Загрязнения в коммерчески доступных фибриногена включают значительное количество фактора XIII, остаточное количество других факторов свертывания крови, буфер хранения и соли. В присутствии кальция, фактор XIII, как известно, перекрестной сети сгустка фибрина. Этот эффект способствует ужесточению структуры сгустка и повышенной прочности сгустка, влияющих на характеристику фибрина. Коммерчески доступные наборы активности могут быть использованы для определения уровня активного фактора XIIIa. Чтобы свести к минимуму изменчивость, вызванную фактором XIIIa, эксперименты должны быть разработаны с исключением кальция или дополнительные шаги по удалению фактора XIIIa должны быть включены в этот протокол. Кроме того, следует оценить содержание соли для хранения белка и буферного типа и при необходимости провести диализ для перевода в предпочтительный рабочий буфер анализа.- Взвешивание и алицит лиофилизированный фибриногенный порошок (бык или человек) в 2 мл трубки при 20 мг белка на трубку и хранить aliquots при -20 градусов по Цельсию на срок до 6 месяцев.
- Разрешить фибриноген aliquot акклиматизироваться к RT (комнатная температура) в течение 10 минут в день эксперимента. Восстановленный фибриноген, добавив 600 МКЛ PBS к алициту за 20 минут до использования.
- Возьмите 10 МКЛ фибриногена и разбавьте его 190 МКЛ PBS в прозрачной 96-ну пластины или кюветт. Определите концентрацию фибриногена, принимая абсорбцию на 280 нм с помощью коммерческого спектрометра и его программного обеспечения.
- Рассчитайте концентрацию фибриногена (мг/мл) с помощью закона пива. Подготовка 12 мг/мл (для анализа мутности) и 3,2 мг/мл (для TEG) фибриногенных фондовых растворов путем дальнейшего разбавления PBS (если иное не указано).
ПРИМЕЧАНИЕ: Определение концентрации фибриногена (мг/мЛ) по закону пива:
Коэффициент вымирания моляра: ɛ 513 400 лмол -1 см -1 при 280 нм; Патленгт (L); Фактор разбавления (D); Молекулярный вес (МВт) - 340 000 da. ɛ вытекает путем умножения E0,1% и 1,51 (280 нм) (коэффициент вымирания, данный поставщиком) с МВт.
- Приготовление и хранение тромбина
- Восстановленный лиофилизированный тромбин (бычий или человеческий, 1000 U запасов) в 200 МКЛ деионизированной (DI) воды, чтобы сделать 200 йл из 5000 U/mL тромбина фондового раствора.
- Сделайте 5 мкл (20 U/tube) алициты раствора и держите алициты замороженными при 20 градусах Цельсия.
- Оттепель тромбин aliquots на RT в течение 15 минут в день эксперимента и сделать тромбин рабочий раствор, разбавляя его до 20 U/mL для анализа мутности и 18 U/mL для TEG с ВОДОЙ DI (если иное не указано).
ПРИМЕЧАНИЕ: Меры предосторожности должны быть приняты для поддержания активности ферментов, которые могут быть выполнены путем поддержания ферментов на льду во время оттаивания и использования; однако, никакого снижения активности тромбина не наблюдалось при использовании непосредственно после оттаивания на RT.
3. Мутность
- Используйте любой коммерчески доступный спектрометр, который имеет диапазон поглощения 350 - 700 нм и соответствующее программное обеспечение для мониторинга мутности сгустка с течением времени (см. Таблицу материалов).
- Включите спектрометр и откройте соответствующее программное обеспечение анализа.
- Выберите табличку 1 и откройте вкладку настроек пластины. Нажмите режим ABS и Kinetic, чтобы контролировать динамическое чтение абсорбанса с течением времени.
- Выберите 550 нм (или любое значение в диапазоне 350 - 700 нм) в вкладке волны и отрегулируйте общее время времени времени времени, чтобы быть 60 мин с интервалом 30 с в вкладке времени. Выберите скважины, представляющие интерес для чтения, подчеркнув скважины. При необходимости отрегулируйте другие настройки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор длины волны на нижнем конце диапазона (около 350 нм) обеспечивает лучшую чувствительность, но абсорбция может также превышать предел обнаружения спектрометра. Наиболее часто используемая длина волны для измерения мутности составляет 405 нм в литературе; однако в этом протоколе используется 550 нм для обеспечения того, чтобы динамические значения мутности были в пределах предела обнаружения для всех экспериментов. Выбранный интервал чтения должен быть как можно более коротким для достижения наивысшего уровня чувствительности анализа. Это будет зависеть от спектрометра и количества скважин, читаемых во время данного анализа. - Возьмите УФ-прозрачную пластину из 96 колодец. Pipette 140 хл PBS в хорошо, который выбран для чтения. Добавить и смешать 10 мкл тромбина (20 U/mL) в колодец.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте высокие связывающие анализные пластины, чтобы свести к минимуму неспецифическую связывание белка с поверхностью колодец. Это может повлиять на дисперсию белка в растворе и привести к высокой изменчивости анализа. - Немедленно инициировать свертываемость путем добавления 50 МКЛ фибриногена (12 мг/мл) в колодец для получения раствора свертывания крови 200 л с конечной концентрацией 3 мг/мл фибриногена и 1 тромбина U/mL. Смешайте содержимое в колодец, трубя вверх и вниз пять раз заботясь, чтобы избежать создания пузырьков в растворе, поскольку они будут влиять на поглощение путем рассеяния света.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте многоканальный пипетку при запуске нескольких образцов сгустка на одной тарелке в то же время. Рекордные разницы во времени между скважинами и период времени до первого чтения инструментом, чтобы компенсировать время свертывания. - Поместите 96-хорошо пластины в держатель и нажмите Начало в программное обеспечение, чтобы начать мутность чтения на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении анализа при повышенной температуре спектрометр, пластина и реагенты должны поддерживаться при желаемой температуре до начала образования тромба. - После завершения, получить данные мутности и получить кривую отслеживания мутности, замышляя изменение поглощения с течением времени в программном обеспечении построения.
- Получить TurbMax (максимальная мутность, указывая на толщину волокна фибрина и плотность сети фибрина), принимая максимальное значение поглощения кривой с течением времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение массы/длины волокна Фибрина может быть рассчитано из значений мутности с использованием уравнения, представленного в следующей рукописи8. - Рассчитайте 90% максимальной мутности, умножая TurbMax на 90%. Получите TurbTime, вычисляя время от инициации сгустка до 90% максимальной мутности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время до 90% максимальной мутности является более надежным метрики, чем время для абсолютной максимальной мутности, как это лучше представляет сгусток времени, устраняя весьма переменной заключительный период образования сгустка. Дополнительные параметры свертывания, такие как время начала образования тромба (время от начала теста до того, когда абсорбация начинает увеличиваться), и скорость образования тромбов (Vmax, самый большой наклон линейной области в кривой отслеживания мутности) также могут быть извлечены из отслеживания мутности.
4. Тромбоэластография (TEG)
- Включите анализатор тромбоэластографа и подождите, пока температура стабилизируется при температуре 37 градусов по Цельсию.
- Открытый TEG - программное обеспечение. После вошли в систему, создать имя эксперимента в разделе ID.
- Проведте электронный тест для всех каналов, следуя подсказкам программного обеспечения на экране. Поместите рычаг обратно в положение нагрузки, как только все проверки будут завершены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется электронный тест TEG, который должен проводиться каждый раз при использовании инструмента. TEG coagulation контроль анализы (с использованием TEG уровня 1 и уровня 2 контроля) необходимы на регулярной производитель предложил интервалы при использовании для клинических образцов. - Нажмите на вкладку TEG, вввените образец информации для каналов, которые будут использоваться. Поместите четкую чашку TEG без покрытия в соответствующий канал. Сдвиньте носитель вверх и нажмите чашку нижней 5 раз, чтобы прикрепить булавку к торсион стержень. Опустите перевозчика и нажмите чашку вниз в базу перевозчика, пока он не "клики".
- Пипетка 20 МКЛ раствора тромбина (18 U/mL) в чашку TEG. Немедленно инициировать свертывание, добавив 340 л фибриногена (3,2 мг/мл) в чашку TEG для получения раствора свертывания крови 360 л с окончательной концентрацией 3 мг/мл фибриногена и 1 U/mL тромбина в чашке. Смешайте содержимое, трубя вверх и вниз пять раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Потенциальные факторы свертывания крови или другие компоненты, представляющие интерес, должны быть добавлены в ходе этого шага, будучи осторожными, чтобы всегда поддерживать окончательный объем 360 МЛ в чашке TEG. - Сдвиньте чашку загружен перевозчика вверх, переместить рычаг в положение чтения и нажмите Начало в программном обеспечении, чтобы инициировать чтение TEG.
- После завершения TEG (примерно через час) извлечения параметров TEG и получения кривой трассировки TEG путем построения амплитуды с течением времени в программном обеспечении для построения.
- Соберите MA как TEGMax (максимальная амплитуда свидетельствует о прочности сгустка) и TMA как TEGTime (время до максимальной амплитуды) от программного обеспечения.
ПРИМЕЧАНИЕ: MA рассчитывается программным обеспечением как максимальная амплитуда в то время, когда амплитуда имеет менее 5% отклонения в течение 3-минутного периода времени. TMA определяется как время от максимальной скорости генерации тромба (около точки разделения) до MA. Другие параметры также могут быть полезны для оценки при выполнении анализа тромбов. Некоторые примеры этих параметров включают в себя: R-время (время от начала теста до того, когда амплитуда достигает 2 мм), K (время от конца R до когда амплитуда достигает 20 мм), альфа (наклон линии между R и K), и CLT (время свертывания лиза).
5. Фибрин характеристика при различных условиях свертывания
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните эксперименты по характеристике фибрина, модулируя определенную переменную в решениях свертывания крови, таких как: концентрации фибриногена и тромбина, ионическая сила, рН и общие концентрации белка. Экспериментальные препараты с этими примерами переменных описаны в этом разделе; однако, другие факторы свертывания и условия интереса можно заменить также. Тщательно выберите подходящую буферную систему с учетом каждого уникального анализа требований. Для анализа мутности и TEG, включите буфер только контроль, чтобы обеспечить точное вычитание фона при анализе эффекта этих переменных.
- Изменяемая концентрация фибриногена (1, 2, 3, 4, 5 мг/мл)
- Отрегулируйте шаг 2.1.4 для подготовки фибриногенного запаса в различных концентрациях (4, 8, 12, 16, 20 мг/мл для анализа мутности и 1.1, 2.1, 3.2, 4.2, 5.3 мг/мл для TEG).
- Отрегулируйте шаг 3.6, чтобы "добавить 50 мкл фибриногена (4, 8, 12, 16, 20 мг/мл) в несколько колодцев 96 скважин" для анализа мутности.
- Отрегулируйте шаг 4.5, чтобы "добавить 340 МКЛ фибриноген (1,1, 2,1, 3,2, 4,2, 5,3 мг/мл) в четкие чашки TEG" для TEG.
- Различаемая концентрация тромбина (0,1, 0,3, 0,6, 0,8, 1, 2,5, 5, 10 U/mL)
- Отрегулируйте шаг 2.2.3 для подготовки запасов тромбина в различных концентрациях (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 U/mL для анализа мутности и 1.8, 5.4, 10.8, 14.4, 18, 45, 90, 180 U/mL для TEG).
- Отрегулируйте шаг 3.5, чтобы "добавить 10 тромбина (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 U/mL) в несколько скважин 96 скважин" для анализа мутности.
- Отрегулируйте шаг 4.5 к «трубе 20 тромбину L (1.8, 5.4, 10.8, 14.4, 18, 45, 90, 180 U/mL) в ясные чашки TEG» для TEG.
- Различная ионная прочность (0,05, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17 и 0,3 М)
- Растворить хлорид натрия (21, 101, 111, 121, 131, 141 и 271 мМ) вместе с 1,8 мМ фосфатом калия монобазным, 10 м Натрием фосфатным дибазом и 2,7 мМ хлоридом калия в воде ДИ, чтобы сделать 0,01 М.П. решения с различной ионной прочностью.
- Отрегулируйте шаг 1.3 для использования PBS сделанных на по-разному ионных прочностях для того чтобы подготовить fibrinogen и свертывая разрешения для обоих анализов мутности и TEG.
- Переменный рН (5,8, 6,6, 7,3, 7,4, 7,5 и 8,0)
- Растворить фосфатный дибаз (0,7, 3,2, 7,7, 8,1, 8,4, 9,5 мМ) и монобазный фосфат калия (8,2, 6,0, 2,0, 1.7, 1.4, 0.5 mM) вместе с 2.7 mM хлоридом калия и хлоридом натрия (153, 147, 138, 137, 136, 134 mM) для того чтобы сделать разрешения 0.01 M PBS с меняя pH и окончательной ионной прочностью на 0.165 M.
- Проверить значение буфера рН с помощью зонда рН и при необходимости настроить рН.
- Отрегулируйте шаг 1.3 для использования PBS, сделанного при различных рН для подготовки фибриногена и свертывания раствора для анализа мутности и TEG.
- Изменяемая концентрация альбумин (0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 мг/мл)
- Растворите 2 г лиофилизированного альбумин в 500 МКЛ PBS в RT в течение 20 минут в день эксперимента.
- Определите концентрацию альбуминов с помощью той же процедуры, упомянутой в шаге 2.1.3 и 2.1.4 с коэффициентом вымирания моляла 43800 l molNo1 см No1 (при 280 нм) для альбумин.
- Подготовка альбумин запасов в различных концентрациях.
- Отрегулируйте шаг 3.5 до "Pipette 40 йL PBS в хорошо, который выбран для чтения и добавить 10 йл тромбина (20 U/mL)". Отрегулируйте шаг 3.6 к «Инициировать свертываемость немедленно путем добавлять фибриноген 50 л (12 мг/mL) с альбомином 100 l (0, 40, 80, 100, 120, 160, 200 мг/мл) в несколько скважин до конечной концентрации 3 мг/мл фибриногена, 1 тромбина U/mL и 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 мг/мл альбумин в колодцах."
- Отрегулируйте шаг 4.5 до "Немедленно инициировать свертываемость, добавляя смесь из 200 МКЛ альбумин (36, 72, 90, 108, 144, 180 мг/мл) и 140 л 7,7 мг/мл фибриногена в чашки TEG для получения раствора свертывания крови 360 л с окончательной концентрацией 3 мг/мл фибриногена, 1 U/mL тромбина и 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 мг/мл альбумин в чашках TEG."
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эксперименты, показанные на рисунке 1, являются репрезентативными кривыми отслеживания мутности человеческих и бычьих сгустков фибрина на различных уровнях фибриногена. Представитель TEG отслеживания кривых для формирования сгустка фибрина на различных уровнях фибриногена показаны на рисунке 2. Обе кривые трассировки показывают, что после периода задержки после начала образования сгустка, мутность сгустка или амплитуда сгустка увеличивается с течением времени и выравнивается в конце образования сгустка. Значение конечной точки максимального образования сгустка и время максимального образования сгустка от каждого анализа используются для оценки особенностей полностью сформированного сгустка и общего процесса свертывания. Максимальная мутность (TurbMax) и время до максимальной мутности (TurbTime) являются двумя параметрами, полученными из мутности, в то время как максимальная амплитуда (TEGMax) и время до максимальной амплитуды (TEGTime) являются производными от TEG.
Кроме того, TurbMax является оптической мерой структуры сгустка, что свидетельствует о толщине фибринового волокна и плотности фибриновой сети. TEGMax является механической мерой, которая отражает абсолютную прочность сгустка. Они представляют различные аспекты сгустка, которые могут меняться независимо друг от друга на основе наших предыдущихвыводов 14. Взятые вместе, эти два значения дают дополнительное представление о микроструктурах сгустка, таких как плотные волокна упакованы в сеть фибринов. Чтобы четко увидеть, как модуляция переменной свертывания влияет на результаты, данные были дополнительно организованы и представлены с использованием трендовых участков. Репрезентативные примеры тенденций как мутности, так и тенденций данных TEG приведены на рисунке 3. На более высоком уровне фибриногена в растворе свертывания, все четыре значения (TurbMax, TEGMax, TurbTime и TEGTime) увеличиваются. Из этих результатов можно интерпретировать, что более высокий уровень фибриногена субстрата приводит к более плотной волокнистой сети, ограничивающей передачу света через сгусток (больше TurbMax). Эта затянутая сеть также повышает прочность сгустка (больше TEGMax). Удлинение времени Turbи TEGTime указывает на то, что полимеризация фибрина затрудняется при повышенном уровне фибриногена. Тенденции TurbMax и TEG Max дляпеременных, проверенных нашей группой, и их интерпретации показаны в таблице 1.
Рисунок 1: Репрезентативные примеры кривой отслеживания мутности тромба (от 0 до 30 мин). Отслеживание турбидрита образования крупного рогатого скота (A) и человека (B) фибрина с течением времени в различных концентрациях фибриногена (1, 2, 3, 4, 5 мг/мл) с 1 U/mL видов соответствует тромбина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Репрезентативные примеры кривой трассировки TEG (от 0 до 30 мин). TEG амплитуды трассировки крупного рогатогоскота( A ) и человека ( B )фибринаформирования с течением времени в различных концентрациях фибриногена (1, 2, 3, 4, 5 мг/ мл) с 1 U / МЛ видов соответствует тромбина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Репрезентативные примеры тенденций в области мутности и данных TEG. Тенденции данных TurbMax и TurbTime (A)и тенденции TEGMax и TEGTime (B) дляразличных концентраций крупного рогатого скота или фибриногена человека (1, 2, 3, 4, 5 мг/мл) с 1U/mL видами, сопогрясными тромбином. Все точки данных и бары ошибок являются средними и стандартными отклонениями от трипликаторов (Turbidity) и дубликатов (TEG). Эта цифра была повторно использована из «Цзэн, 2020»14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Переменные | Результаты тренда | Интерпретации |
| Повышенный уровень фибриногена | Увеличенный TurbМакс и TEGМакс | Формирование более плотных фибринов и более плотной волокнистой сети |
| Повышенный уровень тромбина, рН и ионическая прочность | Снижение TurbMax, увеличение TEGМакс | Формирование более тонких и плотных волокон фибрина |
| Повышенный уровень альбумин | Увеличенный TurbМакс, Снижение TEGМакс | Формирование более толстых и рыхлых фибринов |
Таблица 1: Результаты и интерпретации TurbMax и TEGMax.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол демонстрирует использование двух различных инструментов характеристики сгустка тестирования упрощенной модели сгустка фибриногена/тромбина с использованием коммерчески доступных компонентов. И TEG и мутность анализы легко провести. Они не только обеспечивают конечные точки сгустка обследований, таких как максимальное образование сгустка (TurbMax и TEGMax) и время образования сгустка (TurbTime и TEGTime), но и оценить динамический процесс формирования сгустка. Это делает TEG и мутность ценными инструментами для характеристики сгустка, чтобы добавить к альтернативным методам, таким как: SEM, PT, aPTT, или clot rheology, которые могут иметь сложные экспериментальные процедуры или сосредоточиться только на тестировании одного аспекта сгустка. Turbidity и TEG результаты вместе также предлагают более полный профиль того, как переменная свертывания влияет на характеристики сгустка.
В дополнение к переменным свертывания крови, описанным в этом протоколе, есть много других переменных, которые могут быть изучены с использованием этих методов. Этот протокол может быть изменен путем корректировки: температура, уровень кальция, уровни коэффициента свертывания, добавление активаторов или ингибиторов сгустка, или добавление фармацевтических агентов, чтобы назвать несколько. Эти переменные потенциально могут быть изучены с использованием как упрощенной системы модели фибриногена/тромбина, так и с помощью плазмы. Изучение факторов коагуляции требует тщательного рассмотрения и установки, будучи уверенным, чтобы обеспечить надлежащее активации сгустка вверх по течению инициируя путь свертывания. Turbidity и TEG также являются эффективными инструментами, используемыми для мониторинга пищеварения тромбов. Протокол может быть изменен, чтобы охарактеризовать образование сгустка фибрина и лиза в присутствии антикоагулянтов или тромболитических агентов. Важно отметить, что терапевтический агент должен быть добавлен до начала сгустка при использовании TEG, как система свертывания функционально закрыта, когда инструмент находится в эксплуатации с булавкой сидит в чашке анализа TEG. С тем, что сказал, TEG не может быть использован для проверки терапевтического профиля тромболитического агента в существующий сгусток.
В этом протоколе оба анализа проводились в их обычно используемых экспериментальных условиях. TEG обычно выполняется при температуре 37 градусов по Цельсию, и анализы мутности проводятся при комнатной температуре (RT). Основное внимание в этом методе характеристики заключается в том, чтобы определить и интерпретировать результаты тренда, которые определенная переменная имеет на свертываемость. Важно отметить, что контроль температуры с использованием TEG прост, так как реагенты помываются непосредственно в контролируемую температурой чашку TEG. Контроль температуры в анализе мутности менее прост, так как реагенты свертывания смешиваются и ими и начаты в хорошо пластине до того, как они помещаются в нагретый спектрометр. Скорость, с которой пластина и свертывание раствор тепло в камере медленно по отношению к скорости образования сгустка и поддержания всех реагентов и пластины при повышенной температуре до размещения в нагретой камере может быть трудно и часто приводит к плохой воспроизводимости анализа. Поддержание устойчивой температуры, кроме комнатной температуры для анализа мутности, еще более осложняется при мультиплексии во многих скважинах. Еще одним важным шагом для обеспечения надежного и воспроизводимого результата мутности является смешивание хорошо инициировать свертывания. Как прямой тромбин-фибриноген расщепления быстро, смешивание задолго до начала сгустка может обойти неоднородное образование фибрина.
Этот протокол также может быть легко изменен, чтобы охарактеризовать сгусток, образованный клиническими образцами, такими как богатая тромбоцитами плазма или плазма, бедная тромбоцитами. Цитированные анализы крови рекомендуется, поскольку они были проверены ранее стандартными протоколами TEG. Богатая тромбоцитами и плохая тромбоцитами плазма может быть отделена от цитированной цельной крови через g центрифугирование в 200 и более 2000 х г в течение 15 минут в RT, соответственно. При мутности или TEG анализы, сгустки могут быть начаты с добавлением избыточного хлорида кальция (11 мМ). Однако, так как фосфат может связываться с кальцием в результате осадков, PBS следует избегать, когда кальций используется в качестве инициатора сгустка. При изучении тромбоцитов богатых образованием сгустка плазмы, важно рассмотреть тромбоцитов урегулирования в качестве значительного confounder при запуске образования сгустка анализы в условиях, в которых образование тромбов медленно. Вопросы, касающиеся урегулирования тромбоцитов являются менее эффективными, когда образование тромбов быстро. Это особенно важно для анализа мутности, когда точность анализа и воспроизводимость в значительной степени зависят от однородности реагентов в колодеце. Если экспериментальная конструкция позволяет, каолин (часто используется в качестве инициатора сгустка для TEG) или другие отрицательно заряженные активаторы частиц могут быть использованы для ускорения начала плазменного сгустка, предоставляя дополнительную площадь поверхности для более быстрой активации контактного пути каскада коагуляции. Важно отметить, что подвески активатора должны быть тщательно смешаны с свертыванием растворов, чтобы избежать урегулирования. При использовании поверхности области или заряженных частиц на основе сгустка активатор обеспечить, чтобы необходимые фоновые элементы управления принимаются во внимание, как реагенты сами могут способствовать поглощению в мутности анализов. Кроме того, урегулирование может быть проблемой с более крупными добавками на основе частиц, такими как каолин.
Образцы цельной крови должны быть обработаны тщательно при рассмотрении использования анализа мутности, так как красные кровяные тельца вносят значительный вклад в поглощение на стандартных длинах волн мутности. По этой причине измерение всей крови через мутность часто превышает предел обнаружения большинства спектрометров и, как правило, не представляется возможным. Альтернативные методы для характеристики всей крови может быть необходимым или разбавления до запуска мутности анализы на образцы крови, которые содержат красные кровяные тельца также возможно. TEG и мутность, при использовании вместе, обеспечивают всеобъемлющее образование тромбов и характеристики пищеварения путем объединения различных измерений прочности сгустка и фибринового волокна / морфологии сети как для высоко контролируемых минимальных анализов свертывания белка и клинических образцов плазмы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Ни один.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Albumin from human serum | Millipore Sigma | A1653 | ≥96%, lyophilized powder |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | ≥96%, lyophilized powder |
| Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear) | Haemonetics | REF 6211 | |
| Fibrinogen, Bovine Plasma | Millipore Sigma | 341573 | contains more than 95% clottable protein |
| Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma | Millipore Sigma | 341578 | Contains ≥ 95% clottable proteins. |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | 60130 | ≥99.5% purity |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P9791 | ≥98% purity |
| SevenEasy pH Meter | Mettler Toledo | S20 | |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | 71378 | ≥99.5% purity |
| Sodium phosphate dibasic | Millipore Sigma | 71636 | ≥99.5% purity |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system | Molecular Devices | M5 | |
| TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system | Haemonetics | 07-022 | |
| Thrombin, Bovine | Millipore Sigma | 605157 | |
| Thrombin, Human Plasma, High Activity | Millipore Sigma | 605195 |
References
- Beckman, M. G., Hooper, W. C., Critchley, S. E., Ortel, T. L. Venous Thromboembolism. A Public Health Concern. American Journal of Preventive Medicine. 38, 4 Suppl 495-501 (2010).
- Goldhaber, S. Z., Bounameaux, H. Pulmonary embolism and deep vein thrombosis. The Lancet. 379 (9828), 1835-1846 (2012).
- Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Mechanisms of fibrin polymerization and clinical implications. Blood. 121 (10), 1712-1719 (2013).
- Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50 (6), 1079-1093 (1986).
- Tripathi, M. M., et al. Clinical evaluation of whole blood prothrombin time (PT) and international normalized ratio (INR) using a Laser Speckle Rheology sensor. Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).
- Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L.
- Carr, M. E., Hermans, J. Size and Density of Fibrin Fibers from Turbidity. Macromolecules. 11 (1), 46-50 (1978).
- Carr, M. E., Shen, L. L., Hermans, J. A. N., Chapel, H. Mass-Length Ratio of Fibrin Fibers from Gel Permeation and Light Scattering. 16, 1-15 (1977).
- Gabriel, D. A., Muga, K., Boothroyd, E. M. The Effect of Fibrin Structure on Fibrinolysis. , 24259-24263 (1992).
- Wolberg, A. S., Gabriel, D. A., Hoffman, M. Analyzing fibrin clot structure using a microplate reader. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 13 (6), 533-539 (2002).
- da Luz, L. T., Nascimento, B., Rizoli, S. Thrombelastography (TEG): practical considerations on its clinical use in trauma resuscitation. Scandinavian Journal of Trauma, Resuscitation and Emergency Medicine. 21 (1), 29 (2013).
- Whitten, C. W., Greilich, P. E. Thromboelastography: past, present, and future . Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 92 (5), 1223-1225 (2000).
- Ranucci, M., Laddomada, T., Ranucci, M., Baryshnikova, E. Blood viscosity during coagulation at different shear rates. Physiological Reports. 2 (7), 1-7 (2014).
- Zeng, Z., Fagnon, M., Nallan Chakravarthula, T., Alves, N. J. Fibrin clot formation under diverse clotting conditions: Comparing turbidimetry and thromboelastography. Thrombosis Research. 187, 48-55 (2020).
