Summary
Fibrin ist verantwortlich für die Gerinnselbildung während der Hämostase und Thrombose. Trübungsassays und Thromboelastograhy (TEG) können als synergistische Werkzeuge eingesetzt werden, die eine komplementäre Bewertung eines Gerinnsels ermöglichen. Diese beiden Techniken zusammen können mehr Einblick in die Art und Weise geben, wie Gerinnungsbedingungen die Bildung von Fibringer beeinflussen.
Abstract
Thrombose ist weltweit eine der Haupttodesursachen. Fibrin(ogen) ist das Protein, das in erster Linie für die Gerinnselbildung oder Thrombose verantwortlich ist. Daher ist die Charakterisierung der Fibringeringerbildung vorteilhaft für die Untersuchung der Thrombose. Trübungs- und Thromboelastographie (TEG) sind beide weit verbreitete In-vitro-Assays zur Überwachung der Gerinnselbildung. Trübungsmittel misst dynamisch die Lichtdurchlässigkeit durch eine Fibrin-Gerinnselstruktur über ein Spektrometer und wird häufig in Forschungslabors eingesetzt. TEG ist eine spezialisierte viskoelastische Technik, die die Blutgerinnselstärke direkt misst und vor allem in klinischen Umgebungen zur Beurteilung der Hämostase der Patienten eingesetzt wird. Mit Hilfe dieser beiden Werkzeuge beschreibt diese Studie eine Methode zur Charakterisierung eines In-vitro-Fibringermitensels mit einem vereinfachten Fibrinogen/Thrombin-Gerinnselmodell. Die Datentrends beider Techniken wurden unter verschiedenen Gerinnungsbedingungen verglichen. Menschliche und Rinder Fibrin-Gerinnsel wurden nebeneinander in dieser Studie gebildet, da Rinder gerinnungsfaktoren werden oft als Ersatz für menschliche Gerinnungsfaktoren in klinischen und Forschungsumgebungen verwendet. Die Ergebnisse zeigen, dass TEG- und Trübungsbahn-Gerinnselbildung über zwei unterschiedliche Methoden und bei gleichzeitiger Nutzung komplementäre Gerinnselfestigkeit und Faserstrukturinformationen über verschiedene Gerinnungsbedingungen hinweg liefern.
Introduction
Thrombose ist die pathologische Bildung eines Blutgerinnsels im Körper, das die Durchblutung blockiert, was weltweit zu hoher Morbidität und Sterblichkeit führt. Es gibt 1 bis 2 Fälle von venöser Thromboembolie und 2 bis 3 Fälle von Thrombose-induzierten Gefäßerkrankungen pro 1000 Personen jährlich1,2. Hier wird eine Methode vorgestellt, bei der die Thromboelastographie (TEG) und die Trübung zur Überwachung der Gerinnselbildung unter verschiedenen Gerinnungsbedingungen genutzt werden. Fibrin(ogen) ist das primäre Protein, das für die Gerinnselbildung im Körper verantwortlich ist. In den letzten Schritten der Gerinnungskakadade werden Fibrinopeptide aus Fibrinogen durch Thrombin, das die Polymerisation von unlöslichen Fibrinmonomeren initiiert, während das Gerinnsel3,4entwickelt. Um die Gerinnselbildung bei pathologischer Thrombose zu verstehen, ist es notwendig, die Fibrinbildung unter verschiedenen Gerinnungsbedingungen zu charakterisieren. Mehrere Gerinnsel-Monitoring-Assays wurden verwendet, um die Bildung von Fibrin-Gerinnsel in vitro zu untersuchen. Prothrombinzeit (PT/INR) und aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) sind zwei häufige klinische Assays, die die Integrität eines bestimmten Gerinnungswegs messen. Sie verwenden jedoch die Zeit als einzige Variable, die keinen Hinweis auf physikalische Gerinnseleigenschaftengibt 5. Die Elektronenmikroskopie ermöglicht die Visualisierung der Mikrostruktur eines vollständig geformten Fibringer, liefert aber keine Informationen über den Gerinnselbildungsprozess selbst6. Unter allen Assays bieten Trübungstests und TEG die Möglichkeit, Gerinnseleigenschaften im Laufe der Zeit dynamisch zu verfolgen. Diese Techniken ermöglichen das Maß umfassender Gerinnungsprofile und bieten somit einen gewissen Nutzen gegenüber anderen Fibrin-Gerinnselcharakterisierungswerkzeugen.
Insbesondere Trübungsassays (oder Gerinnseltrübung) werden aufgrund ihrer vereinfachten Umsetzung und der breiten Zugänglichkeit von Spektrometern in Forschungslaboratorien häufig für Forschungs- und klinische Anwendungen eingesetzt. Dieser Test ermöglicht eine dynamische Messung der Lichtdurchlässigkeit durch ein sich bildendes Gerinnsel, indem einzelne sich wiederholende Messwerte bei einer definierten Wellenlänge (am häufigsten bei einer Wellenlänge im Bereich von 350 – 700 nm)7durchgeführt werden. Die Temperatur in der Lesekammer kann ebenfalls eingestellt werden. Wenn sich Fibrin-Gel bildet, wird die Menge an Licht, die durch das Proteinnetzwerk fließt, reduziert, was zu einer Erhöhung der Absorption im Laufe der Zeit führt. In ähnlicher Weise nimmt die Absorption ab, wenn das Gerinnselnetz abnimmt. Trübungsassays können leicht mit einem Multi-Well-Plattenformat multiplexiert werden, um probenlange Sprossenabsiebungen in 96- und 384-Well-Platten zu ermöglichen. Mehrere Gerinnseleigenschaften können aus einer Trübungsverfolgungskurve (Absorption im Zeitmessung) abgeleitet werden, die Folgendes umfasst: maximale Trübung, Zeit bis maximaler Trübung, Zeit bis zum Gerinnselbeginn und Gerinnselbildungsrate (Vmax). Ein Fibrinfaser-Massen-Längen-Verhältnis kann auch aus rohen Trübungsdaten abgeleitet werden, um die Fibrinfaserdicke8,,9,10zu schätzen.
TEG wird in erster Linie im klinischen Umfeld zur Beurteilung der Hämostase und Gerinnsellyse von Patienten eingesetzt. Es wird auch häufig in chirurgischen Anwendungen verwendet, um festzustellen, wann anti-fibrinolytische Medikamente oder hämostatische Blutprodukte verabreicht werden sollten11,12. Die Gerinnselbildung erfolgt in einem TEG-Becher, wobei alle Gerinnungskomponenten vor Beginn des Testes dem Becher hinzugefügt werden. Der Becher, mit sich entwickelnden Gerinnsel, dreht sich physisch gegen einen Stift, der in seine Mitte eingeführt wird und ein elektromechanischer Torsionssensor misst die zunehmende viskoelastische Festigkeit des Gerinnsels. Dieser Test wird in der Regel bei einer physiologischen Temperatur von 37 °C durchgeführt; Die Temperatur kann jedoch manuell am Gerät eingestellt werden. Maximale Amplitude (MA), Reaktionsgeschwindigkeit (R), Kinetikzeit (K), Winkel (Winkel) und Zeit bis zur maximalen Amplitude (TMA) werden von der TEG-Software aus der dynamischen TEG-Ablaufverfolgung extrahiert. Diese Werte werden in der Regel mit klinischen Normalbereichen verglichen, um den Gerinnungszustand eines Patienten zu bewerten. Obwohl TEG nicht gerade ein Viskometer ist, da es die Gerinnselstärke in Millimetereinheiten misst, liefert es wichtige viskoelastische Gerinnseldaten und fungiert als wertvolles klinisches Entscheidungsinstrument für Ärzte, um sich für die Verabreichung bestimmter Blutprodukte und die Anpassung der therapeutischen Dosierung zu entscheiden13. Wenn sowohl TEG- als auch Trübungs-Assays zusammen verwendet werden, bieten sie ergänzende Informationen zur Gerinnselcharakterisierung, da die Gerinnselstärke und die Kinetik leicht aus TEG extrahiert werden können und die Fibrinfaserdicke durch optische Trübungsmessungen erreicht werden kann.
Da Fibrin ein kritischer Bestandteil eines Blutgerinnsels ist, kann die Fibringer-Charakterisierung unter verschiedenen Gerinnselbildungsbedingungen wertvolle Einblicke in die Art und Weise liefern, wie eine bestimmte Variable zum Gerinnselbildungsprozess und den ultimativen Gerinnseleigenschaften beiträgt. Dies zu verstehen, kann Eine Anleitung für die Thrombosediagnose und die Entwicklung von Therapeutika bieten. Um eine repräsentativere Fibringergercharakterisierung zu erhalten, kann Plasma ersetzt werden, um die Gerinnselbildung zu überwachen, da es in vivo Gerinnungsbedingungen näher aussieht als ein vereinfachtes Fibrinogen/Thrombin-Modellsystem. Aufgrund der komplizierten Natur der Gerinnungskaskade erhöht die Gerinnselbildung mit Plasma jedoch die Komplexität, was es schwieriger macht, die Auswirkungen einzelner Faktoren zu isolieren. Die Verwendung eines vereinfachten Fibrinogen-Thrombin-Modells verhindert die Notwendigkeit, die gesamte Gerinnungskaskade zu initiieren, was eine Isolierung des endgültigen Fibrinbildungsschritts ermöglicht. Durch die Einbeziehung von zwei großen Fibrin-Formungskomponenten (Fibrinogen und Thrombin) schafft dieses Setup eine hochkontrollierte Gerinnselbildung. Es ist auch wichtig zu beachten, dass, während das vereinfachte Gerinnselmodell hier verwendet wird, dieses Protokoll auch verwendet werden kann, um komplexere Gerinnsel zu charakterisieren, indem zusätzliche Gerinnungsfaktoren einschließen. In dieser Studie werden die Fibringercharakterisierung mit Trübung und TEG durch unterschiedliche Fibrinogen- und Thrombinkonzentrationen, Ionenstärke, pH-Wert und Gesamtproteinkonzentration in der Gerinnungslösung durchgeführt, um verschiedene In-vivo-Gerinnungsbedingungen nachzuahmen14. Einzelheiten zu diesen Änderungen des Protokolls wurden in Abschnitt 5 aufgenommen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Herstellung von Phosphatpuffer-Saline (PBS)
HINWEIS: PBS wurde während dieser gesamten Studie verwendet, da die beschriebenen Tests keine Zugabe von Kalzium erforderten. Es ist wichtig zu beachten, dass bei der Zugabe von Kalzium, oft verwendet, um zitrierte Blutprodukte re-calcify, PBS sollte vermieden werden, da Kalzium bekannt ist, in Phosphatpuffern zu fällen.
- Machen Sie einen 0,01 M, pH 7,4 PBS Puffer durch Mischen von 137 mM Natriumchlorid, 1,8 mM Kaliumphosphat monobasic, 10 mM Natriumphosphat dibasist und 2,7 mM Kaliumchlorid in DI-Wasser.
- Überprüfen Sie den pH-Puffer mit einer pH-Sonde und passen Sie den pH-Wert mit Natriumhydroxid oder Salzsäure nach Bedarf an.
- Verwenden Sie dieses PBS zur Herstellung von Fibrinogen- und Gerinnungstests (sofern nicht anders angegeben).
HINWEIS: Puffer wird vorgeschlagen, Fibrinogenpulver zu rekonstituieren, da die Rehydratation in DI-Wasser zu fibrinogener Ausfällung auch bei 37 °C führen kann.
2. Herstellung und Lagerung von Proteinen
HINWEIS: Während des gesamten Protokolls werden die Proteinbestandskonzentrationen in unterschiedlichen Konzentrationen für Trübung und TEG vorbereitet, um ein konsistentes Verhältnis von Salz, DI-Wasser, PBS und anderen Restfaktoren in den endgültigen Gerinnungslösungen zu ermöglichen.
- Herstellung und Lagerung von Fibrinogen
HINWEIS: Kontaminanten in handelsüblichem Fibrinogen umfassen eine erhebliche Menge an Faktor XIII, Restmengen anderer Gerinnungsfaktoren, Speicherpuffer und Salze. In Gegenwart von Kalzium ist Faktor XIII dafür bekannt, das Fibrin-Gerinnsel-Netzwerk zu vernetzen. Dieser Effekt trägt zu einer strafferen Gerinnselstruktur und einer verbesserten Gerinnselstärke bei, die die Fibrincharakterisierung beeinflusst. Kommerziell erhältliche Aktivitätskits können verwendet werden, um den Aktivenfaktor XIIIa-Niveau zu bestimmen. Um die durch Faktor XIIIa verursachte Variabilität zu minimieren, sollten Experimente unter Ausschluss von Kalzium oder zusätzliche Schritte zur Entfernung des Faktors XIIIa in dieses Protokoll aufgenommen werden. Darüber hinaus sollten Proteinspeichersalz und Puffertyp bewertet werden und gegebenenfalls dialyseweise in einen bevorzugten Assay-Arbeitspuffer übertragen werden.- Wiegen und aliquot lyophilisiertes Fibrinogenpulver (rinder oder menschlich) in 2 ml-Röhrchen mit 20 mg Protein pro Tube und speichern Aliquots bei -20 °C für bis zu 6 Monate.
- Lassen Sie fibrinogen aliquot am Tag des Experiments 10 Minuten lang an RT (Raumtemperatur) akklimatisieren. Rekonstituieren Sie Fibrinogen, indem Sie dem Aliquot 20 min vor der Anwendung 600 l PBS hinzufügen.
- Nehmen Sie 10 l Fibrinogen und verdünnen Sie es mit 190 l PBS in einer UV-transparenten 96-Well-Platte oder einer Küvette. Bestimmen Sie die Fibrinogenkonzentration, indem Sie die Absorption bei 280 nm über ein kommerzielles Spektrometer und seine Software einnehmen.
- Berechnen Sie die Fibrinogenkonzentration (mg/ml) nach dem Biergesetz. Bereiten Sie 12 mg/ml (für Trübungstests) und 3,2 mg/ml (für TEG) Fibrinogen-Lagerlösungen durch weitere Verdünnung mit PBS vor (sofern nicht anders angegeben).
HINWEIS: Fibrinogen-Konzentrationsbestimmung (mg/ml) nach Biergesetz:
Mol-Aussterbekoeffizient: n = 513.400 L mol-1 cm-1 bei 280 nm; Pfadlänge (L); Verdünnungsfaktor (D); Molekulargewicht (MW) = 340.000 Da. - wird durch Multiplikation von E0,1% = 1,51 (280 nm) (Aussterbekoeffizient, angegeben vom Lieferanten) mit MW abgeleitet.
- Vorbereitung und Lagerung von Thrombin
- Rekonstituieren Sie lyophilisiertes Thrombin (bovines oder menschliches, 1000 U-Lager) in 200 l entionisiertem (DI) Wasser, um eine Lösung für 200 L 5000 U/ml Thrombin zu erzielen.
- Machen Sie 5 l (20 U/Tube) Aliquots der Lösung und halten Sie Aliquots bei 20 °C eingefroren.
- Thrombin am Tag des Experiments 15 min lang bei RT auftauen und Thrombin-Arbeitslösung herstellen, indem man sie für Trübungstests auf 20 U/ml und für TEG mit DI-Wasser auf 20 U/ml verdünnt und 18 U/ml für TEG mit DI-Wasser (sofern nicht anders angegeben).
HINWEIS: Es sollten Vorkehrungen getroffen werden, um die Enzymaktivität aufrechtzuerhalten, die durch die Aufrechterhaltung von Enzymen auf Eis während des Auftauens und der Verwendung erreicht werden kann; jedoch wurde keine Verringerung der Thrombinaktivität beobachtet, wenn sie direkt nach dem Auftauen bei RT genutzt wurde.
3. Trübung
- Verwenden Sie jedes handelsübliche Spektrometer mit einem Absorptionsbereich von 350 - 700 nm und einer entsprechenden Software zur Überwachung der Gerinnseltrübung im Zeitverlauf (siehe Tabelle der Materialien).
- Schalten Sie das Spektrometer ein und öffnen Sie die entsprechende Analysesoftware.
- Wählen Sie Platte 1 und öffnen Sie die Registerkarte "Platteneinstellungen". Klicken Sie auf ABS-Modus und Kinetic, um eine dynamische Absorptionsmessung im Laufe der Zeit zu überwachen.
- Wählen Sie 550 nm (oder einen beliebigen Wert im Bereich von 350 – 700 nm) in der Wellenlängen-Registerkarte und passen Sie die Gesamtlaufzeit auf 60 min mit einem Intervall von 30 s in der Timing-Registerkarte an. Wählen Sie Brunnen von Interesse für die Lektüre, indem Sie die Brunnen hervorheben. Passen Sie bei Bedarf andere Einstellungen an.
HINWEIS: Die Auswahl einer Wellenlänge am unteren Ende des Bereichs (ca. 350 nm) bringt eine bessere Empfindlichkeit, aber die Absorption kann auch die Nachweisgrenze des Spektrometers überschreiten. Die am häufigsten verwendete Wellenlänge für Trübungsmessungen beträgt 405 nm in der Literatur; Dieses Protokoll verwendet jedoch 550 nm, um sicherzustellen, dass die dynamischen Trübungswerte innerhalb der Nachweisgrenze für alle Experimente liegen. Das gewählte Leseintervall sollte so kurz wie möglich sein, um die höchste Assayempfindlichkeit zu erreichen. Dies hängt davon ab, ob das Spektrometer und die Anzahl der Brunnen während eines bestimmten Assays gelesen werden. - Nehmen Sie eine UV-transparente 96-Well-Platte. Pipette 140 L PBS in einem Brunnen, der zum Lesen ausgewählt ist. Fügen Sie 10 l Thrombin (20 U/ml) in den Brunnen und mischen Sie sie.
HINWEIS: Verwenden Sie keine hochbindenden Assayplatten, um unspezifische Proteinbindung an die Brunnenoberfläche zu minimieren. Dies könnte die Proteindispersion in der Lösung beeinflussen und zu einer hohen Assayvariabilität führen. - Initiieren Sie die Gerinnung sofort, indem Sie 50 l Fibrinogen (12 mg/ml) in den Brunnen einteilen, um eine Gerinnungslösung von 200 L mit einer Endkonzentration von 3 mg/ml Fibrinogen und 1 U/ml Thrombin zu erhalten. Mischen Sie den Inhalt im Brunnen, indem Sie fünfmal nach oben und unten pfeifen und darauf achten, die Bildung von Blasen in der Lösung zu vermeiden, da sie die Absorption durch Streulicht beeinträchtigen.
HINWEIS: Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, wenn mehrere Gerinnselproben gleichzeitig auf derselben Platte ausgeführt werden. Zeichnen Sie Zeitunterschiede zwischen Brunnen und den Zeitraum vor dem ersten Lesen durch das Instrument auf, um Gerinnungszeiten auszugleichen. - Legen Sie die 96-Well-Platte in den Halter und klicken Sie in der Software auf Start, um mit dem Trübungslesen bei RT zu beginnen.
HINWEIS: Wenn der Test bei einer erhöhten Temperatur durchgeführt wird, müssen Spektrometer, Platte und Reagenzien alle vor der Gerinnseleinweihung auf der gewünschten Temperatur gehalten werden. - Rufen Sie nach Abschluss die Trübungsdaten ab und erhalten Sie eine Trübungsverfolgungskurve, indem Sie in einer Plotsoftware Absorptionsänderungen im Zeitverlauf zeichnen.
- Derive TurbMax (maximale Trübung, die auf Fibrinfaserdicke und Fibrin-Netzwerkdichte hinweist), indem der maximale Absorptionswert der Kurve im Laufe der Zeit genommen wird.
HINWEIS: Das Verhältnis von Fibrin-Fasermasse/-Länge kann anhand der Gleichung im folgenden Manuskript8aus Trübungswerten berechnet werden. - Berechnen Sie 90 % maximale Trübung, indem Sie TurbMax mit 90 % multiplizieren. Leiten SieTurb-Zeit ab, indem Sie die Zeit von der Gerinnselinitierung bis zu 90% maximaler Trübung berechnen.
HINWEIS: Die Zeit bis zur maximalen Trübung von 90 % ist eine zuverlässigere Metrik als die Zeit bis zur absoluten maximalen Trübung, da sie die Gerinnselzeit besser darstellt, indem die hochvariable endgültige Gerinnselbildungszeit eliminiert wird. Zusätzliche Gerinnungsparameter wie die Anfangszeit von Gerinnsel (Zeit vom Beginn des Tests bis zu dem Zeitpunkt, an dem die Absorption zu zunehmen beginnt) und die Gerinnselbildungsrate (Vmax, die größte Steigung des linearen Bereichs in der Trübungsverfolgungskurve) können ebenfalls aus den Trübungsverfolgungsverfolgungen extrahiert werden.
4. Thromboelastographie (TEG)
- Schalten Sie den Thromboelastographenanalysator ein und warten Sie, bis sich die Temperatur bei 37 °C stabilisiert.
- Öffnen Sie TEG - Software. Erstellen Sie nach der Anmeldung einen Experimentnamen unter dem ID-Abschnitt.
- Führen Sie einen E-Test für alle Kanäle durch, indem Sie den Softwareaufforderungen auf dem Bildschirm folgen. Legen Sie den Hebel wieder in die Ladeposition, sobald alle Prüfungen abgeschlossen sind.
HINWEIS: Ein TEG-E-Test ist erforderlich und sollte jedes Mal durchgeführt werden, wenn das Gerät verwendet wird. TEG-Koagulationskontrolltests (mit TEG-Level-1- und Level-2-Kontrollen) sind in den vom Hersteller vorgeschlagenen Regelmäßigen Intervallen erforderlich, wenn sie für klinische Proben verwendet werden. - Klicken Sie auf die Registerkarte TEG, geben Sie Beispielinformationen für kanäle ein, die verwendet werden. Legen Sie einen eindeutigen unbeschichteten TEG-Becher in den entsprechenden Kanal. Schieben Sie den Träger nach oben und drücken Sie den Becherboden 5-mal, um den Stift an der Torsionsstange zu befestigen. Senken Sie den Träger und drücken Sie den Becher nach unten in die Trägerbasis, bis er "klickt".
- Pipette 20 l Thrombinlösung (18 U/ml) in den TEG-Becher. Initiieren Sie die Gerinnung sofort, indem Sie 340 l Fibrinogen (3,2 mg/ml) in den TEG-Becher geben, um eine 360-L-Gerinnungslösung mit einer Endkonzentration von 3 mg/ml Fibrinogen und 1 U/ml Thrombin in der Tasse zu erhalten. Mischen Sie den Inhalt, indem Sie fünfmal nach oben und unten pfeifen.
HINWEIS: Potenzielle Gerinnungsfaktoren oder andere von Interesse sind während dieses Schritts hinzugefügt werden sollten, wobei darauf zu achten ist, dass immer ein Endvolumen von 360 l im TEG-Becher beibehalten wird. - Schieben Sie den becherbeladenen Träger nach oben, bewegen Sie den Hebel in die Leseposition und klicken Sie in der Software auf Start, um den TEG-Lesung zu initiieren.
- Sobald TEG abgeschlossen ist (nach etwa einer Stunde), rufen Sie teG-Parameter ab und erhalten Sie eine TEG-Ablaufverfolgungskurve, indem Sie die Amplitude im Zeitverlauf in einer Plotsoftware plotten.
- Sammeln Sie MA als TEGMax (maximale Amplitude ist bezeichnend für die Gerinnselstärke) und TMA alsTEG-Zeit (Zeit bis maximale Amplitude) aus der Software.
HINWEIS: MA wird von der Software als maximale Amplitude zu dem Zeitpunkt berechnet, zu dem die Amplitude weniger als eine Abweichung von 5 % über einen Zeitraum von 3 Minuten aufweist. TMA wird als Zeit von der maximalen Thrombus-Erzeugungsrate (in der Nähe des Split-Punkts) bis zum MA bestimmt. Andere Parameter können auch nützlich sein, um bei der Durchführung der Gerinnselanalyse zu bewerten. Einige Beispiele für diese Parameter sind: R-Zeit (die Zeit vom Beginn des Tests bis zu dem Zeitpunkt, an dem die Amplitude 2 mm erreicht), K (die Zeit vom Ende von R bis zu dem Zeitpunkt, an dem die Amplitude 20 mm erreicht), alpha (Neigung der Linie zwischen R und K) und CLT (Gerinnsellysezeit).
5. Fibrin-Charakterisierung unter verschiedenen Gerinnungsbedingungen
HINWEIS: Führen Sie Fibrincharakterisierungsexperimente durch, indem Sie eine bestimmte Variable in den Gerinnungslösungen modulieren, wie z. B.: Fibrinogen- und Thrombinkonzentrationen, Ionenstärke, pH-Wert und Gesamtproteinkonzentrationen. Experimentelle Präparate mit diesen Beispielvariablen werden in diesem Abschnitt beschrieben; aber auch andere Gerinnungsfaktoren und Interessensbedingungen können ersetzt werden. Wählen Sie sorgfältig ein geeignetes Puffersystem unter Berücksichtigung jeder einzelnen Assay-Anforderungen aus. Für Trübungs- und TEG-Assays, fügen Sie eine Puffer-nur-Steuerung, um eine genaue Hintergrundsubtraktion zu gewährleisten, während die Auswirkungen dieser Variablen zu analysieren.
- Unterschiedliche Fibrinogenkonzentration (1, 2, 3, 4, 5 mg/ml)
- Schritt 2.1.4 anpassen, um den Fibrinogenbestand in verschiedenen Konzentrationen zuzubereiten (4, 8, 12, 16, 20 mg/ml für Trübungstests und 1.1, 2.1, 3.2, 4.2, 5.3 mg/ml für TEG).
- Passen Sie Schritt 3.6 an, um "50 L Fibrinogen (4, 8, 12, 16, 20 mg/ml) in mehrere Brunnen der 96 Well-Platte " für Trübungstests hinzuzufügen.
- Schritt 4.5 anpassen, um "340 L Fibrinogen (1,1, 2,1, 3,2, 4,2, 5,3 mg/ml) in klare TEG-Becher einzuzahlen" für TEG.
- Unterschiedliche Thrombinkonzentration (0,1, 0,3, 0,6, 0,8, 1, 2,5, 5, 10 U/ml)
- Passen Sie Schritt 2.2.3 an, um Thrombinbestände in verschiedenen Konzentrationen zuzubereiten (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 U/ml für Trübungstests und 1,8, 5,4, 10,8, 14,4, 18, 45, 90, 180 U/ml für TEG).
- Passen Sie Schritt 3.5 so an, dass Sie für Trübungstests 10 L Thrombin (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 U/mL) in mehrere Bohrungen der 96 Well-Platte "hinzufügen" möchten.
- Schritt 4.5 auf "Pipette 20 l Thrombin (1,8, 5,4, 10,8, 14,4, 18, 45, 90, 180 U/mL) in klare TEG-Becher für TEG einstellen.
- Unterschiedliche Ionenstärke (0,05, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17 und 0,3 M)
- Natriumchlorid (21, 101, 111, 121, 131, 141 und 271 mM) zusammen mit 1,8 mM Kaliumphosphat monobasic, 10 mM Natriumphosphatdibasis und 2,7 mM Kaliumchlorid in DI-Wasser auflösen, um 0,01 M PBS-Lösungen mit unterschiedlichen Ionenstärken herzustellen.
- Passen Sie Schritt 1.3 an, um PBS mit unterschiedlichen Ionenstärken zu verwenden, um Fibrinogen- und Gerinnungslösungen für Trübung und TEG-Assays vorzubereiten.
- Unterschiedlicher pH-Wert (5,8, 6,6, 7,3, 7,4, 7,5 und 8,0)
- Natriumphosphatdibasis (0,7, 3,2, 7,7, 8,1, 8,4, 9,5 mM) und Kaliumphosphat monobasic (8,2, 6,0, 2,0, 1,7, 1,4, 0,5 mM) zusammen mit 2,7 mM Kaliumchlorid und Natriumchlorid (153, 147, 138, 137, 136, 134 mM) zu 0,01 M PBS-Lösungen mit unterschiedlichem pH-Wert und einer endgültigen Ionenstärke bei 0,165 M.
- Überprüfen Sie den Puffer-pH-Wert über die pH-Sonde und passen Sie ggf. den pH-Wert an.
- Passen Sie Schritt 1.3 an, um PBS zu verschiedenen pH-Werten zu verwenden, um Fibrinogen- und Gerinnungslösungen für Trübung und TEG-Assays vorzubereiten.
- Unterschiedliche Albuminkonzentration (0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/ml)
- 2 g lyophilisiertes Albumin in 500 l PBS bei RT für 20 min am Tag des Experiments auflösen.
- Bestimmen Sie die Albuminkonzentration nach dem gleichen Verfahren, das in Schritt 2.1.3 und 2.1.4 erwähnt wird, mit einem molaren Aussterbekoeffizienten von 43.800 l mol1 cm 1 cm (bei 280 nm) für Albumin.
- Bereiten Sie Albumin-Bestände in verschiedenen Konzentrationen vor.
- Passen Sie Schritt 3.5 auf "Pipette 40 l PBS in einem Brunnen, der zum Lesen ausgewählt ist, und fügen Sie 10 L Thrombin (20 U/mL)" hinzu. Passen Sie Schritt 3.6 auf "Gerinnung sofort initiieren, indem Sie 50 l Fibrinogen (12 mg/ml) mit 100 l Albumin (0, 40, 80, 100, 120, 160, 200 mg/ml) in mehrere Brunnen mit einer Endkonzentration von 3 mg/ml Fibrinogen, 1 U/ml Thrombin und 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/ml Albumin in Brunnen."
- Passen Sie Schritt 4.5 auf "Gerinnung sofort initiieren, indem Sie eine Mischung aus 200 L Albumin (36, 72, 90, 108, 144, 180 mg/ml) und 140 l 7,7 mg/ml Fibrinogen in TEG-Becher, um eine 360-L-Gerinnungslösung mit einer Endkonzentration von 3 mg/ml Fibrinogen, 1 U/ml Thrombin und 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/ml Albumin in TEG-Bechern zu erhalten."
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die in Abbildung 1 gezeigten Experimente sind repräsentative Trübungskurven, die Kurven von menschlichen und rindern Fibringer in verschiedenen Fibrinogenkonzentrationen verfolgen. Repräsentative TEG-Tracing-Kurven für die Fibringerbildung bei unterschiedlichen Fibrinogenspiegeln sind in Abbildung 2dargestellt. Beide Tracing-Kurven zeigen, dass nach einer Verzögerungsphase nach der Gerinnseleinweihung die Trübung oder die Gerinnselamplitude im Laufe der Zeit zunimmt und sich am Ende der Gerinnselbildung abbiegt. Ein Endpunktwert der maximalen Gerinnselbildung und die Zeit bis zur maximalen Gerinnselbildung aus jedem Assay werden verwendet, um die Merkmale eines vollständig geformten Gerinnsels und den gesamten Gerinnungsprozess zu bewerten. Maximale Trübung (TurbMax) und Zeit bis zur maximalen Trübung (Turb-Zeit ) sind die beiden Parameter, die von Trübung abgeleitet werden, während maximale Amplitude (TEGMax) und Zeit bis zur maximalen Amplitude (TEG-Zeit ) von TEG abgeleitet werden.TimeTime
Darüber hinaus ist TurbMax ein optisches Maß für die Gerinnselstruktur, das auf Fibrinfaserdicke und Fibrin-Netzwerkdichte hinweist. TEGMax ist ein mechanisches Maß, das die absolute Gerinnselfestigkeit widerspiegelt. Sie stellen verschiedene Aspekte eines Gerinnsels dar, die sich unabhängig voneinander ändern können, basierend auf unseren bisherigen Erkenntnissen14. Zusammengenommen liefern die beiden Werte einen komplementären Einblick in die Gerinnsel-Mikrostrukturen, wie z.B. wie dicht die Fasern im Fibrin-Netzwerk verpackt sind. Um explizit zu sehen, wie sich die Modulation einer Gerinnungsvariablen auf die Ergebnisse auswirkt, wurden die Daten weiter organisiert und mithilfe von Trenddiagrammen dargestellt. Repräsentative Beispiele sowohl für Trübungs- als auch teG-Datentrends sind in Abbildung 3dargestellt. Bei einem höheren Fibrinogengehalt in der Gerinnungslösung erhöhen sich alle vier Werte (TurbMax, TEGMax, TurbTime und TEGTime). Aus diesen Ergebnissen lässt sich interpretieren, dass ein höherer Fibrinogen-Substratspiegel zu einem dichteren faserigen Netzwerk führt, das die Lichtdurchlässigkeit durch das Gerinnsel begrenzt (größerer TurbMax). Dieses gestraffte Netzwerk erhöht auch die Gerinnselfestigkeit (größeres TEGMax). Die Dehnung von TurbTime und TEGTime zeigt an, dass die Fibrinpolymerisation bei erhöhten Fibrinogenspiegeln behindert wird. Die Trends von TurbMax und TEGMax für von unserer Gruppe getestete Variablen und deren Interpretationen sind in Tabelle 1dargestellt.
Abbildung 1: Repräsentative Beispiele für die Tunterungskurve des Gerinnsels (0 bis 30 min). Trübungsspuren von Rindern (A) und humaner (B) Fibrinbildung im Laufe der Zeit bei unterschiedlichen Fibrinogenkonzentrationen (1, 2, 3, 4, 5 mg/ml) mit 1 U/ml-Arten, die mit Thrombin übereinstimmten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Beispiele für die TEG-Ablaufverfolgungskurve (0 bis 30 min). TEG Amplitudenspuren von Rindern (A) und menschlichen (B) Fibrinbildungen im Laufe der Zeit bei verschiedenen Fibrinogenkonzentrationen (1, 2, 3, 4, 5 mg/ml) mit 1 U/ml-Arten, die mit Thrombin übereinstimmten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Beispiele für Trübungs- und TEG-Datentrends. Datentrends von TurbMax und TurbTime (A) und Trends von TEGMax und TEGTime (B) für verschiedene Rinder- oder humane Fibrinogenkonzentrationen (1, 2, 3, 4, 5 mg/ml) mit 1U/ml-Arten mit Thrombin. Alle Datenpunkte und Fehlerbalken sind Mittelwerte und Standardabweichungen von Triplicaten (Turbidity) und Duplikaten (TEG). Diese Zahl wurde aus [Zeng, 2020]14wiederverwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Variablen | Trendergebnisse | Interpretationen |
| Erhöhter Fibrinogenspiegel | Erhöhte TurbMax und TEGMax | Bildung engerer Fibrinfasern und dichterfaseriger Netzwerke |
| Erhöhte Thrombin-Spiegel, pH-Wert und Ionenstärke | Verringerte TurbMax, erhöhte TEGMax | Bildung von dünneren und engeren Fibrinfasern |
| Erhöhtes Albumin-Niveau | Erhöhte TurbMax, Verringerte TEGMax | Bildung von dickeren und lockereren Fibrinfasern |
Tabelle 1: Ergebnisse und Interpretationen von TurbMax und TEGMax.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dieses Protokoll veranschaulicht die Verwendung von zwei unterschiedlichen Gerinnselcharakterisierungswerkzeugen, die ein vereinfachtes Fibrinogen-Thrombin-Gerinnselmodell mit kommerziell erhältlichen Komponenten testen. Sowohl TEG- als auch Trübungstests sind einfach durchzuführen. Sie bieten nicht nur Endpunktgerinnseluntersuchungen wie Max-Gerinnselbildung (TurbMax und TEGMax)und Gerinnselbildungszeiten (TurbTime und TEGTime)an, sondern bewerten auch den dynamischen Gerinnselbildungsprozess. Dies macht TEG und Trübungswerkzeuge zu wertvollen Werkzeugen für die Gerinnselcharakterisierung, um alternative Methoden wie SEM, PT, aPTT oder Gerinnselrheologie hinzuzufügen, die komplizierte experimentelle Verfahren haben oder sich nur auf die Prüfung eines einzelnen Gerinnselaspekts konzentrieren können. Trübungs- und TEG-Ergebnisse zusammen bieten auch ein vollständigeres Profil, wie sich eine Gerinnungsvariable auf die Gerinnseleigenschaften auswirkt.
Zusätzlich zu den gerinnungsvariablen, die in diesem Protokoll beschrieben werden, gibt es viele andere Variablen, die unter Ausnutzung dieser Techniken untersucht werden können. Dieses Protokoll kann durch Anpassung geändert werden: Temperatur, Kalziumspiegel, Gerinnungsfaktor, Zugabe von Gerinnselaktivatoren oder Inhibitoren oder die Zugabe von pharmazeutischen Wirkstoffen, um nur einige zu nennen. Diese Variablen können möglicherweise sowohl mit dem vereinfachten Fibrinogen/Thrombin-Modellsystem als auch mit Plasma untersucht werden. Das Studium von Gerinnungsfaktoren erfordert sorgfältige Überlegung und Einrichtung, um für eine ordnungsgemäße vorgelagerte Gerinnselaktivierung zu sorgen, die den Gerinnungsweg eingibt. Trübung und TEG sind auch wirksame Werkzeuge zur Überwachung der Gerinnselverdauung. Das Protokoll kann modifiziert werden, um die Bildung von Fibringerunden und Lyse in Gegenwart von Antikoagulanzien oder Thrombolytika zu charakterisieren. Es ist wichtig zu beachten, dass das therapeutische Mittel vor der Gerinnseleinweihung bei verwendung von TEG zugegeben werden muss, da das Gerinnungssystem funktionell geschlossen ist, wenn das Gerät in Betrieb ist, wobei der Stift im TEG-Assaybecher sitzt. Damit kann TEG nicht zum Testen des therapeutischen Profils eines Thrombolytika in einem vorhandenen Gerinnsel verwendet werden.
In diesem Protokoll wurden beide Assays unter ihren allgemein verwendeten experimentellen Bedingungen durchgeführt. TEG wird üblicherweise bei 37 °C durchgeführt und Trübungstests werden bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt. Der Schwerpunkt dieser Charakterisierungsmethode liegt darin, die Trendergebnisse zu bestimmen und zu interpretieren, die eine bestimmte Variable bei der Gerinnung hat. Wichtig ist, dass die Temperaturregelung unter Verwendung von TEG einfach ist, da Reagenzien direkt in einen temperaturgeregelten TEG-Becher geleitet werden. Die Temperaturregelung in einem Trübungstest ist weniger einfach, da Gerinnungsreagenzien gemischt und in einer Wellplatte eingeleitet werden, bevor sie in ein beheiztes Spektrometer gelegt werden. Die Geschwindigkeit, mit der sich die Platten- und Gerinnungslösung in der Kammer warm erwärmt, ist im Verhältnis zur Gerinnselbildungsrate langsam und die Aufrechterhaltung aller Reagenzien und der Platte bei erhöhter Temperatur vor dem Einsetzen in die beheizte Kammer kann schwierig sein und führt oft zu einer schlechten Testreproduzierbarkeit. Die Aufrechterhaltung einer anderen konstanten Temperatur als der Raumtemperatur für Trübungstests ist beim Multiplexing in vielen Brunnen noch komplizierter. Ein weiterer wichtiger Schritt, um ein zuverlässiges und reproduzierbares Trübungsergebnis zu gewährleisten, ist das Mischen des Brunnens, um die Gerinnung zu initiieren. Da die direkte Thrombin-Fibrinogen-Spaltung schnell ist, kann das Mischen des Brunnens vor der Gerinnselinite die ungleichmäßige Fibrinbildung umgehen.
Dieses Protokoll kann auch leicht modifiziert werden, um ein Gerinnsel zu charakterisieren, das durch klinische Proben wie plättchenreiches Plasma oder thrombozytenarmes Plasma gebildet wird. Citrated Blutentnahmen werden empfohlen, da sie zuvor durch Standard-TEG-Protokolle validiert wurden. Thrombozytenreiches und plättchenarmes Plasma kann durch Zentrifugation bei 200 bzw. über 2.000 x g für 15 min bei RT vom zerzierten Vollblut getrennt werden. Bei Trübung oder TEG-Assays können Gerinnsel mit Zugabe von überschüssigem Calciumchlorid (11 mM) initiiert werden. Da Phosphat jedoch an Kalzium binden kann, was zu Niederschlägen führt, sollte PBS vermieden werden, wenn Kalzium als Gerinnselinitiator verwendet wird. Bei der Untersuchung der thrombozytenreichen Plasmagerinnselbildung ist es wichtig, die Thrombozytenabsiegung als signifikanten Konstifter zu betrachten, wenn gerinnungsfreie Formationstests unter Bedingungen ausgeführt werden, bei denen die Gerinnselbildung langsam ist. Probleme in Bezug auf die Thrombozytenabsiebung sind weniger wirkungsvoll, wenn die Gerinnselbildung schnell ist. Dies ist besonders wichtig für Trübungstests, bei denen die Assaygenauigkeit und Reproduzierbarkeit weitgehend auf der Homogenität der Reagenzien im Brunnen beruht. Wenn die experimentelle Konstruktion dies zulässt, können Kaolin (häufig als Gerinnselinitiator für TEG) oder andere negativ geladene Partikelaktivatoren verwendet werden, um die Plasmagerinnung zu beschleunigen, indem zusätzliche Oberfläche für eine schnellere Kontaktwegaktivierung der Gerinnungskaskade zur Verfügung gestellt wird. Wichtig ist, dass Aktivatorsuspensionen gründlich mit Gerinnungslösungen gemischt werden sollten, um eine Setzung zu vermeiden. Bei der Nutzung einer Oberfläche oder eines geladenen Teilchen-basierten Gerinnselaktivators stellen Sie sicher, dass die notwendigen Hintergrundkontrollen berücksichtigt werden, da die Reagenzien selbst zur Absorptivität bei Trübungstests beitragen können. Darüber hinaus kann die Abgewöhnung ein Problem mit größeren partikelbasierten Additiven wie Kaolin sein.
Vollblutproben sollten sorgfältig verarbeitet werden, wenn die Verwendung von Trübungstests in Betracht gezogen wird, da rote Blutkörperchen erheblich zur Absorption bei Standard-Trübungswellenlängen beitragen. Aus diesem Grund überschreitet die Messung von Vollblut über Trübung oft die Nachweisgrenze der meisten Spektrometer und ist in der Regel nicht durchführbar. Alternative Methoden zur Charakterisierung von Vollblut können notwendig sein oder Verdünnung vor dem Ausführen trüben Assays auf Blutproben, die rote Blutkörperchen enthalten, ist auch möglich. TEG und Trübung sorgen bei zusammengenommener Verwendung für eine umfassende Gerinnselbildung und Verdauungscharakterisierung, indem sie unterschiedliche Messungen für Gerinnselstärke und Fibrinfaser-/Netzwerkmorphologie sowohl für hochkontrollierte minimale Proteingerinnungstests als auch für klinische Plasmaproben kombinieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
nichts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Albumin from human serum | Millipore Sigma | A1653 | ≥96%, lyophilized powder |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | ≥96%, lyophilized powder |
| Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear) | Haemonetics | REF 6211 | |
| Fibrinogen, Bovine Plasma | Millipore Sigma | 341573 | contains more than 95% clottable protein |
| Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma | Millipore Sigma | 341578 | Contains ≥ 95% clottable proteins. |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | 60130 | ≥99.5% purity |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P9791 | ≥98% purity |
| SevenEasy pH Meter | Mettler Toledo | S20 | |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | 71378 | ≥99.5% purity |
| Sodium phosphate dibasic | Millipore Sigma | 71636 | ≥99.5% purity |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system | Molecular Devices | M5 | |
| TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system | Haemonetics | 07-022 | |
| Thrombin, Bovine | Millipore Sigma | 605157 | |
| Thrombin, Human Plasma, High Activity | Millipore Sigma | 605195 |
References
- Beckman, M. G., Hooper, W. C., Critchley, S. E., Ortel, T. L. Venous Thromboembolism. A Public Health Concern. American Journal of Preventive Medicine. 38, 4 Suppl 495-501 (2010).
- Goldhaber, S. Z., Bounameaux, H. Pulmonary embolism and deep vein thrombosis. The Lancet. 379 (9828), 1835-1846 (2012).
- Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Mechanisms of fibrin polymerization and clinical implications. Blood. 121 (10), 1712-1719 (2013).
- Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50 (6), 1079-1093 (1986).
- Tripathi, M. M., et al. Clinical evaluation of whole blood prothrombin time (PT) and international normalized ratio (INR) using a Laser Speckle Rheology sensor. Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).
- Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L.
- Carr, M. E., Hermans, J. Size and Density of Fibrin Fibers from Turbidity. Macromolecules. 11 (1), 46-50 (1978).
- Carr, M. E., Shen, L. L., Hermans, J. A. N., Chapel, H. Mass-Length Ratio of Fibrin Fibers from Gel Permeation and Light Scattering. 16, 1-15 (1977).
- Gabriel, D. A., Muga, K., Boothroyd, E. M. The Effect of Fibrin Structure on Fibrinolysis. , 24259-24263 (1992).
- Wolberg, A. S., Gabriel, D. A., Hoffman, M. Analyzing fibrin clot structure using a microplate reader. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 13 (6), 533-539 (2002).
- da Luz, L. T., Nascimento, B., Rizoli, S. Thrombelastography (TEG): practical considerations on its clinical use in trauma resuscitation. Scandinavian Journal of Trauma, Resuscitation and Emergency Medicine. 21 (1), 29 (2013).
- Whitten, C. W., Greilich, P. E. Thromboelastography: past, present, and future . Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 92 (5), 1223-1225 (2000).
- Ranucci, M., Laddomada, T., Ranucci, M., Baryshnikova, E. Blood viscosity during coagulation at different shear rates. Physiological Reports. 2 (7), 1-7 (2014).
- Zeng, Z., Fagnon, M., Nallan Chakravarthula, T., Alves, N. J. Fibrin clot formation under diverse clotting conditions: Comparing turbidimetry and thromboelastography. Thrombosis Research. 187, 48-55 (2020).
