Summary
Fibrin hemostaz ve tromboz sırasında pıhtı oluşumundan sorumludur. Bulanıklık tahlilleri ve tromboelastograhy (TEG) bir pıhtı tamamlayıcı değerlendirme sağlayan sinerjik araçlar olarak kullanılabilir. Bu iki teknik birlikte pıhtılaşma koşulları fibrin pıhtı oluşumunu nasıl etkilediği hakkında daha fazla fikir verebilir.
Abstract
Tromboz dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir. Fibrin(ojen) öncelikle pıhtı oluşumu veya tromboz sorumlu proteindir. Bu nedenle fibrin pıhtı oluşumunu karakterize etmek tromboz çalışmasında faydalıdır. Bulanıklık ve tromboelastografi (TEG) pıhtı oluşumunu izlemek için in vitro tahlillerde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bulanıklık, ışık iletimini bir spektrometre ile fibrin pıhtı yapısı üzerinden dinamik olarak ölçer ve genellikle araştırma laboratuvarlarında kullanılır. TEG, kan pıhtısı mukavemetini doğrudan ölçen ve öncelikle hastaların hemostazlarını değerlendirmek için klinik ortamlarda kullanılan özel bir viskoelastik tekniktir. Bu iki alet yardımıyla, bu çalışmada basitleştirilmiş fibrinojen/trombin pıhtısı modeli kullanılarak in vitro fibrin pıhtısını karakterize etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Her iki teknik genelinde veri eğilimleri çeşitli pıhtılaşma koşulları altında karşılaştırıldı. Bu çalışmada, büyükbaş hayvan pıhtılaşma faktörleri genellikle klinik ve araştırma ortamlarında insan pıhtılaşma faktörlerinin yerine kullanıldığından, insan ve büyükbaş fibrin pıhtıları yan yana oluşmuştur. Sonuçlar, TEG ve bulanıklığın pıhtı oluşumunu iki farklı yöntemle izlediğini ve birlikte kullanıldıklarında farklı pıhtılaşma koşullarında tamamlayıcı pıhtı mukavemeti ve fiber yapısal bilgi sağladığını göstermektedir.
Introduction
Tromboz, vücutta kan dolaşımını engelleyen ve dünya çapında yüksek morbidite ve mortaliteye yol açan bir kan pıhtısının patolojik oluşumudur. Her yıl 1000 kişi başına 1-2 venöz tromboemboli olgusu ve 2-3 tromboza bağlı vasküler hastalıklar olgusu vardır1,2. Burada çeşitli pıhtılaşma koşullarında pıhtı oluşumunu izlemek için tromboelastografi (TEG) ve bulanıklığı kullanma yöntemi sunulmuştur. Fibrin(ojen) vücutta pıhtı oluşumundan sorumlu birincil proteindir. Pıhtılaşma kaskad son adımlarında, fibrinopeptidler pıhtı geliştikçe çözünmez fibrin monomerlerin polimerizasyon unu başlatan trombin tarafından fibrinojen den ayrılır3,4. Patolojik trombozda pıhtı oluşumunu anlamak için çeşitli pıhtılaşma koşullarında fibrin oluşumunu karakterize etmek gerekir. İn vitro fibrin pıhtı oluşumunu incelemek için çoklu pıhtı izleme tsays kullanılmıştır. Protrombin zamanı (PT/INR) ve aktive parsiyel tromboplastin zamanı (aPTT) belirli bir pıhtılaşma yolunun bütünlüğünü ölçen iki ortak klinik tahlildir. Ancak, fiziksel pıhtı özellikleri5hiçbir belirti veren tek değişken olarak zaman kullanın. Elektron mikroskobu tamamen oluşmuş bir fibrin pıhtısının mikro-yapısının görüntülenmesine izin verir ancak pıhtı oluşturma işlemi hakkında bilgi vermez6. Tüm tahliller arasında bulanıklık tahlilleri ve TEG, pıhtı özelliklerini zaman içinde dinamik olarak takip etme olanağı sunar. Bu teknikler kapsamlı pıhtılaşma profillerinin ölçülmesini sağlar ve bu nedenle, diğer fibrin pıhtı karakterizasyon araçları üzerinde bazı yarar sağlar.
Özellikle, bulanıklık tahlilleri (veya pıhtı turbidimetrisi) basit uygulaması ve araştırma laboratuvarlarında spektrometrelerin geniş erişilebilirliği nedeniyle araştırma ve klinik uygulamalar için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu töz, tanımlanmış bir dalga boyunda (en sık 350 – 700 nm aralığında bir dalga boyunda)7tek tek tekrarlayan okumalar alarak bir şekillendirme pıhtısı ile ışık iletimi dinamik bir ölçüm sağlar. Okuma odasındaki sıcaklık da ayarlanabilir. Fibrin jel formları gibi, protein ağı üzerinden seyahat ışık miktarı zaman içinde absorbance bir artışa neden azalır. Benzer şekilde, pıhtı ağı bozulduğunda emme azalır. Bulanıklık tahlilleri, hem 96 hem de 384 plakalı yüksek iş elde numune taraması için çok kuyulu plaka biçimi kullanılarak kolayca çok yönlü olarak katlanabilir. Çeşitli pıhtı özellikleri bir bulanıklık izleme eğrisi (zaman ölçümü içinde absorbe) türetilebilir: maksimum bulanıklık, maksimum bulanıklık için zaman, pıhtı başlangıçlı zaman, ve pıhtı oluşum hızı (Vmax). Bir fibrin lif kütlesi / uzunluk oranı da fibrin lif kalınlığı8,9,,10tahmin ham bulanıklık verileri elde edilebilir.
TEG öncelikle hastaların hemostaz ve pıhtı iliklerini değerlendirmek için klinik ortamda kullanılmaktadır. Ayrıca yaygın anti-fibrinolitik ilaçlar veya hemostatik kan ürünleri,11,12uygulanmalıdır belirlemek için cerrahi uygulamalarda kullanılır. Pıhtı oluşumu, bir TEG bardağının içinde, tözün başlamasından önce tüm pıhtılaşma bileşenlerinin bardağa eklenmesiyle oluşur. Gelişen pıhtıya sahip bardak, fiziksel olarak merkezine yerleştirilen bir iğneye karşı döner ve elektromekanik burulma sensörü pıhtının artan viskoelastik gücünü ölçer. Bu test genellikle 37 °C fizyolojik sıcaklıkta yapılır; ancak, sıcaklık cihaz üzerinde manuel olarak ayarlanabilir. Maksimum genlik (MA), reaksiyon hızı (R), kinetik zaman (K), α-açı (Açı) ve maksimum genlik (TMA) için zaman dinamik TEG izleme DEN TEG yazılımı tarafından ayıklanır. Bu değerler genellikle hastanın pıhtılaşma durumunu değerlendirmek için klinik normal aralıklarla karşılaştırılır. TEG tam olarak bir viskometre birimi olmamakla birlikte, milimetre ünitelerinde pıhtı mukavemetini ölçtürünce, hekimlerin spesifik kan ürünlerini yönetmeye karar vermeleri ve terapötik dozlamayı ayarlamaları için değerli bir klinik karar verme aracı olarak önemli viskoelastik pıhtı verileri ve işlevleri ni sağlar13. Hem TEG hem de bulanıklık tahlilleri birlikte kullanıldıklarında, pıhtı mukavemeti ve kinetikte TEG'den kolayca çıkarılabildiği ve fibrin lif kalınlığına optik bulanıklık ölçümleri ile ulaşılabildiği için tamamlayıcı pıhtı karakterizasyonu bilgileri sağlarlar.
Fibrin bir kan pıhtısı kritik bir bileşeni olduğu gibi, farklı pıhtı oluşumu koşulları altında fibrin pıhtı karakterizasyonu belirli bir değişken pıhtı oluşum süreci ve nihai pıhtı özellikleri katkıda nasıl değerli bir fikir sağlayabilir. Bunu anlamak tromboz tanısı ve terapötik gelişimi için rehberlik sağlayabilir. Daha temsili bir fibrin pıhtı karakterizasyonu elde etmek için, plazma basitleştirilmiş fibrinojen/trombin model sisteminden daha yakından in vivo pıhtılaşma koşullarına benzediği için pıhtı oluşumunu izlemek için ikame edilebilir. Ancak, pıhtılaşma kaskad karmaşık doğası nedeniyle, plazma kullanarak pıhtı oluşumu karmaşıklığı ekler, daha zor bireysel faktörlerin etkisini izole etmek için yapım. Basitleştirilmiş bir fibrinojen/trombin modelinin kullanılması, son fibrin oluşum adımının izolasyona izin vererek pıhtılaşma kaskadlarının tamamının başlatılması ihtiyacını önler. İki ana fibrin oluşturan bileşenleri (fibrinojen ve trombin) dahil ederek, bu kurulum son derece kontrollü bir pıhtı oluşumu durumu oluşturur. Basitleştirilmiş pıhtı modeli burada kullanılırken, bu protokolün ek pıhtılaşma faktörleri de dahil edilerek daha karmaşık pıhtıları karakterize etmek için de kullanılabileceğini belirtmek önemlidir. Bu çalışmada, bulanıklık ve TEG kullanılarak fibrin pıhtı karakterizasyonu fibrinojen ve trombin konsantrasyonları, iyonik mukavemet, pH ve pıhtılaşma çözeltisinde toplam protein konsantrasyonu ile farklı in vivo pıhtılaşma durumlarını taklit etmek için14. Protokoldeki bu varyasyonlarla ilgili ayrıntılar Bölüm 5'te yer almaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fosfat tamponsal salin (PBS) hazırlanması
NOT: PBS bu çalışma boyunca kalsiyum ilavesi gerektirmediği için tanımlanmış tahliller kullanılmıştır. Sitrik kan ürünlerini yeniden kalsifiye etmek için kullanılan kalsiyum eklerken, kalsiyumun fosfat tamponlarında çökeltisi bilindiği için PBS'den kaçınılması gerektiği unutulmamalıdır.
- 137 mM sodyum klorür, 1,8 mM potasyum fosfat monobasic, 10 mM sodyum fosfat dibazik ve 2,7 mM POTASYUM klorür DI suda karıştırılarak 0,01 M, pH 7,4 PBS tampon yapın.
- Bir pH probu kullanarak tampon pH'ı doğrulayın ve gerektiğinde sodyum hidroksit veya hidroklorik asit kullanarak pH'ı ayarlayın.
- Fibrinojen ve pıhtılaşma tahlillerinin hazırlanması için bu PBS'yi kullanın (aksi belirtilmedikçe).
NOT: Di suyundaki rehidrasyon 37 °C'de bile fibrinojen çöküntüile sonuçlabildiği için tamponun fibrinojen tozunu yeniden oluşturması önerilmektedir.
2. Proteinlerin hazırlanması ve depolanması
NOT: Protokol boyunca protein stok konsantrasyonları, son pıhtılaşma çözeltilerinde tuz, DI suyu, PBS ve diğer artık faktörlerin tutarlı bir şekilde oranını sağlamak için bulanıklık ve TEG için farklı konsantrasyonlarda hazırlanır.
- Fibrinojenin hazırlanması ve depolanması
NOT: Ticari olarak mevcut fibrinojende bulunan kirleticiler arasında önemli miktarda faktör XIII, diğer pıhtılaşma faktörleri, depolama tamponu ve tuzlar sayılabilir. Kalsiyum varlığında, faktör XIII fibrin pıhtı ağı çapraz bağlantı bilinmektedir. Bu etki sıkılaştırılmış pıhtı yapısına ve fibrin karakterizasyonunu etkileyen gelişmiş pıhtı gücüne katkıda bulunur. Ticari olarak kullanılabilir etkinlik kitleri aktif faktör XIIIa düzeylerini belirlemek için kullanılabilir. Faktör XIIIa'nın neden olduğu değişkenliği en aza indirmek için, deneyler kalsiyum hariç tutularak tasarlanmalı veya faktör XIIIa'yı ortadan kaldırmak için ek adımlar bu protokole dahil edilmelidir. Buna ek olarak, protein depolama tuzu ve tampon tipi değerlendirilmeli ve gerekirse diyaliz tercih edilen bir tedavi çalışma tampon una aktarılabilir.- 2 mL tüplerde 2 mL tüplerde tüp başına 20 mg protein ve -20 °C'de 6 aya kadar aliquots saklayın ve lyophilized fibrinojen tozu (sığır veya insan) tartın ve aliquots.
- Deney günü 10 dakika boyunca RT'ye (oda sıcaklığında) uyum sağlamasına izin verin. Kullanmadan önce aliquot 20 dk'ya 600 μL PBS ekleyerek fibrinojeni yeniden oluşturun.
- 10 μL fibrinojen alın ve UV saydam 96-well plaka veya bir cuvette 190 μL PBS ile seyreltin. Ticari bir spektrometre ve yazılımı ile 280 nm'de absorbans alarak fibrinojen konsantrasyonunu belirleyin.
- Bira yasasını kullanarak fibrinojen konsantrasyonu (mg/mL) hesaplayın. PBS ile daha fazla seyreltme (aksi belirtilmedikçe) 12 mg/mL (bulanıklık tahlilleri için) ve 3.2 mg/mL (TEG için) fibrinojen stok çözeltileri hazırlayın.
NOT: Bira kanununa göre fibrinojen konsantrasyontisi tayini (mg/mL) :
Molar tükenme katsayısı: 513.400 L mol-1 cm-1 280 nm; Yol uzunluğu (L); Seyreltme faktörü (D); Molekül Ağırlığı (MW) = 340.000 Da. E0.1% = 1.51 (280 nm) (tedarikçi tarafından verilen yok olma katsayısı) mw ile çarpılarak elde edilir.
- Trombin hazırlanması ve depolanması
- 200 μL deiyonize (DI) suda 200 μL 5000 U/mL trombin stok çözeltisi yapmak için liyofilize trombin (büyükbaş veya insan, 1000 U stok) yeniden oluşturma.
- Çözeltinin 5 μL (20 U/tüp) aliquots olun ve −20 °C'de dondurulmuş aliquots tutun.
- Deney günü 15 dakika boyunca RT'de trombin aliquots çözülme ve bulanıklık tahlilleri için 20 U/mL ve DI su ile TEG için 18 U/ mL seyrelterek trombin çalışma çözeltisi yapmak (aksi belirtilmedikçe).
NOT: Erime ve kullanım sırasında buz üzerindeki enzimlerin korunması ile gerçeklenebilen enzim aktivitesini korumak için önlemler alınmalıdır; ancak RT'de erimeden sonra doğrudan kullanıldığında trombin aktivitesinde azalma gözlenmemiştir.
3. Bulanıklık
- 350 - 700 nm emme aralığına ve zaman içinde pıhtı bulanıklığını izlemek için ilgili bir yazılıma sahip herhangi bir ticari spektrometre kullanın (Bkz. Malzeme Tablosu).
- Spektrometreyi açın ve ilgili analiz yazılımını açın.
- Plaka 1'i seçin ve plaka ayarları sekmesini açın. Zaman içinde dinamik bir emici okuma izlemek için ABS modu ve Kinetik'i tıklatın.
- Dalga boyu sekmesinde 550 nm (veya 350 - 700 nm aralığındaki herhangi bir değer) seçin ve toplam çalışma süresini zamanlama sekmesinde 30 s aralıkla 60 dk olarak ayarlayın. Kuyuları vurgulayarak okumak için ilgi kuyuları seçin. Gerekirse diğer ayarları ayarlayın.
NOT: Aralığın alt ucunda (yaklaşık 350 nm) bir dalga boyu seçilmesi daha iyi bir hassasiyet getirir ancak absorbans da spektrometrenin algılama sınırını aşabilir. Bulanıklık ölçümü için en sık kullanılan dalga boyu literatürde 405 nm'dir; ancak, bu protokol dinamik bulanıklık değerlerinin tüm denemeler için algılama sınırı içinde olduğundan emin olmak için 550 nm kullanır. Seçilen okuma aralığı, en yüksek düzeyde ki istinat hassasiyetine ulaşmak için mümkün olduğunca kısa olmalıdır. Bu spektrometre ve belirli bir tsurça sırasında okunan kuyuların sayısına bağlıdır. - UV şeffaf 96-iyi plaka alın. Pipet 140 μL PBS okumak için seçilen bir kuyuda. Kuyuya 10 μL (20 U/mL) trombin ekleyin ve karıştırın.
NOT: Kuyu yüzeyine nonspesifik protein bağlanmasını en aza indirmek için yüksek bağlayıcı lı elekt plakaları kullanmayın. Bu çözeltide protein dağılımını etkileyebilir ve yüksek asit değişkenliği ile sonuçlanabilir. - Kuyuya 50 μL fibrinojen (12 mg/mL) ekleyerek pıhtılaşmayı hemen başlatArak 3 mg/mL fibrinojen ve 1 U/mL trombin konsantrasyonu olan 200 μL'lik bir pıhtılaşma solüsyonu elde edin. Onlar ışık saçılma tarafından emicietkisi olacak gibi çözeltide kabarcıklar oluşturulmasını önlemek için özen alarak beş kez yukarı ve aşağı boru ile kuyuda içeriğini karıştırın.
NOT: Aynı plaka üzerinde aynı anda birden fazla pıhtı örneği çalıştırırken çok kanallı bir pipet kullanın. Pıhtılaşma sürelerini dengelemek için kuyular arasındaki zaman farklarını ve enstrümanTarafından ilk okunan zaman dilimini kaydedin. - 96 kuyulu plakayı tutucuya yerleştirin ve RT'de bulanıklık okumaya başlamak için yazılımda Başlat'ı tıklatın.
NOT: Eğer yüksek bir sıcaklıkta titreci gerçekleştiriyorsa, pıhtı başlangıcından önce spektrometre, plaka ve reaktifler istenilen sıcaklıkta muhafaza edilmelidir. - Tamamlandıktan sonra, bulanıklık verilerini alın ve bir çizim yazılımında zaman içinde emicilik değişimini çizerek bulanıklık izleme eğrisi elde edin.
- TurbMax Türetin (fibrin lif kalınlığı ve fibrin ağ yoğunluğu nun maksimum bulanıklık göstergesi) zaman içinde eğrinin maksimum emici değerini alarak.
NOT: Fibrin elyaf kütle/uzunluk oranı aşağıdakiyazı8'de verilen denklem kullanılarak bulanıklık değerlerinden hesaplanabilir. - TurbMax'i %90 ile çarparak %90 maksimum bulanıklığı hesaplayın. Pıhtı başlatmadan %90 maksimum bulanıklığa kadar işlem zamanı ile TurbZamanı elde edin.
NOT: %90'a kadar olan maksimum bulanıklık, son derece değişken son pıhtı oluşum süresini ortadan kaldırarak pıhtı zamanını daha iyi temsil ettiği için mutlak maksimum bulanıklığa göre zamandan daha güvenilir bir ölçümdür. Pıhtı başlangıç zamanı (testin başlangıcından absorbans artmaya başladığı zamana kadar olan süre) ve pıhtı oluşum hızı (bulanıklık izleme eğrisindeki doğrusal bölgenin en büyük eğimi olan Vmax) gibi ek pıhtılaşma parametreleri de bulanıklık izleme lerinden çıkarılabilir.
4. Tromboelastografi (TEG)
- Tromboelastograf analizörü açın ve sıcaklığın 37 °C'de sabitolmasını bekleyin.
- Açık TEG - yazılım. Oturum açtıktan sonra, kimlik bölümünün altında bir deneme adı oluşturun.
- Ekrandaki yazılım istemlerini izleyerek tüm kanallar için bir e-test gerçekleştirin. Tüm kontroller tamamlandıktan sonra kolu yük konumuna geri yerleştirin.
NOT: Bir TEG e-testi gereklidir ve cihaz her zaman yapılmalıdır. TEG koagülasyon kontrol tahlilleri (TEG seviye 1 ve seviye 2 kontrolleri kullanılarak) klinik numuneler için kullanıldığında düzenli üreticinin önerdiği aralıklarla gereklidir. - TEG TEG sekmesini tıklatın, kullanılacak kanallar için örnek bilgileri girdi. İlgili kanala açık bir kaplamasız TEG kabı yerleştirin. Taşıyıcıyı yukarı doğru kaydırın ve pimi burulma çubuğuna yapıştırmak için bardağın alt altına 5 kez bastırın. Taşıyıcıyı düşürün ve "tıklanın" diye kadar bardağı taşıyıcı tabanına doğru aşağı doğru bastırın.
- Pipet 20 μL trombin çözeltisi (18 U/mL) TEG kabına. TEG kabına 3mg/mL fibrinojen (3.2 mg/mL) ekleyerek pıhtılaşmayı hemen başlatArak 3 mg/mL fibrinojen ve fincanda 1 U/mL trombin konsantrasyonu olan 360 μL pıhtılaşma çözeltisi elde edin. Beş kez yukarı ve aşağı boru lama ile içeriğini karıştırın.
NOT: Bu adımda potansiyel pıhtılaşma faktörleri veya diğer ilgi çekici bileşenler, TEG kabında her zaman 360 μL'lik son hacmi korumaya dikkat etmek için eklenmelidir. - Fincan yüklü taşıyıcıyı yukarı kaydırın, kolu okuma konumuna taşıyın ve TEG okumasını başlatmak için yazılımda Başlat'ı tıklatın.
- TEG tamamlandıktan sonra (yaklaşık bir saat sonra), TEG parametrelerini alın ve bir çizim yazılımında zaman içinde genlik çizerek TEG izleme eğrisi edinin.
- YAZıLıMdan TEGMax (maksimum genlik pıhtı mukavemetinin göstergesidir) ve TMA'yı TEGTime (maksimum genlik süresi) olarak toplayın.
NOT: MA, yazılım tarafından genliğin 3 dakikalık bir süre içinde %5'ten daha az bir sapmaya sahip olduğu anda maksimum genlik olarak hesaplanır. TMA, maksimum trombüs üretim hızından (bölme noktasına yakın) MA'ya kadar olan süre olarak belirlenir. Pıhtı analizini yaparken diğer parametreleri değerlendirmek de yararlı olabilir. Bu parametrelere örnek olarak şunlar verilebilir: R-time (testin başlangıcından genlik 2 mm'ye ulaştığında, K (Genlik 20 mm'ye ulaştığında R'nin sonundan 20 mm'ye ulaştığında, alfa (R ve K arasındaki çizginin eğimi) ve CLT (pıhtı lysis süresi) sayılabilir.
5. Farklı pıhtılaşma koşullarında Fibrin karakterizasyonu
NOT: Fibrinojen ve trombin konsantrasyonları, iyonik mukavemet, pH ve total protein konsantrasyonları gibi pıhtılaşma çözeltilerinde belirli bir değişkeni modüle ederek fibrin karakterizasyon deneyleri yapın. Bu örnek değişkenlerle deneysel preparatlar bu bölümde açıklanmıştır; ancak, diğer pıhtılaşma faktörleri ve ilgi koşulları da değiştirilebilir. Her benzersiz arama gereksinimini göz önünde bulundurarak uygun bir arabellek sistemi dikkatle seçin. Bulanıklık ve TEG tahlilleri için, bu değişkenlerin etkisini analiz ederken doğru bir arka plan çıkarma sağlamak için bir tampon kontrolü içerir.
- Değişen fibrinojen konsantrasyonu (1, 2, 3, 4, 5 mg/mL)
- Fibrinojen stoğunu farklı konsantrasyonlarda (4, 8, 12, 16, 20 mg/mL, bulanıklık tahlilleri için ve 1.1, 2.1, 3.2, 4.2, 5.3 mg/mL) hazırlamak için adım 2.1.4'ü ayarlayın.
- Bulanıklık tahlilleri için adım 3.6'yı "50 μL fibrinojen (4, 8, 12, 16, 20 mg/mL) 96 kuyunun birden fazla kuyuya ekleyin" olarak ayarlayın.
- TEG için 4.5 adımLarını "340 μL fibrinojen (1.1, 2.1, 3.2, 4.2, 5.3 mg/mL) net TEG kaplarına ekleyin" olarak ayarlayın.
- Değişen trombin konsantrasyonu (0.1, 0.3, 0.6, 0.8, 1, 2.5, 5, 10 U/mL)
- Trombin stokunun farklı konsantrasyonlarda hazırlanması için adım 2.2.3'ü ayarlayın (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 U/mL ve 1.8, 5.4, 10.8, 14.4, 18, 45, 90, 180 U/mL).
- Bulanıklık tahlilleri için "10 μL trombin (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 U/mL) eklemek için adım 3.5'i ayarlayın.
- 4.5 adımLarını TEG için "pipet 20°L trombin (1.8, 5.4, 10.8, 14.4, 18, 45, 90, 180 U/mL) net TEG kaplarına ayarlayın.
- Değişen iyonik mukavemet (0,05, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17 ve 0,3 M)
- Sodyum klorür (21, 101, 111, 121, 131, 141 ve 271 mM) ile birlikte 1,8 mM potasyum fosfat monobasic, 10 mM sodyum fosfat dibasic ve 2,7 mM potasyum klorür DI suda 0,01 M PBS çözeltisi yapın.
- Hem bulanıklık hem de TEG tahlilleri için fibrinojen ve pıhtılaşma solüsyonları hazırlamak için farklı iyonik mukavemetlerde üretilen PBS'yi kullanmak için adım 1.3'ü ayarlayın.
- Değişen pH (5.8, 6.6, 7.3, 7.4, 7.5 ve 8.0)
- Çözünür sodyum fosfat dibazik (0.7, 3.2, 7.7, 8.1, 8.4, 9.5 mM) ve potasyum fosfat monobasic (8.2, 6.0, 2.0, 1.7, 1.4, 0.5 mM) ile birlikte 2.7 mM potasyum klorür ve sodyum klorür (153, 147, 138, 137, 136, 134 mM) pH değişen ve son iyonik mukavemeti 0,165 M ile 0,01 M PBS çözeltisi yapmak.
- Arabellek pH değerini pH probu ile doğrulayın ve gerekirse pH'ı ayarlayın.
- Fibrinojen ve pıhtılaşma solüsyonu hazırlamak için farklı pH'larda üretilen PBS'yi kullanmak için adım 1.3'ü ayarlayın.
- Değişen albumin konsantrasyonu (0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/mL)
- Deney günü 20 dakika boyunca RT'de 500 μL PBS'de 2 g lyophilized albumin çözün.
- Albumin için 43.800 L mol−1 cm−1 (280 nm) molar yok olma katsayısı ile 2.1.3 ve 2.1.4 adımlarında belirtilen prosedürü kullanarak albumin konsantrasyonu belirleyin.
- Farklı konsantrasyonlarda albümin stoku hazırlayın.
- 3.5 adımı "Okumak için seçilen bir kuyudaki Pipet 40 ΜL PBS" olarak ayarlayın ve 10 μL trombin (20 U/mL)" ekleyin. 3.6 adımına ayarlayın "100 μL albumin (0, 50 μL fibrinojen (12 mg/mL) ekleyerek pıhtılaşmayı hemen başlatın 40, 80, 100, 120, 160, 200 mg/mL) birden fazla kuyuya 3 mg/mL fibrinojen, 1 U/mL trombojen ve 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/mL albumin kuyularda son konsantrasyona kadar."
- 4.5 adımını ayarla "200 μL albumin karışımı ekleyerek pıhtılaşmayı hemen başlatın (36, 72, 90, 108, 144, 180 mg/mL) ve 140 μL 7.7 mg/mL fibrinojen teg bardaklarına 3 mg/mL fibrinojen, 1 U/mL trombojen ve 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/mL'lik son konsantrasyona sahip 360 μL'lik pıhtılaşma solüsyonu elde etmek için TEG'de bir l/mL fibrinojen."
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1'de gösterilen deneyler, farklı fibrinojen düzeylerinde insan ve büyükbaş fibrin pıhtılarının temsili bulanıklık izleme eğrileridir. Farklı fibrinojen düzeylerinde fibrin pıhtı oluşumu için temsilci TEG izleme eğrileri Şekil 2'degösterilmiştir . Her iki izleme eğrisi pıhtı inisiyasyonu ndan sonraki bir gecikme döneminden sonra pıhtı bulanıklığının veya pıhtı genliğinin zamanla arttığını ve pıhtı oluşumunun sonunda ki seviyelerinin arttığını göstermektedir. Tamamen oluşan bir pıhtının özelliklerini ve genel pıhtılaşma işlemini değerlendirmek için maksimum pıhtı oluşumunun uç nokta değeri ve her bir tözden maksimum pıhtı oluşumuna kadar olan süre kullanılır. Maksimum bulanıklık (TurbMax)ve maksimum bulanıklık (TurbTime)için zaman bulanıklık tan türetilen iki parametre ise maksimum genlik (TEGMax)ve maksimum genlik (TEGSüresi)TEG türetilmiştir.
Ayrıca TurbMax, fibrin lif kalınlığı ve fibrin ağ yoğunluğunun göstergesi olan pıhtı yapısının optik bir ölçüsüdür. TEGMax mutlak pıhtı mukavemetini yansıtan mekanik bir ölçüdür. Onlar önceki bulgulara göre birbirinden bağımsız değiştirebilirsiniz bir pıhtı farklı yönlerini temsil14. Birlikte ele alındığında, iki değer fibrin ağında liflerin ne kadar yoğun paketlenmiş gibi pıhtı mikroyapıları hakkında tamamlayıcı bir fikir sağlar. Pıhtılaşma değişkeninin modüle edilmesinin sonuçları nasıl etkilediğini açıkça görmek için, veriler daha da düzenlendi ve eğilim çizimleri kullanılarak sunuldu. Hem bulanıklık hem de TEG veri eğilimlerinin temsili örnekleri Şekil 3'tegösterilmiştir. Pıhtılaşma çözeltisinde daha yüksek bir fibrinojen seviyesinde dört değer (TurbMax, TEGMax, TurbTime ve TEGTime)artar. Bu sonuçlardan, daha yüksek bir fibrinojen substrat seviyesinin pıhtı üzerinden ışık iletimini sınırlayan daha yoğun bir fibrinojen ağ (daha büyük TurbMax)ile sonuçlanacağı yorumlanabilir. Bu sıkılaştırılmış ağ aynı zamanda pıhtı mukavemetini artırır (büyük TEGMax). Hem TurbTime hem de TEGTime'ın uzaması fibrin polimerizasyonunun artmış fibrinojen düzeylerinde engellendiğini gösterir. Grubumuz tarafından test edilen değişkenler için TurbMax ve TEGMax'in eğilimleri ve yorumları Tablo 1'degösterilmiştir.
Şekil 1: Pıhtı bulanıklık izleme eğrisinin temsili örnekleri (0-30 dk). Farklı fibrinojen konsantrasyonlarında (1, 2, 3, 4, 5 mg/mL) sığır (A) ve insan (B) fibrin oluşumunun zaman içinde 1 U/mL türü ile trombin le eşleşerek bulanıklık takibi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: TEG izleme eğrisinin temsili örnekleri (0 - 30 dk). Farklı fibrinojen konsantrasyonlarında (1, 2, 3, 4, 5 mg/mL) zaman içinde sığır(A)ve insan (B) fibrin oluşumunun TEG genlik izlemeleri 1 U/mL türü ile trombin ile eşleşir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Bulanıklık ve TEG veri eğilimlerinin temsili örnekleri. TurbMax ve TurbTime (A)veri eğilimleri ve TEGMax ve TEGTime (B)farklı büyükbaş veya insan fibrinojen konsantrasyonları için (1, 2, 3, 4, 5 mg/ml) 1U/mL türleri ile trombin ile uyumludur. Tüm veri noktaları ve hata çubukları, üçaylık (Bulanıklık) ve yinelenenlerin (TEG) ortalamaları ve standart sapmalarıdır. Bu rakam [Zeng, 2020]14'tenyeniden kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Değişken | Trend Sonuçları | Yorum |
| Artmış fibrinojen düzeyi | Artan TurbMax ve TEGMax | Daha sıkı fibrin liflerinin ve daha yoğun fibröz ağ oluşumu |
| Artmış trombin düzeyi, pH ve iyonik mukavemet | Azalmış TurbMax, artmış TEGMax | Daha ince ve sıkı fibrin liflerinin oluşumu |
| Albümin düzeyi artırıldı | Artmış TurbMax, Azalmış TEGMax | Kalın ve gevşek fibrin liflerinin oluşumu |
Tablo 1: TurbMax ve TEGMax'insonuçları ve yorumları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, basitleştirilmiş bir fibrinojen/trombin pıhtı modelini ticari olarak kullanılabilen bileşenler kullanılarak test eden iki farklı pıhtı karakterizasyon aracının kullanımını göstermektedir. Hem TEG hem de bulanıklık tahlillerinin yapılması kolaydır. Max pıhtı oluşumu (TurbMax ve TEGMax)ve pıhtı oluşum süreleri (TurbTime ve TEGTime)gibi uç nokta pıhtı muayenelerini sağlamakla kalmıyor, aynı zamanda dinamik pıhtı şekillendirme sürecini de değerlendiriyorlar. Bu da TEG ve bulanıklığı pıhtı karakterizasyonu için değerli araçlar haline getirir: SEM, PT, aPTT veya pıhtı reolojisi gibi karmaşık deneysel prosedürlere sahip olabilir veya sadece tek bir pıhtı yönünü test etmeye odaklanabilen. Bulanıklık ve TEG sonuçları, pıhtılaşma değişkeninin pıhtı özelliklerini nasıl etkilediğine daha eksiksiz bir profil sunar.
Bu protokolde ayrıntılı pıhtılaşma değişkenlerine ek olarak, bu tekniklerden yararlanarak incelenebilecek birçok değişken de vardır. Bu protokol ayarlayarak değiştirilebilir: sıcaklık, kalsiyum düzeyleri, pıhtılaşma faktörü düzeyleri, pıhtı aktivatörleri veya inhibitörleri eklenmesi, ya da farmasötik ajanların eklenmesi, birkaç isim. Bu değişkenler hem basitleştirilmiş fibrinojen/trombin model sistemi kullanılarak hem de plazma kullanılarak incelenebilir. Pıhtılaşma faktörlerinin incelenmesi, pıhtılaşma yolunun başlatılmasını sağlayan uygun yukarı akım pıhtı aktivasyonu sağlamak için dikkatli bir değerlendirme ve kurulum gerektirir. Bulanıklık ve TEG de pıhtı sindirimini izlemek için kullanılan etkili araçlardır. Protokol, antikoagülan veya trombolitik ajanların varlığında fibrin pıhtı oluşumunu ve lysisi karakterize etmek için değiştirilebilir. Teg tahsin kabında oturan pim ile çalışırken pıhtılaşma sistemi işlevsel olarak kapalı olduğundan, teg kullanımından önce terapötik ajanın pıhtı başlangıcından önce eklenmesi gerektiğini unutmayın. Bununla birlikte, TEG mevcut bir pıhtıda trombolitik bir ajanın terapötik profilini test etmek için kullanılamaz.
Bu protokolde, her iki tahlil ler de yaygın olarak kullanılan deneysel koşullar altında gerçekleştirilmiştir. TEG genellikle 37 °C'de, bulanıklık tahlilleri ise oda sıcaklığında (RT) yapılmaktadır. Bu karakterizasyon yönteminin vurgusu, belirli bir değişkenin pıhtılaşma da sahip olduğu eğilim sonuçlarını belirlemek ve yorumlamaktır. Daha da önemlisi, reaktifler doğrudan sıcaklık kontrollü TEG kabına borulandırılı olduğundan, TEG kullanan sıcaklığın kontrol altına alınması kolaydır. Bir bulanıklık kontrolünde sıcaklık kontrolü daha az basittir, çünkü pıhtılaşma reaktifleri karıştırılır ve ısıtılmış bir spektrometreye yerleştirilmeden önce iyi bir plaka içinde başlatılır. Plaka ve pıhtılaşma çözeltisinin pıhtı oluşum hızına göre yavaş olması ve ısıtılan hazneye yerleştirilmeden önce tüm reaktiflerin ve plakanın yüksek sıcaklıkta tutulması zor olabilir ve genellikle tahtın tekrarlanmasına neden olabilir. Bulanıklık tahlilleri için oda sıcaklığı dışında sabit bir sıcaklık korumak, birçok kuyuda çokkatlı yken daha da karmaşıktır. Güvenilir ve tekrarlanabilir bir bulanıklık sonucu sağlamak için bir diğer kritik adım pıhtılaşma başlatmak için kuyu karıştırma olduğunu. Direkt trombin-fibrinojen dekoltesi hızlı olduğu için, pıhtı başlatmadan önce kuyunun karıştırılması tek tip olmayan fibrin oluşumunu atlatabilir.
Bu protokol aynı zamanda trombosit açısından zengin plazma veya trombosit fakiri plazma gibi klinik örneklerden oluşan bir pıhtıyı karakterize etmek için de kolayca değiştirilebilir. Standart TEG protokolleri ile daha önce doğrulanmış olduğu için sitrated kan çekmesi tavsiye edilir. Trombosit açısından zengin ve trombosit-fakir plazma, sırasıyla RT'de 15 dakika boyunca 200 ve 2.000 x g'de santrifüj yoluyla sited tam kandan ayrılabilir. Bulanıklık veya TEG tahlillerinde fazla kalsiyum klorür (11 mM) ilavesi ile pıhtı lar başlanabilir. Ancak fosfat kalsiyuma bağlanarak yağışla sonuçlanabildiği için pıhtı başlatıcısı olarak kalsiyum kullanıldığında PBS'den kaçınılmalıdır. Trombosit bakımından zengin plazma pıhtı oluşumu nu incelerken, pıhtı oluşumunun yavaş olduğu koşullarda pıhtı oluşumu tahlillerini çalıştırırken trombosit yerleşmenin önemli bir kurucu olarak düşünülmesi önemlidir. Pıhtı oluşumu hızlı olduğunda trombosit yerleşme ile ilgili sorunlar daha az etkilidir. Bu, tahlil doğruluğu ve tekrarlanabilirliğinin büyük ölçüde kuyudaki reaktiflerin homojenliğine dayandığı bulanıklık tahlilleri için özellikle önemlidir. Deneysel tasarım izin veriyorsa, kaolin (genellikle TEG için pıhtı başlatıcısı olarak kullanılır) veya diğer negatif yüklü parçacık aktivatörleri pıhtılaşma kaskad daha hızlı temas yolu aktivasyonu için ek yüzey alanı sağlayarak plazma pıhtı başlatılması hızlandırmak için kullanılabilir. Daha da önemlisi, aktivatör süspansiyonlar yerleşmemek için pıhtılaşma çözümleri ile iyice karıştırılmalıdır. Bir yüzey alanı veya yüklü parçacık tabanlı pıhtı aktivatör kullanırken reaktifler kendilerini bulanıklık tahlillerinde absorptivity katkıda bulunabilir gibi gerekli arka plan kontrolleri dikkate alındığından emin olun. Ayrıca, yerleşme kaolin gibi büyük parçacık bazlı katkı maddeleri ile ilgili bir sorun olabilir.
Kırmızı kan hücreleri standart bulanıklık dalga boylarında absorbasyona önemli ölçüde katkıda olduğundan tam kan örnekleri bulanıklık tahlilleri kullanımı göz önüne alındığında dikkatle işlenmelidir. Bu nedenle, bulanıklık yoluyla tam kan ölçümü genellikle en spektrometrelerin algılama sınırını aşıyor ve genellikle mümkün değildir. Kırmızı kan hücreleri içeren kan örnekleri üzerinde bulanıklık tahlilleri çalıştırmadan önce tam kanı karakterize etmek için alternatif yöntemler gerekli olabilir veya seyreltme de mümkündür. TEG ve bulanıklık, birlikte kullanıldığında, hem yüksek kontrollü minimal protein pıhtılaşma tahlilleri hem de klinik plazma örnekleri için pıhtı mukavemeti ve fibrin lif/ağ morfolojisi için farklı ölçümleri birleştirerek kapsamlı pıhtı oluşumu ve sindirim karakterizasyonu sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Hiçbiri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Albumin from human serum | Millipore Sigma | A1653 | ≥96%, lyophilized powder |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | ≥96%, lyophilized powder |
| Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear) | Haemonetics | REF 6211 | |
| Fibrinogen, Bovine Plasma | Millipore Sigma | 341573 | contains more than 95% clottable protein |
| Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma | Millipore Sigma | 341578 | Contains ≥ 95% clottable proteins. |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | 60130 | ≥99.5% purity |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P9791 | ≥98% purity |
| SevenEasy pH Meter | Mettler Toledo | S20 | |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | 71378 | ≥99.5% purity |
| Sodium phosphate dibasic | Millipore Sigma | 71636 | ≥99.5% purity |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system | Molecular Devices | M5 | |
| TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system | Haemonetics | 07-022 | |
| Thrombin, Bovine | Millipore Sigma | 605157 | |
| Thrombin, Human Plasma, High Activity | Millipore Sigma | 605195 |
References
- Beckman, M. G., Hooper, W. C., Critchley, S. E., Ortel, T. L. Venous Thromboembolism. A Public Health Concern. American Journal of Preventive Medicine. 38, 4 Suppl 495-501 (2010).
- Goldhaber, S. Z., Bounameaux, H. Pulmonary embolism and deep vein thrombosis. The Lancet. 379 (9828), 1835-1846 (2012).
- Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Mechanisms of fibrin polymerization and clinical implications. Blood. 121 (10), 1712-1719 (2013).
- Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50 (6), 1079-1093 (1986).
- Tripathi, M. M., et al. Clinical evaluation of whole blood prothrombin time (PT) and international normalized ratio (INR) using a Laser Speckle Rheology sensor. Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).
- Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L.
- Carr, M. E., Hermans, J. Size and Density of Fibrin Fibers from Turbidity. Macromolecules. 11 (1), 46-50 (1978).
- Carr, M. E., Shen, L. L., Hermans, J. A. N., Chapel, H. Mass-Length Ratio of Fibrin Fibers from Gel Permeation and Light Scattering. 16, 1-15 (1977).
- Gabriel, D. A., Muga, K., Boothroyd, E. M. The Effect of Fibrin Structure on Fibrinolysis. , 24259-24263 (1992).
- Wolberg, A. S., Gabriel, D. A., Hoffman, M. Analyzing fibrin clot structure using a microplate reader. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 13 (6), 533-539 (2002).
- da Luz, L. T., Nascimento, B., Rizoli, S. Thrombelastography (TEG): practical considerations on its clinical use in trauma resuscitation. Scandinavian Journal of Trauma, Resuscitation and Emergency Medicine. 21 (1), 29 (2013).
- Whitten, C. W., Greilich, P. E. Thromboelastography: past, present, and future . Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 92 (5), 1223-1225 (2000).
- Ranucci, M., Laddomada, T., Ranucci, M., Baryshnikova, E. Blood viscosity during coagulation at different shear rates. Physiological Reports. 2 (7), 1-7 (2014).
- Zeng, Z., Fagnon, M., Nallan Chakravarthula, T., Alves, N. J. Fibrin clot formation under diverse clotting conditions: Comparing turbidimetry and thromboelastography. Thrombosis Research. 187, 48-55 (2020).
