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Medicine

पूरक थक्का लक्षण वर्णन के लिए टर्बिडिटी और थ्रोम्बोएस्टोग्राफी का लाभ उठाना

Published: June 4, 2020 doi: 10.3791/61519
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Emergency Medicine Department, Indiana University School of Medicine, 2Weldon School of Biomedical Engineering, Purdue University

Summary

फाइब्रिन हेमोसिस और थ्रोम्बोसिस के दौरान थक्का गठन के लिए जिम्मेदार है। टर्बिडिटी परख और थ्रोम्बोएस्टेस्टोग्रे (टेग) का उपयोग सहक्रियात्मक उपकरण के रूप में किया जा सकता है जो थक्के का पूरक आकलन प्रदान करते हैं। ये दोनों तकनीकें एक साथ इस बारे में अधिक जानकारी दे सकती हैं कि थक्के की स्थिति फाइब्रिन क्लॉट गठन को कैसे प्रभावित करते हैं।

Abstract

थ्रोम्बोसिस दुनिया भर में मौत का एक प्रमुख कारण है। फिब्रिन (ओनजन) प्रोटीन मुख्य रूप से थक्का गठन या थ्रोम्बोसिस के लिए जिम्मेदार है। इसलिए, फिब्रिन क्लॉट गठन की विशेषता थ्रोम्बोसिस के अध्ययन के लिए फायदेमंद है। टर्बिडिटी और थ्रोम्बोएस्टोग्राफी (टेग) दोनों का व्यापक रूप से थक्का गठन की निगरानी के लिए विट्रो परख में उपयोग किया जाता है। टर्बिडिटी गतिशील रूप से एक स्पेक्ट्रोमीटर के माध्यम से फाइब्रिन क्लॉट संरचना के माध्यम से प्रकाश संचारण को मापता है और अक्सर अनुसंधान प्रयोगशालाओं में उपयोग किया जाता है। टीईजी एक विशेष चिपचिपा तकनीक है जो सीधे रक्त के थक्के की ताकत को मापती है और मुख्य रूप से रोगियों के हेमेस्तासिस का आकलन करने के लिए नैदानिक सेटिंग्स में उपयोग किया जाता है। इन दो उपकरणों की मदद से, यह अध्ययन एक सरलीकृत फाइब्रिनोजेन/थ्रोम्बिन क्लॉट मॉडल का उपयोग करके इन विट्रो फिब्रिन क्लॉट की विशेषता के लिए एक विधि का वर्णन करता है। दोनों तकनीकों में डेटा रुझानों की तुलना विभिन्न थक्के की स्थिति में की गई थी । मानव और गोजातीय फाइब्रिन के थक्के इस अध्ययन में साथ-साथ बनाए गए थे क्योंकि गोजातीय थक्के कारकों का उपयोग अक्सर नैदानिक और अनुसंधान सेटिंग्स में मानव थक्के कारकों के विकल्प के रूप में किया जाता है। परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि दो अलग-अलग तरीकों के माध्यम से टेग और टर्बिडिटी ट्रैक क्लॉट गठन और जब एक साथ उपयोग किया जाता है तो विविध थक्के की स्थिति में पूरक थक्के ताकत और फाइबर संरचनात्मक जानकारी प्रदान करते हैं।

Introduction

थ्रोम्बोसिस शरीर में रक्त के थक्के का रोग निर्माण है जो रक्त परिसंचरण को अवरुद्ध करता है जिससे दुनिया भर में उच्च रुग्णता और मृत्यु दर होती है। वहां 1 से 2 मामलों में 1000 लोगों को प्रति वर्ष 1, 2) घनाम्बोसिस प्रेरित संवहनी रोगों के2,से3मामले हैं। यहां प्रस्तुत विभिन्न थक्के की स्थिति के तहत थक्का गठन की निगरानी करने के लिए थ्रोम्बोएस्टोग्राफी (टेग) और टर्बिडिटी का लाभ उठाने की एक विधि है। फिब्रिन (ओनजेन) प्राथमिक प्रोटीन है जो शरीर में थक्का बनने के लिए जिम्मेदार है। जमावट झरना के अंतिम चरणों में, फाइब्रिनोपेप्टाइड्स को फाइब्रिनोजेन से फृंभान से झुकाया जाता है, जो अघुलनशील फाइब्रिन मोनोमर के बहुलीकरण की शुरुआत करते हैं क्योंकि थक्के3,,4विकसित होते हैं। पैथोलॉजिकल थ्रोम्बोसिस में थक्का गठन को समझने के लिए, विविध थक्के परिस्थितियों में फाइब्रिन गठन की विशेषता होना आवश्यक है। विट्रो में फाइब्रिन क्लॉट गठन का अध्ययन करने के लिए कई क्लॉट मॉनिटरिंग परख का उपयोग किया गया है। प्रोथ्रोम्बिन समय (पीटी/रुपये) और सक्रिय आंशिक थ्रोम्बोप्लांटिन समय (एपीटीटी) दो आम नैदानिक परखें हैं जो एक विशिष्ट जमावट मार्ग की अखंडता को मापती हैं। हालांकि, वे एकमात्र चर के रूप में समय का उपयोग करते हैं जो भौतिक थक्के गुणों का कोई संकेत नहीं देता है5। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी पूरी तरह से गठित फाइब्रिन क्लॉट की सूक्ष्म संरचना के दृश्य की अनुमति देता है लेकिन थक्का बनाने की प्रक्रिया के बारे में कोई जानकारी प्रदान करता है6। सभी परख के अलावा, टर्बिडिटी परख और TEG समय के साथ गतिशील रूप से थक्का विशेषताओं को ट्रैक करने की क्षमता प्रदान करते हैं । ये तकनीकें व्यापक क्लॉटिंग प्रोफाइल के उपाय को सक्षम करती हैं और इसलिए, अन्य फाइब्रिन क्लॉट लक्षण वर्णन उपकरणों पर कुछ लाभ प्रदान करती हैं।

विशेष रूप से, टर्बिडिटी परख (या थक्का टर्बिडिमेट्री) का व्यापक रूप से अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है क्योंकि इसके सरलीकृत कार्यान्वयन और अनुसंधान प्रयोगशालाओं में स्पेक्ट्रोमीटर की व्यापक पहुंच होती है। यह परख एक परिभाषित तरंगदैर्ध्य (सबसे अधिक 350 - 700 एनएम)7की सीमा में एक तरंगदैर्ध्य पर व्यक्तिगत दोहराव रीडिंग लेने के द्वारा एक बनाने के थक्के के माध्यम से प्रकाश संचारण के एक गतिशील माप की अनुमति देता है । रीडिंग चैंबर में तापमान भी समायोजित किया जा सकता है। फिब्रिन जेल रूपों के रूप में, प्रोटीन नेटवर्क के माध्यम से यात्रा करने वाले प्रकाश की मात्रा कम हो जाती है जिससे समय के साथ अवशोषण में वृद्धि होती है। इसी तरह, थक्का नेटवर्क कम होने पर अवशोषण कम हो जाता है। टर्बिडिटी परख आसानी से एक बहु-अच्छी प्लेट प्रारूप का उपयोग करके मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है ताकि 96-और 384-वेल प्लेटों दोनों में उच्च थ्रूपुट नमूना स्क्रीनिंग की अनुमति दी जा सके। कई थक्का विशेषताओं को एक टर्बिडिटी ट्रेसिंग वक्र (समय माप के साथ अवशोषण) से प्राप्त किया जा सकता है जिसमें शामिल हैं: अधिकतम टर्बिडिटी, अधिकतम टर्बिडिटी का समय, थक्का शुरुआत का समय, और थक्का निर्माण दर (वीमैक्स)। एक फाइब्रिन फाइबर द्रव्यमान / लंबाई अनुपात कच्चे टर्बिडिटी डेटा से भी प्राप्त किया जा सकता,है ताकि फाइब्रिन फाइबर कीमोटाई 8,,9,10का अनुमान लगाया जा सके।

टेईजी का उपयोग मुख्य रूप से नैदानिक सेटिंग में रोगियों के हेमोसिस और थक्के लाइसिस का आकलन करने के लिए किया जाता है। इसका उपयोग आमतौर पर सर्जिकल अनुप्रयोगों में यह निर्धारित करने के लिए किया जाता है कि एंटी-फिब्रिनोलिटिक दवाओं या हीमोस्टेटिक रक्त उत्पादों को कब प्रशासित किया जाना चाहिए11,12. थक्का गठन परख की दीक्षा से पहले कप में जोड़े जा रहे सभी थक्के घटकों के साथ एक टेग कप के अंदर होता है। कप, विकसित थक्के के साथ, शारीरिक रूप से एक पिन है कि अपने केंद्र में डाला जाता है और एक विद्युत मरोड़ सेंसर थक्के की बढ़ती चिपचिपा ताकत उपायों के खिलाफ घूमता है । यह परख आमतौर पर 37 डिग्री सेल्सियस के शारीरिक तापमान पर किया जाता है; हालांकि, तापमान को मैन्युअल रूप से उपकरण पर समायोजित किया जा सकता है। अधिकतम आयाम (एमए), प्रतिक्रिया दर (आर), काइनेटिक्स समय (कश्मीर), α-angle (कोण), और समय से अधिकतम आयाम (टीएमए) को गतिशील तेजी ट्रेसिंग से टीईजी सॉफ्टवेयर द्वारा निकाला जाता है। इन मूल्यों को आम तौर पर एक मरीज के जमाव स्थिति का आकलन करने के लिए नैदानिक सामान्य पर्वतमाला के साथ तुलना कर रहे हैं । जबकि TEG ठीक एक विस्कोमीटर नहीं है, क्योंकि यह मिलीमीटर इकाइयों में थक्के ताकत को मापता है, यह महत्वपूर्ण चिपचिपा थक्का डेटा और चिकित्सकों के लिए एक मूल्यवान नैदानिक निर्णय लेने के उपकरण के रूप में कार्य करता है ताकि विशिष्ट रक्त उत्पादों को प्रशासित करने और चिकित्सीय खुराक13को समायोजित करने का निर्णय लिया जा सके। जब टेग और टर्बिडिटी परख दोनों का एक साथ उपयोग किया जाता है, तो वे पूरक थक्के लक्षण वर्णन जानकारी प्रदान करते हैं क्योंकि थक्का ताकत और काइनेटिक्स आसानी से टेग से निकाले जाते हैं और फिब्रिन फाइबर मोटाई को ऑप्टिकल टर्बिडिटी माप द्वारा एक्सेस किया जा सकता है।

चूंकि फाइब्रिन रक्त के थक्के का एक महत्वपूर्ण घटक है, विविध थक्का निर्माण स्थितियों के तहत फाइब्रिन क्लॉट लक्षण वर्णन इस बारे में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है कि एक विशिष्ट चर थक्के गठन प्रक्रिया और अंतिम थक्के गुणों में कैसे योगदान देता है। इसे समझना थ्रोम्बोसिस निदान और चिकित्सीय के विकास के लिए मार्गदर्शन प्रदान कर सकता है। अधिक प्रतिनिधि फाइब्रिन क्लॉट लक्षण वर्णन प्राप्त करने के लिए, प्लाज्मा को थक्के के गठन की निगरानी करने के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है क्योंकि यह एक सरलीकृत फाइब्रिनोजेन/थ्रोम्बिन मॉडल प्रणाली की तुलना में अधिक निकटता से वीवो क्लॉटिंग स्थितियों में जैसा दिखता है। हालांकि, जमावट झरना की जटिल प्रकृति के कारण, प्लाज्मा का उपयोग कर थक्का गठन जटिलता को जोड़ता है, जिससे व्यक्तिगत कारकों के प्रभाव को अलग करना अधिक कठिन हो जाता है। एक सरलीकृत फाइब्रिनोजेन/थ्रोम्बिन मॉडल का उपयोग अंतिम फाइब्रिन गठन चरण के अलगाव के लिए अनुमति देने वाले पूरे थक्के झरना को शुरू करने की आवश्यकता को रोकता है। दो प्रमुख फाइब्रिन बनाने वाले घटकों (फाइब्रिनोजेन और थ्रोम्बिन) को शामिल करके, यह सेटअप एक अत्यधिक नियंत्रित थक्का गठन स्थिति बनाता है। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि जबकि सरलीकृत थक्का मॉडल का उपयोग यहां किया जाता है, इस प्रोटोकॉल का उपयोग अतिरिक्त थक्के कारकों को शामिल करके अधिक जटिल थक्के की विशेषता के लिए भी किया जा सकता है। इस अध्ययन में, टर्बिडिटी और टीईजी का उपयोग करके फाइब्रिन क्लॉट लक्षण वर्णन अलग-अलग फाइब्रिनोजेन और थ्रोम्बिन सांद्रता, आयनिक ताकत, पीएच और कुल प्रोटीन एकाग्रता द्वारा कियाजाताहै ताकि विवो क्लॉटिंग परिस्थितियों में अलग-अलग नकल की जा सके। प्रोटोकॉल में इन विविधताओं के बारे में विवरण धारा 5 में शामिल किया गया है ।

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Protocol

1. फॉस्फेट बफर नमकीन की तैयारी (पीबीएस)

नोट: PBS इस अध्ययन के दौरान इस्तेमाल किया गया था के रूप में वर्णित परख कैल्शियम के अलावा की आवश्यकता नहीं थी । यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कैल्शियम जोड़ते समय, अक्सर सिटरेट रक्त उत्पादों को फिर से कैल्सीिफाई करने के लिए उपयोग किया जाता है, पीबीएस से बचा जाना चाहिए क्योंकि कैल्शियम फॉस्फेट बफ़र्स में तेज़ करने के लिए जाना जाता है।

  1. डीआई वाटर में 137 एमएम सोडियम क्लोराइड, 1.8 एमएम पोटेशियम फॉस्फेट मोनोबेसिक, 10 एमएम सोडियम फॉस्फेट डायबेसिक और 2.7 एमएम पोटेशियम क्लोराइड मिलाकर 0.01 एम, पीएच 7.4 पीबीएस बफर बनाएं।
  2. पीएच जांच का उपयोग करके बफर पीएच सत्यापित करें और आवश्यकतानुसार सोडियम हाइड्रोक्साइड या हाइड्रोक्लोरिक एसिड का उपयोग करके पीएच को समायोजित करें।
  3. फिब्रिनोजेन और क्लॉटिंग परख की तैयारी के लिए इस पीबीएस का उपयोग करें (जब तक कि अन्यथा निर्दिष्ट न हो)।
    नोट: बफर को फिब्रिनोजेन पाउडर का पुनर्गठन करने का सुझाव दिया जाता है क्योंकि डीआई पानी में रिहाइड्रेशन के परिणामस्वरूप 37 डिग्री सेल्सियस पर भी फाइब्रिनोजेन वर्षा हो सकती है।

2. प्रोटीन की तैयारी और भंडारण

नोट: प्रोटोकॉल के दौरान प्रोटीन स्टॉक सांद्रता टर्बिडिटी और तेईग के लिए विभिन्न सांद्रता पर तैयार की जाती है ताकि अंतिम थक्के समाधानों में नमक, डीआई पानी, पीबीएस और अन्य अवशिष्ट कारकों के लगातार अनुपात के लिए अनुमति दी जा सके।

  1. फिब्रिनोजेन की तैयारी और भंडारण
    नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फाइब्रिनोजेन में संदूषकों में कारक तेरहवीं की एक महत्वपूर्ण मात्रा, अन्य थक्के कारकों की अवशिष्ट मात्रा, भंडारण बफर और लवण शामिल हैं। कैल्शियम की उपस्थिति में, कारक तेरहवीं फाइ को फाइब्रिन क्लॉट नेटवर्क को क्रॉसलिंक करने के लिए जाना जाता है। यह प्रभाव एक कड़ा थक्का संरचना और बढ़ाया थक्का ताकत फाइब्रिन लक्षण वर्णन को प्रभावित करने के लिए योगदान देता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध गतिविधि किट का उपयोग सक्रिय कारक XIIIa स्तरों को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। कारक XIIIa के कारण परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, प्रयोगों को कैल्शियम के बहिष्कार के साथ डिजाइन किया जाना चाहिए या कारक XIIIa को हटाने के लिए अतिरिक्त कदम इस प्रोटोकॉल में शामिल किया जाना चाहिए। इसके अलावा, प्रोटीन भंडारण नमक और बफर प्रकार का आकलन किया जाना चाहिए और यदि आवश्यक हो तो डायलिसिस एक पसंदीदा परख काम कर रहे बफर को स्थानांतरित करने के लिए किया जा सकता है ।
    1. प्रति ट्यूब 20 मिलीग्राम प्रोटीन पर 20 मिलीग्राम प्रोटीन पर 2 मिलीग्राम प्रोटीन में 2 मिली लीटर ट्यूब में लियोफिलाइज्ड फिब्रिनोजेन पाउडर (गोजातीय या मानव) का वजन और एलिकोट करें और 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट स्टोर करें।
    2. प्रयोग के दिन 10 मिनट के लिए आरटी (कमरे के तापमान) को स्वीकार करने के लिए फाइब्रिनोजेन एलिकोट की अनुमति दें। उपयोग से पहले एलिकोट 20 मिनट में पीबीएस के 600 माइक्रोन जोड़कर फाइब्रिनोजेन का पुनर्गठन करें।
    3. फिब्रिनोजन के 10 माइक्रोन लें और यूवी पारदर्शी 96-वेल प्लेट या एक क्यूवेट में पीबीएस के 190 माइक्रोन के साथ इसे पतला करें। एक वाणिज्यिक स्पेक्ट्रोमीटर और उसके सॉफ्टवेयर के माध्यम से 280 एनएम पर अवशोषण लेने के द्वारा फाइब्रिनोजन एकाग्रता का निर्धारण करें।
    4. बियर के कानून का उपयोग कर फाइब्रिनोजेन एकाग्रता (मिलीग्राम/एमएल) की गणना करें । पीबीएस के साथ आगे कमजोर पड़ने से 12 मिलीग्राम/एमएल (टर्बिडिटी परख के लिए) और 3.2 मिलीग्राम/एमएल (तेग के लिए) फाइब्रिनोजेन स्टॉक समाधान तैयार करें (जब तक कि अन्यथा निर्दिष्ट न हो)।
      नोट: बियर के कानून द्वारा Fibrinogen एकाग्रता निर्धारण (mg/mL):
      Equation 1
      मोलर विलुप्त होने गुणांक: ɛ = 513,400 एल मोल-1 सेमी-1 280 एनएम पर; पथलेंगथ (एल); कमजोर पड़ने का कारक (डी); आणविक वजन (मेगावाट) = 340,000 डीए ɛ मेगावाट के साथ ई0.1% = 1.51 (280 एनएम) (विलुप्त होने वाले गुणांक, आपूर्तिकर्ता द्वारा दिए गए गुणांक) को गुणा करके प्राप्त किया जाता है।
  2. थ्रोम्बिन की तैयारी और भंडारण
    1. 200 माइक्रोनाइज्ड (डीआई) पानी में लियोफिलाइज्ड थ्रोम्बिन (गोजातीय या मानव, 1000 यू स्टॉक) का पुनर्गठन 5000 यू/एमएल थ्रोम्बिन स्टॉक सॉल्यूशन के 200 माइक्रोन बनाने के लिए।
    2. समाधान के 5 माइक्रोन (20 यू/ट्यूब) एलिकोट्स बनाएं और अलीकोट को −20 डिग्री सेल्सियस पर जमे रहें।
    3. प्रयोग के दिन 15 मिनट के लिए आरटी में गल थ्रोम्बिन एलिकोट्स और इसे टर्बिडिटी परख के लिए 20 यू/एमएल और डीआई पानी के साथ टीईजी के लिए 18 यू/एमएल को कमजोर करके थ्रोम्बिन वर्किंग सॉल्यूशन बनाते हैं (जब तक कि अन्यथा निर्दिष्ट न हो)।
      नोट: एंजाइम गतिविधि को बनाए रखने के लिए सावधानियां बरती जानी चाहिए जिन्हें विगलन और उपयोग के दौरान बर्फ पर एंजाइमों को बनाए रखकर पूरा किया जा सकता है; हालांकि, आरटी में विगलन के बाद सीधे उपयोग किए जाने पर थ्रोम्बिन गतिविधि में कोई कमी नहीं देखी गई।

3. टर्बिडिटी

  1. किसी भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करें जिसमें 350 - 700 एनएम की अवशोषण सीमा है और समय के साथ क्लॉट टर्बिडिटी की निगरानी करने के लिए एक संबंधित सॉफ्टवेयर है (सामग्रियों की तालिकादेखें)।
  2. स्पेक्ट्रोमीटर चालू करें और संबंधित विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें।
  3. प्लेट 1 और ओपन प्लेट सेटिंग्स टैब का चयन करें। समय के साथ एक गतिशील अवशोषण पढ़ने की निगरानी करने के लिए एबीएस मोड और गतिज पर क्लिक करें।
  4. वेवलेंथ टैब में 550 एनएम (या 350 - 700 एनएम की सीमा में कोई भी मूल्य) चुनें और टाइम टैब में 30 एस के अंतराल के साथ कुल रन समय को 60 मिनट तक समायोजित करें। कुओं पर प्रकाश डालते हुए पढ़ने के लिए रुचि के कुओं का चयन करें। जरूरत पड़ने पर अन्य सेटिंग को एडजस्ट करें।
    नोट: सीमा के निचले छोर पर एक तरंगदैर्ध्य का चयन (लगभग 350 एनएम) एक बेहतर संवेदनशीलता लाता है लेकिन अवशोषण भी स्पेक्ट्रोमीटर की पहचान सीमा से अधिक हो सकता है। टर्बिडिटी मापन के लिए सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली तरंगदैर्ध्य साहित्य में 405 एनएम है; हालांकि, यह प्रोटोकॉल यह सुनिश्चित करने के लिए 550 एनएम का उपयोग करता है कि गतिशील टर्बिडिटी मूल्य सभी प्रयोगों के लिए पता लगाने की सीमा के भीतर हैं। चयनित पठन अंतराल परख संवेदनशीलता के उच्चतम स्तर को प्राप्त करने के लिए जितना संभव हो उतना छोटा होना चाहिए। यह किसी दिए गए परख के दौरान पढ़े जा रहे कुओं के स्पेक्ट्रोमीटर और संख्या पर निर्भर करेगा ।
  5. एक यूवी पारदर्शी 96-अच्छी तरह से प्लेट ले लो। एक कुएं में पिपेट 140 माइक्रोन पीबीएस जिसे पढ़ने के लिए चुना जाता है। कुएं में थ्रोम्बिन (20 यू/एमएल) के 10 माइक्रोल जोड़ें और मिलाएं।
    नोट: अच्छी तरह से सतह के लिए बाध्यकारी गैर विशिष्ट प्रोटीन को कम करने के लिए उच्च बाध्यकारी परख प्लेटों का उपयोग न करें। यह समाधान में प्रोटीन फैलाव को प्रभावित कर सकता है और परिणामस्वरूप उच्च परख परिवर्तनशीलता होती है।
  6. 3 मिलीग्राम/एमएल फाइब्रिनोजेन और 1 यू/एमएल थ्रोम्बिन की अंतिम एकाग्रता के साथ 200 माइक्रोन क्लॉटिंग समाधान प्राप्त करने के लिए कुएं में 50 माइक्रोन (12 मिलीग्राम/एमएल) जोड़कर तुरंत थक्का क्लॉटिंग शुरू करें। समाधान में बुलबुले के निर्माण से बचने के लिए पांच बार ध्यान रखकर अच्छी तरह से सामग्री को अच्छी तरह से मिलाएं क्योंकि वे प्रकाश को बिखरने से अवशोषण को प्रभावित करेंगे।
    नोट: एक ही समय में एक ही प्लेट पर कई थक्के नमूने चलाते समय मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें। कुओं में रिकॉर्ड समय मतभेद और समय अवधि पहले उपकरण द्वारा पढ़ा थक्के समय ऑफसेट करने के लिए ।
  7. धारक में ९६-अच्छी थाली रखें और आरटी में टर्बिडिटी रीडिंग शुरू करने के लिए सॉफ्टवेयर में स्टार्ट पर क्लिक करें ।
    नोट: यदि एक ऊंचा तापमान पर परख बाहर ले जाने तो स्पेक्ट्रोमीटर, थाली, और अभिकर् चर सभी थक्का दीक्षा से पहले वांछित तापमान पर बनाए रखा जाना चाहिए ।
  8. एक बार पूरा हो जाने के बाद, टर्बिडिटी डेटा को पुनः प्राप्त करें और एक साजिश रचने वाले सॉफ्टवेयर में समय के साथ अवशोषण परिवर्तन की साजिश रचकर एक टर्बिडिटी ट्रेसिंग वक्र प्राप्त करें।
  9. समय के साथ वक्र के अधिकतम अवशोषण मूल्य लेने के द्वारा टर्बमैक्स (अधिकतम टर्बिडिटी फिब्रिन फाइबर मोटाई और फाइब्रिन नेटवर्क घनत्व का संकेत) प्राप्त करें।
    नोट: फिब्रिन फाइबर द्रव्यमान/लंबाई अनुपात की गणना निम्नलिखित पांडुलिपि8में प्रदान किए गए समीकरण का उपयोग करके टर्बिडिटी मूल्यों से की जा सकती है ।
  10. 90% से टर्बमैक्स गुणा करके 90% अधिकतम टर्बिडिटी की गणना करें। थक्का दीक्षा से 90% अधिकतम टर्बिडिटी के लिए समय कंप्यूटिंग द्वारा टर्बसमय प्राप्त करें।
    नोट: 90% अधिकतम टर्बिडिटी का समय पूर्ण अधिकतम टर्बिडिटी के समय की तुलना में अधिक विश्वसनीय मीट्रिक है क्योंकि यह अत्यधिक चर अंतिम थक्का गठन अवधि को नष्ट करके थक्का समय का बेहतर प्रतिनिधित्व करता है। थक्का शुरुआत समय (परीक्षण की शुरुआत से समय जब अवशोषण में वृद्धि शुरू होती है) जैसे अतिरिक्त थक्के मापदंडों, और थक्का गठन दर (Vmax, टर्बिडिटी ट्रेसिंग वक्र में रैखिक क्षेत्र की सबसे बड़ी ढलान) को भी टर्बिडिटी ट्रेसिंग से निकाला जा सकता है।

4. थ्रोम्बोएस्टोग्राफी (तेईग)

  1. थ्रोम्बोएस्टोग्राफ एनालाइजर चालू करें और तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर होने का इंतजार करें।
  2. तेग खोलें - सॉफ्टवेयर। लॉग इन करने के बाद, आईडी अनुभाग के तहत एक प्रयोग का नाम बनाएं।
  3. ऑन-स्क्रीन सॉफ्टवेयर संकेतों का पालन करके सभी चैनलों के लिए ई-परीक्षण करें। सभी चेक पूरा होने के बाद लीवर को लोड स्थिति में वापस रखें।
    नोट: एक TEG ई परीक्षण की आवश्यकता है और हर बार जब साधन का उपयोग कर आयोजित किया जाना चाहिए । नैदानिक नमूनों के लिए उपयोग किए जाने पर नियमित निर्माता सुझाए गए अंतरालों पर टेग जमावट नियंत्रण परख (तेग स्तर 1 और स्तर 2 नियंत्रण का उपयोग करके) की आवश्यकता होती है।
  4. टेग टैब पर क्लिक करें, चैनलों के लिए इनपुट नमूना जानकारी जिसका उपयोग किया जाएगा। इसके संबंधित चैनल में एक स्पष्ट अनकोटेड तेग कप रखें। ऊपर तक वाहक स्लाइड और कप नीचे 5 बार प्रेस करने के लिए मरोड़ रॉड को पिन प्रत्यय । वाहक को कम करें और कप को वाहक आधार में नीचे दबाएं जब तक कि यह "क्लिक" न हो जाए।
  5. तेग कप में थ्रोम्बिन समाधान (18 यू/एमएल) के पिपेट 20 माइक्रोन। कप में 3 मिलीग्राम/एमएल फिब्रिनोजेन और 1 यू/एमएल थ्रोम्बिन की अंतिम एकाग्रता के साथ 360 माइक्रोन क्लॉटिंग समाधान प्राप्त करने के लिए तेईग कप में 340 माइक्रोन (3.2 मिलीग्राम/एमएल) जोड़कर तुरंत थक्का क्लॉटिंग शुरू करें। पांच बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके सामग्री मिलाएं।
    नोट: संभावित थक्के कारकों या ब्याज के अन्य घटकों को इस कदम के दौरान जोड़ा जाना चाहिए हमेशा TEG कप में ३६० μL की अंतिम मात्रा बनाए रखने के लिए सावधान किया जा रहा है ।
  6. कप लोडेड कैरियर को स्लाइड करें, लीवर को पढ़ने की स्थिति में ले जाएं और तेईग रीडिंग शुरू करने के लिए सॉफ्टवेयर में स्टार्ट पर क्लिक करें।
  7. एक बार TEG पूरा हो गया है (के बारे में एक घंटे के बाद), TEG मापदंडों को पुनः प्राप्त करने और एक साजिश रचने सॉफ्टवेयर में समय के साथ आयाम की साजिश रचने के द्वारा एक TEG ट्रेसिंग वक्र प्राप्त करते हैं ।
  8. TEGअधिकतम के रूप में एमए लीजिए (अधिकतम आयाम थक्का ताकत का संकेत है) और TMA के रूप में TEGसमय (अधिकतम आयाम के लिए समय) सॉफ्टवेयर से ।
    नोट: एमए की गणना सॉफ्टवेयर द्वारा उस समय अधिकतम आयाम के रूप में की जाती है जिस पर आयाम में 3 मिनट की अवधि में 5% से कम विचलन होता है। टीएमए अधिकतम थ्रोम्बस जनरेशन रेट (स्प्लिट पॉइंट के पास) से एमए तक के समय के रूप में निर्धारित किया जाता है। थक्का विश्लेषण करते समय अन्य पैरामीटर भी आकलन करने के लिए उपयोगी हो सकते हैं। इन मापदंडों के कुछ उदाहरणों में शामिल हैं: आर-टाइम (परीक्षण शुरू होने से जब आयाम 2 मिमी तक पहुंचता है), कश्मीर (आर के अंत से समय जब आयाम 20 मिमी तक पहुंचता है), अल्फा (आर और कश्मीर के बीच लाइन की ढलान), और सीएलटी (थक्का लाइसिस समय)।

5. विभिन्न थक्के की स्थिति में फिब्रिन लक्षण वर्णन

नोट: क्लॉटिंग समाधानों में एक विशिष्ट चर को मॉडुल करके फिब्रिन लक्षण वर्णन प्रयोग करें जैसे: फाइब्रिनोजेन और थ्रोम्बिन सांद्रता, आयनिक शक्ति, पीएच और कुल प्रोटीन सांद्रता। इन उदाहरण चर के साथ प्रयोगात्मक तैयारी इस खंड में वर्णित हैं; हालांकि, अन्य थक्के कारकों और ब्याज की शर्तों को भी प्रतिस्थापित किया जा सकता है। प्रत्येक अद्वितीय परख आवश्यकताओं को ध्यान में रखते हुए एक उपयुक्त बफर सिस्टम का सावधानीपूर्वक चयन करें। टर्बिडिटी और तेग परख के लिए, इन चरों के प्रभाव का विश्लेषण करते समय एक सटीक पृष्ठभूमि घटाव सुनिश्चित करने के लिए एक बफर केवल नियंत्रण शामिल करें।

  1. अलग-अलग फाइब्रिनोजेन एकाग्रता (1, 2, 3, 4, 5 मिलीग्राम/
    1. विभिन्न सांद्रता (4, 8, 12, 16, 20 मिलीग्राम/एमएल) पर टर्बिडिटी परख और 1.1, 2.1, 3.2, 4.2, 5.3 मिलीग्राम/एमएल के लिए टेग) पर फाइब्रिनोजेन स्टॉक तैयार करने के लिए चरण 2.1.4 समायोजित करें।
    2. टर्बिडिटी परख के लिए "96 अच्छी तरह से प्लेट के कई कुओं में 50 μL fibrinogen (4, 8, 12, 16, 20 मिलीग्राम/एमएल) जोड़ने के लिए चरण 3.6 समायोजित करें।
    3. टीईजी के लिए स्पष्ट टेग कप में "340 μL फाइब्रिनोजेन (1.1, 2.1, 3.2, 4.2, 5.3 मिलीग्राम/एमएल) जोड़ने के लिए चरण 4.5 को समायोजित करें।
  2. अलग थ्रोम्बिन एकाग्रता (0.1, 0.3, 0.6, 0.8, 1, 2.5, 5, 10 U/mL)
    1. विभिन्न सांद्रता पर थ्रोम्बिन स्टॉक तैयार करने के लिए चरण 2.2.3 समायोजित करें (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 यू/
    2. टर्बिडिटी परख के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेट के कई कुओं में "10 μL थ्रोम्बिन (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 यू/एमएल) जोड़ने के लिए चरण 3.5 समायोजित करें।
    3. टीईजी के लिए स्पष्ट टीईजी कप में "पिपेट 20 माइक्रोल थ्रोम्बिन (1.8, 5.4, 10.8, 14.4, 18, 45, 90, 180 यू/एमएल) में चरण 4.5 को समायोजित करें।
  3. आयनिक शक्ति बदलती (0.05, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17 और 0.3 मीटर)
    1. सोडियम क्लोराइड भंग (21, 101, 111, 121, 131, 141, और 271 mM) के साथ 1.8 एमएम पोटेशियम फॉस्फेट मोनोबेसिक, 10 एमएम सोडियम फॉस्फेट डायबेसिक और 2.7 एमएम पोटेशियम क्लोराइड डीआई वाटर में अलग-अलग आईओनिक स्ट्रेंथ के साथ 0.01 एम पीबीएस सॉल्यूशंस बनाने के लिए।
    2. टर्बिडिटी और टेग परख दोनों के लिए फाइब्रिनोजेन और क्लॉटिंग समाधान तैयार करने के लिए विभिन्न आयनिक ताकत पर बने पीबीएस का उपयोग करने के लिए चरण 1.3 समायोजित करें।
  4. अलग-अलग पीएच (5.8, 6.6, 7.3, 7.4, 7.5, और 8.0)
    1. सोडियम फॉस्फेट डायबेसिक (0.7, 3.2, 7.7, 8.1, 8.4, 9.5 m M) और पोटेशियम फॉस्फेट मोनोबेसिक (8.2, 6.0, 2.0, 1.7, 1.4, 0.5 mM) 2.7 m मैल पोटेशियम क्लोराइड और सोडियम क्लोराइड (153, 147, 138, 137, 136, 134 mM) के साथ 0.01 एम पीबीएस समाधान बनाने के लिए अलग-अलग पीएच और 0.165 एम पर एक अंतिम आयनिक ताकत के साथ।
    2. पीएच जांच के माध्यम से बफर पीएच मूल्य सत्यापित करें और जरूरत पड़ने पर पीएच को समायोजित करें।
    3. टर्बिडिटी और टेग परख दोनों के लिए फाइब्रिनोजेन और क्लॉटिंग समाधान तैयार करने के लिए विभिन्न पीएच पर बने पीबीएस का उपयोग करने के लिए चरण 1.3 समायोजित करें।
  5. अलग-अलग एल्बुमिन एकाग्रता (0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 मिलीग्राम/
    1. प्रयोग के दिन 20 मिनट के लिए आरटी में पीबीएस के 500 माइक्रोन में lyophilized एल्बुमिन के 2 ग्राम भंग करें।
    2. एल्बुमिन के लिए 43,800 एल मोल −1 सेमी −1 सेमी−1 (280 एनएम पर) के मोलर विलुप्त होने के गुणांक के साथ चरण 2.1.3 और 2.1.4 में उल्लिखित एक ही प्रक्रिया का उपयोग करके एल्बुमिन एकाग्रता का निर्धारण करें।−1
    3. अलग-अलग सांद्रता पर एल्बुमिन स्टॉक तैयार करें।
    4. "पिपेट 40 माइक्रोएल पीबीएस को पढ़ने के लिए चुने गए कुएं में" चरण 3.5 को समायोजित करें और 10 माइक्रोल थ्रोम्बिन (20 यू/एमएल) जोड़ें"। चरण 3.6 को समायोजित करें "100 माइक्रोल एल्बुमिन (0,) के साथ 50 माइक्रोल फाइब्रिनोजेन (12 मिलीग्राम/एमएल) जोड़कर तुरंत थक्का क्लॉटिंग शुरू करें ४०, ८०, १००, १२०, १६०, २०० मिलीग्राम/एमएल) कई कुओं में 3 मिलीग्राम/एमएल फाइब्रिनोजेन, 1 यू/एमएल थ्रोम्बिन और 0, 20, ४०, ५०, ६०, ८०, १०० मिलीग्राम/एमएल एल्बुमिन की अंतिम एकाग्रता के लिए कुओं में ।
    5. चरण 4.5 को समायोजित करें "200 माइक्रोल एल्बुमिन (36, 72, 90, 108, 144, 180 मिलीग्राम/एमएल) और 140 माइक्रोन 7.7 मिलीग्राम/एमएल फिब्रिनोजेन तेग कप में 3 मिलीग्राम/एमएल फिब्रिनोजेन, 1 यू/एमएल थ्रोबिन और 0, की अंतिम एकाग्रता के साथ 360 माइक्रोन क्लॉटिंग समाधान प्राप्त करने के लिए तेग कप में 20, 40, 50, 60, 80, 100 मिलीग्राम/

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Representative Results

चित्रा 1 में दिखाए गए प्रयोग विभिन्न फाइब्रिनोजेन स्तरों पर मानव और गोजातीय फाइब्रिन थक्के के प्रतिनिधि टर्बिडिटी ट्रेसिंग घटता हैं। विभिन्न फाइब्रिनोजेन स्तरों पर फाइब्रिन क्लॉट गठन के लिए प्रतिनिधि तेग ट्रेसिंग वक्र्स को चित्र 2में दिखाया गया है। दोनों ट्रेसिंग घटता प्रदर्शित करता है कि थक्का दीक्षा के बाद एक अंतराल अवधि के बाद, थक्का टर्बिडिटी या थक्का आयाम समय और थक्का गठन के अंत में बंद स्तर के साथ बढ़ जाती है । अधिकतम थक्का गठन का एक अंतिम बिंदु मूल्य और प्रत्येक परख से अधिकतम थक्का गठन के समय का उपयोग पूरी तरह से गठित थक्के और समग्र थक्के की प्रक्रिया की विशेषताओं का आकलन करने के लिए किया जाता है। अधिकतम टर्बिडिटी (टर्बमैक्स)और समय से अधिकतम टर्बिडिटी (टर्बटाइम)दो पैरामीटर हैं जो टर्बिडिटी से प्राप्त होते हैं जबकि अधिकतम आयाम (टेगमैक्स)और समय से अधिकतम आयाम (तेईगसमय)टेग से प्राप्त होते हैं।

इसके अलावा, टर्बमैक्स थक्का संरचना का एक ऑप्टिकल उपाय है जो फाइब्रिन फाइबर मोटाई और फाइब्रिन नेटवर्क घनत्व का संकेत है। तेगमैक्स एक यांत्रिक उपाय है जो पूर्ण थक्के ताकत को दर्शाता है। वे एक थक्के के विभिन्न पहलुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं जो हमारे पिछले निष्कर्षों के आधार पर एक दूसरे से स्वतंत्र हो सकते हैं14. एक साथ लिया, दो मान थक्का माइक्रोस्ट्रक्चर के बारे में पूरक अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, जैसे कि फाइब्रिन नेटवर्क में फाइबर कितने घने पैक किए जाते हैं। स्पष्ट रूप से यह देखने के लिए कि क्लॉटिंग वेरिएबल को कैसे मॉडुलिंग करने से परिणाम प्रभावित होते हैं, डेटा को आगे संगठित किया गया और ट्रेंड प्लॉट्स का उपयोग करके प्रस्तुत किया गया। टर्बिडिटी और तेईग डेटा दोनों के प्रतिनिधि उदाहरण चित्र 3में दिखाए गए हैं । थक्के के समाधान में फाइब्रिनोजन के उच्च स्तर पर, सभी चार मान (टर्बमैक्स,टेईगमैक्स,टर्बटाइम और टेईगटाइम)में वृद्धि होती है। इन परिणामों से, यह व्याख्या की जा सकती है कि एक उच्च फाइब्रिनोजेन सब्सट्रेट स्तर के परिणामस्वरूप एक सघन रेशेदार नेटवर्क में थक्का (बड़ा टर्ब मैक्स) के माध्यम से प्रकाश संचरण सीमितहोता है। यह कड़ा नेटवर्क थक्के ताकत (बड़ा TEG मैक्स) को भी बढ़ाताहै। टर्बटाइम और तेईगटाइम दोनों का विस्तार इंगित करता है कि फाइब्रिन बहुलकीकरण में वृद्धि हुई फाइब्रिनोजन स्तरों पर बाधा आती है। हमारे समूह द्वारा परीक्षण किए गए चरों के लिए टर्बमैक्स और तेगमैक्स के रुझान और उनकी व्याख्याएं तालिका 1में दिखाई गई हैं।

Figure 1
चित्रा 1: थक्का टर्बिडिटी ट्रेसिंग वक्र (0 से 30 मिनट) के प्रतिनिधि उदाहरण। 1 यू/एमएल प्रजातियों के साथ विभिन्न फाइब्रिनोजेन सांद्रता (1, 2, 3, 4, 5 मिलीग्राम/एमएल) में समय के साथ गोजातीय (ए) और मानव (बी) फाइब्रिन गठन की टर्बिडिटी ट्रेसिंग थ्रोम्बिन से मेल खाती है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: तेग ट्रेसिंग वक्र (0 से 30 मिनट) के प्रतिनिधि उदाहरण। 1 यू/एमएल प्रजातियों के साथ विभिन्न फाइब्रिनोजेन सांद्रता (1, 2, 3, 4, 5 मिलीग्राम/एमएल) में समय के साथ गोजातीय(ए)और मानव(बी)फाइब्रिन गठन के टेईजी आयाम ट्रेसिंग थ्रोम्बिन से मेल खाते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: टर्बिडिटी और तेईग डेटा रुझानों के प्रतिनिधि उदाहरण। टर्बमैक्स और टर्बटाइम (ए)के डेटा ट्रेंड्स और विभिन्न गोजातीय या मानव फाइब्रिनोजेन सांद्रता (1, 2, 3, 4, 5 मिलीग्राम/मिलीलीटर) के लिए तेगमैक्स और तेगसमय (बी)के रुझान 1U/एमएल प्रजातियों के साथ थ्रोम्बिन से मेल खाते हैं । सभी डेटा अंक और त्रुटि सलाखों के औसत और त्रिप्लिकेट (टर्बिडिटी) और डुप्लिकेट (TEG) के मानक विचलन हैं । इस आंकड़े को [जेंग, 2020]14से पुन: इस् तेदात किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चर ट्रेंड परिणाम व्याख्याओं
बढ़ा हुआ फाइब्रिनोजेन स्तर बढ़ी हुई टर्बमैक्स और तेगमैक्स सख्त फाइब्रिन फाइबर और डेंजर रेशेदार नेटवर्क का गठन
थ्रोम्बिन स्तर, पीएच और आयनिक ताकत में वृद्धि कम टर्बमैक्स,बढ़ी हुई टेगमैक्स पतले और सख्त फाइब्रिन फाइबर का गठन
एल्बुमिन स्तर में वृद्धि बढ़ी हुई टर्बमैक्स,घटी टीईजीमैक्स मोटा और लूजर फाइब्रिन फाइबर का गठन

तालिका 1: टर्बमैक्स और तेगमैक्सके परिणाम और व्याख्याएं।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध घटकों का उपयोग करके एक सरलीकृत फाइब्रिनोजेन/थ्रोम्बिन क्लॉट मॉडल का परीक्षण करने वाले दो अलग-अलग क्लॉट लक्षण वर्णन उपकरणों के उपयोग को दर्शाता है। तेग और टर्बिडिटी परख दोनों ही आचरण करना आसान है। वे न केवल मैक्स क्लॉट फॉर्मेशन (टर्बमैक्स और तेईगमैक्स)और क्लॉट फॉर्मेशन टाइम (टर्ब टाइम और टेगटाइम) जैसे एंड पॉइंट क्लॉट परीक्षाएं प्रदान करते हैं बल्कि डायनेमिक क्लॉट बनाने की प्रक्रिया का भी आकलन करते हैं।Time यह थक्के लक्षण वर्णन के लिए टेईजी और टर्बिडिटी मूल्यवान उपकरण बनाता है जैसे वैकल्पिक तरीकों को जोड़ने के लिए: एसईएम, पीटी, एपीटीटी, या क्लॉट रीटोलॉजी, जिसमें जटिल प्रायोगिक प्रक्रियाएं हो सकती हैं या केवल एक थक्का पहलू के परीक्षण पर ध्यान केंद्रित किया जा सकता है। टर्बिडिटी और तेईग परिणाम एक साथ भी अधिक पूर्ण प्रोफ़ाइल प्रदान करते हैं कि थक्के चर थक्के विशेषताओं को कैसे प्रभावित करता है।

इस प्रोटोकॉल में विस्तृत क्लॉटिंग चर के अलावा, कई अन्य चर हैं जिनका इन तकनीकों का लाभ उठाने का अध्ययन किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को समायोजित करके संशोधित किया जा सकता है: तापमान, कैल्शियम का स्तर, जमावट कारक स्तर, थक्का सक्रियकों या अवरोधकों के अलावा, या दवा एजेंटों के अलावा, कुछ नाम के लिए। इन चरों का अध्ययन संभावित रूप से सरलीकृत फाइब्रिनोजेन/थ्रोम्बिन मॉडल प्रणाली या प्लाज्मा का उपयोग करके किया जा सकता है । जमावट कारकों का अध्ययन करने के लिए सावधानीपूर्वक विचार करने और सेटअप की आवश्यकता होती है ताकि जमाव मार्ग को शुरू करने के लिए उचित अपस्ट्रीम क्लॉट एक्टिवेशन प्रदान किया जा सके। टर्बिडिटी और तेग भी प्रभावी उपकरण हैं जो थक्का पाचन की निगरानी के लिए उपयोग किए जाते हैं। प्रोटोकॉल को एंटीकोगुलेंट्स या थ्रोम्बोलिटिक एजेंटों की उपस्थिति में फाइब्रिन क्लॉट गठन और लाइसिस की विशेषता के लिए संशोधित किया जा सकता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि टेग का उपयोग करते समय थक्का दीक्षा से पहले चिकित्सीय एजेंट को जोड़ा जाना चाहिए क्योंकि टिंग सिस्टम कार्यात्मक रूप से बंद हो जाता है जब तेईग परख कप में बैठे पिन के साथ उपकरण चल रहा होता है। इसके साथ ही कहा, टीईजी का उपयोग मौजूदा थक्के में थ्रोम्बोलिटिक एजेंट के चिकित्सीय प्रोफ़ाइल का परीक्षण करने में असमर्थ है।

इस प्रोटोकॉल में, दोनों परख उनके आमतौर पर उपयोग की गई प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत आयोजित किए गए थे। TEG आमतौर पर 37 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है और टर्बिडिटी परख कमरे के तापमान (आरटी) पर किया जाता है। इस लक्षण वर्णन विधि का जोर उस प्रवृत्ति परिणामों को निर्धारित और व्याख्या करना है जो एक विशिष्ट चर थक्के पर है। महत्वपूर्ण बात यह है कि टेग का उपयोग करने वाले तापमान को नियंत्रित करना सीधा है क्योंकि अभिकर् थियों को सीधे तापमान नियंत्रित तेईग कप में पिपेट किया जाता है। एक टर्बिडिटी परख में तापमान नियंत्रण कम सीधा है क्योंकि थक्के वाले अभिकरने वालों को मिश्रित किया जाता है और गर्म स्पेक्ट्रोमीटर के भीतर रखे जाने से पहले एक अच्छी तरह से प्लेट में शुरू किया जाता है। जिस दर पर प्लेट और थक्के समाधान कक्ष के भीतर गर्म थक्का गठन दर के सापेक्ष धीमी गति से है और सभी अभिकर्मकों और गर्म कक्ष में रखने से पहले ऊंचा तापमान पर थाली को बनाए रखने मुश्किल हो सकता है और अक्सर गरीब परिवर्तन में परिणाम । कई कुओं में मल्टीप्लेक्सिंग होने पर टर्बिडिटी परख के लिए कमरे के तापमान के अलावा स्थिर तापमान बनाए रखना और जटिल होता है। एक विश्वसनीय और प्रजनन योग्य टर्बिडिटी परिणाम सुनिश्चित करने के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम थक्के शुरू करने के लिए अच्छी तरह से मिश्रण है। जैसा कि प्रत्यक्ष थ्रोम्बिन-फाइब्रिनोजेन क्लीवेज दरार तेजी से होता है, थक्का दीक्षा से पहले अच्छी तरह से मिश्रण गैर-समान फाइब्रिन गठन को दरकिनार कर सकता है।

इस प्रोटोकॉल को प्लेटलेट से भरपूर प्लाज्मा या प्लेटलेट-खराब प्लाज्मा जैसे नैदानिक नमूनों द्वारा गठित थक्के की विशेषता के लिए भी आसानी से संशोधित किया जा सकता है। सिटरेटेड ब्लड ड्रॉ की सिफारिश की जाती है क्योंकि उन्हें पहले मानक तेईग प्रोटोकॉल द्वारा मान्य किया गया है। प्लेटलेट-रिच और प्लेटलेट-खराब प्लाज्मा को क्रमशः 200 पर अपकेंद्री के माध्यम से और आरटी में 15 मिनट के लिए 2,000 x ग्राम से अधिक के माध्यम से सिटरेटेड पूरे रक्त से अलग किया जा सकता है। टर्बिडिटी या तेग में कहते हैं, थक्के अतिरिक्त कैल्शियम क्लोराइड (11 mM) के अलावा के साथ शुरू किया जा सकता है। हालांकि, चूंकि फॉस्फेट कैल्शियम से बांध सकता है जिसके परिणामस्वरूप वर्षा होती है, इसलिए कैल्शियम का उपयोग थक्का सर्जक के रूप में किए जाने पर पीबीएस से बचा जाना चाहिए। प्लेटलेट से भरपूर प्लाज्मा थक्का गठन का अध्ययन करते समय, प्लेटलेट को एक महत्वपूर्ण कॉन्फिंडर के रूप में निपटाने पर विचार करना महत्वपूर्ण है जब थक्का गठन चल रहा है, जिसमें थक्का गठन धीमा है। थक्का गठन तेजी से होने पर प्लेटलेट निपटाने के बारे में समस्याएं कम प्रभावशाली होती हैं। यह विशेष रूप से टर्बिडिटी परख के लिए महत्वपूर्ण है जहां परख सटीकता और प्रजनन क्षमता काफी हद तक अच्छी तरह से अभिकर्मकों की एकरूपता पर निर्भर करती है। यदि प्रयोगात्मक डिजाइन परमिट, काओलिन (अक्सर TEG के लिए एक थक्का सर्जक के रूप में उपयोग किया जाता है) या अन्य नकारात्मक आवेशित कण सक्रियकों का उपयोग जमाव झरना के तेज संपर्क मार्ग सक्रियण के लिए अतिरिक्त सतह क्षेत्र प्रदान करके प्लाज्मा क्लॉट दीक्षा को गति देने के लिए किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात, एक्टिवेटर निलंबन को व्यवस्थित करने से बचने के लिए थक्के समाधानों के साथ अच्छी तरह से मिलाया जाना चाहिए। सतह क्षेत्र या आवेशित कण-आधारित थक्का सक्रियक का उपयोग करते समय यह सुनिश्चित करें कि आवश्यक पृष्ठभूमि नियंत्रणों को ध्यान में रखा जाए क्योंकि अभिकर्ष स्वयं टर्बिडिटी परख में अवशोषण में योगदान दे सकते हैं। इसके अतिरिक्त, बसने के रूप में बड़ा कण आधारित योजक जैसे काओलिन के साथ एक मुद्दा हो सकता है ।

टर्बिडिटी परख के उपयोग पर विचार करते समय पूरे रक्त नमूनों को सावधानीपूर्वक संसाधित किया जाना चाहिए क्योंकि लाल रक्त कोशिकाएं मानक टर्बिडिटी तरंगदैर्ध्य में अवशोषण में महत्वपूर्ण योगदान देती हैं। इस कारण से, टर्बिडिटी के माध्यम से पूरे रक्त का माप अक्सर अधिकांश स्पेक्ट्रोमीटर की पहचान सीमा से अधिक होता है और आमतौर पर संभव नहीं होता है। लाल रक्त कोशिकाओं वाले रक्त के नमूनों पर टर्बिडिटी परख चलाने से पहले पूरे रक्त की विशेषता के लिए वैकल्पिक तरीके आवश्यक या कमजोर पड़ सकते हैं। TEG और टर्बिडिटी, जब एक साथ इस्तेमाल किया, थक्का शक्ति और fibrin फाइबर के लिए अलग माप के संयोजन से व्यापक थक्का गठन और पाचन लक्षण वर्णन के लिए प्रदान करते हैं/

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

कोई नहीं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate Corning 3635 Non-treated acrylic copolymer, non-sterile
Albumin from human serum Millipore Sigma A1653 ≥96%, lyophilized powder
Arium Mini Plus Ultrapure Water System Sartorius NA DI water source
Bovine serum albumin Millipore Sigma A2153 ≥96%, lyophilized powder
Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear) Haemonetics REF 6211
Fibrinogen, Bovine Plasma Millipore Sigma 341573 contains more than 95% clottable protein
Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma Millipore Sigma 341578 Contains ≥ 95% clottable proteins.
Phosphate buffered saline Millipore Sigma P3813 Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
Potassium chloride Millipore Sigma 60130 ≥99.5% purity
Potassium phosphate monobasic Millipore Sigma P9791 ≥98% purity
SevenEasy pH Meter Mettler Toledo S20
Sodium chloride Millipore Sigma 71378 ≥99.5% purity
Sodium phosphate dibasic Millipore Sigma 71636 ≥99.5% purity
SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system Molecular Devices M5
TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system Haemonetics 07-022
Thrombin, Bovine Millipore Sigma 605157
Thrombin, Human Plasma, High Activity Millipore Sigma 605195

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References

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मेडिसिन अंक 160 थ्रोम्बोएस्टोग्राफी टर्बिडिटी थ्रोम्बोसिस फिब्रिन क्लॉट क्लॉट स्ट्रेंथ क्लॉट टर्बिडिटी
पूरक थक्का लक्षण वर्णन के लिए टर्बिडिटी और थ्रोम्बोएस्टोग्राफी का लाभ उठाना
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Zeng, Z., Nallan Chakravarthula, T., Alves, N. J. Leveraging Turbidity and Thromboelastography for Complementary Clot Characterization. J. Vis. Exp. (160), e61519, doi:10.3791/61519 (2020).

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