चूहों में मंडीबुलर बोन मैरो मेसेंचिमल स्टेम सेल की अलगाव और खेती
Summary
यह लेख एक विधि प्रस्तुत करता है जो चूहे के मंडलों से अस्थि मज्जा पालन और प्रवाह साइटोमेट्री छंटाई को अलग-थलग करने, खेती करने, छंटाई करने और बोन मैरो मेसेन्चिमल स्टेम कोशिकाओं की पहचान करने के लिए जोड़ती है।
Abstract
यहां हम प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के लिए कई उच्च गुणवत्ता वाली कोशिकाओं को तेजी से प्राप्त करने के लिए विट्रो में मंडीबुलर बोन मैरो मेसेंचिमल स्टेम सेल (एमबीएएमएससी) को अलग-थलग करने और बनाने के लिए एक कुशल विधि प्रस्तुत करते हैं। एमबीएमएससी का व्यापक रूप से उत्कृष्ट आत्म-नवीकरण क्षमता और बहु-वंश भेदभाव क्षमता के कारण भविष्य में क्रैनियोफेशियल रोगों और क्रैनियो-मैक्सिलोफेशियल पुनर्जनन के मामले में ऊतक इंजीनियरिंग कोशिकाओं के रूप में चिकित्सीय अनुप्रयोगों में उपयोग किया जा सकता है। इसलिए, बड़ी संख्या में एमबीएमएससी प्राप्त करना महत्वपूर्ण है।
इस अध्ययन में, अस्थि मज्जा को मंडीबल से निकाल दिया गया था और प्राथमिक एमबीएमएससी को पूरे अस्थि मज्जा अनुयायी खेती के माध्यम से अलग किया गया था। इसके अलावा, सीडी 29+सीडी90+सीडी 45− एमबीएमएससी फ्लोरोसेंट सेल छंटाई के माध्यम से शुद्ध किया गया। शुद्ध mBMSCs की दूसरी पीढ़ी का उपयोग आगे के अध्ययन के लिए किया गया था और ऑस्टियोब्लास्ट, एडिपोसाइट्स और कोंड्रोसाइट्स में अंतर करने में क्षमता प्रदर्शित की गई थी। इस इन विट्रो मॉडल का उपयोग करते हुए, कोई भी उच्च संख्या में प्रोलिफेरेटिव एमबीएमएससी प्राप्त कर सकता है, जो जैविक विशेषताओं के अध्ययन, माइक्रोएनवायरमेंट के बाद की प्रतिक्रिया और एमबीएमएससी के अन्य अनुप्रयोगों को सुविधाजनक बना सकता है।
Introduction
बोन मैरो मेसेन्चिमल स्टेम सेल (बीएमएससी) अस्थि मज्जा से प्राप्त गैर-हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल हैं जो मजबूत प्रसार क्षमता और बहु-वंश भेदभाव क्षमता1,2,3,4प्रकट करते हैं। दरअसल, BMSCs हड्डी ऊतक इंजीनियरिंग और उत्थान के लिए एक आदर्श उंमीदवार के रूप में माना गया है जब से वे की खोज की गई । वर्षों के लिए, इलियाक क्रेस्ट या लंबी हड्डियों जैसे टिबिया और फीमर क्रैनियोफेशियल पुनर्जनन के लिए बीएमएससी का सबसे आम स्रोत रहा है। हालांकि, ऑर्फियल बीएमएससी, जैसे मंडीबुलर बीएमएससी (एमबीएएमएससी), लंबी हड्डी बीएमएससी से कुछ अंतर प्रदर्शित करते हैं, जैसे कि विभिन्न भ्रूणीय मूल और विकास पैटर्न। मंडीबल्स न्यूरोेक्टोडर्म रोगाणु परत की तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं से उत्पन्न होते हैं और नसों में एंक्यूब्रैस ऑसिफिकेशन से गुजरते हैं, जबकि अक्षीय और परिशिष्ट कंकाल मेसोडर्म से होते हैं और एंडोकॉन्ड्रल ऑसिफिकेशन से गुजरते हैं। इसके अलावा , नैदानिक टिप्पणियों और प्रायोगिक पशु अध्ययनों ने लगातार संकेत दिया है कि ओरोफेशियल और इलियाक क्रेस्ट बीएमएससी 5 ,6,7,8के बीच कार्यात्मक अंतर हैं। रिपोर्टों से पता चला है कि बीएमएससी ने कपाल की हड्डी जैसे मंडीबल, मैक्सिलरी बोन और अल्वेलर बोन से प्राप्त एक्सियल और परिशिष्ट हड्डियों की तुलना में बेहतर प्रसार, जीवन काल और भेदभाव क्षमताकाप्रदर्शन किया । इसलिए, एमबीएमएससी को करूबिज्म, जबड़े के ट्यूमर, जबड़े की हड्डी के ऑस्टियोपोरोसिस और पीरियोडोन्टल ऊतक दोष10, 11, 12जैसे क्रैनियोफेशियल रोगों के भविष्य के चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए पसंदीदा संसाधन मानाजाताहै। पूर्व नैदानिक प्रयोगों में उपचार क्षमता को समझने के लिए, विट्रो में एमबीएमएससी को तेजी से अलग करने और बनाने के लिए एक विधि स्थापित करना आवश्यक है।
इस अध्ययन में, इसका उद्देश्य पूरे अस्थि मज्जा पालन और प्रवाह साइटोमेट्री छंटाई द्वारा शुद्ध एमबीएएमएससी प्राप्त करना था। चूहे के शारीरिक आकृति विज्ञान, स्पष्ट रूप से माइक्रो कंप्यूटेड टोमोग्राफी (माइक्रो सीटी) और हिस्टोलॉजिकल वर्गों के माध्यम से मनाया जाता है, से पता चला है कि मंडीबल की ट्राबेकुलर हड्डी तीक्ष्ण मेडुलरी अंतरिक्ष और अल्वेलर हड्डी के बीच थी। ट्राबेकुलर बोन से अस्थि मज्जा को मंडीबुलर मैरो कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए फ्लश किया गया था, लेकिन इस तरह से सुसंस्कृत कोशिकाएं शुद्ध एमबीएमएससी नहीं थीं और इसमें अनिश्चित पोटेंसी और विविध वंश जैसे हड्डी, वसा और एंडोथेलियल कोशिकाओं से कोशिकाओं के साथ कई प्रकार की कोशिकाएं शामिल होने की संभावना थी13,14। सेल शुद्धिकरण का अगला कदम विशेष रूप से महत्वपूर्ण था। सेल-सतह प्रोटीन के संयोजन को पहचानकर कोशिकाओं को प्रवाहित करें और मेसेंकिमल स्टेम कोशिकाओं के संवर्धन में व्यापक रूप से अपनाया गया है। सेल एकरूपता प्रवाह साइटोमेट्री का मुख्य लाभ है, लेकिन प्रक्रिया सेल व्यवहार्यता निर्धारित नहीं करती है और इसके परिणामस्वरूप सीमित सेल उपज हो सकती है। इस अध्ययन में, पूरे बोन मैरो पालन से प्राप्त पी0 एमबीएमएससी को उच्च शुद्धता और मजबूत प्रसार क्षमता के साथ एमबीएएमएससी प्राप्त करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा हल किया गया था।
यह अध्ययन पूरे बोन मैरो पालन और प्रवाह साइटोमेट्री छंटाई के संयोजन का उपयोग करके चूहे के मंडीबुलर बीएमएससी के अलगाव, संस्कृति और भेदभाव के लिए एक प्रजनन योग्य और विश्वसनीय प्रोटोकॉल का परिचय देता है। यह संबंधित क्षेत्रों में शोधकर्ताओं के लिए उपयोग करने के लिए एक विश्वसनीय और सुविधाजनक तरीका है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल पूरे बोन मैरो पालन और फ्लोरोसेंट सेल छंटाई के संयोजन से विट्रो में चूहे के मंडलियों से बीएमएससी को अलग करने की एक विधि का वर्णन करता है, जो मजबूत भेदभाव क्षमता के साथ प्रोलिफेरेटिव एमबीएम?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम शंघाई नौवें पीपुल्स अस्पताल के Craniofacial विसंगतियों के लिए डिजिटाइज्ड Stomatology और अनुसंधान केंद्र के लिए प्रयोगशाला की सहायता के लिए धंयवाद । इस पांडुलिपि का काम नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (एनएसएफसी) [81570950,81870740,81800949] से अनुदान द्वारा समर्थित है, शंघाई शिखर सम्मेलन और पठार विषयों, शंघाई इंस्टीट्यूट ऑफ प्रिसिजन मेडिसिन, शंघाई नौवें पीपुल्स हॉस्पिटल, शंघाई जियाओ टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन [JC201809], शंघाई जियाओ टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन के लिए उच्च स्तरीय नवाचार टीम की प्रोत्साहन परियोजना से शिपएम-एमयू फंड । और एलजे उत्कृष्ट युवा चिकित्सा प्रतिभाओं के एक विद्वान है, शंघाई “चिकित्सा प्रतिभा के उभरते सितारे” युवा विकास कार्यक्रम और शंघाई Jiaotong विश्वविद्यालय से “चेन Xing” परियोजना ।
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA（1X） | Gibco | 25200072 | |
| 10cm culture dish | Corning | ||
| acutenaculum | |||
| Adipogenic differentiation medium | Cyagen biosciences inc. | MUBMX-90031 | |
| Alcian Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime Biotechnology | C3206 | |
| alpha-Minimum essential medium | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30265.01B | |
| Anti -CollagenII Rabbit pAb | Abcam | ab34712 | |
| Antibodies against CD16/CD32 | |||
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Beyotime Biotechnology | P0131 | |
| APC anti-mouse/rat CD29 Antibody | biolegend inc | 102215 | |
| Biosafety cabinet | Esco | AC2-4S8-CN | |
| CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0461-82 | |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience | Invitrogen | 11-0900-85 | |
| Centrifuge | cence | L500 | |
| Chondrogenesis differentiation medium | cyagen biosciences inc. | ||
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM880 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Crystal Violet Staining Solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30084.03 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 | |
| Incubator | Esco | CCL-170B-8 | |
| Inverted microscope | olympus | CKX53 | |
| Magzol reagent(Trizol reagent) | Magen | ||
| micropipettor | Eppendorf | ||
| Oil Red O | |||
| Osteogenic differentiation medium | cyagen biosciences inc. | MUBMX-90021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline（1X） | Gibco | 20012027 | |
| PrimeScript RT Master Kit | TakaRa Bio Inc | RR036A | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
| QuickBlock Blocking Buffer | Beyotime Biotechnology | P0260 | |
| scissor | |||
| SYBR1 Premix | TakaRa Bio Inc | ||
| Toluidine Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
References
- Jin, C., et al. Stem cell education for medical students at Tongji University: Primary cell culture and directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (2), 151-154 (2018).
- Chu, D. T., et al. An Update on the Progress of Isolation, Culture, Storage, and Clinical Application of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem/Stromal Cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 708 (2020).
- Jin, Z., Chen, J., Shu, B., Xiao, Y., Tang, D. Bone mesenchymal stem cell therapy for ovariectomized osteoporotic rats: a systematic review and meta-analysis. BMC Musculoskeleton Disorder. 20 (1), 556 (2019).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Belyavskii, A. V., Sukhikh, G. T. Differentiation potential of mesenchymal stem cells of different origin. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 141 (1), 147-151 (2006).
- Lloyd, B., et al. Similarities and differences between porcine mandibular and limb bone marrow mesenchymal stem cells. Archives in Oral Biology. 77, 1-11 (2017).
- Zhang, W., et al. Comparison of the use of adipose tissue-derived and bone marrow-derived stem cells for rapid bone regeneration. Journal of Dental Research. 92 (12), 1136-1141 (2013).
- Stefanik, D., et al. Disparate osteogenic response of mandible and iliac crest bone marrow stromal cells to pamidronate. Oral Disorders. 14 (5), 465-471 (2008).
- Aghaloo, T. L., et al. Osteogenic potential of mandibular vs. long-bone marrow stromal cells. Journal of Dental Research. 89 (11), 1293-1298 (2010).
- Kaigler, D., et al. Stem cell therapy for craniofacial bone regeneration: a randomized, controlled feasibility trial. Cell Transplantation. 22 (5), 767-777 (2013).
- Li, C., Wang, F., Zhang, R., Qiao, P., Liu, H. Comparison of proliferation and osteogenic differentiation potential of rat mandibular and femoral bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Stem Cells Development. 2020, 1941629 (2020).
- Matsubara, T., et al. Alveolar bone marrow as a cell source for regenerative medicine: differences between alveolar and iliac bone marrow stromal cells. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (3), 399-409 (2005).
- Chan, C. K. F., et al. Identification of the Human Skeletal Stem Cell. Cell. 175 (1), 43-56 (2018).
- Bianco, P., Riminucci, M., Gronthos, S., Robey, P. G. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications. Stem Cells. 19 (3), 180-192 (2001).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocol. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Xu, H., et al. Icariin prevents oestrogen deficiency-induced alveolar bone loss through promoting osteogenesis via STAT3. Cell Proliferation. 53 (2), 12743 (2020).
- Zhang, P., Wu, Y., Jiang, Z., Jiang, L., Fang, B. Osteogenic response of mesenchymal stem cells to continuous mechanical strain is dependent on ERK1/2-Runx2 signaling. Internation Journal of Molecular Medicine. 29 (6), 1083-1089 (2012).
- Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nature Protocol. 5 (3), 550-560 (2010).
- Lach, M. S., et al. Chondrogenic Differentiation of Pluripotent Stem Cells under Controllable Serum-Free Conditions. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2711 (2019).
- Huang, X., Zhong, L., Hendriks, J., Post, J. N., Karperien, M. The Effects of the WNT-Signaling Modulators BIO and PKF118-310 on the Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 561 (2018).
- Gale, A. L., Linardi, R. L., McClung, G., Mammone, R. M., Ortved, K. F. Comparison of the Chondrogenic Differentiation Potential of Equine Synovial Membrane-Derived and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Veterinary Sciences. 6, 178 (2019).
- Li, X., Zhang, Y., Qi, G. Evaluation of isolation methods and culture conditions for rat bone marrow mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 65 (3), 323-334 (2013).
- Kagami, H., Agata, H., Tojo, A. Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: basic science to clinical translation. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 43 (3), 286-289 (2011).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Abdallah, B. M., Alzahrani, A. M., Abdel-Moneim, A. M., Ditzel, N., Kassem, M. A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal(mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture. Biology Proceedings Online. 21, 3 (2019).
