Summary

Изоляция и культивирование мюндибулярных костных костных костных мозга мезенхимальных стволовых клеток у крыс

Published: August 25, 2020
doi:

Summary

В этой статье представлен метод, который сочетает в себе соблюдение всего костного мозга и цитометрии потока сортировки для изоляции, культивирования, сортировки и выявления мезенхимальных стволовых клеток костного мозга из крысиных челюстей.

Abstract

Здесь мы представляем эффективный метод изоляции и культивирования мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (mBMSCs) в пробирке для быстрого получения многочисленных высококачественных клеток для экспериментальных требований. mBMSCs может быть широко использован в терапевтическом применении в качестве тканевых инженерных клеток в случае черепно-мозговых заболеваний и черепно-челюстно-лицевой регенерации в будущем из-за отличной способности к самообувечиваем и потенциалу дифференциации нескольких линий. Поэтому важно получать mBMSCs в больших количествах.

В этом исследовании костный мозг был смыт из челюсти и первичных mBMSCs были изолированы через весь костный мозг приверженец культивирования. Кроме того, CD29иCD90иCD45и mBMSCs были очищены с помощью флуоресцентной сортировки клеток. Второе поколение очищенных MBMSCs были использованы для дальнейшего изучения и отображается потенциал в дифференциации на остеобласты, адипоциты и хондроциты. Используя эту модель in vitro, можно получить большое количество пролиферативных mBMSCs, которые могут облегчить изучение биологических характеристик, последующую реакцию на микроокнивиронику и другие применения mBMSCs.

Introduction

Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (BMSCs) являются негематопоэтическими стволовыми клетками, полученными из костного мозга, которые проявляют сильную способность к пролиферациии потенциал многослойной дифференциации 1,2,3,4. Действительно, BMSCs были рассмотрены в качестве идеального кандидата для костной ткани инженерии и регенерации с тех пор они были обнаружены. В течение многих лет, подвиховый гребень или длинные кости, такие как голени и бедренной кости были наиболее распространенным источником BMSCs для черепно-мозговой регенерации. Однако орафасовые БМС, такие как мандибулярные БМС (МБМКС), демонстрируют некоторые отличия от длинных костных БМСК, такие как различное эмбриональное происхождение и структура развития. Челюсти возникают из нервных клеток гребня нейроэктодермного зародышевого слоя и проходят внутримембранное окостенение, в то время как осевые и аппендикулярные скелеты из мезодерма и проходят эндохонделальное окостенение. Кроме того, клинические наблюдения и экспериментальные исследования на животных постоянно указывают на то, что существуют функциональные различия между орафациальной и подвиховной гребень BMSCs5,6,7,8. Отчеты показали, что BMSCs производные от черепно-мозговой кости, такие как челюсти, челюстной кости и альвеолярной кости выставлены превосходное пролиферации, продолжительность жизни, и дифференциации возможности, чем у из осяных и аппендикулярныхкостей 9. mBMSCs, таким образом, считаются предпочтительными ресурсами для будущего терапевтического применения черепно-мозговых заболеваний, таких как херувим, опухоль челюсти, остеопороз челюстной кости, и дефектпародонтальной ткани 10,11,12. Чтобы понять потенциал лечения в доклинических экспериментах, необходимо установить метод быстрой изоляции и культивирования mBMSCs in vitro.

В этом исследовании, цель состояла в том, чтобы получить очищенные mBMSCs путем присоединения всего костного мозга и потока цитометрии сортировки. Анатомическая морфология крысиной челюсти, четко наблюдаемая с помощью микрокомитной томографии (Micro-CT) и гистологических секций, показала, что трабекулярная кость челюсти была между резцаторным медуллярным пространством и альвеолярной костью. Костный мозг из трабекулярной кости был промыт для получения клеток мсудистого мозга, но клетки, культурные таким образом, не были чистыми mBMSCs и,вероятно,состоят из нескольких типов клеток с неопределенными потенциями и различных линий, таких как клетки из костей, жира иэндотелиальных клеток 13,14. Следующим шагом очистки клеток было особенно важно. Поток цитометрии фильтрует клетки, распознавая сочетание белков клеточной поверхности и был широко принят в обогащении мезенхимальных стволовых клеток. Однородность клеток является основным преимуществом цитометрии потока, но процесс не определяет жизнеспособность клеток и может привести к ограниченной урожайности клеток. В этом исследовании P0 mBMSCs, полученные из всего костного мозга присоединения были отсортированы по цитометрии потока для получения mBMSCs с высокой чистотой и сильной пролиферативной способности.

Это исследование вводит воспроизводимый и надежный протокол для изоляции, культуры и дифференциации крысы мибибулярных BMSCs с использованием сочетания всего костного мозга присоединения и потока цитометрии сортировки. Это надежный и удобный метод для исследователей в смежных областях для использования.

Protocol

Все экспериментальные процедуры для животных в этой статье были одобрены Комитетом по уходу за животными Шанхайской девятой народной больницы, Медицинской школой Шанхайского университета Цзяо Тонг. 1. Подготовка Используйте двух 5-недельных самцов крыс Спрага Доу?…

Representative Results

Используя этот протокол, большая часть клеток прилипла к пластине на третий день после первоначальной культуры. Как правило, после дополнительных 3-4 дней культуры, слияние клеток достигло 70 до 80%(рисунок 1B). При сортировке флуоресцентныхклеток,DAPI – CD29- CD90и</s…

Discussion

Этот протокол описывает метод изоляции BMSCs от крыс челюсти in vitro путем совмещать все присоединение костного мозга и флуоресцентную сортировку клетки, которая просто и надежный путь получить пролиферативные mBMSCs с сильной способностью дифференциации. Этот метод может предварительно оч?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Благодарим за помощь Лабораторию оцифровке стоматологии и научно-исследовательский центр краниофациальных аномалий Шанхайской девятой народной больницы. Работа этой рукописи поддерживается грантами Национального фонда естественных наук Китая (NSFC) (81570950,81870740,81800949), Шанхайский саммит – Плато Дисциплины, фонд SHIPM-mu от Шанхайского института точной медицины, Шанхайская девятая населения больница, Шанхайская школа медицины Университета Цзяо Тонга (JC201809), проект стимулирования высокоуровневой инновационной команды для Медицинской школы Шанхайского университета Цзяо Тонга. И Л.Д. является ученым выдающихся молодых медицинских талантов, Шанхай “Восходящие звезды медицинского таланта” Программа развития молодежи и “Чэнь Син” проекта из Шанхайского университета Цзяотун.

Materials

0.25% Trypsin-EDTA(1X) Gibco 25200072
10cm culture dish Corning
acutenaculum
Adipogenic differentiation medium Cyagen biosciences inc. MUBMX-90031
Alcian Blue Beyotime Biotechnology
Alizarin red Sigma-Aldrich A5533
Alkaline Phosphatase Color Development Kit Beyotime Biotechnology C3206
alpha-Minimum essential medium GE Healthcare HyClone Cell Culture SH30265.01B
Anti -CollagenII Rabbit pAb Abcam ab34712
Antibodies against CD16/CD32
Antifade Mounting Medium with DAPI Beyotime Biotechnology P0131
APC anti-mouse/rat CD29 Antibody biolegend inc 102215
Biosafety cabinet Esco AC2-4S8-CN
CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience Invitrogen 12-0461-82
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience Invitrogen 11-0900-85
Centrifuge cence L500
Chondrogenesis differentiation medium cyagen biosciences inc.
Confocal laser scanning microscope Zeiss LSM880
Countess II FL Automated Cell Counter Invitrogen AMQAF1000
Crystal Violet Staining Solution Beyotime Biotechnology C0121
Fetal Bovine Serum GE Healthcare HyClone Cell Culture SH30084.03
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) abcam ab150077
Incubator Esco CCL-170B-8
Inverted microscope olympus CKX53
Magzol reagent(Trizol reagent) Magen
micropipettor Eppendorf
Oil Red O
Osteogenic differentiation medium cyagen biosciences inc. MUBMX-90021
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070063
Phosphate-buffered saline(1X) Gibco 20012027
PrimeScript RT Master Kit TakaRa Bio Inc RR036A
Proteinase K Sigma-Aldrich P6556
QuickBlock Blocking Buffer Beyotime Biotechnology P0260
scissor
SYBR1 Premix TakaRa Bio Inc
Toluidine Blue Beyotime Biotechnology
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061

References

  1. Jin, C., et al. Stem cell education for medical students at Tongji University: Primary cell culture and directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (2), 151-154 (2018).
  2. Chu, D. T., et al. An Update on the Progress of Isolation, Culture, Storage, and Clinical Application of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem/Stromal Cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 708 (2020).
  3. Jin, Z., Chen, J., Shu, B., Xiao, Y., Tang, D. Bone mesenchymal stem cell therapy for ovariectomized osteoporotic rats: a systematic review and meta-analysis. BMC Musculoskeleton Disorder. 20 (1), 556 (2019).
  4. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
  5. Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Belyavskii, A. V., Sukhikh, G. T. Differentiation potential of mesenchymal stem cells of different origin. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 141 (1), 147-151 (2006).
  6. Lloyd, B., et al. Similarities and differences between porcine mandibular and limb bone marrow mesenchymal stem cells. Archives in Oral Biology. 77, 1-11 (2017).
  7. Zhang, W., et al. Comparison of the use of adipose tissue-derived and bone marrow-derived stem cells for rapid bone regeneration. Journal of Dental Research. 92 (12), 1136-1141 (2013).
  8. Stefanik, D., et al. Disparate osteogenic response of mandible and iliac crest bone marrow stromal cells to pamidronate. Oral Disorders. 14 (5), 465-471 (2008).
  9. Aghaloo, T. L., et al. Osteogenic potential of mandibular vs. long-bone marrow stromal cells. Journal of Dental Research. 89 (11), 1293-1298 (2010).
  10. Kaigler, D., et al. Stem cell therapy for craniofacial bone regeneration: a randomized, controlled feasibility trial. Cell Transplantation. 22 (5), 767-777 (2013).
  11. Li, C., Wang, F., Zhang, R., Qiao, P., Liu, H. Comparison of proliferation and osteogenic differentiation potential of rat mandibular and femoral bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Stem Cells Development. 2020, 1941629 (2020).
  12. Matsubara, T., et al. Alveolar bone marrow as a cell source for regenerative medicine: differences between alveolar and iliac bone marrow stromal cells. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (3), 399-409 (2005).
  13. Chan, C. K. F., et al. Identification of the Human Skeletal Stem Cell. Cell. 175 (1), 43-56 (2018).
  14. Bianco, P., Riminucci, M., Gronthos, S., Robey, P. G. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications. Stem Cells. 19 (3), 180-192 (2001).
  15. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocol. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  16. Xu, H., et al. Icariin prevents oestrogen deficiency-induced alveolar bone loss through promoting osteogenesis via STAT3. Cell Proliferation. 53 (2), 12743 (2020).
  17. Zhang, P., Wu, Y., Jiang, Z., Jiang, L., Fang, B. Osteogenic response of mesenchymal stem cells to continuous mechanical strain is dependent on ERK1/2-Runx2 signaling. Internation Journal of Molecular Medicine. 29 (6), 1083-1089 (2012).
  18. Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nature Protocol. 5 (3), 550-560 (2010).
  19. Lach, M. S., et al. Chondrogenic Differentiation of Pluripotent Stem Cells under Controllable Serum-Free Conditions. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2711 (2019).
  20. Huang, X., Zhong, L., Hendriks, J., Post, J. N., Karperien, M. The Effects of the WNT-Signaling Modulators BIO and PKF118-310 on the Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 561 (2018).
  21. Gale, A. L., Linardi, R. L., McClung, G., Mammone, R. M., Ortved, K. F. Comparison of the Chondrogenic Differentiation Potential of Equine Synovial Membrane-Derived and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Veterinary Sciences. 6, 178 (2019).
  22. Li, X., Zhang, Y., Qi, G. Evaluation of isolation methods and culture conditions for rat bone marrow mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 65 (3), 323-334 (2013).
  23. Kagami, H., Agata, H., Tojo, A. Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: basic science to clinical translation. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 43 (3), 286-289 (2011).
  24. Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
  25. Abdallah, B. M., Alzahrani, A. M., Abdel-Moneim, A. M., Ditzel, N., Kassem, M. A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal(mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture. Biology Proceedings Online. 21, 3 (2019).

Play Video

Cite This Article
Hong, Y., Xu, H., Yang, Y., Zhou, S., Jin, A., Huang, X., Dai, Q., Jiang, L. Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats. J. Vis. Exp. (162), e61532, doi:10.3791/61532 (2020).

View Video