Изоляция и культивирование мюндибулярных костных костных костных мозга мезенхимальных стволовых клеток у крыс
Summary
В этой статье представлен метод, который сочетает в себе соблюдение всего костного мозга и цитометрии потока сортировки для изоляции, культивирования, сортировки и выявления мезенхимальных стволовых клеток костного мозга из крысиных челюстей.
Abstract
Здесь мы представляем эффективный метод изоляции и культивирования мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (mBMSCs) в пробирке для быстрого получения многочисленных высококачественных клеток для экспериментальных требований. mBMSCs может быть широко использован в терапевтическом применении в качестве тканевых инженерных клеток в случае черепно-мозговых заболеваний и черепно-челюстно-лицевой регенерации в будущем из-за отличной способности к самообувечиваем и потенциалу дифференциации нескольких линий. Поэтому важно получать mBMSCs в больших количествах.
В этом исследовании костный мозг был смыт из челюсти и первичных mBMSCs были изолированы через весь костный мозг приверженец культивирования. Кроме того, CD29иCD90иCD45и mBMSCs были очищены с помощью флуоресцентной сортировки клеток. Второе поколение очищенных MBMSCs были использованы для дальнейшего изучения и отображается потенциал в дифференциации на остеобласты, адипоциты и хондроциты. Используя эту модель in vitro, можно получить большое количество пролиферативных mBMSCs, которые могут облегчить изучение биологических характеристик, последующую реакцию на микроокнивиронику и другие применения mBMSCs.
Introduction
Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (BMSCs) являются негематопоэтическими стволовыми клетками, полученными из костного мозга, которые проявляют сильную способность к пролиферациии потенциал многослойной дифференциации 1,2,3,4. Действительно, BMSCs были рассмотрены в качестве идеального кандидата для костной ткани инженерии и регенерации с тех пор они были обнаружены. В течение многих лет, подвиховый гребень или длинные кости, такие как голени и бедренной кости были наиболее распространенным источником BMSCs для черепно-мозговой регенерации. Однако орафасовые БМС, такие как мандибулярные БМС (МБМКС), демонстрируют некоторые отличия от длинных костных БМСК, такие как различное эмбриональное происхождение и структура развития. Челюсти возникают из нервных клеток гребня нейроэктодермного зародышевого слоя и проходят внутримембранное окостенение, в то время как осевые и аппендикулярные скелеты из мезодерма и проходят эндохонделальное окостенение. Кроме того, клинические наблюдения и экспериментальные исследования на животных постоянно указывают на то, что существуют функциональные различия между орафациальной и подвиховной гребень BMSCs5,6,7,8. Отчеты показали, что BMSCs производные от черепно-мозговой кости, такие как челюсти, челюстной кости и альвеолярной кости выставлены превосходное пролиферации, продолжительность жизни, и дифференциации возможности, чем у из осяных и аппендикулярныхкостей 9. mBMSCs, таким образом, считаются предпочтительными ресурсами для будущего терапевтического применения черепно-мозговых заболеваний, таких как херувим, опухоль челюсти, остеопороз челюстной кости, и дефектпародонтальной ткани 10,11,12. Чтобы понять потенциал лечения в доклинических экспериментах, необходимо установить метод быстрой изоляции и культивирования mBMSCs in vitro.
В этом исследовании, цель состояла в том, чтобы получить очищенные mBMSCs путем присоединения всего костного мозга и потока цитометрии сортировки. Анатомическая морфология крысиной челюсти, четко наблюдаемая с помощью микрокомитной томографии (Micro-CT) и гистологических секций, показала, что трабекулярная кость челюсти была между резцаторным медуллярным пространством и альвеолярной костью. Костный мозг из трабекулярной кости был промыт для получения клеток мсудистого мозга, но клетки, культурные таким образом, не были чистыми mBMSCs и,вероятно,состоят из нескольких типов клеток с неопределенными потенциями и различных линий, таких как клетки из костей, жира иэндотелиальных клеток 13,14. Следующим шагом очистки клеток было особенно важно. Поток цитометрии фильтрует клетки, распознавая сочетание белков клеточной поверхности и был широко принят в обогащении мезенхимальных стволовых клеток. Однородность клеток является основным преимуществом цитометрии потока, но процесс не определяет жизнеспособность клеток и может привести к ограниченной урожайности клеток. В этом исследовании P0 mBMSCs, полученные из всего костного мозга присоединения были отсортированы по цитометрии потока для получения mBMSCs с высокой чистотой и сильной пролиферативной способности.
Это исследование вводит воспроизводимый и надежный протокол для изоляции, культуры и дифференциации крысы мибибулярных BMSCs с использованием сочетания всего костного мозга присоединения и потока цитометрии сортировки. Это надежный и удобный метод для исследователей в смежных областях для использования.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает метод изоляции BMSCs от крыс челюсти in vitro путем совмещать все присоединение костного мозга и флуоресцентную сортировку клетки, которая просто и надежный путь получить пролиферативные mBMSCs с сильной способностью дифференциации. Этот метод может предварительно оч?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Благодарим за помощь Лабораторию оцифровке стоматологии и научно-исследовательский центр краниофациальных аномалий Шанхайской девятой народной больницы. Работа этой рукописи поддерживается грантами Национального фонда естественных наук Китая (NSFC) (81570950,81870740,81800949), Шанхайский саммит – Плато Дисциплины, фонд SHIPM-mu от Шанхайского института точной медицины, Шанхайская девятая населения больница, Шанхайская школа медицины Университета Цзяо Тонга (JC201809), проект стимулирования высокоуровневой инновационной команды для Медицинской школы Шанхайского университета Цзяо Тонга. И Л.Д. является ученым выдающихся молодых медицинских талантов, Шанхай “Восходящие звезды медицинского таланта” Программа развития молодежи и “Чэнь Син” проекта из Шанхайского университета Цзяотун.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA（1X） | Gibco | 25200072 | |
| 10cm culture dish | Corning | ||
| acutenaculum | |||
| Adipogenic differentiation medium | Cyagen biosciences inc. | MUBMX-90031 | |
| Alcian Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime Biotechnology | C3206 | |
| alpha-Minimum essential medium | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30265.01B | |
| Anti -CollagenII Rabbit pAb | Abcam | ab34712 | |
| Antibodies against CD16/CD32 | |||
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Beyotime Biotechnology | P0131 | |
| APC anti-mouse/rat CD29 Antibody | biolegend inc | 102215 | |
| Biosafety cabinet | Esco | AC2-4S8-CN | |
| CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0461-82 | |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience | Invitrogen | 11-0900-85 | |
| Centrifuge | cence | L500 | |
| Chondrogenesis differentiation medium | cyagen biosciences inc. | ||
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM880 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Crystal Violet Staining Solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30084.03 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 | |
| Incubator | Esco | CCL-170B-8 | |
| Inverted microscope | olympus | CKX53 | |
| Magzol reagent(Trizol reagent) | Magen | ||
| micropipettor | Eppendorf | ||
| Oil Red O | |||
| Osteogenic differentiation medium | cyagen biosciences inc. | MUBMX-90021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline（1X） | Gibco | 20012027 | |
| PrimeScript RT Master Kit | TakaRa Bio Inc | RR036A | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
| QuickBlock Blocking Buffer | Beyotime Biotechnology | P0260 | |
| scissor | |||
| SYBR1 Premix | TakaRa Bio Inc | ||
| Toluidine Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
References
- Jin, C., et al. Stem cell education for medical students at Tongji University: Primary cell culture and directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (2), 151-154 (2018).
- Chu, D. T., et al. An Update on the Progress of Isolation, Culture, Storage, and Clinical Application of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem/Stromal Cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 708 (2020).
- Jin, Z., Chen, J., Shu, B., Xiao, Y., Tang, D. Bone mesenchymal stem cell therapy for ovariectomized osteoporotic rats: a systematic review and meta-analysis. BMC Musculoskeleton Disorder. 20 (1), 556 (2019).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Belyavskii, A. V., Sukhikh, G. T. Differentiation potential of mesenchymal stem cells of different origin. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 141 (1), 147-151 (2006).
- Lloyd, B., et al. Similarities and differences between porcine mandibular and limb bone marrow mesenchymal stem cells. Archives in Oral Biology. 77, 1-11 (2017).
- Zhang, W., et al. Comparison of the use of adipose tissue-derived and bone marrow-derived stem cells for rapid bone regeneration. Journal of Dental Research. 92 (12), 1136-1141 (2013).
- Stefanik, D., et al. Disparate osteogenic response of mandible and iliac crest bone marrow stromal cells to pamidronate. Oral Disorders. 14 (5), 465-471 (2008).
- Aghaloo, T. L., et al. Osteogenic potential of mandibular vs. long-bone marrow stromal cells. Journal of Dental Research. 89 (11), 1293-1298 (2010).
- Kaigler, D., et al. Stem cell therapy for craniofacial bone regeneration: a randomized, controlled feasibility trial. Cell Transplantation. 22 (5), 767-777 (2013).
- Li, C., Wang, F., Zhang, R., Qiao, P., Liu, H. Comparison of proliferation and osteogenic differentiation potential of rat mandibular and femoral bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Stem Cells Development. 2020, 1941629 (2020).
- Matsubara, T., et al. Alveolar bone marrow as a cell source for regenerative medicine: differences between alveolar and iliac bone marrow stromal cells. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (3), 399-409 (2005).
- Chan, C. K. F., et al. Identification of the Human Skeletal Stem Cell. Cell. 175 (1), 43-56 (2018).
- Bianco, P., Riminucci, M., Gronthos, S., Robey, P. G. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications. Stem Cells. 19 (3), 180-192 (2001).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocol. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Xu, H., et al. Icariin prevents oestrogen deficiency-induced alveolar bone loss through promoting osteogenesis via STAT3. Cell Proliferation. 53 (2), 12743 (2020).
- Zhang, P., Wu, Y., Jiang, Z., Jiang, L., Fang, B. Osteogenic response of mesenchymal stem cells to continuous mechanical strain is dependent on ERK1/2-Runx2 signaling. Internation Journal of Molecular Medicine. 29 (6), 1083-1089 (2012).
- Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nature Protocol. 5 (3), 550-560 (2010).
- Lach, M. S., et al. Chondrogenic Differentiation of Pluripotent Stem Cells under Controllable Serum-Free Conditions. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2711 (2019).
- Huang, X., Zhong, L., Hendriks, J., Post, J. N., Karperien, M. The Effects of the WNT-Signaling Modulators BIO and PKF118-310 on the Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 561 (2018).
- Gale, A. L., Linardi, R. L., McClung, G., Mammone, R. M., Ortved, K. F. Comparison of the Chondrogenic Differentiation Potential of Equine Synovial Membrane-Derived and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Veterinary Sciences. 6, 178 (2019).
- Li, X., Zhang, Y., Qi, G. Evaluation of isolation methods and culture conditions for rat bone marrow mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 65 (3), 323-334 (2013).
- Kagami, H., Agata, H., Tojo, A. Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: basic science to clinical translation. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 43 (3), 286-289 (2011).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Abdallah, B. M., Alzahrani, A. M., Abdel-Moneim, A. M., Ditzel, N., Kassem, M. A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal(mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture. Biology Proceedings Online. 21, 3 (2019).
