Dit artikel presenteert een methode die volledige beenmergaanhechting en flowcytometriesortering combineert voor het isoleren, cultiveren, sorteren en identificeren van beenmerg mesenchymale stamcellen uit rattenkaken.
Hier presenteren we een efficiënte methode voor het isoleren en cultiveren van mandibulaire beenmerg mesenchymale stamcellen (mBMSC’s) in vitro om snel talrijke hoogwaardige cellen te verkrijgen voor experimentele vereisten. mBMSC’s kunnen op grote schaal worden gebruikt in therapeutische toepassingen als weefseltechnologiecellen in het geval van craniofaciale ziekten en cranio-maxillofaciale regeneratie in de toekomst vanwege het uitstekende zelfvernieuwingsvermogen en multi-lineage differentiatiepotentieel. Daarom is het belangrijk om mBMSC’s in grote aantallen te verkrijgen.
In deze studie werd beenmerg uit de onderkaak gespoeld en werden primaire mBC’s geïsoleerd door hele beenmergaanaanhechtingsteelt. Bovendien werden CD29+CD90+CD45− mBC’s gezuiverd door fluorescerende celsortering. De tweede generatie gezuiverde mBC’s werd gebruikt voor verder onderzoek en toonde potentieel bij het differentiëren in osteoblasten, adipocyten en chondrocyten. Met behulp van dit in vitro model kan men een groot aantal proliferatieve mBC’s verkrijgen, wat de studie van de biologische kenmerken, de daaropvolgende reactie op het micromilieu en andere toepassingen van mBMSC’s kan vergemakkelijken.
Beenmerg mesenchymale stamcellen (BMSC ‘s) zijn niet-hematopoëtische stamcellen afgeleid van beenmerg die een sterk proliferatievermogen en multi-lineage differentiatiepotentieel1,2,3,4manifesteren . Bmsc’s worden inderdaad beschouwd als een ideale kandidaat voor botweefseltechnologie en regeneratie sinds ze werden ontdekt. Al jaren zijn de iliacale kuif of lange botten zoals het scheenbeen en dijbeen de meest voorkomende bron van BMSC’s voor craniofaciale regeneratie. Orofaciale BMSC’s, zoals mandibulaire BMSC’s (mBMSC’s), vertonen echter enkele verschillen met BMSC’s met lange botten, zoals verschillende embryonale oorsprong en ontwikkelingspatroon. Kaken ontstaan uit neurale kuifcellen van de kiemlaag van het neuroectoderm en ondergaan intramembraneuze ossificatie, terwijl axiale en appendiculaire skeletten van het mesoderm zijn en endochondrale ossificatie ondergaan. Bovendien hebben klinische waarnemingen en experimentele dierstudies consequent aangetoond dat er functionele verschillen zijn tussen orofaciale en iliacale crest BMSC ‘s5,6,7,8. Rapporten hebben aangetoond dat BMSC’s afgeleid van craniofaciale botten zoals onderkaak, maxillair bot en alveolair bot een superieure proliferatie, levensduur en differentiatiecapaciteit vertoonden dan die van axiale en appendiculaire botten9. mBMSC’s worden daarom beschouwd als de voorkeursbronnen voor toekomstige therapeutische toepassingen van craniofaciale ziekten zoals cherubisme, kaaktumor, osteoporose van kaakbot en parodontale weefseldefect10,11,12. Om het behandelingspotentieel in preklinische experimenten te begrijpen, is het essentieel om een methode vast te stellen voor het snel isoleren en cultiveren van mBC’s in vitro.
In deze studie was het doel om gezuiverde mBC’s te verkrijgen door volledige beenmergaantrouwing en flowcytometriesortering. De anatomische morfologie van de onderkaak van ratten, duidelijk waargenomen door middel van micro-computertomografie (Micro-CT) en histologische secties, toonde aan dat het trabeculaire bot van de onderkaak zich tussen de snijtanden en het alveolaire bot bevond. Het beenmerg van trabeculair bot werd gespoeld om mandibulaire mergcellen te verkrijgen, maar de cellen die op deze manier werden gekweekt, waren geen zuivere mBMSC’s en bestonden waarschijnlijk uit meerdere soorten cellen met onzekere potenties en diverse afstammingen zoals cellen uit bot-, vet- en endotheelcellen13,14. De volgende stap van celzuivering was bijzonder belangrijk. Flow cytometrie filtert cellen door het herkennen van een combinatie van cel-oppervlakte eiwitten en is op grote schaal toegepast in de verrijking van mesenchymale stamcellen. Celhomogeniteit is het belangrijkste voordeel van flowcytometrie, maar het proces bepaalt de levensvatbaarheid van cellen niet en kan resulteren in een beperkte celopbrengst. In deze studie werden de P0 mBMSC’s verkregen uit volledige beenmergaantrouwing gesorteerd op flowcytometrie om mBC’s met een hoge zuiverheid en sterke proliferatiecapaciteit te verkrijgen.
Deze studie introduceert een reproduceerbaar en betrouwbaar protocol voor isolatie, kweek en differentiatie van mandibulaire BMSC’s van ratten met behulp van een combinatie van volledige beenmergaantrouwing en flowcytometriesortering. Het is een betrouwbare en handige methode voor onderzoekers op verwante gebieden om te gebruiken.
Dit protocol beschrijft een methode om BMSC’s in vitro te isoleren van rattenmankaken door volledige beenmergaantrouwing en fluorescerende celsortering te combineren, wat een eenvoudige en betrouwbare manier is om proliferatieve mBC’s met een sterk differentiatievermogen te verkrijgen. Deze methode zou mBC’s voorlopig kunnen zuiveren door celsortering, maar als er hogere eisen zijn aan celhomogeniteit, kunnen nauwkeurigere zuiveringsmethoden nodig zijn.
Momenteel zijn er vier hoofdtechnieken d…
The authors have nothing to disclose.
We danken voor de hulp van Laboratory for Digitized Stomatology and Research Center for Craniofacial Anomalies of Shanghai Ninth People’s Hospital. Het werk van dit manuscript wordt ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit & Plateau Disciplines, het SHIPM-mu fonds van Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], het Incentive Project of High-level Innovation Team for Shanghai Jiao Tong University. En L.J. is een geleerde van de Outstanding Youth Medical Talents, Shanghai “Rising Stars of Medical Talent” Youth Development Program en het “Chen Xing” project van shanghai Jiaotong University.
0.25% Trypsin-EDTA(1X) | Gibco | 25200072 | |
10cm culture dish | Corning | ||
acutenaculum | |||
Adipogenic differentiation medium | Cyagen biosciences inc. | MUBMX-90031 | |
Alcian Blue | Beyotime Biotechnology | ||
Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime Biotechnology | C3206 | |
alpha-Minimum essential medium | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30265.01B | |
Anti -CollagenII Rabbit pAb | Abcam | ab34712 | |
Antibodies against CD16/CD32 | |||
Antifade Mounting Medium with DAPI | Beyotime Biotechnology | P0131 | |
APC anti-mouse/rat CD29 Antibody | biolegend inc | 102215 | |
Biosafety cabinet | Esco | AC2-4S8-CN | |
CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0461-82 | |
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience | Invitrogen | 11-0900-85 | |
Centrifuge | cence | L500 | |
Chondrogenesis differentiation medium | cyagen biosciences inc. | ||
Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM880 | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
Crystal Violet Staining Solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
Fetal Bovine Serum | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30084.03 | |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 | |
Incubator | Esco | CCL-170B-8 | |
Inverted microscope | olympus | CKX53 | |
Magzol reagent(Trizol reagent) | Magen | ||
micropipettor | Eppendorf | ||
Oil Red O | |||
Osteogenic differentiation medium | cyagen biosciences inc. | MUBMX-90021 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
Phosphate-buffered saline(1X) | Gibco | 20012027 | |
PrimeScript RT Master Kit | TakaRa Bio Inc | RR036A | |
Proteinase K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
QuickBlock Blocking Buffer | Beyotime Biotechnology | P0260 | |
scissor | |||
SYBR1 Premix | TakaRa Bio Inc | ||
Toluidine Blue | Beyotime Biotechnology | ||
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |