Denne artikel præsenterer en metode, der kombinerer hele knoglemarvsophæftning og flowcytometrisortering til isolering, dyrkning, sortering og identifikation af knoglemarvsmetrimometriske stamceller fra rotte mandibler.
Her præsenterer vi en effektiv metode til isolering og dyrkning af mandibulære knoglemarvsmetrimylceller (mBMSCs) in vitro for hurtigt at opnå mange celler af høj kvalitet til eksperimentelle behov. mBMSCs kunne i vid udstrækning anvendes i terapeutiske anvendelser som vævstekniske celler i tilfælde af kraniofaciale sygdomme og kranio-maxillofacial regenerering i fremtiden på grund af den fremragende selvfornyelse evne og multi-afstamning differentiering potentiale. Derfor er det vigtigt at opnå mBMSCs i stort antal.
I denne undersøgelse blev knoglemarven skyllet ud af underkæben, og primære mBMSC’er blev isoleret gennem hele knoglemarvshængende dyrkning. Desuden blev CD29+CD90+CD45− mBMSCs renset gennem fluorescerende cellesortering. Anden generation af rensede mBMSC’er blev anvendt til yderligere undersøgelse og viste potentiale i at differentiere sig til osteoblaster, adipocytter og chondrocytter. Ved hjælp af denne in vitro-model kan man opnå et stort antal proliferative mBMSC’er, hvilket kan lette undersøgelsen af de biologiske egenskaber, den efterfølgende reaktion på mikromiljøet og andre anvendelser af mBMSC’er.
Knoglemarvsmetrimyle stamceller (BMSC’er) er ikke-hæmatopoietiske stamceller fra knoglemarv , der manifesterer en stærk spredningskapacitet og differentieringspotentiale for flere afstamninger1,2,3,4. Faktisk er BMSC’er blevet betragtet som en ideel kandidat til knoglevævsteknik og regenerering, lige siden de blev opdaget. I årevis har iliaca kam eller lange knogler såsom skinnebenet og lårbenet været den mest almindelige kilde til BMSCs for kraniofacial regenerering. Eller af kommercielle BMSC’er, såsom mandibular BMSCs (mBMSCs), udviser dog visse forskelle fra BMSC’er med lange knogler, f.eks. Mandibler opstår fra neurale kamceller i neuroectoderm kimlaget og gennemgår intramembranøs ossifikation, mens aksiale og blindtarmssømmer er fra mesodermen og gennemgår endokondrisk ossifikation. Endvidere har kliniske observationer og eksperimentelle dyreforsøg konsekvent vist , at der er funktionelle forskelle mellem orofacial og iliaca crest BMSCs5,6,7,8. Rapporter har vist, at BMSCs stammer fra kraniofacial knogle såsom mandible, maxillary knogle, og alveolar knogle udstillet overlegen spredning, levetid, og differentiering kapacitet end dem fra aksial og blindtarmsfæld9. mBMSCs anses derfor for at være de foretrukne ressourcer til fremtidige terapeutiske anvendelser af kraniofaciale sygdomme som cherubisme, kæbetumor, osteoporose af kæbeknogle og paradentosevævsdefekt10,11,12. For at forstå behandlingspotentialet i prækliniske eksperimenter er det vigtigt at etablere en metode til hurtig isolering og dyrkning af mBMSCs in vitro.
I denne undersøgelse var målet at opnå rensede mBMSC’er ved hel knoglemarvstilkæv og flowcytometrisortering. Den anatomiske morfologi af rotte mandible, tydeligt observeret gennem mikrocomputertomografi (Micro-CT) og histologiske sektioner, viste, at mandiblens trabekulære knogle var mellem det incisor medullære rum og alveolarbenet. Knoglemarven fra trabekulær knogle blev skyllet for at opnå mandibular marv celler, men cellerne dyrket på denne måde var ikke ren mBMSCs og var tilbøjelige til at bestå af flere typer af celler med usikre potencies og forskellige afstamninger såsom celler fra knogler, fedt og endotelceller13,14. Det næste trin i cellerensning var særlig vigtigt. Flow cytometri filtrerer celler ved at genkende en kombination af celle-overflade proteiner og er blevet bredt vedtaget i berigelsen af mesenchymale stamceller. Celle homogenitet er den største fordel ved flowcytometry, men processen bestemmer ikke celle levedygtighed og kan resultere i en begrænset celleydelse. I denne undersøgelse blev P0 mBMSC’erne opnået ved overholdelse af hele knoglemarvsbesætning sorteret efter flowcytometry for at opnå mBMSC’er med høj renhed og stærk spredningskapacitet.
Denne undersøgelse introducerer en reproducerbar og pålidelig protokol for isolation, kultur og differentiering af rotte mandibular BMSCs ved hjælp af en kombination af hele knoglemarvsophæftning og flow cytometrisortering. Det er en pålidelig og bekvem metode for forskere inden for beslægtede områder at bruge.
Denne protokol beskriver en metode til at isolere BMSC’er fra rotte mandibles in vitro ved at kombinere hele knoglemarvstilstrækkelse og fluorescerende cellesortering, hvilket er en enkel og pålidelig måde at opnå proliferative mBMSCs med stærk differentieringsevne. Denne metode kan foreløbigt rense mBMSCs ved flowcellesortering, men hvis der er højere krav til celle homogenitet, kan der være behov for mere præcise rensningsmetoder.
I øjeblikket er der fire hovedteknikker, der anvend…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker for hjælp fra Laboratoriet for Digitaliseret Stomatologi og Research Center for Craniofacial Anomalies of Shanghai Ninth People’s Hospital. Værket i dette manuskript er støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit &Plateau Disciplines, SHIPM-mu-fonden fra Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], Incitamentsprojektet for innovationsteam på højt niveau for Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Og LJ er en forsker i Outstanding Youth Medical Talents, Shanghai “Rising Stars of Medical Talent” Youth Development Program og “Chen Xing” projekt fra Shanghai Jiaotong University.
0.25% Trypsin-EDTA(1X) | Gibco | 25200072 | |
10cm culture dish | Corning | ||
acutenaculum | |||
Adipogenic differentiation medium | Cyagen biosciences inc. | MUBMX-90031 | |
Alcian Blue | Beyotime Biotechnology | ||
Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime Biotechnology | C3206 | |
alpha-Minimum essential medium | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30265.01B | |
Anti -CollagenII Rabbit pAb | Abcam | ab34712 | |
Antibodies against CD16/CD32 | |||
Antifade Mounting Medium with DAPI | Beyotime Biotechnology | P0131 | |
APC anti-mouse/rat CD29 Antibody | biolegend inc | 102215 | |
Biosafety cabinet | Esco | AC2-4S8-CN | |
CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0461-82 | |
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience | Invitrogen | 11-0900-85 | |
Centrifuge | cence | L500 | |
Chondrogenesis differentiation medium | cyagen biosciences inc. | ||
Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM880 | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
Crystal Violet Staining Solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
Fetal Bovine Serum | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30084.03 | |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 | |
Incubator | Esco | CCL-170B-8 | |
Inverted microscope | olympus | CKX53 | |
Magzol reagent(Trizol reagent) | Magen | ||
micropipettor | Eppendorf | ||
Oil Red O | |||
Osteogenic differentiation medium | cyagen biosciences inc. | MUBMX-90021 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
Phosphate-buffered saline(1X) | Gibco | 20012027 | |
PrimeScript RT Master Kit | TakaRa Bio Inc | RR036A | |
Proteinase K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
QuickBlock Blocking Buffer | Beyotime Biotechnology | P0260 | |
scissor | |||
SYBR1 Premix | TakaRa Bio Inc | ||
Toluidine Blue | Beyotime Biotechnology | ||
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |