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Medicine

चूहों में मंडीबुलर बोन मैरो मेसेंचिमल स्टेम सेल की अलगाव और खेती

Published: August 25, 2020 doi: 10.3791/61532
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Science, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology, 2The 2nd Dental Center, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology
* These authors contributed equally

Summary

यह लेख एक विधि प्रस्तुत करता है जो चूहे के मंडलों से अस्थि मज्जा पालन और प्रवाह साइटोमेट्री छंटाई को अलग-थलग करने, खेती करने, छंटाई करने और बोन मैरो मेसेन्चिमल स्टेम कोशिकाओं की पहचान करने के लिए जोड़ती है।

Abstract

यहां हम प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के लिए कई उच्च गुणवत्ता वाली कोशिकाओं को तेजी से प्राप्त करने के लिए विट्रो में मंडीबुलर बोन मैरो मेसेंचिमल स्टेम सेल (एमबीएएमएससी) को अलग-थलग करने और बनाने के लिए एक कुशल विधि प्रस्तुत करते हैं। एमबीएमएससी का व्यापक रूप से उत्कृष्ट आत्म-नवीकरण क्षमता और बहु-वंश भेदभाव क्षमता के कारण भविष्य में क्रैनियोफेशियल रोगों और क्रैनियो-मैक्सिलोफेशियल पुनर्जनन के मामले में ऊतक इंजीनियरिंग कोशिकाओं के रूप में चिकित्सीय अनुप्रयोगों में उपयोग किया जा सकता है। इसलिए, बड़ी संख्या में एमबीएमएससी प्राप्त करना महत्वपूर्ण है।

इस अध्ययन में, अस्थि मज्जा को मंडीबल से निकाल दिया गया था और प्राथमिक एमबीएमएससी को पूरे अस्थि मज्जा अनुयायी खेती के माध्यम से अलग किया गया था। इसके अलावा, सीडी 29+सीडी90+सीडी 45− एमबीएमएससी फ्लोरोसेंट सेल छंटाई के माध्यम से शुद्ध किया गया। शुद्ध mBMSCs की दूसरी पीढ़ी का उपयोग आगे के अध्ययन के लिए किया गया था और ऑस्टियोब्लास्ट, एडिपोसाइट्स और कोंड्रोसाइट्स में अंतर करने में क्षमता प्रदर्शित की गई थी। इस इन विट्रो मॉडल का उपयोग करते हुए, कोई भी उच्च संख्या में प्रोलिफेरेटिव एमबीएमएससी प्राप्त कर सकता है, जो जैविक विशेषताओं के अध्ययन, माइक्रोएनवायरमेंट के बाद की प्रतिक्रिया और एमबीएमएससी के अन्य अनुप्रयोगों को सुविधाजनक बना सकता है।

Introduction

बोन मैरो मेसेन्चिमल स्टेम सेल (बीएमएससी) अस्थि मज्जा से प्राप्त गैर-हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल हैं जो मजबूत प्रसार क्षमता और बहु-वंश भेदभाव क्षमता1,2,3,4प्रकट करते हैं। दरअसल, BMSCs हड्डी ऊतक इंजीनियरिंग और उत्थान के लिए एक आदर्श उंमीदवार के रूप में माना गया है जब से वे की खोज की गई । वर्षों के लिए, इलियाक क्रेस्ट या लंबी हड्डियों जैसे टिबिया और फीमर क्रैनियोफेशियल पुनर्जनन के लिए बीएमएससी का सबसे आम स्रोत रहा है। हालांकि, ऑर्फियल बीएमएससी, जैसे मंडीबुलर बीएमएससी (एमबीएएमएससी), लंबी हड्डी बीएमएससी से कुछ अंतर प्रदर्शित करते हैं, जैसे कि विभिन्न भ्रूणीय मूल और विकास पैटर्न। मंडीबल्स न्यूरोेक्टोडर्म रोगाणु परत की तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं से उत्पन्न होते हैं और नसों में एंक्यूब्रैस ऑसिफिकेशन से गुजरते हैं, जबकि अक्षीय और परिशिष्ट कंकाल मेसोडर्म से होते हैं और एंडोकॉन्ड्रल ऑसिफिकेशन से गुजरते हैं। इसके अलावा , नैदानिक टिप्पणियों और प्रायोगिक पशु अध्ययनों ने लगातार संकेत दिया है कि ओरोफेशियल और इलियाक क्रेस्ट बीएमएससी 5 ,6,7,8के बीच कार्यात्मक अंतर हैं। रिपोर्टों से पता चला है कि बीएमएससी ने कपाल की हड्डी जैसे मंडीबल, मैक्सिलरी बोन और अल्वेलर बोन से प्राप्त एक्सियल और परिशिष्ट हड्डियों की तुलना में बेहतर प्रसार, जीवन काल और भेदभाव क्षमताकाप्रदर्शन किया । इसलिए, एमबीएमएससी को करूबिज्म, जबड़े के ट्यूमर, जबड़े की हड्डी के ऑस्टियोपोरोसिस और पीरियोडोन्टल ऊतक दोष10, 11, 12जैसे क्रैनियोफेशियल रोगों के भविष्य के चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए पसंदीदा संसाधन मानाजाताहै। पूर्व नैदानिक प्रयोगों में उपचार क्षमता को समझने के लिए, विट्रो में एमबीएमएससी को तेजी से अलग करने और बनाने के लिए एक विधि स्थापित करना आवश्यक है।

इस अध्ययन में, इसका उद्देश्य पूरे अस्थि मज्जा पालन और प्रवाह साइटोमेट्री छंटाई द्वारा शुद्ध एमबीएएमएससी प्राप्त करना था। चूहे के शारीरिक आकृति विज्ञान, स्पष्ट रूप से माइक्रो कंप्यूटेड टोमोग्राफी (माइक्रो सीटी) और हिस्टोलॉजिकल वर्गों के माध्यम से मनाया जाता है, से पता चला है कि मंडीबल की ट्राबेकुलर हड्डी तीक्ष्ण मेडुलरी अंतरिक्ष और अल्वेलर हड्डी के बीच थी। ट्राबेकुलर बोन से अस्थि मज्जा को मंडीबुलर मैरो कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए फ्लश किया गया था, लेकिन इस तरह से सुसंस्कृत कोशिकाएं शुद्ध एमबीएमएससी नहीं थीं और इसमें अनिश्चित पोटेंसी और विविध वंश जैसे हड्डी, वसा और एंडोथेलियल कोशिकाओं से कोशिकाओं के साथ कई प्रकार की कोशिकाएं शामिल होने की संभावना थी13,14। सेल शुद्धिकरण का अगला कदम विशेष रूप से महत्वपूर्ण था। सेल-सतह प्रोटीन के संयोजन को पहचानकर कोशिकाओं को प्रवाहित करें और मेसेंकिमल स्टेम कोशिकाओं के संवर्धन में व्यापक रूप से अपनाया गया है। सेल एकरूपता प्रवाह साइटोमेट्री का मुख्य लाभ है, लेकिन प्रक्रिया सेल व्यवहार्यता निर्धारित नहीं करती है और इसके परिणामस्वरूप सीमित सेल उपज हो सकती है। इस अध्ययन में, पूरे बोन मैरो पालन से प्राप्त पी0 एमबीएमएससी को उच्च शुद्धता और मजबूत प्रसार क्षमता के साथ एमबीएएमएससी प्राप्त करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा हल किया गया था।

यह अध्ययन पूरे बोन मैरो पालन और प्रवाह साइटोमेट्री छंटाई के संयोजन का उपयोग करके चूहे के मंडीबुलर बीएमएससी के अलगाव, संस्कृति और भेदभाव के लिए एक प्रजनन योग्य और विश्वसनीय प्रोटोकॉल का परिचय देता है। यह संबंधित क्षेत्रों में शोधकर्ताओं के लिए उपयोग करने के लिए एक विश्वसनीय और सुविधाजनक तरीका है।

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Protocol

इस पत्र में सभी पशु प्रायोगिक प्रक्रियाओं को शंघाई नौवें पीपुल्स अस्पताल, शंघाई जियाओ टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन की पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. तैयारी

  1. प्रयोग के लिए दो 5 सप्ताह पुराने पुरुष स्प्राग डावले चूहों का उपयोग करें।
  2. उच्च तापमान पर सुई धारकों, चिमटी और कैंची सहित सभी उपकरणों को स्टरलाइज करें या 10 मिनट के लिए 75% इथेनॉल में डूबे हुए।
    नोट: इथेनॉल विसर्जन सेल क्षति से बचने के लिए बहुत लंबा नहीं होना चाहिए।
  3. संस्कृति मीडिया को पहले से तैयार करें, जिसकी संरचना तालिका 1में प्रदान की जाती है। नीचे वर्णित प्रत्येक माध्यम को पूरक करें।
    1. α-एमईएम कल्चर मीडियम (10% एफबीएस के साथ): 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ न्यूनतम आवश्यक मध्यम अल्फा (α-एमईएम) का पूरक।
    2. ऑस्टियोजेनिक विभेदन माध्यम की तैयारी: 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% ग्लूटामीन, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 0.20% एस्कॉर्बिक एसिड, 1% β-ग्लीसेरोफोस्फेट और 0.01% डेक्सेमेटेस्टोन के साथ पूरक ऑस्टियोजेनिक विभेद बेसल माध्यम।
    3. ऑस्टियोजेनिक इंडक्शन मीडियम की तैयारी: मिक्स 70% α-एमईएम कल्चर मीडियम (10% एफबीएस के साथ) और 30% ऑस्टियोजेनिक विभेदन माध्यम।
    4. एडिपोजेनिक विभेदन माध्यम ए की तैयारी: पूरक एडिपोजेनिक विभेदन बेसल माध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% ग्लूटामीन, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 0.20% इंसुलिन, 0.10% आईबीएमएक्स, 0.10% रोसिग्लिटाज़ोन और 0.01% डेक्समेथाज़ोन के साथ।
    5. एडिपोजेनिक विभेदन माध्यम बी की तैयारी: 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% ग्लूटामीन, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन और 0.20% इंसुलिन के साथ एडिपोजेनिक विभेदन बेसल माध्यम का पूरक।
    6. कोंड्रोजेनिक विभेदन माध्यम की तैयारी: 0.01% डेक्सामेथासोन, 0.30% एस्कॉर्बिक एसिड, 1% आईटीएस, 0.10% सोडियम पाइरुवेट, 0.10% प्रोलाइन और 1% टीजीएफ-ए3 के साथ पूरक कोन्ड्रोजेनिक विभेदन बेसल माध्यम।
      नोट: ऑस्टियोजेनिक भेदभाव माध्यम विन्यास के बाद एक महीने के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए । कॉन्फ़िगर किए गए कॉन्ड्रोजेनिक विभेदन माध्यम की प्रभावी अवधि 12 घंटे है।

2. चूहे एमबीएएमएससी का अलगाव और खेती

नोट: सभी प्रयोगात्मक आपरेशनों के रूप में ज्यादा के रूप में सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए संभव के रूप में बर्फ पर किया जाना चाहिए ।

  1. चूहे की कटाई
    1. सीओ 2 asphyxiation द्वारा दो5 सप्ताह पुराने पुरुष Sprague Dawley चूहों इच्छामृत्यु । प्रयोग के साथ आगे बढ़ने से पहले जानवर की सांस लेना बंद कर दिया जाए।
    2. 3 मिनट के लिए 75% इथेनॉल युक्त बीकर में इन चूहों को कुल्ला करें।
    3. फसल मंडीबल्स के लिए चूहे को एक साफ धुएं के हुड के अंदर रखें।
      नोट: उपयोग से पहले 30 मिनट के लिए पराबैंगनी प्रकाश विकिरण द्वारा धुएं हुड को स्टरलाइज करें।
    4. चूहे को रीढ़ की स्थिति में रखें। द्विपक्षीय अंगुलुस ओरिस से चमड़ी और बुसिनेटर मांसपेशियों को मंडीबल के पीछे के क्षेत्र में झुकाएं, जो कम छेदक के साथ एकमात्र चल हड्डी है।
      नोट: स्पष्ट ऑपरेशन फ़ील्ड प्राप्त करने के लिए अंगुलुस ओरिस के प्रत्येक तरफ 2 सेमी चीरा लगाने की सिफारिश की जाती है।
    5. मंडीबुलर दांतों को बेनकाब करने के लिए दोनों अंगूठों के साथ विपरीत दिशा की ओर अधिकतम और मंडीबुलर छेदक को धक्का देकर चूहे का मुंह खोलें, जो मंडीबल से जुड़े होते हैं।
    6. बुर्कल मांसपेशियों और कॉर्राकोइड्स से जुड़े टेंडन और मंडीबल की अवर सीमा को पूरी तरह से काट दें।
      नोट: मांसपेशियों में तनाव की कमी के कारण इस कदम के दौरान मंडीबल की बढ़ी हुई गतिशीलता देखी जाती है।
    7. मंडीबुलर पीछे के दांतों को दबाएं और वापस और नीचे की ओर घुमाएं जब तक कि दोनों तरफ के कोंडल स्पष्ट रूप से उजागर न हो जाएं।
      नोट: यह कदम कृत्रिम रूप से चूहे के मुंह को अधिकतम सीमा तक खोलने के लिए किया जाता है ताकि कोंडील को विस्थापित किया जा सके। मंडीबल द्विपक्षीय condyles के माध्यम से खोपड़ी से जुड़ा हुआ है, इसलिए condyles के जोखिम खोपड़ी और मंडीबल के बीच वियोग की ओर जाता है।
    8. खोपड़ी से मंडीबल बॉडी को अलग करें।
    9. गीली धुंध का उपयोग करके हड्डी की सतह पर अनुयायी नरम ऊतक को साफ करें।
    10. व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए बर्फ पर प्रीकूल्ड न्यूनतम आवश्यक मध्यम α (α-एमईएम) या फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) से भरे 10 सेमी बाँझ ग्लास डिश में हड्डी रखें।
  2. एमबीएमएससी का अलगाव और खेती
    1. मंडीबुलर शरीर से पहले मोलर के मेसियल किनारे के साथ पूर्वकाल की हड्डी को काट लें। मज्जा गुहा का पर्दाफाश करने के लिए तीसरे मोलर के डिस्टल किनारे के साथ कोराकोइड और कोंडील सहित मंडीबुलर रैमस को हटा दें।
    2. α-एमईएम (10% एफबीएस के साथ) के 10 एमएल के साथ 10 सेमी बाँझ ग्लास डिश भरें।
    3. α-एमईएम कल्चर मीडियम को एस्पिरेट करने के लिए 1 एमएल सिरिंज का इस्तेमाल करें। सिरिंज सुई अस्थि मज्जा गुहा में डाला के साथ, बार-बार पकवान में अस्थि मज्जा फ्लश। हड्डी गुहा को क्रमशः हड्डी के दोनों मेसियल और डिस्टल दोनों पक्षों से कम से कम 3 बार फ्लश करें, जब तक कि हड्डी सफेद न हो जाए।
      नोट: यह सबसे महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि चूहे के मंडल की अस्थि मज्जा गुहा लंबी हड्डी में उतनी स्पष्ट नहीं है और सुई डालने के लिए उचित बिंदु अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता है। ऊपर दिए गए सभी प्रायोगिक नमूनों को कोशिका व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए बर्फ पर संग्रहीत किया जाना चाहिए और इसलिए ऑपरेशन का समय 2 घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए।
    4. फ्लश कोशिकाओं वाले मीडिया को 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में 800 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट को त्याग दें।
    5. α-एमईएम (10% एफबीएस के साथ) के 3 एमसीएल के साथ कोशिकाओं को फिर से रीसुस्ल करें। एक नए 10 सेमी कल्चर डिश में कोशिकाओं को प्लेट करें और 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    6. संस्कृति के तीसरे दिन इन कोशिकाओं के रूपात्मक परिवर्तन और विकास की जांच करें। गैर-अधिष्ठाता कोशिकाओं और ऊतकों के टुकड़ों के साथ संस्कृति माध्यम को हटा दें। धीरे-धीरे ताजा α-एमईएम (10% एफबीएस के साथ) के 10 एमएल जोड़ें।
    7. 7 दिनों की संस्कृति के बाद पी0 एमबीएमएससी 70% से 80% संगम तक पहुंच गया।
  3. फ्लो सेल छंटाई
    नोट: पी0 mBMSCs को फेनोथिक रूप से पहचाना गया था और मुख्य रूप से प्रवाह सेल छंटाई के माध्यम से शुद्ध किया गया था।
    1. एस्पिरेट और संस्कृति माध्यम त्यागें और फिर पीबीएस के साथ पकवान धोते हैं। पीबीएस को छोड़ दें।
    2. डिश में 0.02% ईडीटीए के साथ 0.25% ट्राइपसिन का 1 मिलियन जोड़ें। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को पचाएं, फिर प्रतिक्रिया को रोकने के लिए α-एमईएम (10% एफबीएस के साथ) का 2 मिलियन जोड़ें।
    3. कोशिकाओं के निलंबन को 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें।
    4. अपकेंद्रित्र के बाद पीबीएस (10% एफबीएस के साथ) के 120 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।
    5. CD16/CD32 के खिलाफ एंटीबॉडी के 1 μL के साथ इन सेल निलंबन को 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ब्लॉक करें।
    6. सेल निलंबन के 100 माइक्रोल को एक नए माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, फाइकोरीथ्रिन (पीई) के साथ कोशिकाओं को दाग दें- सीडी 45 के खिलाफ संयुग्मित एंटीबॉडी, फ्लोरोसेइन-आइसोथियोसाइनेट (फिटसी) - सीडी 90 और एलोफिसियानिन (एपीसी) के खिलाफ संयुग्मित एंटीबॉडी - सीडी 29 के खिलाफ एंटीबॉडी13, 15में 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। इस प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी की एकाग्रता तालिका 2में दिखाई गई है। असंता नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेल निलंबन के अन्य 20 μL का उपयोग करें।
    7. फिर 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें, निलंबन को त्यागें, और पीबीएस के 0.5 एमएल (10% एफबीएस के साथ) में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।
    8. विश्लेषण से पहले 10 मिनट के लिए 0.01 मिलीग्राम/एमएल DAPI के 10 माइक्रोल जोड़ें।
    9. कोशिकाओं को फ़िल्टर करने के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूबों पर रखे 40 एनएम फिल्टर का उपयोग करें।
    10. फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टर पर कोशिकाओं का विश्लेषण करें। पैनलों को इस प्रकार सेट करें। सबसे पहले, डीएपीआई - कोशिकाओं, तो गेट CD29+CD90+CD45- लक्षित mBMSCs के रूप में चयनित कोशिकाओं में गेट द्वारा कुल सेल गिनती से मृत कोशिकाओं को हटा दें।
    11. छंटाई CD29+CD90+CD45 - कोशिकाओं को α-एमईएम (10% एफबीएस के साथ) के 3 एमएल के साथ 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में पहले से तैयार करें।
    12. 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें। संग्रह बफर निकालें और कोशिकाओं को फिर से खर्च करने के लिए ताजा α-एमईएम (10% एफबीएस के साथ) के 1 एमएल जोड़ें। फिर उन्हें 6 सेमी कल्चर डिश में प्लेट करें।

3. कॉलोनी निर्माण क्षमता

नोट: यह कदम एमबीएमएससी की विभाजन क्षमता की जांच करने के लिए किया गया था। 15

  1. इस प्रयोग के लिए दूसरा मार्ग mBMSCs (P2) चुनें। जब सेल संगम 80% से 90% तक पहुंच गया, तो कोशिकाओं को 6 अच्छी तरह से प्लेट में एक धारावाहिक ढाल में उनके क्लोन प्रसार की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए फिर से सीज़न किया।
    नोट: यह 1 x 102 से 1 x 103 कोशिकाओं के लिए अच्छी तरह से ढाल सेट करने की सिफारिश की है, लेकिन मानव या पशु मूल के विभिन्न कोशिका लाइनों के अंतिम कमजोर पड़ने अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया गया ।
  2. संस्कृति α-एमईएम (10% एफबीएस के साथ) में कोशिकाओं को लगभग दो सप्ताह के लिए जब तक कॉलोनी बनाने इकाइयों की एक अच्छी संख्या प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत देखा जा सकता है । हर 3 दिन में कल्चर मीडियम को रिफ्रेश करें।
  3. संस्कृति माध्यम को एस्पिरेट और त्यागें, एक समय में 5 मिनट के लिए दो बार पीबीएस के साथ कुओं को धोएं। इसके बाद प्रत्येक कुएं में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान जोड़ें और कम से कम 10 मिनट के लिए ठीक करें।
  4. पैराफॉर्मलडिहाइड निकालें और पीबीएस के साथ दो बार कुओं को कुल्ला करें।
  5. क्रिस्टल वायलेट धुंधला समाधान के साथ कोशिकाओं को दाग और के बारे में 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस में उन्हें इनक्यूबेट।
    नोट: धुंधला समय उचित समायोजित जब तक वांछित छाया प्राप्त की है ।
  6. धुंधला समाधान निकालें और प्रतिक्रिया को रोकने के लिए आसुत पानी के साथ नमूनों को धोएं।
  7. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत छवि और बिखरे हुए सेल उपनिवेशों की गिनती करें जिसमें कम से कम 50 कोशिकाएं शामिल थीं।

4. एमबीएमएससी का मल्टीलाइनेज भेदभाव

नोट: P2 mBMSCs का उपयोग बाद के प्रयोगों के लिए किया गया था जब तक कि अन्यथा वर्णित न हो।

  1. एमबीएमएससी का ऑस्टियोजेनिक इंडक्शन
    1. ऊपर वर्णित एमबीएमएससी को पचाएं। 1 एमएल α-एमईएम (10% एफबीएस के साथ) के साथ पूरक 12 अच्छी प्लेट में 2.5 x 105/सेमी2 के घनत्व पर बीज कोशिकाएं।
    2. जब सेल संगम 60-70% तक पहुंच गया, तो माध्यम को 30% ऑस्टियोजेनिक इंडक्शन मीडिया में बदल दें। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में α-एमईएम (10% एफबीएस के साथ) वाली कोशिकाओं को संस्कृति दें और हर 2 दिनों में माध्यम को बदलें।
      नोट: ऑस्टियोजेनेसिस के दौरान कैल्शियम नोड्यूल की एक बड़ी अच्छी संख्या दिखाई देने के बाद, ऑस्टियोब्लास्ट को फ्लोटिंग से रोकने के लिए, हर 2 दिनों में मध्यम विनिमय पैटर्न को आधा मात्रा मध्यम विनिमय में बदलने की सिफारिश की जाती है।
    3. सात दिनों तक खेती करने के बाद,16, 17 क्षारीयफॉस्फेटस दाग द्वारा इन कोशिकाओं के कैल्किफिकेशन का आकलन करें।
    4. संस्कृति माध्यम को हटा दें और 10 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। 3 मिनट के लिए अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से 1 एमएल का उपयोग कर कोशिकाओं कुल्ला दो बार ।
    5. फिर क्षारीय फॉस्फेट धुंधला समाधान के साथ कोशिकाओं को दाग और 10-30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
      नोट: इनक्यूबेशन आवश्यक रंग प्राप्त करने के लिए कमरे के तापमान पर रात भर प्रदर्शन किया जा सकता है ।
    6. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए कुओं को आसुत पानी से धोएं। हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे तस्वीरें लें। लाल पिगमेंटेड कणिकाएं क्षारीय फॉस्फेट (एएलपी) गतिविधि का प्रतिनिधित्व करती हैं।
    7. एक और 7 दिनों के लिए शेष कोशिकाओं को तैयार करने के बाद, कोशिकाओं की खनिज क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए एलिजारिन लाल धुंधला प्रदर्शन करते हैं।
    8. 10 मिनट16,18के लिए सेल निर्धारण के बाद 0.5% एलिजारिन लाल धुंधला समाधान के साथ कोशिकाओं को दाग। 3-5 मिनट के बाद आसुत पानी के साथ क्रोमोजेनिक प्रतिक्रिया बंद करो।
      नोट: विकसित रंग के आधार पर प्रतिक्रिया समय बढ़ाया जा सकता है।
    9. अंत में, ऑस्टियोजेनिक धुंधला के प्रभाव का निरीक्षण करने के लिए संस्कृति प्लेट को हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे रखें; लाल पिंड इन कोशिकाओं के कैल्शियम जमा होने का संकेत देते हैं।
  2. एमबीएमएससी का एडिपोजेनिक इंडक्शन
    1. ऊपर वर्णित 12 अच्छी प्लेट में बीज पी 2 एमबीएमएससी।
    2. अच्छी तरह से 90% कॉन्फ्ल्यूंट बनने के बाद, आदिपोजेनिक विभेदन माध्यम के साथ कोशिकाओं को संस्कृति करें ए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में α-एमईएम संस्कृति माध्यम (10% एफबीएस के साथ) में सुसंस्कृत कोशिकाओं का उपयोग करें।
    3. 2 दिनों के प्रेरण के बाद, माध्यम ए को कुएं से हटा दें और प्रत्येक कुएं में एडिपोजेनिक विभेदन माध्यम बी का 1 एमएल जोड़ें।
    4. एक दिन के बाद, मध्यम बी को हटा दें और चक्र को फिर से मध्यम ए के साथ फिर से शुरू करें। संस्कृति कोशिकाओं बारी से मध्यम ए और बी का उपयोग कर ।
    5. तीन चक्रों के लिए बारी - बारी से विभेदन माध्यम ए और बी लागू करें और इन कोशिकाओं के आदिपोजेनेसिस का पता16,18कोतेल लाल ओ धुंधला करके करें .
      नोट: अतिरिक्त 2 से 3 दिनों के लिए भेदभाव माध्यम बी के साथ इन कोशिकाओं को तैयार करके बहुत सारे दौर और बड़े लिपिड बूंदों को देखा जा सकता है।
    6. माध्यम निकालें और 10 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    7. तेल लाल ओ धुंधला समाधान के साथ कोशिकाओं को दाग और लगभग 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    8. धुंधला समाधान निकालें और आसुत पानी के साथ कुओं को धो लें।
    9. प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत एडीपोजेनेसिस का निरीक्षण करें।
  3. एमबीएमएससी का छांड्रोजेनेसिस इंडक्शन
    1. 5 x 10 5 /सेमी2के घनत्व पर 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में बीज पी2एमबीएमएससी ।
    2. 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट को त्याग दें।
    3. कोशिकाओं को 0.5 एमएल के साथ कोन्ड्रोजेनिक विभेदन माध्यम से फिर से र्इंसाल करें। 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें।
    4. सेंट्रलाइज ट्यूब की कैप को ढीला करें और इसे 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। हर 2 दिन में मीडियम को रिन्यू करें।
      नोट: कोशिकाओं को 24 घंटे के बाद गोली लगने लगते हैं । यह 48 घंटे के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूब स्थानांतरित करने के लिए नहीं करने की सिफारिश की है। माध्यम बदलते समय सेल पेलेट को एस्पिरेट न करें, सावधान रहें।
    5. इंडक्शन के 21 दिनों के बाद, सेल छर्रों को 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड के साथ ठीक करें, इसके बाद निर्जलीकरण, पैराफिन एम्बेडिंग और सेक्शनिंग करें।
    6. डिपैराफिनाइजेशन और हाइड्रेशन के बाद, कम से कम 15 मिनट 18, 19,20,21के लिए एल्सियन ब्लू सॉल्यूशन में स्लाइड्स को दाग दें, फिर प्रतिक्रिया को रोकने के लिए आसुत पानी से धोएं। हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे तस्वीरों को कैप्चर करें।
    7. कोलेजन प्रकार II के इम्यूनोफ्लोरेटेंट धुंधला के लिए, नीचे दिए गए चरणों को करें।
      1. डिपैराफिनाइजेशन और हाइड्रेशन स्टेप के बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 5 माइक्रोग्राम/एमएल प्रोटीन के साथ स्लाइड्स को इनक्यूबेट करें ।
      2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए बफर अवरुद्ध में स्लाइड इनक्यूबेट।
      3. स्लाइड्स में बफर को ब्लॉक करने के 200 माइक्रोन में कोलेजन टाइप II एंटीबॉडी का 1 माइक्रोन लगाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
      4. अगले दिन, पीबीएस के साथ स्लाइड्स को दो बार धोएं और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेकेंडरी एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें।
      5. 10 मिनट के लिए 40,6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडोल (DAPI) के साथ स्लाइस को इनक्यूबेट करें।
    8. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के तहत प्रत्येक स्लाइड की तस्वीरें ले लो।

5. रियल टाइम पीसीआर

  1. एक ग्वानिडियम आइसोथियोसायनेट आधारित वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध अभिवाचित का उपयोग करके एमबीएएमएससी से कुल आरएनए निकालें।
  2. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके पूरक डीएनए में आरएनए के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन करें। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन की प्रतिक्रिया स्थितियां इस प्रकार थीं: 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 15 एस के लिए 85 डिग्री सेल्सियस।
  3. तालिका 3 में सूचीबद्ध प्राइमर का उपयोग करके ऑस्टियोजेनेसिस और एडिपोजेनेसिस विशिष्ट जीन का पता लगाने के लिए वास्तविक समय पीसीआर करें। पीसीआर प्रवर्धन प्रक्रिया इस प्रकार थी: 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस। 5 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 40 चक्रों के लिए 30 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, कोशिकाओं का एक बड़ा हिस्सा प्रारंभिक संस्कृति के बाद तीसरे दिन प्लेट का पालन करता है। आमतौर पर, संस्कृति के एक अतिरिक्त 3-4 दिनों के बाद, सेल संगम 70 से 80%(चित्रा 1B)तक पहुंच गया। फ्लोरोसेंट सेल छंटाई के साथ, DAPI-CD29+CD90+CD45− mBMSCs को शुद्ध किया गया18,22,जो पी0 कोशिकाओं(चित्रा 1C) में लगभग 81.1%था।

एक सप्ताह के लिए 6 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में 100 कोशिकाओं पर पी 2 एमबीएमएससी सीडिंग के बाद, कॉलोनी बनाने इकाइयों की एक महत्वपूर्ण राशि देखी गई, जिसने एमबीएमएससी(चित्र 1 डी)की महत्वपूर्ण कॉलोनी बनाने की क्षमता का सुझाव दिया।

बहु-वंश भेदभाव क्षमता का आकलन करने के लिए, एमबीएमएससी को क्रमशः 12 अच्छी प्लेटों में ऑस्टियो-, चेंड्रो और एडिपो-वंश में प्रेरित किया गया था। एमबीएमएससी ने मजबूत ऑस्टियोजेनिक भेदभाव क्षमता प्रदर्शित की। एएलपी की बढ़ी हुई गतिविधि, एलिजारिन रेड स्टेनिंग के तहत छिटपुट रूप से वितरित लाल कैल्सीफिक नोड्यूल, और ऑस्टियोजेनिक विशिष्ट जीन रनक्स2, एएलपी, बीएसपी और ओएन (चित्रा 2)की अभिव्यक्ति में वृद्धि ने ओस्टोजेनिक प्रेरण का संकेत दिया। तेल-लाल-ओ धुंधला द्वारा पहचाने गए एडिपोजेनेसिस के लिए, 9 दिनों के प्रेरण के बाद कई लिपिड-समृद्ध वैक्यूल्स स्पष्ट थे। इसी तरह, Pparγ1 और सीब्पा के आदिपोजेनिक विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण वृद्धि(चित्र 3)दिखाई दी। chondrogenic भेदभाव स्लाइड के सूक्ष्म अवलोकन के लिए, नमूनों Alcian नीले रंग के लिए सकारात्मक धुंधला दिखाया । इसके अलावा, एंटी-टाइप II कोलेजन एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेटिंग ने उपास्थि मैट्रिक्स(चित्र 4)का बढ़ाया संचय दिखाया।

संस्कृति माध्यम घटक अंतिम एकाग्रता
1.α-एमईएम संस्कृति माध्यम (10% एफबीएस के साथ) α न्यूनतम आवश्यक माध्यम
भ्रूण गोजातीय सीरम 10%
पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन 1%
2. ऑस्टियोजेनिक इंडक्शन माध्यम α-एमईएम संस्कृति माध्यम (10% एफबीएस के साथ) 70%
ऑस्टियोजेनिक भेदभाव भेदभाव माध्यम 30%
3. ऑस्टियोजेनिक विभेदन माध्यम ऑस्टियोजेनिक विभेदन बेसल माध्यम
भ्रूण गोजातीय सीरम 10%
ग्लूटामाइन 1%
पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन 1%
एस्कॉर्बिक एसिड 0.20%
β-ग्लिसेरोफॉस्फेट 1%
डेक्सामेथासोन 0.01%
4. एडिपोजेनिक विभेदन माध्यम एक एडिपोजेनिक विभेदन बेसल माध्यम
भ्रूण गोजातीय सीरम 10%
ग्लूटामाइन 1%
पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन 1%
इनसुलिन 0.20%
आईबीएमएक्स 0.10%
रोसिग्लिटाजोन 0.10%
डेक्सामेथासोन 0.01%
5. एडिपोजेनिक विभेदन माध्यम बी: एडिपोजेनिक विभेदन बेसल माध्यम
भ्रूण गोजातीय सीरम 10%
ग्लूटामाइन 1%
पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन 1%
इनसुलिन 0.20%
6. चोन्ड्रोजेनिक विभेदन माध्यम: Chondrogenesis भेदभाव बेसियल माध्यम
डेक्सामेथासोन 0.01%
एस्कॉर्बिक एसिड 0.30%
यह है 1%
सोडियम पायरुवेट 0.10%
प्रोलाइन 0.10%
टीजीएफ-13 1%

तालिका 1: संस्कृति माध्यम और भेदभाव माध्यम के घटक।

प्रतिपिंड एकाग्रता
CD90.1 (तेरा-1.1) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 0.5 मिलीग्राम/एमएल
सीडी 45 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 0.2 मिलीग्राम/एमएल
CD29 एंटीबॉडी 0.2 मिलीग्राम/एमएल
कोलेजनआईआई खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी 5मिलीग्राम/एमएल
बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी एचएंडएल (एलेक्सा फ्लोर® 488) 1mg/mL

तालिका 2: इस अध्ययन में एंटीबॉडी एकाग्रता का उपयोग किया जाता है।

प्राइमर अनुक्रम (5'से 3')
गप्पे फोवर्ड: CGGCAAGCAACCAGCAGTCAAGG
रिवर्स: ACGACATACTCAGACCAGCATCACC
रनक्स2 फोवर्ड: GCCTTCAAGGTTTAGCCCCCT
रिवर्स: TGAACCTGGCCACTTGGTTT
एएलपी फोवर्ड: AAACTCGCTTATGGCCCCCCG
रिवर्स: TGGGTTTGAATTCCTGCGGT
बीपीएस फोवर्ड: GCACGGTTGAGTATGGGGAA
रिवर्स: ATCCTGACCCTCTAGCCTT
ओसीएन फॉरवर्ड: CAACCCCAATTGTGACGAGC
रिवर्स: GGCACACACACCCCCCAAACG
सेबपा फोवर्ड: AGTCGGTGGATAAGAAGAACACACG
रिवर्स: CGGTCATTGTCACTGGCAACTCC
Pparγ1 फोवर्ड: CCATCGAGAACATCAAGAACC
रिवर्स: GTGCTCTGTGAATCTGCCTGAG

तालिका 3: रियल-टाइम पीसीआर में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर।

Figure 1
चित्रा 1: एमबीएमएससी का अलगाव और संस्कृति। (A)प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध आरेख। mBMSCs अलग और 0 दिन पर चढ़ाया गया और α-MEM संस्कृति माध्यम के साथ इनक्यूबेटेड । 7 दिन, पी0 mBMSCs प्रवाह साइटोमेट्री छंटाई के माध्यम से शुद्ध किया गया और हल कोशिकाओं को एक नई संस्कृति पकवान पर चढ़ाया गया । 14 दिन, पी 1 एमबीएमएससी एकत्र किए गए और 12-वेल प्लेट पर चढ़ाना। 15 दिन, पी 2 एमबीएमएससी को इसी प्रेरण माध्यम के तहत ऑस्टियोब्लास्ट, एडिपोजेनिक कोशिकाओं और chondroblasts में प्रेरित किया गया था। (ख)चूहे मंडीबुलर बोन मैरो का योजनाबद्ध मॉडल और पी0 एमबीएमएससी का सूक्ष्म अवलोकन। (ग)चूहा mBMSCs के प्रवाह साइटोमेट्री छंटाई । प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण से पता चलता है कि ये कोशिकाएं CD29 और CD90 के लिए सकारात्मक थीं, लेकिन सीडी 45 के लिए नकारात्मक थीं, जो बीएमएससी विशेषताओं के अनुकूल है। इनमें से, 1.4 x 106 कोशिकाओं को हल किया गया था, जो कुल कोशिकाओं का उचित 80% था। (घ)क्रिस्टल वायलेट दाग P2 mBMSC क्लोन के प्रतिनिधि छवि । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एमबीएमएससी की ऑस्टियोजेनिक विभेदन क्षमता। (क)ऑस्टियोजेनिक इंडक्शन के 7 दिनों के बाद एएलपी एक्टिविटी में बदलाव की कल्पना की गई । ऑस्टियोजेनिक विभेदन को शामिल करने के 14 दिनों में एलिजारिन लाल धुंधला के तहत बड़ी संख्या में खनिज नोड्यूल दाग दिए गए थे। (B,C) एएलपी और एलिजारिन रेड स्टेनिंग के सकारात्मक क्षेत्र का मूल्यांकन इमेज जे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था। (सी-जी) ऑस्टियोजेनेसिस के 7 दिनों के बाद ऑस्टियोब्लास्ट-विशिष्ट मार्कर रनक्स2, एएलपी, बीएसपी और ओसीएन की एमआरएनए अभिव्यक्ति में काफी वृद्धि हुई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: नौ दिनों के बाद एमबीएमएससी की आदिपोजेनिक विभेदन क्षमता। (ए)तेल-लाल-ओ से बड़ी मात्रा में लिपिड बूंदें और एडिपोसाइट्स दाग रहे थे । (B,C) आदिपोजेनिक मार्कर सेपा और Pparγ1 की एमआरएनए अभिव्यक्ति 9 दिनों के बाद एडीपोजेनेसिस में उल्लेखनीय रूप से वृद्धि हुई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: कोंड्रोजेनिक विभेदन प्रभाव का स्टीरियोस्कोप दृश्य। (A)एमबीएमएससी 21 दिनों के बाद कोंड्रोजेनिक इंडक्शन ने एल्सियन ब्लू स्टेनिंग के लिए पॉजिटिव दिखाया । (ख)इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेज ऑफ कॉन्ड्रोजेनिक एग्रीगेट एंटी-टाइप II कोलेजन के साथ दाग । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल पूरे बोन मैरो पालन और फ्लोरोसेंट सेल छंटाई के संयोजन से विट्रो में चूहे के मंडलियों से बीएमएससी को अलग करने की एक विधि का वर्णन करता है, जो मजबूत भेदभाव क्षमता के साथ प्रोलिफेरेटिव एमबीएमएससी प्राप्त करने का एक सरल और विश्वसनीय तरीका है। यह विधि प्रारंभिक रूप से प्रवाह सेल छंटाई द्वारा एमबीएमएससी को शुद्ध कर सकती है, लेकिन यदि सेल एकरूपता के लिए उच्च आवश्यकताएं हैं, तो अधिक सटीक शुद्धिकरण विधियों की आवश्यकता हो सकती है।

वर्तमान में, एमबीएमएससी को अलग-थलग करने के लिए चार मुख्य तकनीकों का उपयोग किया जाता है, जिसमें पूरे बोन मैरो पालन, घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र, फ्लोरोसेंट सेल छंटाई और चुंबकीय सक्रिय सेल छंटाई22शामिल हैं। पूरे बोन मैरो पालन और घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र सबसे आम और आसान तरीके हैं जिनका उपयोग कम समय में एमबीएएमएससी प्राप्त करने के लिए किया जाता है, हालांकि, काटा गए एमबीएमएससी की कम शुद्धता उनका मुख्य नुकसान है। पिछले दो तरीकों इम्यूनोलॉजिकल तकनीकों के माध्यम से अत्यधिक शुद्ध mBMSCs अलग कर सकते हैं, लेकिन महंगा होने की कमियों है, लंबे समय और बिगड़ा सेल व्यवहार्यता ले रही है । इस अध्ययन में पूरे बोन मैरो पालन के फायदे और फ्लोरोसेंट सेल छंटाई विधि को कम समय में पर्याप्त संख्या में प्रोलिफेरेटिव एमबीएमएससी प्राप्त करने के लिए संयुक्त किया गया था।

निस्संदेह, इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक चूहे के विच्छेदन है, जो अक्षीय और परिशिष्ट हड्डियों से काफी अलग है। एक अक्षुण्ण नमूना प्राप्त करने के लिए चूहे के शरीर रचना को समझना आवश्यक है। मानव के समान, चूहा मंडीबल मैक्सिला के नीचे बैठता है, निचले दांतों को जगह में रखता है और द्विपक्षीय condyles द्वारा खोपड़ी से जुड़ा हुआ है। चूंकि मंडीबल एकमात्र हड्डी है जो खोपड़ी में स्थानांतरित हो सकती है, इसलिए मंडीबल से जुड़ी कई मांसपेशियां हैं, जो इसके आंदोलन को नियंत्रित करती हैं। केवल इन नरम ऊतकों को पूरी तरह से हटाकर और मुंह को अधिकतम रूप से खोलकर खोपड़ी से जोड़ने वाले कॉन्डील्स को उजागर किया जा सकता है। यह भी उल्लेखनीय है कि कोंडिलर गर्दन मंडीबल में एक शारीरिक कमजोरी है और फ्रैक्चर करने के लिए आसान है लायक है। यदि मंडीबल को नीचे की ओर घुमाते समय अत्यधिक प्रतिरोध पाया जाता है, तो इसका मतलब है कि मास्टिकरी मांसपेशियों को पूरी तरह से हटाया नहीं जा सकता है। जब यह मनाया जाता है, तो इसे विवश रूप से न घुमाएं, अन्यथा कॉन्डायलर गर्दन को तोड़ना आसान होता है जिससे कोशिका संदूषण होता है। एमबीएमएससी के पृथक्करण और संस्कृति में अन्य कठिनाइयों में बोन मैरो, नाजुक कोशिका गतिविधि, कम शुद्धता, कम कोशिका आवृत्ति और हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं के संदूषण में कम सामग्री शामिल है18,23। अच्छी वृद्धि और अपेक्षाकृत उच्च भेदभाव क्षमता के साथ एमबीएमएससी प्राप्त करने के लिए, एमबीएमएससी की गतिविधि सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण महत्व का है। इसके और बाद के प्रयोगों के लिए चार सप्ताह पुराने चूहों के उपयोग सहित कई महत्वपूर्ण कदम हैं, क्योंकि युवा चूहों को अच्छी व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए पसंद किया जाता है। कई अध्ययनों ने पुष्टि की है कि एमबीएएमएससी की गतिविधि प्रायोगिक जानवरों की उम्र से संबंधित है। पुराने दानदाताओं से उन mBMSCs कम प्रसार गतिविधि, भेदभाव क्षमता और जीवन अवधि2में परिणाम हो सकता है । सेल हार्वेस्ट के दौरान सभी ऑपरेशन बर्फ पर पूरा करने की जरूरत है और ऑपरेशन का समय यथासंभव कम होना चाहिए, अधिमानतः 2 घंटे के भीतर। इसके अलावा, ट्राइप्सिन पाचन समय 3 मिनट से अधिक समय नहीं रखें। अंत में, अभी भी इस प्रोटोकॉल में एक और चुनौती एमबीएमएससी की कटाई की प्रक्रिया है। एमबीएमएससी को हड्डी के गुहा से फ्लश करना परेशानी हो सकती है क्योंकि चूहे की कैविटी बहुत छोटी होती है, इसलिए शारीरिक संरचना से परिचित होना बहुत जरूरी है। माइक्रो सीटी इमेज इस संबंध में काफी मददगार साबित हो सकती है। इसके अलावा, यह देखने लायक है कि किशोर हड्डियों के रूप में पतला और भंगुर हैं, टूटना संदूषण में परिणाम कर सकते हैं ।

इम्यूनोफेनोटिक लक्षण वर्णन का जिक्र करते हुए, बीएमएससी कई फेनोटाइप व्यक्त करते हैं, लेकिन जिनमें से कोई भी उनके लिए विशिष्ट नहीं है24। यह आम तौर पर स्वीकार किया जाता है कि BMSCs CD11b, CD14, CD34, या CD45 व्यक्त नहीं करते हैं, लेकिन उनके पास एससीए-1, सीडी 29, सीडी 90 और सीडी 105 की उच्च अभिव्यक्ति है। इस अध्ययन ने फ्लोरोसेंट सेल छंटाई13, 14, 25के लिए सीडी29, सीडी 90 और सीडी45के व्यापक रूप से स्वीकृत मार्कर को चुना। इसमें पाया गया कि CD29+CD90+CD45− सेल कुल कोशिकाओं का उचित 80% है, जो बाद में सेल संस्कृति और अनुसंधान के लिए पर्याप्त था।

दशकों से, स्टेम सेल थेरेपी का व्यापक रूप से विभिन्न रोगों, जैसे प्रतिरक्षा प्रणाली रोगों, हीमेटोलॉजिकल प्रणालीगत रोगों, कैंसर या आघात के उपचार में उपयोग किया जाता है। निस्संदेह, बीएमएससी के विकल्प के रूप में एमबीएमएससी को उनकी बेहतर विशेषताओं के कारण स्टेम सेल थेरेपी में एक सुरक्षित और अधिक शक्तिशाली उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसलिए, बीएमएमसी की कोशिका संस्कृति और विस्तार, उपचार के लिए पर्याप्त संख्या में कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो जाते हैं।

संक्षेप में, इस अध्ययन ने कम समय में उच्च एकरूपता और बहु-भेदभाव क्षमता के साथ प्रचुर मात्रा में एमबीएएमएससी फसल के लिए एक आशाजनक और विश्वसनीय प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया।

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Disclosures

सभी लेखकों का कहना है कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

हम शंघाई नौवें पीपुल्स अस्पताल के Craniofacial विसंगतियों के लिए डिजिटाइज्ड Stomatology और अनुसंधान केंद्र के लिए प्रयोगशाला की सहायता के लिए धंयवाद । इस पांडुलिपि का काम नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (एनएसएफसी) [81570950,81870740,81800949] से अनुदान द्वारा समर्थित है, शंघाई शिखर सम्मेलन और पठार विषयों, शंघाई इंस्टीट्यूट ऑफ प्रिसिजन मेडिसिन, शंघाई नौवें पीपुल्स हॉस्पिटल, शंघाई जियाओ टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन [JC201809], शंघाई जियाओ टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन के लिए उच्च स्तरीय नवाचार टीम की प्रोत्साहन परियोजना से शिपएम-एमयू फंड । और एलजे उत्कृष्ट युवा चिकित्सा प्रतिभाओं के एक विद्वान है, शंघाई "चिकित्सा प्रतिभा के उभरते सितारे" युवा विकास कार्यक्रम और शंघाई Jiaotong विश्वविद्यालय से "चेन Xing" परियोजना ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA(1X) Gibco 25200072
10cm culture dish Corning
acutenaculum
Adipogenic differentiation medium Cyagen biosciences inc. MUBMX-90031
Alcian Blue Beyotime Biotechnology
Alizarin red Sigma-Aldrich A5533
Alkaline Phosphatase Color Development Kit Beyotime Biotechnology C3206
alpha-Minimum essential medium GE Healthcare HyClone Cell Culture SH30265.01B
Anti -CollagenII Rabbit pAb Abcam ab34712
Antibodies against CD16/CD32
Antifade Mounting Medium with DAPI Beyotime Biotechnology P0131
APC anti-mouse/rat CD29 Antibody biolegend inc 102215
Biosafety cabinet Esco AC2-4S8-CN
CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience Invitrogen 12-0461-82
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience Invitrogen 11-0900-85
Centrifuge cence L500
Chondrogenesis differentiation medium cyagen biosciences inc.
Confocal laser scanning microscope Zeiss LSM880
Countess II FL Automated Cell Counter Invitrogen AMQAF1000
Crystal Violet Staining Solution Beyotime Biotechnology C0121
Fetal Bovine Serum GE Healthcare HyClone Cell Culture SH30084.03
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) abcam ab150077
Incubator Esco CCL-170B-8
Inverted microscope olympus CKX53
Magzol reagent(Trizol reagent) Magen
micropipettor Eppendorf
Oil Red O
Osteogenic differentiation medium cyagen biosciences inc. MUBMX-90021
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070063
Phosphate-buffered saline(1X) Gibco 20012027
PrimeScript RT Master Kit TakaRa Bio Inc RR036A
Proteinase K Sigma-Aldrich P6556
QuickBlock Blocking Buffer Beyotime Biotechnology P0260
scissor
SYBR1 Premix TakaRa Bio Inc
Toluidine Blue Beyotime Biotechnology
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jin, C., et al. Stem cell education for medical students at Tongji University: Primary cell culture and directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (2), 151-154 (2018).
  2. Chu, D. T., et al. An Update on the Progress of Isolation, Culture, Storage, and Clinical Application of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem/Stromal Cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 708 (2020).
  3. Jin, Z., Chen, J., Shu, B., Xiao, Y., Tang, D. Bone mesenchymal stem cell therapy for ovariectomized osteoporotic rats: a systematic review and meta-analysis. BMC Musculoskeleton Disorder. 20 (1), 556 (2019).
  4. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
  5. Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Belyavskii, A. V., Sukhikh, G. T. Differentiation potential of mesenchymal stem cells of different origin. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 141 (1), 147-151 (2006).
  6. Lloyd, B., et al. Similarities and differences between porcine mandibular and limb bone marrow mesenchymal stem cells. Archives in Oral Biology. 77, 1-11 (2017).
  7. Zhang, W., et al. Comparison of the use of adipose tissue-derived and bone marrow-derived stem cells for rapid bone regeneration. Journal of Dental Research. 92 (12), 1136-1141 (2013).
  8. Stefanik, D., et al. Disparate osteogenic response of mandible and iliac crest bone marrow stromal cells to pamidronate. Oral Disorders. 14 (5), 465-471 (2008).
  9. Aghaloo, T. L., et al. Osteogenic potential of mandibular vs. long-bone marrow stromal cells. Journal of Dental Research. 89 (11), 1293-1298 (2010).
  10. Kaigler, D., et al. Stem cell therapy for craniofacial bone regeneration: a randomized, controlled feasibility trial. Cell Transplantation. 22 (5), 767-777 (2013).
  11. Li, C., Wang, F., Zhang, R., Qiao, P., Liu, H. Comparison of proliferation and osteogenic differentiation potential of rat mandibular and femoral bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Stem Cells Development. 2020, 1941629 (2020).
  12. Matsubara, T., et al. Alveolar bone marrow as a cell source for regenerative medicine: differences between alveolar and iliac bone marrow stromal cells. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (3), 399-409 (2005).
  13. Chan, C. K. F., et al. Identification of the Human Skeletal Stem Cell. Cell. 175 (1), 43-56 (2018).
  14. Bianco, P., Riminucci, M., Gronthos, S., Robey, P. G. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications. Stem Cells. 19 (3), 180-192 (2001).
  15. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocol. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  16. Xu, H., et al. Icariin prevents oestrogen deficiency-induced alveolar bone loss through promoting osteogenesis via STAT3. Cell Proliferation. 53 (2), 12743 (2020).
  17. Zhang, P., Wu, Y., Jiang, Z., Jiang, L., Fang, B. Osteogenic response of mesenchymal stem cells to continuous mechanical strain is dependent on ERK1/2-Runx2 signaling. Internation Journal of Molecular Medicine. 29 (6), 1083-1089 (2012).
  18. Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nature Protocol. 5 (3), 550-560 (2010).
  19. Lach, M. S., et al. Chondrogenic Differentiation of Pluripotent Stem Cells under Controllable Serum-Free Conditions. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2711 (2019).
  20. Huang, X., Zhong, L., Hendriks, J., Post, J. N., Karperien, M. The Effects of the WNT-Signaling Modulators BIO and PKF118-310 on the Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 561 (2018).
  21. Gale, A. L., Linardi, R. L., McClung, G., Mammone, R. M., Ortved, K. F. Comparison of the Chondrogenic Differentiation Potential of Equine Synovial Membrane-Derived and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Veterinary Sciences. 6, 178 (2019).
  22. Li, X., Zhang, Y., Qi, G. Evaluation of isolation methods and culture conditions for rat bone marrow mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 65 (3), 323-334 (2013).
  23. Kagami, H., Agata, H., Tojo, A. Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: basic science to clinical translation. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 43 (3), 286-289 (2011).
  24. Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
  25. Abdallah, B. M., Alzahrani, A. M., Abdel-Moneim, A. M., Ditzel, N., Kassem, M. A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal(mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture. Biology Proceedings Online. 21, 3 (2019).

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चिकित्सा अंक 162 मंडीबुलर बोन मैरो मेसेन्चिमल स्टेम सेल एमबीएमएससी ऑस्टियोजेनेसिस कोंड्रोजेनेसिस एडिपोजेनेसिस सेल की खेती फ्लोरोसेंट सेल छंटाई
चूहों में मंडीबुलर बोन मैरो मेसेंचिमल स्टेम सेल की अलगाव और खेती
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Hong, Y., Xu, H., Yang, Y., Zhou,… More

Hong, Y., Xu, H., Yang, Y., Zhou, S., Jin, A., Huang, X., Dai, Q., Jiang, L. Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats. J. Vis. Exp. (162), e61532, doi:10.3791/61532 (2020).

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