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Cancer Research

Avaliação funcional das variantes BRCA1 usando editores de base mediados pelo CRISPR

Published: February 28, 2021 doi: 10.3791/61557
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Biomedical Sciences, Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, 2Stem Cell Immunomodulation Research Center, University of Ulsan College of Medicine

Summary

Pessoas com mutações BRCA1 têm maior risco de desenvolver câncer, o que garante uma avaliação precisa da função das variantes BRCA1. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliação funcional das variantes BRCA1 usando editores de base de citosina mediados pelo CRISPR que permitem a conversão de C:G para T:A direcionada em células vivas.

Abstract

Estudos recentes têm investigado os riscos associados às mutações genéticas BRCA1 usando vários métodos de avaliação funcional, como ensaios de repórteres fluorescentes, ensaios de viabilidade de células-tronco embrionárias e ensaios de sensibilidade à base de drogas terapêuticas. Embora tenham esclarecido muitas variantes brca1, estes ensaios envolvendo o uso de variantes BRCA1 exogenously expressas estão associados a questões de superexpressão e não podem ser aplicados à regulação pós-transcrição. Para resolver essas limitações, relatamos anteriormente um método de análise funcional das variantes BRCA1 através do editor de base de citosina mediada pelo CRISPR que induz a substituição de nucleotídeos direcionados em células vivas. Usando este método, identificamos variantes cujas funções permanecem ambíguas, incluindo c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T e c.4986+5G>A, e confirmaram que os editores de base mediados pelo CRISPR são ferramentas úteis para reclassificar as variantes de significado incerto no BRCA1. Aqui, descrevemos um protocolo para análise funcional das variantes BRCA1 usando o editor base de citosina baseado em CRISPR. Este protocolo fornece diretrizes para a seleção de locais-alvo, análise funcional e avaliação das variantes BRCA1.

Introduction

O gene de suscetibilidade do câncer de mama tipo 1 (BRCA1) é um gene supressor de tumor amplamente conhecido. Como o gene BRCA1 está relacionado à reparação de danos no DNA, mutações nesse gene levariam a um maior risco de desenvolvimento de câncer em um indivíduo1. Câncer de mama, ovário, próstata e pâncreas estão ligados a mutações herdadas de perda de função (LOF) do gene BRCA1 2. A avaliação funcional e identificação das variantes BRCA1 podem ajudar na prevenção e diagnóstico das diversas doenças. Para abordar a função das variantes BRCA1, vários métodos foram desenvolvidos e amplamente utilizados para investigar a patogenicidade das variantes BRCA1, como ensaios de viabilidade de células-tronco embrionárias, ensaios de repórteres fluorescentes e ensaios de sensibilidade à base de drogas terapêuticas3,4,5,6. Embora esses métodos tenham avaliado a função de muitas variantes BRCA1, os métodos que envolvem variantes BRCA1 exogenousamente expressas apresentam limitações em termos de superexpressão que podem afetar a regulação a jusante, a dosagem genética e a dobra deproteínas 7. Além disso, esses ensaios não podem ser aproveitados para a regulamentação pós-transcrição, como emenda mRNA, estabilidade da transcrição e efeito da região não traduzida8,9.

O sistema CRISPR-Cas9 permite a edição de genomas direcionados em células vivas e organismos10. Através de um RNA de guia único, o Cas9 pode induzir quebras de dois fios (DSBs) no DNA cromossômico em loci genômicos específicos, a fim de ativar duas vias de reparaçãode DNA: caminho de junção final nonhomologous propensa a erros (NHEJ) e caminho de reparo direcionado por eliseução não-11 (HDR) sem erros . HDR é um mecanismo de reparo preciso; no entanto, os DSBs induzidos por nuclease Cas9 para HDR muitas vezes resulta em inserção indesejada e supressão (indel) mutação. Além disso, precisa de modelos de DNA de doadores homólogos para reparar danos de DNA e tem relativamente baixa eficiência. Recentemente, cas9 nickase (nCas9) foram fundidos com domínios de deaminase cytidina para direcionar substituições C:G a T:A, sem a necessidade de modelos de DNA homólogos e quebras de cadeia dupla de DNA12,13,14,15. Utilizando o editor base de citosina, desenvolvemos um novo método de análise funcional das variantes BRCA116.

Neste estudo, utilizou-se o editor de base de citosina mediada pelo CRISPR, BE314, que induz mutações eficientes de C:G a T:A point, para a implementação da avaliação funcional das variantes BRCA1 e identificou com sucesso as funções de várias variantes BRCA1 (Figura 1).

Figure 1
Figura 1: Uma visão geral do fluxo de trabalho para avaliação funcional. (A) Esquema mostrando a avaliação funcional do BRCA1. Como o LOF do BRCA1 afeta a viabilidade celular, quando a mutação BRCA1 é patogênica, as células morrem à medida que o número de passagem aumenta. (B) Etapas da avaliação funcional do BRCA1. A caixa pontilhada é opcional. Pode ser substituído por co-transfecção de gRNA expressando e BE3 expressando DNA de plasmídeos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocol

NOTA: O método 1 (geração de linhas celulares HAP1-BE3) é opcional. Em vez de construir uma linha celular que expresse BE3, o DNA plasmídeo codificador BE3 pode ser co-transfectado com DNA plasmídeo codificador de gRNA. Outras variantes de editores base de citosina, como o BE4max, também podem ser usadas para edição de base altamente eficiente.

1. Geração de linhas celulares HAP1-BE3

  1. Construção de DNA plasmídeo
    1. Para construir o DNA plasmídeo lentiBE3-blast para a produção de lentivírus, amplie as sequências de codificação BE3 em pCMV-BE3 (Tabela de Materiais) por PCR usando polimerase de alta fidelidade. Projete o primer PCR para conter sequências sobrepostas do vetor digerido (a partir da etapa 1.1.2) para montagem isotérmica da seguinteforma: 17:
      primer-F:5'-TTTGCCGCCAGAACACAGGACCGGTTCTAGA GCCGCCACCATGAGCTCAGAG-3',
      primer-R:5'-CAGAGAGAAGTTTGTTGCGCCGGATCC GACTTTCCTTCTTCTTCTTCTTGGG-3'
      NOTA: Os nucleotídeos mostrados em sublinhados são sobrepostos com o vetor digerido e essas sequências serão específicas para o vetor de destino escolhido pelo usuário.
    2. Digeste lentiCas9-blast(Tabela de Materiais) DNA plasmídeo com as enzimas de restrição, XbaI e BamHI (1 unidade por 1 μg) por 1 h a 37 °C. Execute o produto digerido em um gel de 0,8% de agarose e purifique as bandas de tamanho apropriado (8,6 kb) utilizando um kit de extração de gel comercial(Tabela de Materiais).
    3. Clone o produto BE3 PCR amplificado e o vetor lentiCas9-Blast digerido usando o kit de montagem isotemal(Tabela de Materiais). Use um total de 0,02-0,5 pmol de fragmentos de DNA e uma razão de 1:3 de vetor:insert. Transforme o produto de montagem em células alfa-competentes DH518. Adicione os transformadores em uma placa de ágar contendo ampicillina (100 μg/mL) e incubar a placa durante a noite a 37 °C.
    4. Escolha várias colônias e inocula-as em 4 mL de LB (caldo de litogenia) médio contendo ampicilina (100 μg/mL) e cresça a cultura em uma incubadora de agitação a 180 rpm.
    5. Purificar o DNA plasmídeo usando um kit comercial de purificação de DNA plasmídeo(Tabela de Materiais) de acordo com os protocolos do fabricante.
    6. Para confirmar o sucesso da clonagem de DNA, analise as sequências BE3 de cada DNA plasmídeo purificado (a partir da etapa 1.1.5) pelo sequenciamento Sanger usando primers padrão e específico BE3(Tabela Suplementar 1) e selecione a construção de lentiBE3-blast clonada exata.
      NOTA: Para analisar os resultados do sequenciamento Sanger, recomendamos várias ferramentas como BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) e CLUSTALW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw).
  2. Cultura celular e geração de linhas celulares HAP1-BE3
    1. Manter as células em uma condição saudável e em um estado ativamente divisória. Cultura Células HAP1 no meio modificado de Dulbecco(Tabela de Materiais)modificado de Iscove contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina. Cultura HEK293T/17 células no meio modificado da Águia de Dulbecco (Tabela de Materiais) contendo 10% de FBS e 1% penicilina/estreptomicina.
      NOTA: A célula HAP1 é útil para pesquisas genéticas por causa de suas células quase haploides. No entanto, as células podem retornar espontaneamente a um estado diploide na cultura celular. Enriquecimento Hoechst 34580 manchado 1n-população usando flucittometria será útil para a manutenção de haploidy de células HAP119.
    2. Sementes 5 x 106 células HEK293T/17 em um prato de 100 nm 1 dia antes da transfecção. No dia da transfecção, transfete o DNA plasmídeo (15 μg de lentiBE3-blast, 9 μg de psPAX2 para embalagem viral, e 6 μg de pMD2.G para envelope de frasco de2ª geração do sistema de embalagem lentiviral) utilizando reagentes de transfecção comercial de acordo com os protocolos do fabricante(Tabela de Materiais)20. Altere o meio em 6h após a transfecção e colher o meio contendo vírus em 48 h ou 72 h após a transfecção. Filtre o supernatante usando um filtro de 0,45 μm.
    3. Transduque as partículas lentivirais de BE3 em células HAP1 em um MOI (multiplicidade de infecção) de 0,1. Para ajustar para um MOI apropriado, use concentrações diluídas em série de vírus. Remova o meio e substitua-o por meio de cultura viral ajustada e fresca.
    4. Um dia após a transdução, altere o médio para 10 μg/mL de blasticidina(Tabela de Materiais) - contendo meio e selecione as células transduzidas por 3 dias com blasticidina. Após a seleção blasticidin, selecione um poço com ~10% das células sobreviventes para o próximo passo.
    5. Após a seleção blasticidin, as células transduzidas em placas de 96 poços a uma densidade de 0,5 células/poço, a fim de isolar clones únicos (por exemplo, diluir 50 células em 20 mL (0,5 células por 200 μL) cultura média e alíquota de 200 μL por poço em 96 placas de poço). Incubar as placas de 96 poços por 2 semanas e escolher as colônias individuais para confirmar a atividade BE3.
    6. Divida as colônias únicas em dois conjuntos, um conjunto para testar a atividade BE3 e outro para manutenção. Transduza as partículas lentivirais de gRNAs em um dos conjuntos para confirmar a atividade BE3. Analise a frequência de mutação de cada colônia utilizando o ensaio de endonuclease T7 I (T7E1, Tabela de Materiais) ou realizando a técnica de sequenciamento profundo direcionada (etapa 4)21. Selecione clones únicos apropriados que sejam saudáveis e tenham um BE3 altamente ativo.
      NOTA: Para validar as frequências exatas de mutação, recomendamos o sequenciamento profundo direcionado do que o ensaio T7E1. HEK2 (5'-GAACACAAAGCATAGACTGCGGG-'3) é um local de destino bem validado para BE3.

2. Projeto e construção de BRCA1 visando gRNAs

Figure 2
Figura 2: Um exemplo de DNA plasmídeo gRNA. (A) Para editar efetivamente a sequência de destino com BE3, é necessário um NGG PAM (CCN PAM) que coloque o alvo C (alvo G) dentro de uma janela de cinco nucleotídeos. NGG PAM é mostrado em vermelho e a janela de edição base é representada por uma caixa cinza. (B) A sequência de gRNA para c.8047C>T (H1283Y) é indicada e os pares C:G alvo são mostrados em vermelho enquanto a janela ativa é destacada por uma caixa cinza. Para clonagem de gRNA, as sequências de saliência indicadas em negrito são adicionadas em ambas as extremidades de 50. Os modelos para gRNA foram gerados pela ressarção dos dois oligonucleotídeos complementares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

NOTA: Os controles positivos e negativos das variantes BRCA1 são essenciais. Neste estudo, c.5252G>A (R1751Q) e c.4527C>T (Y1509Y) são usados como controles benignos. c.191G>A (C64Y), 81-1G>A e c.3598C>T (Q1200*) são usados como controles patogênicos. As sequências de destino de cada gRNA estão listadas na Tabela Suplementar 1.

  1. Obtenha a sequência de genoma BRCA1 do GenBank no NCBI22.
  2. Pesquise os locais de destino de 20 bps com a sequência "NGG" e "CCN" do Protospacer Adjacent Motif (PAM) em torno da mutação de interesse. A mutação de interesse deve estar localizada em 4-8 nucleotídeos na extremidade PAM-distal das sequências de alvo gRNA devido à janela ativa do BE3 é de 4 a 8 nucleotídeos na extremidade PAM-distal das sequências de alvo gRNA14. No caso de c.8047C>T (H1283Y)- e c.5252G>A (R1751Q)-targeting gRNAs, 50-TCAGGAACATCACCTTAGTG-AGG-30 e 50-CCA-CCAAGGTCCAAAGCGAGCAA-30, as sequências em negrito são janelas ativas. As conversões C a T e G para A ocorrem com NGG e CCN PAM, respectivamente (Figura 2A).
    NOTA: BE-Designer (http://www.rgenome.net/be-designer/)23 é uma ferramenta baseada na Web útil para design gRNA.
  3. Encomendar dois oligonucleotídeos complementares por gRNA; para os oligonucleotídeos dianteiros, adicione "CACCG" à extremidade 50 da sequência guia, e para os oligonucleotídeos invertidos, adicione "AAAC" ao final de 5' e "C" ao final de 3'. Essas sequências adicionais são específicas do vetor de expressão gRNA de destino (a partir da etapa 2.5) usado para este protocolo, e os usuários devem ser ajustados para vetores alternativos de expressão gRNA(Figura 2B).
  4. Resuspend o oligonucleotídeo em água destilada em uma concentração final de 100 μM. Misture os dois oligonucleotídeos complementares a uma concentração final de 10 μM com tampão de ligadura T4(Tabela de Materiais)e aqueça-os a 95 °C por 5 min e esfrie-os à temperatura ambiente para ressarcimento.
  5. Digeste pRG2 utilizando a enzima de restrição, BsaI (1 unidade por 1 μg) por 1 h a 37 °C(Tabela de Materiais). Execute o produto digerido em gel de 1% de agarose e purifique a banda de tamanho apropriado (2,5 kb).
    NOTA: Em vez de usar um método clássico de digestão e ligadura, outro método de clonagem, como a clonagem golden gate, pode ser usado.
  6. Ligate o duplex de oligonucleotídeo regaled ao DNA vetorial usando a ligase de DNA adquirida(Tabela de Materiais) de acordo com o protocolo do fabricante e transformá-los em células alfa-competentes DH5 (Outras cepas E. coli que amplamente utilizadas para subcloamento também podem ser usadas).
  7. Adicione os transformadores a uma placa de ágar contendo ampicillina (100 μg/mL) e incubar a placa durante a noite a 37 °C. Purificar o DNA plasmídeo de vários transformadores e analisar suas sequências de gRNA por sequenciamento Sanger usando primers que prime no U6 promoter(Tabela de Materiais).

3. Criação de variantes BRCA1 usando ferramentas de edição base mediadas pelo CRISPR

NOTA: Se as linhas celulares HAP1-BE3 não forem utilizadas, o DNA plasmídeo codificador BE3 pode ser co-transfeinado com gRNA brca1-targeting. Em comparação com a co-transfecção de plasmídeos BE3 e gRNA, a transfecção de plasmídeos de gRNA para células HAP-BE3 induz a edição eficiente de base de até 3 vezes no lócus alvo em nossas mãos.

  1. Sementes 5 x 105 células HAP1-BE3 (ou células HAP1 em caso de métodos de co-transfecção) por poço em placas de 24 poços 1 dia antes da transfecção. No momento da transfecção, as células culturais atingem uma densidade adequada (70%-80% confluência).
  2. Transfect BRCA1-targeting gRNAs utilizando os reagentes de transfecção adquiridos(Tabela de Materiais) de acordo com o protocolo do fabricante. Use 1 μg de gRNAs de segmentação BRCA1(com 1 μg de DNA plasmídeo codificador BE3 em caso de métodos de co-transfecção) para induzir C:G a T:A conversão em locais alvo BRCA1. Incubar as células a 37 °C e subcultura a cada 3-4 dias.
  3. Colher as pelotas celulares 3, 10 e 24 dias após a transfecção para analisar a eficiência de edição base (Amostras de 3 dias após a transfecção são analisadas como amostras do dia 0).
  4. Extrair DNA genômico utilizando o kit de purificação de DNA genômico(Tabela de Materiais).
    NOTA: Recomendamos otimizar as condições de transfecção com proporção variável de reagente para DNA. A condição ideal para transfecção hap1 é 4:1 ração de reagente para DNA em nossas mãos.

4. Preparação da amostra para sequenciamento de próxima geração de Illumina (NGS)

Figure 3
Figura 3: Preparação para sequenciamento de próxima geração. O primer 1st PCR foi projetado para amplificar o local alvo BRCA1 no DNA genômico. O primer2º PCR foi projetado de tal forma que suas sequências estão localizadas mais dentro do que as sequências de primer 1st PCR. Sequências adicionais mostradas como uma barra amarela foram adicionadas em ambas as extremidades do primer2º PCR para anexar as sequências essenciais para realizar o sequenciamento da próxima geração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Projete os primers 1st PCR para amplificar os locais de destino BRCA1. Embora não haja restrição sobre o tamanho do produto 1st PCR, recomenda-se um tamanho de produto de <1 kb para amplificar eficientemente uma região específica(Figura 3).
  2. Projete os 2primers PCR localizados dentro do produto1º PCR. Considere o tamanho do amplicon de acordo com o comprimento de leitura do NGS (Por exemplo, o tamanho do produto amplicon deve ser menor que 300 bp por 2 × corrida final emparelhada de 150 bp para mesclar cada leitura). A fim de anexar sequências essenciais para análise de NGS, adicionar sequências adicionais ao final de 5' dos primers2'º PCR da seguinte forma: para os primers dianteiros, adicione sequências de 5'-ACACTCTTTCTCTACACGACGACGCTTCCGATCT-3' ao final de 5' e, para os primers invertidos, adicione sequências ATCT-3 de 5'-GTGACTGGAGAGCGTGTCGTTCTTCCG ATCT-3' ao final de 5''.
    NOTA: Usamos PCR aninhado para reduzir a amplicon de vinculação não específica, impedindo que os primers se conectem à sequência não-alvo.
  3. Amplifique os locais alvo brca1 no DNA genômico obtido a partir de três pontos de tempo. Use polimerase de alta fidelidade de acordo com o protocolo do fabricante para minimizar os erros de PCR. Para a reação 1st PCR, use 100 ng de DNA genômico para amplificação ao longo de 15 ciclos. Para a reação2 º PCR, use 1 μL do 1º produto PCR para amplificação ao longo de 20 ciclos. Execute 5 μL do2º produto PCR em gel de 2% de agarose e confirme o tamanho.
  4. A fim de anexar as sequências essenciais para a análise de NGS, amplie o2º produto PCR usando os primers listados abaixo. Para a reação pcr, 1 μL do2º produto PCR é usado para amplificação de até 30 ciclos usando polimerase de alta fidelidade.
    1. Para realizar o sequenciamento multiplex para que um grande número de bibliotecas sejam agrupadas e sequenciadas simultaneamente, use primers para frente (D501 – D508) e primers reversos (D701 – D712), que possuem sequência de índice única(Tabela Suplementar 1). Amplie cada amostra usando conjuntos de primers diferentes para conduzir a estratégia única de indexação dupla.
    2. Execute 5 μL do produto PCR em gel de 2% de agarose para confirmar o tamanho e purifique o amplicon usando um kit comercial de limpeza pcr(Tabela de Materiais). Misture cada amostra em quantidades iguais para criar uma biblioteca NGS.
  5. Quantifique a biblioteca NGS em comprimento de onda de 260 nm usando espectrofotômetros e dilua a biblioteca NGS para concentração de 1 nM usando tampão de resuspensão ou 10 mM Tris-HCl, pH 8.5. Prepare 100 μL da biblioteca diluída para a concentração de carregamento apropriada, dependendo dos tipos de biblioteca (Por exemplo, prepare 200 pM da biblioteca para Nextera DNA Flex).
    1. Como controle, combine phiX com a amostra diluída apropriada para o tipo de kit.
    2. Carregue a biblioteca no cartucho e execute o NGS de acordo com o protocolo do fabricante. Os sistemas Illumina iSeq 100 ou Miseq podem sequenciar os amplicons de vários comprimentos até 300 bp para final de leitura única ou emparelhado. Recomendamos mais de 10.000 leituras por amplicon alvo para análise aprofundada da eficiência de edição base.

5. Análise da eficiência de edição base para a avaliação funcional das variantes BRCA1

  1. Analise as eficiências de edição base usando MAUND24. A eficiência de edição base é calculada conforme descrito abaixo.
    Equation 1
    Se várias citosinas estiverem presentes na janela ativa BE3, apenas a conversão C para T que é direcionada para avaliação da variante BRCA1 é considerada. Por exemplo, se as sequências da janela ativa BE3 são "C4A5T6C7T8",as possíveis sequências geradas pela edição base são "T4A5T6C7T8","C4A5T 6 T7T8",e "T4A5T 6 T7T8". Neste momento, se a posição 4 for a posição alvo da variante BRCA1 desejada, entãoapenasa sequência "T 4 A5T6C7T8" é considerada para calcular a eficiência de edição base.
    NOTA: Também recomendamos outras ferramentas web para análise de atividades de edição base, como CRISPResso225e BE-analyzer23.
  2. Verifique os resultados utilizando controles positivos e negativos das variantes BRCA1. As eficiências de edição base do controle benigno devem permanecer as mesmas, enquanto as do controle patogênico devem diminuir com o tempo.
  3. Calcule a eficiência relativa da edição de base das variantes BRCA1 e determine sua patogenicidade. As diferenças significativas entre as amostras do dia 0 e 21 do dia 21 são analisadas análises estatísticas adequadas, como o teste T.

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Representative Results

As abordagens experimentais descritas neste protocolo permitem a avaliação funcional das variantes brca1 endógenas geradas pelos editores de base de citosina baseadas em CRISPR. Para selecionar linhas celulares apropriadas para a avaliação funcional das variantes BRCA1, os pesquisadores devem confirmar que o BRCA1 é um gene essencial nas linhas celulares alvo. Por exemplo, nós primeiro transfeinamos Cas9 e gRNAs em linhas celulares HAP1 para interromper brca1 e analisamos frequências de mutação por sequenciamento profundo direcionado. Descobrimos que as frequências de mutação diminuíram significativamente ao longo do tempo nas linhas celulares HAP1(Figura 4A). Esses resultados mostraram que o BRCA1 é um gene essencial para a viabilidade celular nas linhas celulares HAP1. Para investigar se as variantes substituídas C:G a T:A afetam a função de BRCA1, foram analisadas as gRNAs de codificação de DNA plasmids, que poderiam induzir cada mutação, foram transfectadas para linhas celulares HAP1-BE3 e as frequências de substituição foram analisadas. As frequências relativas de substituição de c.3598C>T (p. Q1200*), uma variante patogênica, diminuíram drasticamente, enquanto as de c.4527C>T (p.Y1509Y), variante benigna, permaneceram semelhantes com o tempo(Figura 4B). No banco de dados ClinVar, c.154C>T (p. L52F), c.3847C>T (p.H1283Y) e c.5056C>T (p.H1686Y) do BRCA1 são relatados como variantes de significância incerta. Analisamos a função dessas variantes utilizando os métodos mencionados acima e descobrimos que as frequências de substituição de nucleotídeos dessas três variantes diminuíram de forma dependente do tempo(Figura 4B). A partir desses resultados, as três substituições alteraram a função BRCA1 e poderiam ser categorizadas como mutações patogênicas.

Figure 4
Figura 4: Resultados representativos do estudo funcional do BRCA1 utilizando sistemas CRISPR-Cas9. ( A )Ainterrupção do BRCA1 afeta a viabilidade celular. As células HAP1 foram transfeinadas com spCas9 e dois gRNAs direcionados ao BRCA1, respectivamente, e o sequenciamento profundo direcionado foi realizado para análise de viabilidade celular. As frequências de mutação do BRCA1 diminuíram de forma dependente do tempo em células transfeinadas com dois gRNAs independentes, e as frequências de mutação de CCR5, que foi usada como controle negativo, permaneceram as mesmas ao longo do tempo. (B) Avaliações funcionais de cinco variantes BRCA1. As células HAP1-BE3 foram transfeinadas com gRNAs induzindo mutações BRCA1, respectivamente, e foi realizado sequenciamento profundo direcionado para análise de viabilidade celular. As frequências relativas de substituição diminuíram de forma dependente do tempo em células de c.3598C>T, c.154C>T, c.3847C>T, e c.5056C>T e as de c.4527C>T permaneceram as mesmas. As barras de erro mostram o erro padrão da média. Asteriscos denotam diferentes valores P: * P<0.05; ** P<0.005., n.s: não significativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo descreve um método simples para avaliações funcionais das variantes BRCA1 usando o editor base de citosina meditada por CRISPR. O protocolo descreve métodos para o desenho de gRNAs no lócus alvo e construção dos DNAs plasmídeos dos quais são expressos. Os editores de base de citosina induzem a conversão de nucleotídeos em uma janela ativa (no caso de BE3, nucleotídeos 4-8 na extremidade PAM-distal das sequências de alvo gRNA). O pesquisador deve escolher cuidadosamente sequências de destino porque todas as citosinas na janela ativa podem ser substituídas por timinas. Além disso, conforme descrito na Etapa 5, várias citosinas em uma janela ativa devem ser cuidadosamente analisadas para avaliar a função das variantes BRCA1.

Um dos passos mais importantes é a transfecção na linha celular alvo, que afeta a frequência inicial de mutação para avaliações funcionais BRCA1. Para melhorar a frequência inicial de mutação, os pesquisadores devem otimizar os métodos de entrega à linha de interesse celular. Como descrito no Passo 1, a geração de linhas celulares expressas BE3 é opção útil para aumentar a frequência inicial de mutação. Não recomendamos a transdução lentiviral do gRNA para as células HAP1-BE3, pois a expressão constitutiva de BE3 e gRNA poderia causar conversão de nucleotídeos acumulados, e esses resultados interferem na avaliação funcional das variantes BRCA1.

Além dos métodos mediados pelo BE3 introduzidos neste protocolo, recomenda-se diversos métodos complementares para ampliar ainda mais as avaliações funcionais das variantes BRCA1. Em primeiro lugar, como descrito acima, a frequência de mutação na amostra inicial é importante para obter resultados confiantes das variantes BRCA1. Para aumentar a eficiência de edição base, são recomendadas variantes de editores de base de citosina, como o BE4max. Em segundo lugar, o BE3 reconhece a sequência de DNA alvo através das sequências PAM de 5'-NGG-3', que é uma limitação na geração de vários tipos de variantes BRCA1. Variantes Cas9 recentemente desenvolvidas com sequências PAM alteradas são opções úteis neste caso para estender as variantes BRCA1 direcionadas 26,27,28. Em terceiro lugar, o BE3 induz a edição base substancial em locais indesejados e o efeito fora do alvo pode influenciar a avaliação funcional das variantes BRCA129,30,31. Para reduzir o efeito fora do alvo do BE3, os locais-alvo das gRNAs devem ser cuidadosamente escolhidos sem sequências semelhantes no genoma. SECURE-BE3 ou YE1, que se desenvolveu para reduzir a edição de base indesejada em genoma e transcriptome são opções úteis32,33. Por diante, um método de edição de genoma de saturação (SGE) baseado no HDR mediado cas9 também é uma ótima opção para análise funcional das variantes BRCA119. O método não tem limitação para a seleção de sequências de destino e posições nucleotídeas das variantes BRCA1. No entanto, a abordagem baseada em HDR é relativamente menos eficiente do que os editores-base e, adicionalmente, requer design e síntese dos modelos de doadores14. Finalmente, as variantes BRCA1 derivadas do paciente incluem várias variedades de mutações, como mutações de pontos, inserções e exclusões. Destes, mutações pontuais são a maior população de variantes BRCA1, que não são apenas c:G para T:A conversão, mas também A:T para G:C, C:G para G:C e conversões A:T para T:A. Para avaliações funcionais desses tipos de conversões, editores de base de adenosina mediados pelo CRISPR e Editores Prime são opções valiosas34,35. O rápido desenvolvimento de tecnologias de engenharia de genomas permitirá avaliações funcionais de variantes BRCA1 mais diversas.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (bolsas 2017M3A9B4062419, 2019R1F1F1057637 e 2018R1A5A20732 a Y.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BamHI NEB R3136 Restriction enzyme
Blasticidin Thermo Fisher Scientific A1113903 Drug for selecting transduced cells
BsaI NEB R0535 Restriction enzyme
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504 Genomic DNA prep. kit
Dulbecco’s modified Eagle’s medium Gibco 11965092 Medium for HEK293T/17 cells
Fetal bovine serum Gibco 16000036 Supplemetal for cell culture
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311 Transfection reagent
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611L Gibson assembly kit
Iscove’s modified Dulbecco’s medium Gibco 12440046 Medium for HAP1 cells
lentiCas9-Blast Addgene 52962 Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027 Transfection reagent
Opti-MEM Gibco 31985070 Transfection materials
pCMV-BE3 Addgene 73021 Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140 Supplemetal for cell culture
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530SQ High-fidelity polymerase
pMD2.G Addgene 12259 Plasmids DNA for virus prep.
pRG2 Addgene 104174 gRNA cloning vector
psPAX2 Addgene 12260 Plasmids DNA for virus prep.
QIAprep Spin Miniprep kit Qiagen 27106 Plasmid DNA prep. Kit
QIAquick Gel extraction Kit Qiagen 28704 Gel extraction kit
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 PCR product prep. kit
Quick Ligation Kit NEB M2200 Ligase for gRNA cloning
T7 Endonuclease I NEB M0302 Materials for T7E1 assay
XbaI NEB R0145 Restriction enzyme

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References

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