Avaliação funcional das variantes BRCA1 usando editores de base mediados pelo CRISPR

Ji-Eun See; Ha Rim Shin; Gayoung Jang; Jiyeon Kweon; Yongsub Kim

doi:10.3791/61557

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Artigo de método

Avaliação funcional das variantes BRCA1 usando editores de base mediados pelo CRISPR

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DOI:

10.3791/61557

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28 de fevereiro de 2021

Ji-Eun See¹^,² , Ha Rim Shin¹^,² , Gayoung Jang¹^,² , Jiyeon Kweon¹^,² , Yongsub Kim¹^,²

¹Department of Biomedical Sciences, Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, ²Stem Cell Immunomodulation Research Center, University of Ulsan College of Medicine

Neste artigo

Resumo

Pessoas com mutações BRCA1 têm maior risco de desenvolver câncer, o que garante uma avaliação precisa da função das variantes BRCA1. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliação funcional das variantes BRCA1 usando editores de base de citosina mediados pelo CRISPR que permitem a conversão de C:G para T:A direcionada em células vivas.

Resumo

Estudos recentes têm investigado os riscos associados às mutações genéticas BRCA1 usando vários métodos de avaliação funcional, como ensaios de repórteres fluorescentes, ensaios de viabilidade de células-tronco embrionárias e ensaios de sensibilidade à base de drogas terapêuticas. Embora tenham esclarecido muitas variantes brca1, estes ensaios envolvendo o uso de variantes BRCA1 exogenously expressas estão associados a questões de superexpressão e não podem ser aplicados à regulação pós-transcrição. Para resolver essas limitações, relatamos anteriormente um método de análise funcional das variantes BRCA1 através do editor de base de citosina mediada pelo CRISPR que induz a substituição de nucleotídeos direcionados em células vivas. Usando este método, identificamos variantes cujas funções permanecem ambíguas, incluindo c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T e c.4986+5G>A, e confirmaram que os editores de base mediados pelo CRISPR são ferramentas úteis para reclassificar as variantes de significado incerto no BRCA1. Aqui, descrevemos um protocolo para análise funcional das variantes BRCA1 usando o editor base de citosina baseado em CRISPR. Este protocolo fornece diretrizes para a seleção de locais-alvo, análise funcional e avaliação das variantes BRCA1.

Introdução

O gene de suscetibilidade do câncer de mama tipo 1 (BRCA1) é um gene supressor de tumor amplamente conhecido. Como o gene BRCA1 está relacionado à reparação de danos no DNA, mutações nesse gene levariam a um maior risco de desenvolvimento de câncer em um indivíduo¹. Câncer de mama, ovário, próstata e pâncreas estão ligados a mutações herdadas de perda de função (LOF) do gene BRCA1 ². A avaliação funcional e identificação das variantes BRCA1 podem ajudar na prevenção e diagnóstico das diversas doenças. Para abordar a função das variantes BRCA1, vários métodos foram desenvolvidos e ampla....