Summary
ここでは、経胸管リンパ球を採取し、ラット・ペイアーのパッチ中の腸管リンパ球の移動をタイムラプス写真を用いて3時間観察するための正確な方法について述べた。この技術は、炎症性条件下でリンパ球の動態がどのように影響を受けるかを明らかにすることができる。
Abstract
ナイーブリンパ球は、生理学的状態下で血液からリンパ組織に再循環し、腸免疫における重要な現象として一般的に認識されています。ペイヤーのパッチ(P)や腸間膜リンパ節などの二次リンパ器官の間質は、ナイーブリンパ球が抗原を感知する場所である。ナイーブリンパ球は、高い内皮小静脈、PPへの参入のポータルに到達するために血流を循環します。一部の免疫調節剤はリンパ球の移動に影響を与えると推定されるが、微小循環ダイナミクスの正確な評価は非常に困難であり、生体内でリンパ球の移動を観察する方法を確立することは、正確なメカニズムの解明に寄与することができる。リンパ管からリンパ球を採取し、ラットPの腸管-熱帯リンパ球の詳細なダイナミクスを観察する方法を改良した。生体内でラットPを観察する共焦点レーザー走査顕微鏡を選び、タイムラプス写真を用いて記録しました。リンパ球動態の解析に貢献できる鮮明な画像を得ることができるようになりました。
Introduction
ペイアーのパッチ(P)は、小腸の層状層の数百のリンパ卵胞で構成されています。PPは、卵胞、卵胞間領域、および卵胞の下部に位置する胚葉中心に分けられ、そこでリンパ球は抗原提示によって刺激される。不十分なリンパ管はなく、抗原は上皮細胞層を介して腸管腔から層状のプロプリアに侵入する。リンパ様卵胞を覆う上皮領域は、毛包関連上皮と呼ばれ、その中に特殊な散在するM細胞が粘膜抗原を取り込む。M細胞は、その後、高等内皮細胞(HEV)の内皮を介してPに流入する素朴なリンパ球に向かって提示される、発光側および抗原からの抗原を取り込む。PPは腸内免疫に重要な役割を果たし、炎症の初期段階に関連しています。多くの分子相互作用は、接着分子、ケモカイン2、3、およびスフィンゴシン-1リン酸4を含む、二次リンパ系器官(SLA)へのリンパ球の入り口を含む。したがって、多くの期待される治療標的がある。したがって、PP内のリンパ球ダイナミクスを観察することで、炎症の非常に初期の段階を垣間見ることができ、いくつかの有望な薬物の有用性を調べることができます。
この方法は、いくつかの手順(胸管5 へのカヌリン化および採取されたリンパ球への注射後のリンパ球および長期観察)を含む、PPにおけるリンパ球の移行に焦点を当てています。これらの手順は複雑で、これまでのレポートで各手順がどのように実行されたかを正確に確認することは困難であったため、ここで、観察を成功させるためのヒントをいくつか挙げた。例えば、胸部管への管のカヌレーションは非常に困難であり、そして、カヌリン化の最初の成功率は50%未満であった。しかし、我々は方法を改善し、80%を超える成功率を達成しました。我々は、いくつかの条件下でリンパ球の経経皮移動の定量的評価を可能にするために成功した観察に必要な他のいくつかのヒントをこの原稿で述べた。
これまでの報告では、インドのインクを静脈内注入してPP6の血管構造を染色する、または顕微鏡が単焦点7であるなど、時間の経過に伴う3次元的変化を理解することは困難であった。近年、Kaedeマウスのようないくつかの光変換可能な蛍光タンパク質トランスジェニック動物を用いた観察法が、生体内における系統的な細胞の動きを明らかにしている。もう一つの研究は、PPs9からのリンパ球出口のCD69独立したシャットダウンを明らかにした。分析能力が高いため、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)を使用しました。今では、高解像度の画像を簡単に取得し、リンパ球ダイナミクスを分析するためにそれらを使用することができます。
本報告では、PPにおけるリンパ球移動を評価するための一連の方法を示した。まず、リンパ球を採取する胸部管缶取の精製方法を示した。第2に、顕微鏡観察の下で可能な限り目的の器官を維持するために、いくつかの方法で観察方法を改善し、3時間の高品質な画像を得ることを可能にしました。第三に、リンパ球移動の細胞の動きを定量化し、いくつかの薬の効果を評価した。これらの改変されたプロトコルは、粘膜免疫学評価の開発に寄与する。
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Protocol
実験議定書は、国防医科大学動物研究委員会(16058年)によって承認された。動物は標準的な実験室のチャウ(クレア日本株式会社、東京、日本)で維持された。実験動物は国立衛生研究所のガイドラインに従って治療された。
1. リンパ球の採取と分離
注:リンパ球は新鮮で保存できないため、実験ごとにラットから採取する必要があります。さらに、腸管-熱帯リンパ球は、それらが循環する胸部管から直接収集されなければならない。すべての手順は6時間以内に完了する予定で、すべての器具、手袋、表面はきれいです。動物を生理的に安定した状態に保つためには、実験で使用されるすべての生理食塩水および他の液体を暖かく保つべきである。
- ヘパリン曲線(半径約5mm)のように、高温(約80~90°C)に浸漬した後、缶詰チューブ(直径1mm)を形成し、数時間前から粘着テープを使用してプラスチック製の板に固定します。
- ミダゾラム(2mg/kg)、ドミトール(0.15mg/kg)、ベトゥルファール(2.5mg/kg)の混合物を腹腔内注射で雄のウィスターラット(8-12週間)に麻酔し、ヘアクリッパーを使用して腹部の体毛を切断します。髪が腹腔に入らないように剃った後、しっかりと髪を取り除きます。
- つま先ピンチにより、手術に必要な安定した麻酔の深さが得られていることを確認した後、中線から左肋後部領域に水平に外科用ハサミで切開を行う。光の下で血管を見て頭頂腹の血管を損傷しないように注意してください。
- ぬれたガーゼで胃を包み、胃を体の右外側にやさしく動かして後腹膜器官を明らかにする。外科的はさみを使用して脊椎の勃起筋と脂肪組織の間にノッチを挿入し、指でぶっきらぼうに分離する。
- 胸部管の周りの結合組織を慎重に取り除きます。過剰な結合組織は年齢とともに増加する。胸部管の長さが20mmになるまで、横隔膜の左の十字架のすぐ下から胸管を露出させます。胸部ダクトと大タオルの間の密着性を、精密なピンセットや湿った綿棒でそっと分離します。
- 一部のラットは、リンパ叢(クモの巣のように広がる小さな胸部管)の高い位置のために、胸部管または短い胸管を横切る腹部動脈から分岐する動脈を持っているので、このプロセスを慎重に実行します。浮腫を誘発しないように、胸部管への不必要な接触を避けてください。
- 横隔膜の左の十字架のすぐ下の胸管に弦(3-0シルク)で合字を適用します。尾柱胸管が歪んでしまいます。
- 手術用ハサミの刃先を刺して腹壁に穴(直径5mm)を作り、ヘアピン湾曲したカヌルチューブを通過させ、一点で腸筋にチューブをリゲートします。10 U/mLヘパリンを含む通常の生理液で缶詰チューブを充填します。
- 歪んだ胸部管の下にひも(3-0シルク)を置いた後、缶詰チューブの鋭く切断された端で胸部管を刺し、尾部に向かって約5mmに向かってカニューレートし、胸部管を固定用の缶詰管でリゲートします。
- 脱水を防ぐために生理食塩水を供給するには、精密ピンセットを使用して胃のアントラムの前壁に穴(直径3mm)を作成し、シリコンチューブ(直径2mm)を幽門リングを通して十二指腸に渡します。傷を縫い上げ、ボルマンのケージで動物を維持した後、3 mL/hの流量でシリコンチューブから各ラットの十二指腸に糖を含んだ生理食動物を注入し始める。ケージ全体をペーパータオルで覆い、暖かく保ちます。
- 6 U/mLヘパリン、10%のウシ胎児血清、RPMI 1640培地(pH 7.4;材料表を参照)を含む氷上の50mL円錐形チューブの蓋の中央の穴にcannulationチューブを固定し、氷の上に胸部管リンパ球(TDl)を収集します。チューブ内部のフィブリン血塊形成によるカニューレート管閉塞を防止するために、チューブの先端を円錐管の壁に接触しないように注意してください。約1.0 x 10 8〜109リンパ球を含むリンパ液(約20mL)は、6時間で得ることができる。完全麻酔下でリンパ球を得るために、麻酔の面が監視され、リンパ流が適切に観察される。同じ麻酔薬は、ラットがボールマンのケージに入れられた約3時間後に同じ用量で加え、6時間連続的に深部麻酔を得る。
2. カルボキシフルオレセインジアセテート・スハクニミジルエステル(CFDSE)のリンパ球標識
- ジメチルスルホキシド(DMSO)でCFDSE(材料表)を15.6mM(500 μgのCFDSEをDMSOの60 μLに溶解)に溶解します。
- インキュベートリンパ球(1 x 108〜109)をRPMI 1640の50mLで、CFDSE溶液50μLを37°Cで30分間用いた10を前述した。
3. 微小血管研究の実験
- ミダゾラム(2mg/kg)、ドミトール(0.15mg/kg)、ベトゥルファール(2.5mg/kg)の混合物を腹腔内注射でレシピエントラット(8-12週間)に麻酔し、つま先ピンチで麻酔の深さを確認します。毛髪の汚れを最小限に抑えるために、毛皮を手入れする前に腹部を濡らします。次に、正中線切開を介してレシピエントウィスターラットの腹部を開く。
- ガラススライド(24 x 50 mm)で覆われた中央の周りに長方形の穴を持つポータブルステンレス鋼板(約120 x 300ミリメートル)にラットを置きます。観察のためにPを含む、イレラルセグメントの約10cmを選択してください。
- 腸をできるだけ暖かく保ち、リン酸緩衝生理食塩分(PBS)を37°Cに温めて湿ら。 PBSで小腸を覆うために使用されるガーゼを浸します。
- 2%のイソフルラン(材料表を参照)で連続麻酔を与えながら、顕微鏡のステージにスライドを置き、いくつかのHEVがセローザを通って走っているPPの微小循環の観察に適した領域を選択します。P のサイズの範囲;より大きな物はCLSMを用いた微小循環の観察に適している。小腸は場所でまっすぐではありません。長さ2cm以上の直線セグメントは、張力なしで観察に適しています。
- 隣接する腸管セグメントと腸間腸をPBSで浸した吸収性綿で覆います。2つのロールコットンボールの間に腸セグメントを配置し、ラットの心拍と呼吸によって振動するのを防ぐために、ラットの体から可能な限り遠くに配置します。
- 1 mL シリンジを使用して、CFSE 標識 TDL (1 x 108 細胞) をレシピエントラットの頸静脈にゆっくりと注入します。急速な静脈注射は、全身循環に影響を与える可能性があります。
4. リンパ球の微小循環
- CLSMを使用してPのマイクロバスキュアチュアのTDLを継続的に監視し、30 s間隔でタイムラプス写真を使用して3時間コンピュータに記録します。セローサからPPsのHEVまでの深さは約25μmで、30μmの深さまでストロマと毛細血管を観察することができます。
- テキサスレッドデキストラン(25mg/kg)を各レシピエントラットの頸静脈に注入して血流を染色し、Hoechest 33342(5mg/kg)を注入して細胞核を染色します。
- (オプション)リンパ球のダイナミクスを定量化するために、HEVに30秒以上付着するリンパ球を「接着性リンパ球」と定義し、HEVからストロマに移動するリンパ球を「リンパ球の移行」と定義する。次に、移動の平均割合(リンパ球/粘着リンパ球+移動リンパ球)を視野(約0.3mm2)で計算する。
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Representative Results
リンパ球からのリンパ球の採取
胸部管のカヌレーションのためにラットを準備するには、 図1 に示すように緊張した胸管に切開し、次に図 2に示すようにボルマンのケージにラットを維持する。
リンパ球が十分に採取されると、約107〜108/mLリンパ球を含む約20mL/6hのリンパ液を得ることができる。TDLのうち、70%がCD4を発現し、その中で約90%の細胞がCD62Lを発現し、TDLの主な組成(>60%)を意味する。ナイーブ腸管リンパ球で構成されています。ここで採取したリンパ球は、腸管に特異的に移動する細胞であるため、ペイアーのパッチ中の移動状態を評価するのに適している。
顕微鏡観察
十分な量の蛍光リンパ球を注入した後、 図3に示すように、レシピエントラットの腸をガラススライドに取り付ける。生理学的状態のPの顕微鏡画像を 図4に示す。
マイクロ観察のために、ラットは、約3時間の腹腔の下で安定して麻酔することができる。リンパ球はHEVに付着し、ロールし、周囲の間質に移行し、リンパ毛細血管に移行する。観察期間内に間質に移行したリンパ球の割合を定量化し、評価した。
十分な量の蛍光リンパ球の注入後、腸管熱帯リンパ球はHEVに付着し始め、約1時間で内皮を越えて間質に移行する。ほとんどの場合、間質内で移動し、他の人は約2〜3時間でリンパ毛細血管に移動します。この研究では、よく発達した蛍光標識ex vivoは高強度をもたらし、非常に深い領域のリンパ球ダイナミクスを観察することを可能にする。また、異なる種類の蛍光標識を用いることで、異なる種類のリンパ球のダイナミクスを同時に観察することができます。この腸内熱帯リンパ球の移動は、以前のレポートに示すように、FTY720のような一部の免疫調節剤による抑制のために視覚的に明らかにすることができる。
微小循環系自体の観察は極めて困難であり、容易な評価方法を確立することが望ましい。この研究はまた、薬のアクションサイトがペイアーのパッチ内にある場所を見つけることを可能にしました.特に、リンパ球へのFTY720のエキソウビボ投与は、リンパ球のみに作用部位を限定することを可能にしたが、内皮には限定しなかった。特定のリンパ球の選別と組み合わせることで、より詳細な結果が得られるであろう。
図1:胸部管を露出させ、カヌルを行う手順。 腹膜を縦方向に切断した後、胸部管は胃をクラニヤ状に動かし、腹部大動脈の右下側の結合組織を解剖することによって露出させることができる。横隔膜の周りの結合組織は、傷害を防ぐために慎重に解剖する必要があります。胸部管は、缶詰のための十分なスペースを作成するためにできるだけ広く外視して露出し、次に横隔膜のすぐ下に3-0シルク縫合糸で結び付け、リンパの流れを止め、液体を尾大に保持する必要があります。乳白色のリンパ液は、カテーテルを挿入することができるリンパ管を通して見える。ラットの胸部管は、滑らかなカヌレーションを確実にするためにわずかに緊張する必要があります。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:胸管リンパ球(TDL)を収集する設定全体の画像。 ラットはボルマンのケージに保持され、TDLは各バイアルにカヌレーションチューブを通して収集されます。バイアルは氷の上に置き、新鮮なリンパ液を収集するために12時間ごとに交換されます。糖分を含む生理食動物は、脱水を防ぐために約3mL/hの速度でシリンジポンプを使用してシリコーンチューブを介して投与されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3:ラットは、麻酔装置に接続された顕微鏡の段階に置かれ、静脈カテーテルから内部頸静脈を通して蛍光物質または蛍光標識リンパ球が注入される(A)。腸管の観察領域は、2つのロールコットンボールの間に穏やかに固定された。腸管は、呼吸の動きによる振動を避けるために、体幹から遠く離れて固定されました。ロールコットンボールは、観察期間中の腸の乾燥を防ぐためにリン酸緩衝生理食塩水に浸漬した(B)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4:生理的状態におけるペイアーのパッチの顕微鏡画像(A)血管内皮細胞の核は青色に染色される。血漿は赤く、血の流れは染色されていない細胞の流れによって検出される。高内皮性小胞に付着した腸管リンパ球(染色緑色)(B)この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、ナイーブな腸管熱帯リンパ球を収集し、ラットPでの移動を観察するためのプロトコルについて説明しました。これらの手順は、リンパ球がPの微小血管構造でどのように動くかを明らかにし、正常または薬用状態下でそれらのダイナミクスを視覚的に比較することを可能にする。これらのダイナミクスの直接観察は、観察期間は数時間に制限されているが、いくつかの薬物による免疫学的修飾の手がかりを得るために多くのメリットを有する。
メソッドにいくつかのヒントを記載しました。その中で最も繊細な手順の1つは、オペレータが胸部管を迅速かつ正確にできる必要があるということです。手術に時間がかかり、不必要な損傷を伴う場合、著しい出血および炎症が起こり、結合組織の浮腫および胸部管の閉塞によるTDL採取の減少をもたらす。私たちは、小さな刃先のはさみを使用して胸部管に小さな切開を作成した後、チューブをカニュールにしていました。しかし、この手順は、リンパの排水によるカヌレーション部位を妨害する。したがって、今、私たちは胸部ダクトを切断しません。むしろ、鋭いエッジでそれを刺します。この方法により、cannulation が簡単になり、成功率が向上します。また、胸部管の切開部位は、限られた腹腔のため非常に重要である。切開部位が横隔膜に近すぎると、カヌレーションチューブの湾曲した部分が横隔膜にぶつかるでしょう。横隔膜から遠すぎる場合、尾胸管のリンパ叢による固定を確保するのに十分な深さのチューブをカンニュートすることも困難である。良好なカヌレーションの場合でも、カヌレーションチューブはフィブリン形成によって容易に閉塞することができる。そのため、定期的にヘパリンでチューブを静かに洗い流すのをお勧めします。
CLSMの最近の進歩により、前回の研究11に比べて、より明確かつ正確にリアルタイムで焦点領域を観察することが可能になった。現在は研究室でCLSMを使用していますが、多光子顕微鏡を用いてマイクロ循環をより明確に観察することができます。プロトコルは技術的進歩と共に幾つかの点で修正を必要とするが、目的の器官12,13の局在領域の観察を可能にする。
この方法のメリットと鍵は、リンパ球をレシピエント動物から分離し、インビトロであらゆる種類の化合物を使用してそれらをインキュベートし、レシピエント動物に注射した後にそれらを観察することです。これにより、リンパ球単独の効果を解明することが可能になる。逆に、血管内皮などのリンパ球以外の細胞に対するあらゆる種類の化合物の効果を解明したい場合は、レシピエント動物をあらゆる種類の化合物で治療し、コントロールリンパ球の注射後に観察することができます。同じものをマウスで解明するためには、遺伝子操作された条件動物を一匹ずつ作らなければなりません。さらに、特定の表面マーカーを用いて単離されたリンパ球を選別することで、特定のタイプのリンパ球のダイナミクスを研究することが可能になる。
本研究のビデオに示すように、リンパ球は、生体内の血管内皮を無限に、そして横に移動するので、生体内観察のみを用いてそれらの挙動に対する影響を評価することは困難である。さらに、投与された薬物の作用機序が調べられる場合、本来は各作用部位を調べるには不適当である。この研究のメリットは、リンパ球を分離し、インビトロでインキュベートすることによって、血管およびリンパ球側で別々に薬効を調べることができるということです。分析が容易な変数が少なくなります。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、厚生労働省の難病研究に対する厚生医療大学の助成金や厚生労働科学研究助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A1R+ | Nikon | Comfocal Laser Scanning Microscopy | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 medium | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Red–dextran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
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