Mikroskopisk observasjon av lymfocyttdynamikk i Rotte Peyers patcher

Summary

Her beskriver vi en presis metode for å samle thoraxkanallymfocytter og observere migrering av tarmtropiske lymfocytter hos rotte Peyers patcher i 3 timer ved hjelp av time-lapse fotografering. Denne teknikken kan avklare hvordan dynamikken i lymfocytter påvirkes under inflammatoriske forhold.

Abstract

Naive lymfocytter resirkulerer fra blodet til lymfoidvevet under fysiologisk tilstand, og det er ofte anerkjent som et viktig fenomen i tarmimmuniteten. Stroma av sekundære lymfoide organer, som Peyers patcher (PPer) eller mesenteriske lymfeknuter, er der naive lymfocytter registrerer antigener. Naive lymfocytter sirkulerer gjennom blodet for å nå høye endotel venules, portalen for inntreden i PPs. Noen immunmodulatorer er anslått å påvirke lymfocyttmigrasjon, men den nøyaktige evalueringen av mikrosirkulasjonsdynamikk er svært vanskelig, og etablering av en metode for å observere lymfocyttmigrasjon in vivo kan bidra til avklaring av de nøyaktige mekanismene. Vi raffinerte metoden for å samle lymfocytter fra lymfekanalen og observere den detaljerte dynamikken i tarmtropiske lymfocytter hos rotte-PPer. Vi valgte konfokal laserskanning mikroskopi for å observere rotte PPs in vivo og registrert den ved hjelp av time-lapse fotografering. Vi kan nå få klare bilder som kan bidra til analyse av lymfocyttdynamikk.

Introduction

Peyers patcher (PPer) består av hundrevis av lymfoide follikler i laminapropria i tynntarmen. PPs er delt inn i follikler, den interfollicular regionen, og germinal sentre som ligger i den nedre delen av folliklene, hvor lymfocytter stimuleres av antigenpresentasjon. Det er ingen afferent lymfatiske kar, og antigenene invaderer lamina propria fra tarmlumen via epitelcellelaget. Epitelregionen som dekker lymfoide follikler kalles follikkel-assosiert epitel, der spesialiserte ispedd M-celler tar opp slimhinneantigener. M celler tar i antigener fra luminalsiden og antigener blir deretter fanget av dendrittiske celler og presentert mot naive lymfocytter som strømmer inn i PPer gjennom endotelet av høye endotel venules (HEVs)¹. PPs spiller en viktig rolle i tarmimmunitet og er relatert til det tidlige stadiet av betennelse. Mange molekylære interaksjoner involverer inngangen til lymfocytter til sekundære lymfoide organer (SFO), inkludert vedheftmolekyler, chemokines^2,3og sphingosine-1-fosfat⁴; Dermed er det mange forventede terapeutiske mål. Derfor, observere lymfocytt dynamikken i PPs gjør oss i stand til å få et glimt av den svært tidlige fasen av betennelse og undersøke nytten av flere lovende legemidler.

Metoden her fokuserer på migrering av lymfocytter hos PPer, som inkluderer flere prosedyrer (kanylering i thoraxkanalen⁵ og innsamling av lymfocytter og langsiktig observasjon etter injeksjonen i innsamlede lymfocytter). Siden disse prosedyrene er komplekse og det var vanskelig å se nøyaktig hvordan hver prosedyre ble utført i tidligere rapporter, nevnte vi her noen tips for å oppnå en vellykket observasjon. For eksempel var hermetikk av rørene i thoraxkanalen svært vanskelig, og den første suksessraten for hermetikk var mindre enn 50%. Vi forbedret imidlertid metoden og oppnådde en suksessrate over 80%. Vi nevnte noen andre tips i dette manuskriptet som er nødvendige for vellykket observasjon for å muliggjøre kvantitativ evaluering av transendothelial migrasjon av lymfocytter under flere forhold.

I tidligere rapporter var det vanskelig å forstå de tredimensjonale endringene over tid, for eksempel intravenøs injeksjon av India-blekk for å flekke den vaskulære strukturen til PPs⁶, eller mikroskopet er monofokal⁷. I de senere årene har en observasjonsmetode ved hjelp av noen fotokonvertible fluorescensproteintransgene dyr som Kaede-mus avklart systematiske cellulære bevegelser in vivo⁸. Den andre studien avklart CD69 uavhengig nedleggelse av lymfocytt utgående fra PPs⁹. Vi brukte konfokal laserskanning mikroskopi (CLSM) på grunn av sin høye analytiske evne. Nå kan vi enkelt få høyoppløselige bilder og bruke dem til å analysere lymfocyttdynamikk.

I denne rapporten demonstrerte vi en rekke metoder for evaluering av lymfocyttmigrasjon i PPer. Først viste vi raffinerte metoder for thoraxkanal cannulation for å samle lymfocytter. For det andre forbedret vi observasjonsmetodene på flere måter for å opprettholde objektive organer når det er mulig under mikroskopisk observasjon, slik at vi kan få bilder av høy kvalitet i 3 timer. For det tredje kvantifiserte vi cellulære bevegelser av lymfocyttmigrasjon for å evaluere effekten av noen medisiner. Disse modifiserte protokollene vil bidra til utvikling av slimhinneimmunologievalueringer.

Protocol

Den eksperimentelle protokollen ble godkjent av Animal Research Committee of National Defense Medical College (nr. 16058). Dyrene ble opprettholdt på standard laboratoriemat (CLEA Japan Inc, Tokyo, Japan). Laboratoriedyrene ble behandlet i henhold til Nasjonale helseinstitutter.

1. Innsamling og separasjon av lymfocytter

MERK: Siden lymfocytter må være friske og ikke kan lagres, må de samles inn fra rotter for hvert eksperiment. I tillegg må tarmtropiske lymfocytter samles direkte fra thoraxkanalen der de sirkulerer. Alle prosedyrer forventes å være fullført innen 6 timer, og alle instrumenter, hansker og overflater er rene. For å holde dyrene i fysiologisk stabil tilstand, bør alle saltvann og andre væsker som brukes i eksperimentet holdes varme.

1. Form et hermetikkrør (1 mm diameter) som en heparinkurve (en radius på ca. 5 mm) etter å ha dyppet det i varmt vann (ca. 80–90 °C) og fest den til et plastbrett ved hjelp av tape i noen timer i forveien.
2. Bedøve en mannlig Wistar rotte (8–12 uker) med intraperitoneal injeksjon av en blanding av Midazolam (2mg/kg), Domitor (0.15mg/kg) og Betulphar (2.5mg/kg) og kutte kroppshåret i magen ved hjelp av en hårklipper. Fjern håret godt etter barbering slik at håret ikke kommer inn i bukhulen.
3. Etter å ha bekreftet at den stabile dybden av anestesi som kreves for prosedyren oppnås ved tåklemme, gjør et snitt med kirurgisk saks horisontalt fra midtlinjen til venstre subkostalt område. Vær forsiktig så du ikke skader blodkarene i parietal bukhinnen ved å se karene under lys.
4. Pakk magen med våt gasbind og flytt magen forsiktig til høyre utenfor kroppen for å avsløre retroperitoneale organer. Sett inn et hakk mellom erector musklene i ryggraden og fettvevet ved hjelp av kirurgisk saks og rett ut skille dem med fingrene.
5. Fjern forsiktig bindevevet rundt thoraxkanalen. Overflødig bindevev øker med alderen. Utsett thoraxkanalen fra like under venstre crus av membranen caudally til en 20 mm lengde av thoraxkanalen var synlig. Separer forsiktig adhesjoner mellom thoraxkanalen og aorta ved hjelp av presisjons pinsett eller våte bomullspinner.
   1. Utfør denne prosessen nøye fordi noen rotter har arterioler forgrening fra bukarterien krysset over thoraxkanalen eller en kort thoraxkanal på grunn av en høyere posisjon av lymfeplexus (små thoraxkanaler sprer seg som edderkoppbaner). Unngå unødvendig kontakt med thoraxkanalen for å unngå å indusere ødem.
6. Påfør en ligatur med en streng (3-0 silke) på thoraxkanalen like under venstre crus av membranen. Den kaudale thoraxkanalen blir distended.
7. Lag et hull (5 mm diameter) i bukveggen ved å stikke forkant av kirurgisk saks, passere hårnål-buet hermetuleringsrør, og ligate røret på iliopsoas muskelen på et tidspunkt. Fyll hermetuleringsrøret med vanlig saltvann som inneholder 10 E/ml heparin.
8. Etter å ha plassert en streng (3-0 silke) under den distended thoraxkanalen, stikke thoraxkanalen med den kraftig kuttede kanten av et kanyleringsrør, kanyle den mot halen ca 5 mm, og ligate thoraxkanalen med kanyleringsrør for fiksering.
9. For å levere saltvann for å forhindre dehydrering, lag et hull (3 mm diameter) på den fremre veggen i magen ved hjelp av presisjonsfliser og send silisiumrøret (2 mm i diameter) til tolvfingertarmen gjennom pylorisk ring. Etter å ha sydd opp et sår og vedlikeholdt dyrene i Bollmans bur, begynn å sette sukkerbelastet saltvann inn i hver rottes tolvfingertarm fra silisiumrøret med en strømningshastighet på 3 ml / t. Dekk hele buret med et papirhåndkle for å holde det varmt.
10. Fest hermetikkrøret til hullet i midten av lokket på et 50 ml konisk rør på is som inneholder 6 U /ml heparin, 10% fostervinserum og RPMI 1640 medium (pH 7.4; se tabellen av materialer), og samle thorax duct lymfocytter (TDLs) på is. Vær forsiktig så du ikke kontakter tuppen av røret til veggen av det koniske røret for å forhindre cannulated-tube okklusjon på grunn av fibrin koagulasjon inne i røret. Lymfevæske (ca. 20 ml) inkludert ca. 1,0 x 10⁸~10⁹ lymfocytter kan oppnås på 6 timer. For å oppnå lymfocytter under fullstendig anestesi overvåkes anestesiplanet og lymfestrømmen observeres riktig. De samme anestetika legges til i samme dose ca 3 timer etter at rotter er satt inn i Ballmans bur for å oppnå dyp anestesi kontinuerlig i 6 timer.

2. Lymfocytt merking med karboksyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFDSE)

1. Oppløs CFDSE (Materialsekk) i dimetylsulfoksid (DMSO) til 15,6 mM (500 μg CFDSE oppløst i 60 μL DMSO).
2. Inkuber lymfocytter (1 x 10⁸~10⁹⁾i 50 ml RPMI 1640 med 50 μL CFDSE-oppløsning i 30 min ved 37 °C som beskrevet tidligere¹⁰.

3. Eksperimentelt oppsett for mikrovaskulære studier

1. Bedøve mottakerrotter (8–12 uker) med intraperitoneal injeksjon av en blanding av Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) og Betulphar (2,5mg/kg) og bekreft dybden av anestesi ved tåklem. Våt magen før grooming pelsen for å minimere hårforurensning. Deretter åpner du magen til mottakeren Wister rotte via et midtlinjet snitt.
2. Sett en rotte på en bærbar plate i rustfritt stål (ca. 120 x 300 mm) med et rektangelhull rundt midten dekket med et glasssklie (24 x 50 mm). Velg ca 10 cm av ileal segmentet inkludert PPer for observasjon.
3. Hold tarmen så varm som mulig og fuktig med fosfatbufret saltvann (PBS) varmet opp til 37 °C. Suge gasbind som brukes til å dekke tynntarmen med PBS.
4. Mens du gir kontinuerlig anestesi med 2 % isofluran (se tabell over materialer), legg lysbildet på mikroskopets stadium og velg egnede områder for observasjon av mikrosirkulasjonen i PPer der noen HEVs kjører gjennom serosa. PPs varierer i størrelse; større er egnet for observasjon av mikrosirkulasjonen ved hjelp av CLSM. Tynntarmen er ikke rett på steder; et rett segment som er minst 2 cm langt uten spenning er egnet for observasjon.
5. Dekk det tilstøtende tarmsegmentet og mesenteriet med absorberende bomull gjennomvåt med PBS. Plasser tarmsegmentet mellom to rullede bomullsballer og plasser det så langt som mulig fra rottens kropp for å forhindre at det blir vibrert av rottens hjerteslag og pust.
6. Bruk en 1 ml sprøyte til å injisere (over 1 min) CFSE-merkede TDLer (1 x 10⁸ celler) i kannevenen til mottakerrottene. En rask intravenøs injeksjon kan påvirke den systemiske sirkulasjonen.

4. Mikrosirkulasjon av lymfocytter

1. Overvåk kontinuerlig TDLer i mikrovasulaturen til PPer ved hjelp av CLSM og ta opp på en datamaskin i 3 timer ved hjelp av tidsforløpsfotografering med 30 s intervaller. Dybden fra serosa til HEV av PPs er ca 25 μm, slik at observasjon av stroma og kapillær lymfekar til en dybde på 30 μm.
2. Injiser Texas Red-dextran (25 mg/kg) i halsvenen til hver mottaker rotte for å flekke blodet og Hoechest 33342 (5 mg/kg) for å flekke cellekjernene.
3. (Valgfritt) For å kvantifisere lymfocyttdynamikk, definer lymfocytter som følge av HEVs mer enn 30 sekunder som "klebende lymfocytter" og lymfocytter som emigrerer fra HEVs til stroma som ''migrerende lymfocytter". Beregn deretter den gjennomsnittlige prosentandelen av migrasjon (migrerende lymfocytter / klebende lymfocytter + migrerende lymfocytter) per synsfelt (ca. 0,3 mm²).

Representative Results

Innsamling av lymfocytter fra lymfe
For å forberede rotten for thoraxkanal cannulation, gjør et snitt i den spente thoraxkanalen som vist i figur 1 og deretter opprettholde rotten i en Bollmanbur som vist i figur 2.

Når lymfocytter er godt samlet, kan vi få ca 20 ml / 6 h lymfevæske som inneholder ca 10⁷~ 10⁸/ ml lymfocytter. Av TDLs, 70% express CD4, blant annet ca 90% celler uttrykke CD62L, noe som betyr den viktigste sammensetningen av TDLs (> 60%) består av naive tarmtropiske lymfocytter. Siden lymfocytter samlet her er celler som spesifikt migrerer til tarmkanalen, er de egnet for å evaluere tilstanden til migrasjon i Peyers patcher.

Mikroskopisk observasjon
Etter å ha injisert en tilstrekkelig dose fluorescerende lymfocytter, monter mottakerens rottetarm på et glasssklie som vist i figur 3. Et mikroskopisk bilde av PPer i fysiologisk tilstand er vist i figur 4.

For mikroobservasjonen kan rotter stabilt bedøves under laparotomi i ca 3 timer. Lymfocytter holder seg til HEVs, ruller og migrerer til det omkringliggende stromaet, og migrerer deretter til lymfekapillærer. Vi kvantifiserte og evaluerte prosentandelen av lymfocytter som migrerte i stroma i observasjonsperioden.

Etter injeksjon av en tilstrekkelig dose fluorescerende lymfocytter begynner tarmtropiske lymfocytter å følge HEVs og migrere over endotelet inn i stroma om ca. 1 time. De fleste beveger seg i stroma, mens andre migrerer til lymfekapillærer i ca 2-3 timer. Den velutviklede fluorescens merking ex vivo i denne studien resulterte høy intensitet, og det gjør oss i stand til å observere lymfocytt dynamikk av svært dypt område. I tillegg, ved å bruke en annen type fluorescens merking, kan vi enkelt observere dynamikken i forskjellig type lymfocytt samtidig. Denne tarmtropiske lymfocyttmigrasjonen kan visuelt avklares for undertrykkelse av noen immunmodulatorer som FTY720 som vist i vår forrige rapport.

Observasjon av mikrosirkulasjonssystemet i seg selv er ekstremt vanskelig, og det er ønskelig å etablere en enkel evalueringsmetode. Denne studien har også gjort det mulig å finne ut hvor handlingsstedet for stoffet er i Peyers patcher. Spesielt, ex vivo administrasjon av FTY720 til lymfocytt gjorde det mulig å begrense handlingsstedet bare til lymfocytter, men ikke til endotel. Kombinert med sortering av spesifikke lymfocytter, mer detaljerte resultater ville bli oppnådd.

Figur 1: Prosedyre for å eksponere thoraxkanalen og utføre hermetikk. Etter å ha kuttet bukhinnen langsgående, kan thoraxkanalen bli utsatt ved å bevege magen kranielt og dissekere bindevevet på dorsal høyre side av abdominal aorta. Bindevevet rundt membranen bør dissekeres nøye for å forhindre skade. Thoraxkanalen bør eksponeres så bredt kranielt som mulig for å skape tilstrekkelig plass til hermetikk og deretter ligated av en 3-0 silkesutur like under membranen for å stoppe strømmen av lymfe og beholde væsken caudally. Melkeaktig lymfevæske er synlig gjennom lymfekanalen, hvor kateteret kan settes inn. Thoraxkanalen til rotten bør være litt anstrengt for å sikre en jevn kanyling. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Et bilde av hele innstillingen for å samle thoraxkanallymfocytter (TDLer). Rottene opprettholdes i Bollmans bur og TDLer samles gjennom hermeteltrøret i hvert hetteglass. Hetteglassene er satt på is og erstattes hver 12. Sukkerbelastet saltvann administreres gjennom et silikonrør ved hjelp av en sprøytepumpe med en hastighet på rundt 3 ml/t for å forhindre dehydrering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Rotten er satt på mikroskopets stadium koblet til anestesimaskinen, og et fluorescerende stoff eller fluorescerende merkede lymfocytter injiseres fra venekateteret gjennom den indre halsvenen (A). Observasjonsområdet i tarmkanalen ble forsiktig festet mellom to rullede bomullsballer. Tarmkanalen ble festet langt fra stammen for å unngå vibrasjoner ved luftveisbevegelser. Valsede bomullsballer ble gjennomvåt i fosfatbufret saltvann for å hindre tørking av tarmen i observasjonsperioden (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Mikroskopisk bilde av Peyers patcher i fysiologisk tilstand (A). Kjernene i vaskulære endotelceller er farget blå. Blodplasmaet er rødt, og blodstrømmen oppdages ved strømmen av uopphetede celler. Gut-tropiske lymfocytter (farget grønn) som følge av høye endotel venler (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Her beskrev vi en protokoll for innsamling av naive tarmtropiske lymfocytter og observere deres migrasjon hos rotte-PPer. Disse prosedyrene kan avsløre hvordan lymfocytter beveger seg i mikrovaskulaturen av PPer og gjør det mulig å visuelt sammenligne dynamikken under en normal eller medisinert tilstand. Den direkte observasjonen av disse dynamikkene har mye fortjeneste for å få en anelse om immunologisk modifikasjon av noen stoffer, selv om observasjonsperioden er begrenset til bare noen få timer.

Vi nevnte noen tips i metodene. Blant dem er en av de mest delikate prosedyrene at operatøren må kanylere thoraxkanalen raskt og presist. Hvis en operasjon tar lang tid og innebærer unødvendig skade, oppstår betydelig blødning og betennelse, noe som resulterer i en redusert TDL-samling på grunn av ødem i bindevevet og obstruksjon av thoraxkanalen. Vi pleide å kanylere røret etter å ha skapt et lite snitt på thoraxkanalen ved hjelp av saks med en liten cutting edge. Denne prosedyren forstyrrer imidlertid hermetuleringsstedet på grunn av drenering av lymfe. Derfor kutter vi nå ikke thoraxkanalen; Snarere stikker vi den med en skarp kant. Denne metoden gjør kanylingen enklere og øker suksessratene. I tillegg er snittstedet i thoraxkanalen svært viktig på grunn av den begrensede bukhulen. Hvis snittstedet er for nær membranen, vil den buede delen av hermetuleringsrøret støte mot membranen. Hvis det er for langt fra membranen, er det også vanskelig å kanylere røret dypt nok til å sikre fiksering på grunn av lymfeplexus i caudal thoraxkanalen. Selv i tilfeller av god kanyling kan hermetuleringsrøret lett okkluderes ved fibrindannelse. Dermed anbefaler vi periodisk forsiktig spyling av røret med heparin.

Nylige fremskritt i CLSM gjorde det mulig å observere det fokuserte området tydeligere og presist i sanntid sammenlignet med en tidligere studie¹¹. Vi bruker nå CLSM i laboratoriet vårt, men vi kan observere mikrosirkulasjonen tydeligere ved hjelp av et multifotonmikroskop. Selv om protokollen krever endring på flere punkter sammen med teknisk fremgang, muliggjør det observasjon av det lokaliserte området av^{interesseorganet 12,13}.

Fordelene og nøkkelen til metoden er at det innebærer å skille lymfocytter fra mottakerdyr, inkubere dem ved hjelp av noen form for forbindelser in vitro, og observere dem etter injeksjon i mottaker dyr. Dette gjør det mulig å belyse effekten av lymfocytter alene. Tvert imot, hvis vi ønsker å belyse effekten av noen form for forbindelser på andre celler enn lymfocytter, for eksempel vaskulær endotel, kan vi behandle mottakerdyr med noen form for forbindelser og observere dem etter injeksjon av kontrolllymfocytter. For å belyse de samme tingene ved hjelp av mus, må vi lage betingede genetisk manipulerte dyr en etter en. I tillegg ville sortering av de isolerte lymfocytter ved hjelp av bestemt overflatemarkør gjøre det mulig å studere dynamikken i bestemte typer lymfocytter.

Som vist i videoen av denne studien, beveger lymfocytter seg på ubestemt tid og lateralt gjennom det vaskulære endotelet i selve kroppen, så det er vanskelig å evaluere effekter på deres oppførsel ved hjelp av in vivo observasjoner bare. Videre, hvis virkningsmekanismen til et administrert stoff skal undersøkes, er det opprinnelig uegnet for å undersøke hvert handlingssted. Fordelene med denne studien er at ved å skille lymfocytter og inkubere dem in vitro, kan de medisinske effektene undersøkes separat på vaskulære og lymfocyttsider. Færre variabler er lettere å analysere.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A1R+	Nikon		Comfocal Laser Scanning Microscopy
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester	Thermo Fisher Scientific	C1157
Hoechest 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Isoflurane	Wako Pure Chemical Industries	099-06571
RPMI 1640 medium	GIBCO	11875093
Texas Red–dextran	Thermo Fisher Scientific	D1863