Summary
Aqui, descrevemos um método preciso para coletar linfócitos toráclicos e observar a migração de linfócitos gut-tropic nos patches de Rato Peyer por 3 horas usando fotografia de lapso de tempo. Esta técnica pode esclarecer como a dinâmica dos linfócitos são afetadas em condições inflamatórias.
Abstract
Linfócitos ingênuos recirculam do sangue para os tecidos linfoides sob condição fisiológica e é comumente reconhecido como um fenômeno importante na imunidade intestinal. O estroma de órgãos linfoides secundários, como as manchas de Peyer (PPs) ou linfonodos mesentéricos, são onde linfócitos ingênuos sentem antígenos. Linfócitos ingênuos circulam pela corrente sanguínea para alcançar venules endoteliais elevados, o portal de entrada em PPs. Estima-se que alguns imunomoduladores influenciem a migração de linfócitos, mas a avaliação precisa da dinâmica da microcirculação é muito difícil, e estabelecer um método para observar a migração de linfócitos in vivo pode contribuir para o esclarecimento dos mecanismos precisos. Refinamos o método de coleta de linfócitos do ducto linfático e observação da dinâmica detalhada dos linfócitos gut-trópicos em PPs de ratos. Escolhemos microscopia de varredura a laser confocal para observar PPs de ratos in vivo e gravamos usando fotografia de lapso de tempo. Agora podemos obter imagens claras que podem contribuir para a análise da dinâmica do linfócito.
Introduction
As manchas de Peyer (PPs) consistem em centenas de folículos linfoides na álmina propria do intestino delgado. Os PPs são divididos em folículos, região interfollicular e centros germinais localizados na parte inferior dos folículos, onde linfócitos são estimulados pela apresentação de antígeno. Não há vasos linfáticos diferentes, e os antígenos invadem a órmina propria do lúmen intestinal através da camada celular epitelial. A região epitelial que cobre folículos linfoides é chamada de epitélio associado ao folículo, dentro do qual células M intercaladas especializadas captam antígenos mucosais. As células M tomam antígenos do lado luminal e os antígenos são então capturados por células dendríticas e apresentados em direção a linfócitos ingênuos que fluem para PPs através do endotélio de venules endoteliais elevados (HEVs)1. Os PPs desempenham um papel importante na imunidade intestinal e estão relacionados com o estágio inicial da inflamação. Muitas interações moleculares envolvem a entrada de linfócitos a órgãos linfoides secundários (SLOs), incluindo moléculas de adesão, quimiocinas2,3e sphingosina-1-fosfato4; assim, há muitos alvos terapêuticos esperados. Portanto, observar a dinâmica do linfócito dentro dos PPs nos permite vislumbrar o estágio inicial da inflamação e examinar a utilidade de várias drogas promissoras.
O método aqui se concentra na migração de linfócitos em PPs, que inclui vários procedimentos (cannulação no ducto torácico5 e coleta de linfócitos e observação a longo prazo após a injeção em linfócitos coletados). Como esses procedimentos são complexos e foi difícil ver exatamente como cada procedimento foi realizado em relatórios anteriores, mencionamos aqui algumas dicas para conseguir uma observação bem sucedida. Por exemplo, a canulação dos tubos no ducto torácico foi muito difícil, e a taxa inicial de sucesso da canulação foi inferior a 50%. No entanto, melhoramos o método e alcançamos uma taxa de sucesso superior a 80%. Mencionamos algumas outras dicas neste manuscrito que são necessárias para a observação bem sucedida para permitir a avaliação quantitativa da migração transendotelial de linfócitos em várias condições.
Em relatórios anteriores, era difícil entender as mudanças tridimensionais ao longo do tempo, como a injeção intravenosa de tinta da Índia para manchar a estrutura vascular dos PPs6, ou o microscópio sendo monofocal7. Nos últimos anos, um método observacional utilizando alguns animais transgênicos de proteína fluorescência fotoconvertível, como camundongos Kaede, esclareceu movimentos celulares sistemáticos in vivo8. O outro estudo esclareceu o desligamento independente do CD69 da saída de linfócitos dos PPs9. Utilizamos microscopia de escaneamento a laser confocal (CLSM) devido à sua alta capacidade analítica. Agora podemos facilmente obter imagens de alta resolução e usá-las para analisar a dinâmica do linfócito.
Neste relatório, demonstramos uma série de métodos para avaliar a migração de linfócitos em PPs. Primeiro, mostramos métodos refinados de cannulação do ducto torácico para coletar linfócitos. Em segundo lugar, melhoramos os métodos observacionais de várias maneiras para manter órgãos objetivos sempre que possível sob observação microscópica, permitindo-nos obter imagens de alta qualidade por 3 horas. Em terceiro lugar, quantificamos os movimentos celulares da migração de linfócitos para avaliar os efeitos de alguns medicamentos. Esses protocolos modificados contribuirão para o desenvolvimento de avaliações de imunologia mucosa.
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Protocol
O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Pesquisa Animal da National Defense Medical College (nº 16058). Os animais foram mantidos em chow de laboratório padrão (CLEA Japan Inc, Tóquio, Japão). Os animais de laboratório foram tratados de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde.
1. Coleta e separação de linfócitos
NOTA: Uma vez que os linfócitos devem ser frescos e não podem ser armazenados, eles devem ser coletados de ratos para cada experimento. Além disso, os linfócitos gut-tropic devem ser coletados diretamente do duto torácico onde circulam. Espera-se que todos os procedimentos sejam concluídos dentro de 6 horas, e todos os instrumentos, luvas e superfícies estejam limpos. Para manter os animais em estado fisiologicamente estável, todos os soro fisiológicos e outros fluidos utilizados no experimento devem ser mantidos aquecidos.
- Forme um tubo de canulação (1 mm de diâmetro) como uma curva de heparina (um raio de cerca de 5 mm) depois de mergulhá-lo em água quente (cerca de 80-90 °C) e fixá-lo em uma placa de plástico usando fita adesiva por algumas horas de antecedência.
- Anestesiar um rato Wistar macho (8-12 semanas) com injeção intraperitoneal de uma mistura de Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) e Betulphar (2,5mg/kg) e cortar o cabelo do abdômen usando um cortador de cabelo. Retire o cabelo firmemente após a barba para que o cabelo não entre na cavidade abdominal.
- Após confirmar que a profundidade estável da anestesia necessária para o procedimento é obtida por beliscão do dedo do pé, faça uma incisão com tesoura cirúrgica horizontalmente da linha média para a área subcostal esquerda. Tenha cuidado para não danificar os vasos sanguíneos no peritônio parietal observando os vasos sob luz.
- Enrole o estômago com gaze molhada e mova o estômago suavemente para o lado de fora do corpo para revelar os órgãos retroperitoneais. Insira um entalhe entre os músculos eretores da coluna vertebral e o tecido adiposo usando uma tesoura cirúrgica e separe-os sem rodeios com os dedos.
- Retire cuidadosamente o tecido conjuntivo ao redor do duto torácico. O excesso de tecido conjuntivo aumenta com a idade. Expor o duto torácico de pouco abaixo das cruzes esquerdas do diafragma caudal até que um comprimento de 20 mm do ducto torácico fosse visível. Separe suavemente as aderências entre o ducto torácico e a aorta usando pinças de precisão ou cotonetes de algodão molhados.
- Realize este processo com cuidado porque alguns ratos têm artérias ramificadas da artéria abdominal atravessando o ducto torácico ou um curto ducto torácico devido a uma posição mais alta do plexo linfático (pequenos dutos torácicas se espalhando como teias de aranha). Evite contato desnecessário com o ducto torácico para evitar induzir edema.
- Aplique uma ligadura por uma corda (3-0 de seda) no duto torácico logo abaixo das crus esquerdas do diafragma. O ducto torácico caudal fica distendido.
- Faça um orifício (5 mm de diâmetro) na parede abdominal esfaqueando a borda de corte da tesoura cirúrgica, passe o tubo de canulação curvado do grampo de cabelo e liga o tubo no músculo iliopsoas em um ponto. Encha o tubo de canulação com soro fisiológico normal contendo heparina de 10 U/mL.
- Depois de colocar uma corda (3-0 de seda) sob o ducto torácico distendido, esfaqueie o ducto torácico com a borda afiada de um tubo de canulação, cannulate-o em direção à cauda cerca de 5 mm, e liga o duto torácico com tubo de canulação para fixação.
- Para fornecer soro fisiológico para evitar a desidratação, crie um orifício (3 mm de diâmetro) na parede anterior do antrum do estômago usando pinças de precisão e passe o tubo de silício (2 mm de diâmetro) para o duodeno através do anel pilórico. Depois de costurar uma ferida e manter os animais nas gaiolas de Bollman, comece a infundir soro fisiológico carregado de açúcar no duodeno de cada rato a partir do tubo de silício a uma taxa de fluxo de 3 mL/h. Cubra toda a gaiola com uma toalha de papel para mantê-la aquecida.
- Fixar o tubo de canulação ao orifício no centro da tampa de um tubo cônico de 50 mL no gelo contendo heparina de 6 U/mL, soro bovino fetal de 10% e meio RPMI 1640 (pH 7,4; ver a tabela de materiais) e coletar linfócitos de ducto torácico (TDLs) no gelo. Tenha cuidado para não entrar em contato com a ponta do tubo para a parede do tubo cônico para evitar a oclusão do tubo cannulado devido à formação de coágulos fibrinas dentro do tubo. O fluido linfático (cerca de 20 mL) incluindo cerca de 1,0 x 108~109 linfócitos pode ser obtido em 6 horas. Para obter os linfócitos sob anestesia completa, o plano de anestesia é monitorado e o fluxo linfático é observado adequadamente. Os mesmos anestésicos são adicionados na mesma dose cerca de 3 horas depois que ratos são colocados na gaiola de Ballman para obter anestesia profunda continuamente por 6 horas.
2. Rotulagem de linfócitos com carboxyfluorescein diacetate éster succinimidyl (CFDSE)
- Dissolver CFDSE (Tabela de Materiais) em sulfóxido de dimetil (DMSO) a 15,6 mM (500 μg de CFDSE dissolvido em 60 μL de DMSO).
- Incubar linfócitos (1 x 108~109) em 50 mL de RPMI 1640 com 50 μL de solução CFDSE por 30 min a 37 °C, como descrito anteriormente10.
3. Configuração experimental para estudos microvasculares
- Anestesize os ratos receptores (8-12 semanas) com injeção intraperitoneal de uma mistura de Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) e Betulphar (2,5mg/kg) e confirme a profundidade da anestesia por pinça do dedo do dedo. Molhe o abdômen antes de preparar a pele para minimizar a contaminação do cabelo. Em seguida, abra o abdômen do receptor Wister rato através de uma incisão midline.
- Coloque um rato em uma placa portátil de aço inoxidável (cerca de 120 x 300 mm) com um orifício de retângulo ao redor do centro coberto com um escorregador de vidro (24 x 50 mm). Escolha cerca de 10 cm do segmento ileal, incluindo PPs para observação.
- Mantenha o intestino o mais quente possível e úmido com salina tamponada de fosfato (PBS) aquecida a 37 °C. Mergulhe a gaze que é usada para cobrir o intestino delgado com PBS.
- Ao mesmo tempo em que dá anestesia contínua com isoflurane de 2 % (ver tabela de materiais), coloque o slide no palco do microscópio e escolha áreas adequadas para observação da microcirculação em PPs onde alguns HEVs estão correndo pelo serosa. Os PPs variam em tamanho; os maiores são adequados para observação da microcirculação usando CLSM. O intestino delgado não é reto em lugares; um segmento reto de pelo menos 2 cm de comprimento sem qualquer tensão é adequado para observação.
- Cubra o segmento intestinal adjacente e mesenteria com algodão absorvente encharcado com PBS. Coloque o segmento do intestino entre duas bolas de algodão enroladas e posicione-o o mais longe possível do corpo do rato para evitar que ele seja vibrado pelos batimentos cardíacos e respiração do rato.
- Usando uma seringa de 1 mL, injete lentamente (mais de 1 min) TDLs rotulados com CFSE (1 x 108 células) na veia jugular dos ratos receptores. Uma injeção intravenosa rápida pode influenciar a circulação sistêmica.
4. Microcirculação de linfócitos
- Monitore continuamente os TDLs na microvasculatura de PPs usando CLSM e grave em um computador por 3 horas usando fotografia de lapso de tempo em intervalos de 30 s. A profundidade do serosa ao HEV de PPs é de cerca de 25 μm, permitindo a observação dos vasos linfáticos estroma e capilar a uma profundidade de 30 μm.
- Injete o Texas Red-dextran (25 mg/kg) na veia jugular de cada rato receptor para manchar a corrente sanguínea e Hoechest 33342 (5 mg/kg) para manchar os núcleos celulares.
- (Opcional) Para quantificar a dinâmica do linfócito, defina linfócitos aderindo aos HEVs por mais de 30 segundos como "linfócitos adesivos" e linfócitos emigrando de HEVs para stroma como "linfócitos migratórios". Em seguida, calcule a porcentagem média de migração (linfócitos migratórios / linfócitos adesivos + linfócitos migratórios) por campo de visão (aproximadamente 0,3 mm2).
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Representative Results
Coleta de linfócitos de linfáticos
Para preparar o rato para a canulação do ducto torácico, faça uma incisão no tenso ducto torácico como mostrado na Figura 1 e, em seguida, mantenha o rato na gaiola de um Bollman, como mostrado na Figura 2.
Quando os linfócitos são bem coletados, podemos obter cerca de 20 mL /6 h de fluido linfático contendo cerca de 107~108/mL linfócitos. Dos TDLs, 70% expressam CD4, entre os quais cerca de 90% das células expressam CD62L, o que significa a composição principal de TDLs (>60%) consiste em linfócitos ingenuos. Uma vez que os linfócitos coletados aqui são células que migram especificamente para o trato intestinal, são adequados para avaliar o estado de migração nas manchas de Peyer.
Observação microscópica
Depois de injetar uma dose adequada de linfócitos fluorescentes, monte o intestino do rato receptor em uma lâmina de vidro, como mostrado na Figura 3. Uma imagem microscópica de PPs na condição fisiológica é mostrada na Figura 4.
Para a micro-observação, os ratos podem ser anestesiados sob laparotomia por cerca de 3 horas. Linfócitos aderem a HEVs, rolam e migram para o estroma circundante, e depois migram para capilares linfáticos. Quantificamos e avaliamos o percentual de linfócitos que migraram no estroma dentro do período de observação.
Após a injeção de uma dose adequada de linfócitos fluorescentes, linfócitos gut-trópicos começam a aderir aos HEVs e migrar através do endotélio para o estroma em cerca de 1 hora. A maioria se move dentro do estroma, enquanto outros migram para capilares linfáticos em cerca de 2-3 horas. A rotulagem de fluorescência bem desenvolvida neste estudo resultou em alta intensidade e nos permite observar a dinâmica do linfócito de área muito profunda. Além disso, usando um tipo diferente de rotulagem de fluorescência, podemos facilmente observar dinâmicas de diferentes tipos de linfócitos simultaneamente. Esta migração de linfócitos gut-tropic pode ser esclarecida visualmente para supressão por alguns imunomoduladores como o FTY720, como mostrado em nosso relatório anterior.
A observação do sistema microcirculatório em si é extremamente difícil, e é desejável estabelecer um método de avaliação fácil. Este estudo também possibilitou descobrir onde está o local de ação da droga nos patches do Peyer. Em particular, a administração ex vivo do FTY720 ao linfócito possibilitou limitar o local de ação apenas aos linfócitos, mas não ao endotélio. Combinados com a classificação de linfócitos específicos, resultados mais detalhados seriam obtidos.
Figura 1: Procedimento para expor o ducto torácico e realizar a cannulação. Depois de cortar o peritônio longitudinalmente, o ducto torácico pode ser exposto movendo o estômago cranialmente e dissecando o tecido conjuntivo no lado direito dorsal da aorta abdominal. O tecido conjuntivo ao redor do diafragma deve ser cuidadosamente dissecado para evitar lesões. O ducto torácico deve ser exposto o mais largo cranialmente possível para criar espaço suficiente para a cannulação e, em seguida, ligado por uma sutura de seda 3-0 logo abaixo do diafragma para parar o fluxo de linfático e reter o fluido caudally. O fluido linfático leitoso é visível através do ducto linfático, onde o cateter pode ser inserido. O ducto torácico do rato deve ser ligeiramente tenso para garantir uma cannulação lisa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem de todo o cenário para coleta de linfócitos torácicos (TDLs). Os ratos são mantidos nas gaiolas de Bollman e TDLs são coletados através do tubo de cannulação em cada frasco. Os frascos são colocados no gelo e substituídos a cada 12 horas para coletar fluido linfático fresco. A solução salina carregada de açúcar é administrada através de um tubo de silicone usando uma bomba de seringa a uma taxa de cerca de 3 mL/h para evitar a desidratação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O rato é colocado no estágio do microscópio conectado à máquina de anestesia, e uma substância fluorescente ou linfócitos fluorescentes são injetados do cateter venoso através da veia jugular interna(A). A área de observação do trato intestinal foi suavemente fixada entre duas bolas de algodão enroladas. O trato intestinal foi fixado longe do tronco para evitar vibração por movimentos respiratórios. Bolas de algodão laminadas foram encharcadas em soro fisiológico tamponado fosfato para evitar a secagem do intestino durante o período de observação(B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagem microscópica das manchas de Peyer na condição fisiológica (A). Os núcleos das células endoteliais vasculares são manchados de azul. O plasma de sangue é vermelho, e o fluxo sanguíneo é detectado pelo fluxo de células não manchadas. Linfócitos gut-trópicos (verde manchado) aderindo a venules endoteliais elevados(B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui descrevemos um protocolo para coletar linfócitos ingenuos e trópicos ingenuos e observar sua migração em PPs de ratos. Esses procedimentos podem revelar como os linfócitos se movem na microvasculatura dos PPs e possibilitar comparar visualmente sua dinâmica em uma condição normal ou medicada. A observação direta dessas dinâmicas tem muito mérito em obter uma pista para modificação imunológica por algumas drogas, embora o período observacional seja limitado a apenas algumas horas.
Mencionamos algumas dicas nos métodos. Entre eles, um dos procedimentos mais delicados é que o operador deve cannular o ducto torácico de forma rápida e precisa. Se uma operação demorar muito tempo e envolver danos desnecessários, ocorrem sangramentos significativos e inflamação, resultando em uma diminuição da coleta de TDL devido ao edema do tecido conjuntivo e obstrução do ducto torácico. Costumávamos cannutar o tubo depois de criar uma pequena incisão no duto torácico usando uma tesoura com uma pequena borda de corte. No entanto, este procedimento interfere no local da canulação devido à drenagem de linfáticos. Portanto, agora não cortamos o duto torácico; em vez disso, nós esfaqueá-lo com uma borda afiada. Este método facilita a cannulação e aumenta as taxas de sucesso. Além disso, o local de incisão no ducto torácico é muito importante por causa da cavidade abdominal limitada. Se o local da incisão estiver muito próximo do diafragma, a parte curva do tubo de cannulação colidiria contra o diafragma. Se estiver muito longe do diafragma, também é difícil cannular o tubo profundamente o suficiente para garantir a fixação devido ao plexo linfático do ducto torácico caudal. Mesmo em casos de boa cannulação, o tubo de canulação pode ser facilmente ocluído pela formação de fibrina. Assim, recomendamos lavar periodicamente o tubo com heparina.
Os recentes avanços no CLSM permitiram observar a área focalizada de forma mais clara e precisamente em tempo real em comparação com um estudo anterior11. Agora usamos CLSM em nosso laboratório, mas podemos observar a microcirculação com mais clareza usando um microscópio multifotográfico. Embora o protocolo exija modificação em vários pontos, juntamente com o andamento técnico, permite a observação da área localizada do órgão de interesse12,13.
O mérito e a chave do método é que envolve separar linfócitos de animais receptores, incuba-los usando qualquer tipo de composto in vitro e observá-los após sua injeção em animais receptores. Isso possibilita elucidar apenas os efeitos dos linfócitos. Pelo contrário, se quisermos elucidar os efeitos de qualquer tipo de compostos em outras células além de linfócitos, como o endotélio vascular, podemos tratar animais receptores com qualquer tipo de compostos e observá-los após a injeção de linfócitos de controle. Para elucidar as mesmas coisas usando camundongos, devemos criar animais geneticamente manipulados condicionalmente um a um. Além disso, a triagem dos linfócitos isolados utilizando marcadores de superfície específicos permitiria estudar a dinâmica de tipos específicos de linfócitos.
Como mostrado no vídeo deste estudo, os linfócitos se movem indefinidamente e lateralmente através do endotélio vascular do corpo real, por isso é difícil avaliar os efeitos sobre seu comportamento utilizando observações in vivo apenas. Além disso, se o mecanismo de ação de uma droga administrada for examinado, ele é originalmente inadequado para examinar cada local de ação. O mérito deste estudo é que, separando linfócitos e incubando-os in vitro, os efeitos medicinais podem ser examinados separadamente nos lados vascular e linfócito. Menos variáveis são mais fáceis de analisar.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por subsídios da National Defense Medical College e de uma bolsa de pesquisa em Saúde e Ciências do Trabalho para pesquisas sobre doenças intratáveis do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar, Japão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A1R+ | Nikon | Comfocal Laser Scanning Microscopy | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 medium | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Red–dextran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
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